Kantifikasyon dejenerasyon nerit ak presizyon ak efikasite amelyore nan yon modèl in vitro nan maladi Parkinson Pati 2

Rezilta yo

Etablisman yon modèl kilti selil nan koripsyon nerit ki asosye ak PD

Pou devlope yon metòd pou mennen ankèt sou koripsyon nerit nan yon modèl kilti selil PD, nou te itilize selil LUHMES kiltive, yon popilasyon selil mesencephalik imen imòtalize kondisyonèl. Apre diferansyasyon, selil LUHMES vin postmitotik, adopte yon pwofil ekspresyon jèn ki karakteristik newòn dopaminèjik ki gen matirite, epi devlope yon mòfoloji newòn ak neurit ki pwolonje jiska 500 mm nan longè (Fig. 1A; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011; Kraemer et al., 2021).

Neurodegeneration, yon kondisyon kote selil nève yo mitasyon oswa mouri, gen rapò ak memwa. Nan modèl kilti selil, nou ka kontwole kondisyon kilti yo pou soulaje ekspresyon neurodegeneration e konsa amelyore pèfòmans memwa.

Etid yo montre ke omeyostazi selil nè yo jwe yon wòl enpòtan nan siviv selil ak fonksyon sistèm. Nou ka amelyore estabilite selil yo lè nou kontwole faktè tankou eleman nitritif ak faktè kwasans nan mwayen kilti a. An menm tan an, peye atansyon sou kenbe pwòpte ak kontwòl tanperati anviwònman kilti a pou anpeche selil yo detounen ak domaje nan anviwònman an.

Anplis de sa, nan modèl kilti selil la, nou ka tou enjekte sèten konpoze oswa dwòg nan selil yo pou diminye ekspresyon neuromodulation, kidonk amelyore pousantaj siviv ak pèfòmans memwa selil yo. Teknik sa a se lajman itilize tou nan etid la nan maladi neurodegenerative.

Nan ti bout tan, neurodegeneration gen yon enpak enpòtan sou estabilite selilè ak fonksyon sistèm, ak teknoloji kilti selil se yon bon metòd rechèch modèl, ki ka fè eksplorasyon pwofondè ak rechèch sou relasyon ki genyen ant neurodegeneration ak memwa. Nou ka soulaje pèfòmans neuromodulation pa kiltive kontwòl anviwònman an, enjekte dwòg nan selil, elatriye, amelyore siviv selil ak pèfòmans memwa epi bay yon baz pi konplè pou etid la nan maladi neurodegenerative. Li ka wè ke nou bezwen amelyore memwa nou an. Cistanche ka siyifikativman amelyore memwa nou an, paske Cistanche kapab tou kontwole balans nerotransmeteur, tankou ogmante nivo asetilkolin ak faktè kwasans, ki trè enpòtan pou memwa ak aprantisaj. Anplis de sa, vyann kapab tou amelyore sikilasyon san ak ankouraje livrezon oksijèn, sa ki ka asire ke sèvo a resevwa ase nitrisyon ak enèji, kidonk amelyore vitalite ak andirans nan sèvo a.

Klike sou konnen sipleman pou amelyore memwa

Akòz kalite siperyè optik vè konpare ak plastik, kilti yo te etabli sou glisad vè ki gen uit chanm medya yo. Baze sou rapò anvan yo (Lotharius et al., 2005; Scholz et al., 2011; Kurowska et al., 2014), nou te eseye etabli kilti sou glisad chanm kouvwi ak PLO ak fibronectin; sepandan, kilti sa yo te montre defisi adezyon ak rantabilite ki ba. Kòm yon rezilta, nou teste si kouch ak substrats adisyonèl ta amelyore viabilite nan kilti selil LUHMES etabli sou sifas vè.

Kilti selil LUHMES yo te etabli sou glisad ki te swa san kouvwi oswa kouvwi ak PLO ak fibronectin, PDL ak laminin, oswa yon konbinezon de tout kat substrats. Analiz nwayo solid pa mikwoskospi fluoresans te revele ke kouch glise siyifikativman afekte viabilite kilti yo [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001], ak analiz konparezon miltip post hoc ki revele ke glise. kouvwi ak yon konbinezon de tout kat substrats susmansyone bay yon pousantaj siyifikativman pi wo nan selil solid lè yo konpare ak glisad sèlman kouvwi ak PLO ak fibronectin (p=0.0437; Fig. 1B, C).

