Efè Pwoteksyon Tubuloside B sou Apoptoz TNF-induit nan selil newòn yo

REZIME

OBJEKTIF: Pou envestige efè neropwotektif tubuloside B, youn nan feniletanoid izole nan tij yo.Cistanche salsa, sou timè necrosis faktè-alfa (TNF)-pwovoke apoptoz nan selil newòn SH-SY5Y.METÒD: Yo te analize viabilite selil yo lè l sèvi avèk yon tès MTT. Selil apoptotik yo te detekte lè l sèvi avèk Hoechst33342staining, epi konfime pa fwagmantasyon ADN ak analiz sitometrik koule. Aktivite kaspas-3 yo te mezire ak yon twous tès espesyal. Konsantrasyon kalsyòm gratis entraselilè a te detèmine ak probeIndo-1 pa espektwomèt la. Nivo espès oksijèn reyaktif intraselilè ak potansyèl manbràn mitokondriyo a te detèmine pa mikwoskospi konfokal lazè (LSCM) konbine avèk fluoresans probeH2DCFDA oswa JC-1 respektivman. REZILTA: Selil SH-SY5Y trete ak TNF 100 µg/L pou 36 èdtan te montre chanjman mòfolojik tipik nan apoptoz. Nechèl ADN ta ka obsève pa elektwoforèz jèl agarose. Pousantaj ki pi wo nan selil apoptotik akimile a 37.5 pousan. Apre tretman 36 èdtan ak TNF, yo te obsève akimilasyon ROS intraselilè ak [Ca2 plus ] I ak diminisyon nan potansyèl manbràn mitokondriyo, ak aktivite kapase -3ogmante apeprè senk fwa konpare ak kontwòl yo. Sepandan, pretreatment ak tubuloside B (1, 10, oswa 100 mg / L) pou 2 èdtan atenye apoptoz TNF-medyatè. Aksyon antiapoptotik tubuloside Bte pasyèlman depann sou efè estrès anti-oksidatif, kenbe nan fonksyon mitokondri, yon diminisyon nan konsantrasyon nan kalsyòm gratis entraselilè, ak anpèchman nan aktivite kaspas-3. KONKLIZYON: Tubuloside B gen kapasite neuroprotective pou antagonize apoptoz TNF-induit nan selil SH-SY5Y epi li ka itil nan trete kèk maladi neurodegenerative.

ENTWODIKSYON

Apoptoz jwe yon wòl omeostatik enpòtan nan plizyè pwosesis selilè ak nan devlopman sistèm nève yo [1]. Lanmò selil pwograme ka kontribye tou nan divès kondisyon patolojik, tankou iskemi serebral [2,3], maladi neurodegenerative, tankou maladi alzayme, maladi Parkinson, maladi Hunting ton, ak paralezit lateral amyotwofik [4-7]; osi byen ke ansefalopati reta apre anpwazònman egi monoksid kabòn[8]. Plizyè liy prèv yo te sijere ke estrès oksidatif, yon move balans selilè ant pwodiksyon ak eliminasyon espès oksijèn reyaktif (ROS), te mennen nan apoptoz newòn ak necrosis [9-11]. Se poutèt sa, li gen anpil valè yo idantifye konpoze ki ka antagonize aksyon an danjere nan ROS ak aji kòm yon antioksidan pwoteje newòn soti nan apoptoz.

Tubuloside B se youn nan phenylethanoids yo izole nan tij yo nanCistanche salsa, yon medikaman èrbal Chinwa, ki se yon dwòg enpòtan ki itilize kòm tou de ajan anti-selenium ak anti-fatig [12]. Plizyè phenylethanoid yo te montre yo posede pwopriyete radikal gratis ak pwoteje blesi toksik oksidatif estrès [13-15]. Faktè necrosis timè-alfa (TNF) se yon ajan toksik-entèfere akòz wòl enpòtan li nan maladi neurodegenerative. Yo te wè lanmò pa swa nekwoz oswa apoptoz an repons a TNF [16]. Anpil etid sijere ke estrès oksidatif jwe yon wòl kritik nan mekanis nan apoptoz selil TNF-medyatè. Ogmantasyon nivo ROS yo te dokimante nan selil apre tretman ak TNF [17,18] ak TNF-medyatè lanmò ka anpeche pa radikal gratis [19]. Kidonk, nou etidye si tubuloside Bcanprotect kont apoptoz TNF-induit ak estrès oksidatif nan kiltive selil newòn SH-SY5Y.