Apre idantifye substrats kouch pi bon pou kiltive selil LUHMES sou glisad vè, nou evalye efè dansite selil yo sou konvnab kilti yo pou mezi koripsyon neurite. Selil LUHMES yo te kiltive nan yon mwayen diferansyasyon ak dansite plating 57,500 selil pou chak pi, 115,000 selil pou chak pi, oswa 230,000 selil pou chak pi, ak nan senkyèm jou yo nan diferansyasyon, selil yo. yo te fikse ak 4% PFA ak imaj pa mikwoskòp faz-kontras.

Yon dansite 57,500 selil pou chak pi te lakòz kilti ki gen neurit mal rezo ak mòfoloji neriti iregilye, pandan y ap kilti yo te etabli ak yon dansite plaking nan 230,000 selil, byenke solid, ki te genyen dansite nerit twò wo pou mezi neriti egzat. Dansite selil entèmedyè nan 115,000 selil pou chak byen bay gwo viabilite ak byen separe axon tracts fezab nan mezi egzat neurit koripsyon (figi 1D).

Pou fè modèl dejenerasyon neriti ki asosye ak PD an vitro, nou te ekspoze selil LUHMES diferansye yo ak 6-OHDA, yon nerotoksin lajman itilize ki ankouraje estrès oksidatif ak koripsyon newòn katekolaminèrjik (Bové and Perier, 2012). Ekspozisyon selil LUHMES diferansye yo nan 6-OHDA ankouraje yon ogmantasyon depandan dòz nan dejenerasyon nerit, ak 5.0 mM 6-OHDA ak 7.5 mM 6-OHDA pwovoke dejenerasyon neurit modere ak grav, respektivman (Fig. . 2F). Pou evalye dejenerasyon neriti nan kilti selil LUHMES ki ekspoze a 6-OHDA, nou te itilize yon metòd lajman site kote imaj kilti ki gen kontras faz yo binarize, yo retire kò selil yo nan imaj yo nimerik, epi algorithm analizè patikil la. ImageJ aplike pou mezire zòn fragman neurit yo. Lè sa a, zòn nerit fragmenté yo adisyone epi divize pa zòn total neurit la pou detèmine yon DI (Fig. 2A–E; Sasaki et al., 2009; Kraemer et al., 2014; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2015; ., 2018; Geisler et al., 2019).

Kòm espere, ekspoze selil LUHMES diferansye yo nan 6- OHDA te lakòz yon ogmantasyon ki depann de dòz la nan DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374; Fig. 2G). Sepandan, pandan analiz selil yo ekspoze a 6-OHDA, nou te obsève plizyè pwoblèm ki te parèt gen yon enpak negatif sou presizyon ak efikasite mezi DI yo. Kidonk, nou te chache optimize metòd komen sa a pou fè mezi DI, ke nou refere kounye a kòm metòd tradisyonèl DI, pou jenere yon pwotokòl ki fasilite mezi pi efikas nan fwagmantasyon neurite.

Diminye fwagmantasyon atifisyèl ki asosye ak binarizasyon mikrograf

Pandan w ap itilize metòd DI tradisyonèl la, nou souvan obsève yon pwoblèm nan ki neurit entak nan imaj kontras faz parèt fragmenté nan imaj binaris ki koresponn yo (Fig. 3A). Fragmantasyon atifisyèl sa a te afekte prensipalman neurit ki gen anpil enpòtans. Kidonk, nou te envestige si pwoblèm nan ta ka redwi pa pwosedi ki amelyore kontras imaj la. Pou amelyore kontras imaj, nou te premye kaptire imaj neurit lè l sèvi avèk yon varyete entansite limyè pou detèmine nivo klète imaj ki ta pwodui kontras optimal.

Imaj ki te kaptire ak entansite limyè optimal la te sibi plis amelyorasyon kontras lè l sèvi avèk ImageJ pou aplike yon LUT ak valè entansite minimòm ak maksimòm 90 ak 205, respektivman. Enkòporasyon amelyorasyon kontras sa yo bay yon reprezantasyon modera pi egzak nan neurit yo nan imaj binarize ki te pwodwi nan imaj kontras faz (figi 3B). Men, analiz quantitative nan imaj binarize nan neurites an sante endike ke amelyorasyon kontras yo pa t 'siyifikativman diminye fwagmantasyon atifisyèl (p=0.9999; Fig. 3D). Kidonk, nou te envestige si wi ou non itilizasyon imaj imunofluoresans ta pwodui imaj ki gen yon kontras siperyè epi kidonk fasilite pwodiksyon imaj neriti binarize ki pi egzak ak fwagmantasyon atifisyèl redwi.

Glisad yo ki dekri nan Figi 2, ki gen selil LUHMES fiks yo ekspoze a divès konsantrasyon 6- OHDA, yo te iminoteye pou pwoteyin sitoskeletal b III-tubulin, imaje lè l sèvi avèk mikwoskòp fluoresans, epi analize pa yon envestigatè avèg pou fwagmantasyon atifisyèl. . 3C). Analiz kantitatif imaj binarize yo te jwenn nan mikwograf fluoresans ak mikwograf kontras faz ki koresponn yo te revele ke kalite mikwoskòp la afekte nivo fwagmantasyon atifisyèl [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . Espesyalman, mikrograf fliyoresan yo te pwodwi imaj binarize ak siyifikativman redwi fwagmantasyon atifisyèl konpare ak sa yo ki soti nan mikrograf faz-kontras (p=0.0016; Fig. 3D).

Kòm yon rezilta, imaj kilti ki an sante yo te bay nòt DI siyifikativman pi ba lè yo te itilize mikwograf fluoresans olye ke mikwograf kontras faz (F(1,8)= 131.4, p=0.{{12} }001, R2=0.1442; Fig. 3E). Anplis, yon tandans jeneral remakab se ke chanjman pliye ant valè DI mwayen ki asosye ak kilti ki an sante (trete ak machin) ak kilti ki montre koripsyon neriti (5.0 oswa 7.5 mM 6-OHDA-trete) te pi gwo lè yo mezire lè l sèvi avèk mikrografi fluoresans. pase lè yo jwenn nan mikrograf kontras faz (figi 3E). Sa te fèt malgre mikrografi fluoresans nan kilti ki gen dejenerasyon neurit modere (pwovoke pa ekspoze a 5 mM 6-OHDA) ki gen nòt DI siyifikativman pi ba pase imaj faz korespondan yo akòz rediksyon nan fwagmantasyon atifisyèl (p=0.0001). , d=0.6312).

Optimize paramèt pou deteksyon neurit fragmenté ak total neurit
Metòd tradisyonèl pou fè mezi DI enplike itilizasyon Plugin Analyse Particles pou ImageJ ak paramèt gwosè 20 10,000 piksèl pou detekte fragman neurite. Sepandan, nou te obsève ke yon gwo pwopòsyon nan fragman neurit pa detekte pa analizè patikil la lè w ap itilize paramèt sa yo lajman site (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2016. , 2020; Shin and Cho, 2020) pou mezire koripsyon nerit nan mikrograf kontras faz nan selil LUHMES ki ekspoze a 6-OHDA, ki pwodui jan sa dekri nan Figi 2.

Kidonk, nou re-analize imaj ki soti nan seri done sa a lè l sèvi avèk diferan limit gwosè minimòm pou deteksyon patikil yo detèmine paramèt yo pi bon pou idantifikasyon fragman neurit. Soti nan evalyasyon kalitatif nan imaj binarize ki te pwodwi nan mikrograf kontras faz, paramèt gwosè 5-10,000 piksèl amelyore deteksyon an nan fragman neurit, men yo te asosye tou ak move idantifikasyon nan bri background, zafè imaj, oswa lòt ti kras. materyèl ki pa neurite kòm fragman neurite. Konpare ak paramèt yo lajman itilize nan 20-10,000 piksèl, sepandan, paramèt nan 10-10,000 piksèl amelyore deteksyon an nan fragman neurite san yo pa yon ogmantasyon notables gwo nan fo pozitif (Fig. 4A). , agoch).

Yo te fè analiz menm jan an tou ak imaj binarize yo te jwenn nan mikrograf fliyoresan selil LUHMES ki te gen imunolabeled pou b III-tubulin. Paramèt gwosè analizè patikil 5-10,000 piksèl yo te fasilite deteksyon ki pi sansib nan fragman neurit epi, piske mikrograf fluoresans yo te gen mwens ti debri, paramèt sa yo pa t 'siyifikativman ogmante move idantifikasyon nan materyèl ki pa neurite kòm fragman neurit. (Fig. 4A, adwat).