MATERYÈL AK METÒD

Reyaktif

Modifye Eagle's medium (MEM) ak serom fetal bovine (FBS) te achte nan men GIBCO/BRL. Chromatin lank bisbenzimid (Hoechst 33342), Poly-L-lysine, 3-(4,5-dimethylthiazal-z-yl)-2, 5-diphenyltetrazolyum (MTT), TNF , ak 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) yo te jwenn nan Sigma Chemical Company (St Louis, MO, USA). Twous deteksyon apoptoz annexin-V fluorescein isothiocyanate(FITC) te achte nan men Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, Almay). Yo te achte 5,5',6,6'-Tetrachloral-1,1',3,3'-tetraethyl benzimidazole carbocyanine (JC-1) ak Indo-1/AM nan Molecular Sond (Leiden, TheNetherlands). Caspase-3 tès ak twous ekstraksyon ADN yo te jwenn nan Promega (USA). Tubuloside B soti nanCistanche salsaDoktè Peng-fei TU (Peking University Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine) te byen apwovizyone. Pite a nan konpoze yo te plis pase 98 pousan sou segondè-pèfòmans likid kromatografi (HPLC). Tout lòt reyaktif oswa dwòg yo te nan klas analyse.

Kilti selil ak tretman

Neuronal SH-SY5Ycells yo te jwenn nan ATCC yo te kenbe nan MEMsupplemented ak 10 pousan FBS, 100 KU/L benzylpenicilin, ak 100 mg/L streptomycins nan yon flacon kilti poly-L-lysine-kouvwi nan yon enkibatè imidite ak 5 pousan CO2 a 37 ºC. Mwayen kilti a te renouvle chak 2 a 3d. Selil yo te pretrete ak divès kalite konsantrasyon nan tubuloside B (1, 10, oswa 100 mg / L) pou 2 èdtan ak Lè sa a, trete ak 100 µg / L TNF pou 36 èdtan anvan analiz. Selil nòmal yo te konsidere kòm kontwòl la.

Analiz de viabilite selil

Vitabilite selil yo te detèmine pa itilizasyon yon tès MTT [20]. Selil yo te simen nan 96-plak byen nan 1 × 104 selil pou chak pi epi yo te grandi nan 70 pousan konfluyans nan mwayen kilti. Mwayen an te ranplase pa yon mwayen ki gen plizyè konsantrasyon nan tubuloside B pou 2 èdtan ak Lè sa a, ak TNF pou 36 èdtan. Yon total de 5 g/L MTT te ajoute nan chak pi apre 36 èdtan, ak kilti a kontinye enkubasyon pou yon lòt 4 èdtan nan 37 ºC. Apre yo te retire mwayen an, selil yo ak kristal lank yo te solubilize ak 200 µL dimethylsulfoxide (Me2SO), epi yo te mezire absorbans nan 570 nm lè l sèvi avèk yon lektè modèl ELX-800 microplate assay reader(One Lambda Inc).

Hoechst 33342 tach

Apre tretman ak tubuloside B ak/oswa TNF, selil yo te rekòlte ak fikse ak 4 pousan paraformaldehyde pou 30 minit nan 25 ºC, Lè sa a, lave ak pre-refwadi tanpon fosfat saline (PBS) twa fwa epi ekspoze a 10 mg/L Hoechst33342 nan chanm. tanperati nan fè nwa a pou 10 minit. Yo te obsève echantiyon yo anba mikwoskospi fliyoresan (Olympus RX 400) [21].

Analiz fragmentation ADN

ADN te extrait pa sèvi ak yon twous ekstraksyon ADN (Promega) selon enstriksyon manifakti a. Yon ti tan, yo te chaje yon echantiyon ADN 10µL sou 1.5 pousan jèl agaroz orizontal ki gen bromur etidyòm. Jèl yo te kouri nan 60 V pou 1 èdtan ak fragman ADN yo te vizyalize lè l sèvi avèk lumières UV [22].