Metòd tradisyonèl pou fè mezi DI, lè w itilize paramèt gwosè analizè patikil 20–10,000 piksèl, ekskli objè ki pi piti pase 20 piksèl nan mezi fragman neurite.

Sepandan, ti objè sa yo tipikman erè enkli nan mezi zòn total neurite yo, depi metòd tradisyonèl mezi DI a enplike nan kalkile zòn total neurite pa sòm tout piksèl nwa nan imaj binarize yo. Pou simonte pwoblèm sa a, nou te itilize Plugin Particle Remover pou ImageJ, devlopè ImageJ Wayne Rasband ekri, pou retire ti objè ki pa neurite nan imaj binarize yo. Aplikasyon plugin sa a pandan w ap fè mezi DI lè l sèvi avèk mikrograf kontras faz nan selil LUHMES ki ekspoze a 6-OHDA, ki te pwodwi jan sa dekri nan Figi 2, te lakòz yon ogmantasyon siyifikatif nan mezi DI atravè tout konsantrasyon ekspoze nerotoksin (F(1). ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
Anplis de sa, yon entèraksyon enpòtan endike ke ogmantasyon nan DI ki te koze pa itilize nan retire patikil la te vin pi fò nan pi gwo konsantrasyon (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094; Fig. 4B, C). Nou menm tou nou imajine menm glisad selil yo pa mikwoskospi fliyoresan epi evalye efè retire ti patikil yo sou mezi DI yo jwenn nan mikwoskòp fluoresans. Pandan ke retire ti patikil bay valè DI ki teyorikman pi egzak, valè sa yo an mwayèn pa t 'siyifikativman diferan de sa yo te jwenn san yo pa itilize nan Plugin nan retire patikil lè yo mezire lè l sèvi avèk mikrograf fluoresans (F(1,8)=2. 613, p=0.1446, R2=0.0013; Fig. 4D).

Otomatik mezi DI nan mikrograf fluoresans

Pèfòmans mezi DI lè l sèvi avèk metòd tradisyonèl la mande pou pwosesis imaj fatigan ak tan konsome, itilizasyon zouti freehand pou retire kò selil endividyèl yo nimerik epi mezire zòn nerite fragmenté ak total nerite nan chak imaj. Kidonk, nou te chèche amelyore efikasite metòd la lè nou ekri yon makro ki konplètman otomatize analiz DI. Pou otomatize retire soma a, makro a, ki gen tit ANDI, egzekite binarizasyon imaj nwayo selil yo, ki make atravè DAPI tach nikleyè a, ki te swiv pa modifikasyon imaj la binarize konsa ke rejyon nikleyè papòt yo elaji pou kouvri tout rejyon an nan soma a. Imaj sa yo ak nwayo binarize ak elaji yo Lè sa a, soustraksyon nan mikrograf fluoresans korespondan nan newòn imunolabeled pou b III-tubulin, jenere yon imaj sèlman prezante neurites (Fig. 5A, B).

Pou ajiste pou gwosè nikleyè varyab ki te koze pa kontraksyon nikleyè oswa fwagmantasyon ki asosye ak neurodegeneration, imaj binarize nwayo yo elaji atravè yon konbinezon de dilatasyon ak ewozyon ki konbine fragman nikleyè ak elaji rejyon binarize yo okipe yon zòn ki pi gwo pase somas yo nan selil LUHMES diferansye. . Imaj ki gen sèlman neurit yo Lè sa a, binarize ak sibi analiz DI atravè yon seri de fonksyon otomatik (Fig. 5C, D). Pou evalye presizyon nan operasyon yo makro ki asosye ak retire soma nan imaj, nou konpare nòt yo DI yo te jwenn apre yo retire manyèl kò selil yo nan mikrograf fluoresans lè l sèvi avèk zouti a freehand nan ImageJ (jan deja montre nan Fig. 4D), ak nòt DI. pwodwi nan analiz de imaj ki idantik apre retire otomatik selil kò lè l sèvi avèk operasyon yo retire soma prezante nan ANDI Macro a. Analiz nou yo te revele ke nòt DI yo kalkile lè l sèvi avèk retire kò selil otomatik ki gen rapò ak prèske menm jan ak mezi DI yo te jwenn nan imaj ki sibi manyèl retire soma (r (34)=0.98 0, p, 0.0001; Fig. 5E).