Eksperyans obligatwa Annexin-V

Twous deteksyon apoptoz AnnexinV-FITC te itilize pou mare anexin-V, ki gen yon gwo afinite pou fosfatidylserine epi li ka sonde pou apoptoz [23]. An brèf, selil yo te rekòlte ak sispann nan tanpon obligatwa nan yon konsantrasyon selil final nan 1 × 106 selil / ml. Apeprè 1 × 105 selil yo te enkube nan fè nwa a ak anexin-V ak yòd propidium pou 15 min. Lè sa a, sispansyon an te analize ak itilizasyon yon FACS eskanè sitomèt koule (Becton Dickinson, Heidelberg, Almay). Annexin-VFITC ak fliyoresans ki gen rapò ak yodidyòm yo te anrejistre sou FL1-H (525 nm) ak FL2-H (575 nm) filtè, respektivman.

Tès aktivite kaspas-3

Yo te detekte aktivite Caspase-3 grasa itilizasyon twous tès Apo-ONETM HomogeneousCaspase-3 (Promega). Yon ti tan, selil yo te simen nan 96-plak byen nan 1 × 104 selil / pi. Apre yo fin ekspoze a plizyè konsantrasyon tubulosideB ak/oswa TNF, selil yo te lave ak PBS ki frèt. Apre sa, yo te melanje 1 µL Z-DEVD-R110 ak 99 µL tanpon caspase pou fè reyaktif caspase-3omojèn. Yo te ajoute yon total de 100 µL reyaktif omojèn caspase-3 nan chak pi. Kontni yo te dousman melanje ak enkube pou 4 èdtan nan tanperati chanm nan fè nwa a. Entansite fluoresans substrate Z-DEVD-R110 te mezire nan yon longèdonn eksitasyon 498 nm ak yon longèdonn emisyon 521 nm ak itilizasyon yon espektrofluoromèt mikroplak (Wallac Victor2TM 1420 Multilabel Counter, USA).

Detèminasyon intraselilè nivo ROS intraselilè

Nivo ROS yo te mezire ak itilizasyon metòd tach fluorescent H2DCFDA [24]. H2DCFDA se yon konpoze ki pa polè ki konvèti nan yon derive polè ki pa fliyoresan (H2DCF) pa esteraz selilè apre enkòporasyon nan selil yo. H2DCF se manbràn enpèmeyab ak rapidman soksid nan 2,7-dichlorofluorescein (DCF) trè fliyoresan nan prezans ROS intraselilè [25]. Selil ki kiltive sou kouvèti vè nan chak gwoup yo te enkube pou 30 min a 37 ºC ak H2DCFDA 20 µmo/L ki fonn nan PBS. Lè sa a, Coverslips yo te lave twa fwa ak PBS ak analize anba mikwoskòp lazè konfokal (Leica, Almay). DCF te eksite nan 488 nm, ak filtè emisyon an te yon filtè baryè 510 nm. Entansite fliyoresan ak imaj mikwoskopik lazè konfokal yo te kenbe konstan pou pèmèt konparezon entansite fliyoresan relatif ant kontwòl ak selil eksperimantal yo.

Egzamen potansyèl manbràn mitokondriyo

Potansyèl manbràn mitokondriyo selil yo te sèten ak itilizasyon sond JC -1[26]. JC-1 ka antre nan mitokondri yo selektivman, ki parèt vèt nan konsantrasyon ki ba oswa potansyèl manbràn ba kòm yon monomè. Sepandan, nan gwo konsantrasyon, mitokondri yo montre tankou wouj fliyoresan total. JC-1 sansib a potansyèl manbràn mitokondriyo ak chanjman ki fèt nan rapò ant fluoresans vèt ak wouj ka bay enfòmasyon konsènan potansyèl manbràn mitokondriyo a. Apre selil trete yo te chaje ak JC-1 1 µmol/L pou 10 min nan 37 ºC, lank fliyoresan an te eksite nan 490 nm, epi entansite fliyoresan tou de monomè ak molekil total yo te anrejistre nan 590 nm anba yon konfokal. mikwoskòp lazè eskanè.