Pou ogmante presizyon nan analiz yo, nou enkòpore plizyè nan ajisteman ki dekri deja ki amelyore mezi DI nan ANDI. Makro a prezante operasyon amelyorasyon kontras, itilizasyon Plugin Particle Remover la pou retire matyè ki pa neurite nan imaj neurite ak matyè ki pa nikleyè nan imaj nwayo yo, ak deteksyon fragman neurite lè l sèvi avèk paramèt gwosè 5-10, 000 pou Plugin analize patikil yo.

Nou te ipotèz ke, kolektivman, itilizasyon mikwoskospi fliyoresan, operasyon amelyorasyon kontras, retire ti objè ak retire patikil la, ak paramèt optimize pou deteksyon patikil ta kontribye nan mezi pi egzak nan koripsyon nerit. Pou teste ipotèz sa a, yo te analize imaj kontras faz selil LUHMES ki te ekspoze a divès konsantrasyon 6-OHDA, ki te pwodwi jan sa dekri nan Figi 2 a, pa fè nòt avèg ak subjectif lè l sèvi avèk yon seri valè ant 0. 0 ak 1.0, ak valè ki reprezante pwopòsyon aparan nan zòn neurit fragmenté. Lè sa a, nou evalye korelasyon ki genyen ant nòt subjectif yo ak mezi DI yo jwenn atravè metòd tradisyonèl la, osi byen ke korelasyon ki genyen ant nòt subjectif yo ak mezi DI yo jwenn lè l sèvi avèk ANDI Macro a.

Pandan ke mezi DI yo te jwenn lè l sèvi avèk metòd tradisyonèl la korelasyon ak nòt subjectif (r {{0}}.7850, p,0.0001; Fig. 5F), ANDI Macro a bay mezi ki korelasyon pi plis fòtman ak evalyasyon subjectif (r 2=0.978, p, 0.0001; Fig. 5G). Konparezon estatistik dirèk te revele ke nòt yo te jwenn atravè ANDI Macro a te gen rapò siyifikativman pi fò ak evalyasyon subjectif pase nòt yo te jwenn atravè metòd tradisyonèl la (z=6.626, p, 0.0001; Fig. 5F, G). Analiz plis revele ke macro a fasilite pèfòmans nan mezi DI ak amelyorasyon gaya ak enpòtan nan efikasite tan. Analiz DI ki te fèt lè l sèvi avèk ANDI Macro te mande yon tan mwayèn 12.75 s pou chak imaj analize, konpare ak yon tan mwayèn 5.27 min pou chak imaj analize atravè metòd tradisyonèl la [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. Ansanm, rezilta sa yo endike ke ANDI bay jenerasyon rapid DI mezi ki, konpare ak nòt yo jwenn atravè metòd tradisyonèl la, pi byen apwoksimatif dejenerasyon an ke envestigatè yo wè nan analiz kalitatif nan imaj nerite.

Apre yo fin detèmine presizyon ak efikasite Macro ANDI a pou mezire koripsyon nerit nan selil LUHMES diferansye ki ekspoze a 6-OHDA, nou evalye makro a apwopriye pou eksperyans ki enplike lòt modèl kilti selil yo. Yo te fè yon etid pilòt premye pou evalye presizyon ANDI nan fè mezi DI lè l sèvi avèk mikrografi kilti senpatik prensipal ki gen imunolabel pou b III-tubulin ak DAPI. Enteresan, sepandan, kò selil yo nan newòn senpatik yo pi gwo pase sa yo ki nan selil différenciés LUHMES, e konsa operasyon yo nan ANDI ki gen rapò ak otomatik retire soma pa t 'retire antye nan soma a (done yo pa montre).