[Ca2 plis ]i mezi

Yo te detèmine konsantrasyon gratis nan kalsyòm intraselilè ([Ca2 plis ]i) nan selil SHSYY ak pwofonde Indo-1 nan swiv metòd ki dekri pa Rego et al [27]. Apre tretman TNF (nan prezans oswa absans tubuloside B), selil SHSYY yo te chaje ak 3 µmol Indo-1/AM nan MEM pou 45min, nan 37 ºC ak plis enkubasyon pou 15 minit nan MEM pou pèmèt idroliz la. acetoxymethyl ester précurseur nan sond la. Apre rense ak solisyon sodyòm saline (avèk 1.5 mmol / L CaCl2), yo te mezire fliyoresans selilè nan 37 ºC nan yon espektwomèt luminesans, ak eksitasyon nan 335 nm ak emisyon nan 410 nm. [Ca2 plis ] mwen te kalkile dapre ekwasyon an:

[Ca2 plis ]i=250 nmol/L×[(F-Fmin)/(Fmax-F)] (nmol/L),

kote 250 nmol/L koresponn ak konstan disosyasyon konplèks Indo-1–Ca2 plis, Fmax se fliyoresans maksimòm ki jwenn lè w ajoute 3 ¦Ìmol/Lionomycin, ak Fmin se fliyoresans minimòm ki detèmine apre ekwasyon an: Fmin =AF plis 1/12(Fmax-AF), kote AF se otofluoresans yo jwenn lè w ajoute 3 mmol/L MnCl2.

Analiz estatistik

Rezilta yo te eksprime kòm mwayen ± SD nan valè triple pou chak eksperyans. Konparezon estatistik te enplike itilizasyon Student-S-test la. P<0.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

REZILTA

Efè tubuloside B sou mòfoloji nikleyè selilè

Yo te itilize tach Hoechst 33342 ki sansib a ADN pou evalye chanjman nan mòfoloji nikleyè apre tretman tubuloside B ak TNF. Nwayo yo nan selil nòmal yo te nòmal epi yo te montre difize tach kwomatin nan (Fig 1A). Sepandan, apre yo fin ekspoze a TNF 100 µg / L pou 36 èdtan, SH-SY5Ycells te sibi chanjman mòfolojik tipik nan apoptoz tankou kondansasyon chromatin ak nwayo ratresi (figi 1B). Yo te obsève yon diminisyon ki make nan selil yo pretrete ak tubuloside B (Fig 1C -1 E).

Efè neropwotektif nan tubuloside B sou viabilite selil yo

Apre enkubasyon ak TNF, apeprè 45.6 pousan nan selil yo te sibi lanmò apoptoz. Pre-tretman ak tubuloside B (1, 10, oswa 100 mg / L) diminye pousantaj lanmò selil la nan yon fason ki depann de dòz (pousantaj lanmò selil te 30 pousan, 19.5 pousan, ak 6.2 pousan, respektivman; Fig 2), men tubuloside B pou kont li pa te lakòz okenn sitotoksisite aparan (done yo pa montre).

Efè tubuloside B sou fwagmantasyon ADN

Apre ekspoze selil SH-SY5Y ak TNF pou 36 èdtan, yo te obsève yon nechèl ADN ki tipikman pwononse. Sepandan, selil pretretman ak tubuloside B inibit TNF-medyatè ADN nechèl, espesyalman nan konsantrasyon nan 100 mg / L, ki konplètman anpeche fwagmantasyon ADN (figi 3).

Efè tubuloside B sou ekspoze fosfolipid fosfatidilserin

Aksyon antiapoptotik tubuloside B te konfime tou lè yo mezire prezans fosfatidylserin sou manbràn selilè deyò a. Nan kontwòl la, apeprè 96.3 pousan nan selil yo an sante. Fig 4 te montre rezilta eksperyans obligatwa annexin-V pou mezire prezans fosfatidylserin sou manbràn selil deyò a. Pousantaj apoptoz la te 37.5 pousan apre tretman TNF (figi 4B), men pwopòsyon an diminye a 28.2 pousan, 19.29 pousan, ak 7.9 pousan ak 1, 10 oswa 100 mg/L tubulosideB pretretman, respektivman (figi 4C -4 E).

Efè inhibition nan tubuloside B sou fòmasyon ROS

Nan etid prezan an, yo te jwenn mikrografi lazè konfokal tipik nan selil SH-SY5Y pou 36h nan absans oswa prezans TNF ak tubulosideB. Nivo ROS ki te pwodwi nan selil TNF-induit ogmante ansibleman konpare ak kontwòl (figi 5B). Sepandan, entansite fliyoresans nan tubuloside B-trete selil diminye pa 16.2 pousan, 56.4 pousan, ak 89.7 pousan ak 1,10, oswa 100 mg / L tretman tubuloside B konpare ak selil TNF trete, respektivman (Fig 5C -5 E).

Efè tubuloside B sou potansyèl manbràn mitokondriyo

Selil kontwòl ki pa trete yo te montre anpil mitokondri ki tach klere ki emèt fliyoresans wouj-zoranj ak rapò wouj / vèt te 5.97± 0.21, ki te endike potansyèl manbràn nòmal segondè (figi 5A). TNF-tretman-induit yon tranzisyon nan pèmeyabilite mitokondri ak yon pèt enpòtan nan potansyèl manbràn (pwopòsyon wouj / vèt te 0.35± 0.02) (Fig 5B). Tretman TubulosideB anpeche efondreman nan potansyèl manbràn mitokondriyo pwovoke pa TNF nan SH-SY5Ycells ak ogmante dòz. Tubuloside B piti piti rekòmanse potansyèl manbràn mitokondriyo a ak ogmantasyon konsantrasyon jan sa endike nan reaparisyon nan tach mitokondriyo wouj (Fig6C -6E).Efè tubuloside B sou aktivite kaspas-3

Aktivite kaspas-3 te ogmante apeprè senk fwa konpare ak kontwòl apre ekspoze TNF (figi 7). Kontrèman, selil SH-SY5Y ki te pretrete ansanm ak tubuloside B 1, 10, oswa 100 mg/L te montre yon siyifikatif diminisyon nan aktivite kaspas-3 konpare ak selil TNF-Kreye nan menm pwen an (figi 7).

Efè tubuloside B sou nivo [Ca2 plis ]i

Nivo [Ca2 plus ] I nan selil TNF-induit ogmante ansibleman konpare ak kontwòl (kontwòl: 105.5±11.2nmol/L; 100 µg/L TNF: 238.4±18.9 nmol/L), ki te pasyèlman redwi pa pretreated ak tubuloside. B (10 oswa 100 mg/L) (figi 8).

DISKISYON

Cistanchessalsa(CA Mey) G Beck, yon sèl espèsCistancheski fè pati fanmi Orobanchaceae, se yon plant parazit natif natal nan nòdwès Lachin. Tij la nan plant sa a se yon medikaman tradisyonèl Chinwa enpòtan epi yo itilize pou defisi ren, lakòz fi, leukorrhea morbid, neurasthenia, ak konstipasyon senil akòz inèsi kolonik. Pi gwo konstitiyan aktif nan zèb sa a se phenylethanoid glycoside [28].Nan dènye ane yo, rezilta yo nan plizyè etid mete aksan sou fonksyon an nan tubuloside B nan fè pwomosyon divès aktivite famasi ak byolojik [13-15]. Sepandan, mekanis selilè ak molekilè ki kache aksyon yo pa konplètman konprann. Etid la te demontre ke tubuloside B te gen efè neuroprotective siyifikatif sou apoptoz TNF-induit nan selil SH-SY5Yneuronal yo nan kenbe fonksyon mitokondriyo a, diminye jenerasyon ROS, diminye nivo kalsyòm intraselilè, ak anpeche aktivite kapase -3 atravè. yon mekanis antioksidasyon. Mekanis sa yo ka atravè efè neuroprotective endividyèl tubuloside B oswa entèraksyon li yo ak lòt faktè ak Lè sa a, ka mennen nan yon rapò diminye nan apoptoz nan selil yo.

Etid anvan yo te montre ke oksidan oswa pro-oksidan yo se regilatè enpòtan nan apoptoz epi yo ka pwovoke apoptoz [29,30]. Estrès oksidatif se yon eleman komen nan apoptoz pwovoke pa stimuli divès kalite tankou TNF ak ekspoze toksin nan anviwònman an, ki anjeneral pa fè egzèsis yon aksyon oksidan dirèk. Wòl santral la nan estrès oksidatif nan apoptoz fòtman sipòte pa kapasite nan divès kalite antioksidan selilè yo bloke apoptoz pwovoke pa ajan divès [31]. Konpoze ak pwopriyete antioksidan ta ka gen yon efè pwoteksyon nan diferan sitiyasyon nan malfonksyònman selilè atravè scavenging nan radikal gratis [32]. Anplis, plizyè glikozid phenylpropanoid yo te rapòte yo posede pwopriyete radikal gratis ak pwoteje blesi toksik oksidatif estrès-induit. Nan liy ak lide sa a, nou te jwenn ke tubuloside B diminye nivo a nan ROS pwovoke pa TNF, li ta ka pwoteje newòn kont apoptoz pa dirèkteman scavenging entraselilè espès oksijèn reyaktif.

Anpil prèv sijere ke gwo chanjman nan fonksyon mitokondriyo yo te enplike kritik nan pwosesis apoptotik la [33]. Twoub omeyostaz kalsyòm ak chanjman nan potansyèl manbràn mitokondriyo yo te jwenn ankouraje ouvèti pò tranzisyon pèmeyabilite mitokondriyo a (MPTP) oswa pwovoke cytochrome c lage atravè mekanis MPTP-endepandan, yo te dirèkteman responsab pou aktivasyon an nan kaskad apoptotik la epi yo ka anvan nikleyè. siy apoptoz [34]. Chanjman byochimik sa yo ka lakòz altènasyon nan fonksyon mitokondri yo [35]. Reyalite yo ke tubuloside B anpeche rediksyon nan potansyèl manbràn mitokondriyo ak redwi ogmantasyon nan kalsyòm entraselilè pwovoke pa TNF sijere ke tubuloside B ka gen kapasite nan kontrekare toksisite nan TNF pa anpeche ouvèti MPTP ak siprime malfonksyònman nan mitokondri.

Eksteryè stimuli ka kòmanse apoptoz atravè mekanis ki anwo yo epi yo ka konvèje sou chemen kaspase pou egzekite faz final pwosesis apoptoz la [36]. Fanmi caspase nan proteaz yo konsiste de omwen 14 manm mamifè ki konstititifman eksprime nan prèske tout kalite selil kòm proenzymes inaktif (zymogens) ki vin trete ak aktive an repons a yon varyete de stimuli pro-apoptotik [37].Caspase{{4 }} se yon manm en nan kaspase a epi li aji kòm yon efèktè santral nan faz ekzekisyon an. Lè caspase-3 pwoteyin précurseur CPP32 aktive pa siyal en tankou liberasyon mitokondriyo cytochrome c, kaspas aktif la-3konnen rezidi aspartat espesifik nan pwoteyin ak divès kalite estriktirèl, antretyen, ak fonksyon regilasyon[{{ 8}}]. Evènman pwoteolitik sa yo ka mennen nan apoptoz selil epi kontribye nan fwagmantasyon ADN ak chanjman mòfolojik nikleyè. Kidonk, sibstans ki ka anpeche aktivite kaspas -3 ta ka pwoteje selil yo kont apoptoz [2,31]. Piske tubuloside B te anpeche aktivite kaspas-3 nan selil trete TNF yo, li gen kapasite neropwotektif.

An konklizyon, tubuloside B te gen yon efè pwoteksyon miltifonksyon sou newòn domaje. Akòz aktivite pwisan anti-apoptoz ak antioksidatif estrès li yo, li ta ka pou itilize klinik nan andikap neurodegenerative ak newolojik ki enplike apoptoz newòn.