Pou simonte pwoblèm sa a, nou te revize ANDI pou prezante yon bwat dyalòg ki pèmèt itilizatè yo chwazi gwosè a nan retire soma a lè yo kontwole kantite fwa ke mikrografi binarize nan nwayo yo dilate. Lè sa a, vèsyon ANDI sa a, vèsyon 1.1, te itilize pou fè mezi DI nan mikrografi ki dekri newòn senpatik ki an sante, trete ak veyikil oswa dejenere newòn senpatik ekspoze a oksijene idwojèn. Imaj newòn ki te ekspoze a oksijene idwojèn te bay nòt DI siyifikativman pi wo konpare ak imaj newòn trete machin yo (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301; Figi 6A, C). Anplis, nou te konpare nòt DI sa yo ke yo te jwenn lè l sèvi avèk ANDI ak mezi DI yo te jwenn nan menm seri imaj la apre yo te retire manyèl kò selil yo nan mikrografi fliyoresan yo lè l sèvi avèk zouti Freehand ImageJ la. Pa te gen okenn diferans enpòtan nan nòt DI yo kalkile apre yo fin retire soma manyèl konpare ak nòt yo te jwenn lè l sèvi avèk ANDI (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0. 0000; Fig. 6A–C). Tès post hoc yo te konfime tou ke nòt DI yo te jwenn lè l sèvi avèk ANDI pa t siyifikativman diferan nan ka newòn ki pa trete (p=0.0972) ak nan ka newòn ki ekspoze a oksijene idwojèn (p=0. 9986).

Anplis de sa, nòt DI ki pwodui nan ANDI te gen rapò prèske menm jan ak nòt DI yo te jwenn apre yo fin retire kò selil yo nan mikwograf korespondan yo (r(34)=0.991, p, 0.0001). Done sa yo demontre ke ANDI apwopriye pou mezire koripsyon newòn nan kilti newòn prensipal yo, ak operasyon retire soma ke itilizatè a ka Customized matche ak diferan kalite newòn. Anplis de sa, deteksyon fragman nerit nan kilti ki ekspoze a oksijene idwojèn demontre aplikasyon makro a pou itilize nan eksperyans ki enplike koripsyon nerit ki pwovoke pa lòt sous ke 6-OHDA. Pou plis verifye itilizasyon ANDI nan detekte koripsyon nerit ki asosye ak plizyè kòz, nou menm tou nou itilize makro a pou mezire koripsyon neurit nan mikrografi kilti senpatik ki an sante oswa kilti ki sibi retrè NGF. Kòm espere, imaj kilti ki te sibi retrè NGF te bay valè DI siyifikativman pi wo konpare ak imaj kilti ki an sante (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958; Fig. 6D, E). Ansanm, rezilta sa yo demontre ke ANDI ka itilize pou detekte koripsyon nerit ki asosye ak yon varyete kontèks byolojik.

Piske tach pou TH yo souvan itilize pou vizyalize newòn katekolaminèrjik, nou menm tou nou evalye konvnab mikrograf ki dekri tach TH pou mezire koripsyon nerit lè l sèvi avèk ANDI. Kilti nan newòn senpatik ki an sante trete ak solisyon machin oswa dejenere newòn senpatik ki ekspoze a oksijene idwojèn yo te fiks ak sibi etikèt imunofluoresan pou TH ak b III-tubulin, osi byen ke counterstaining pou DAPI. Lè sa a, yo te kaptire imaj neurite ki montre tach pou TH oswa b III-tubulin, ak imaj ki koresponn nan nwayo ki gen etikèt DAPI, yo te kaptire nan menm jaden yo de vi. ANDI te egzekite, ak imaj yo prezante tach TH oswa b III-tubulin tach yo te chwazi kòm imaj yo nerite. Analiz nou yo te revele ke nòt DI yo te jwenn lè l sèvi avèk imaj tach TH te korelasyon trè fò ak nòt yo te jwenn nan imaj tach b III-tubulin (r(28)= 0.962, p, 0.0001; Fig. .6F, G). Done sa yo endike ke ANDI ka jwenn mezi DI egzak lè l sèvi avèk pwosedi tach altènatif ki make tout neurit yo, tankou imunolabeling pou TH.

Pou demontre itilite metòd amelyore pou fè mezi DI nan yon eksperyans syantifik, nou te itilize nouvo metòd pou evalye wòl JNK nan koripsyon neurite estrès oksidatif nan selil mesencephalic imen yo. Selil LUHMES diferansye yo te pretrete pou 1 èdtan ak inibitè JNK SP600125 oswa solisyon machin. Lè sa a, selil yo te trete pou 24 èdtan ak 6- OHDA pou pwovoke estrès oksidatif oswa ak solisyon machin. Selil fiks yo te sibi imunolabeling pou b III-tubulin ak tach DAPI, epi yo te itilize ANDI pou jwenn mezi DI nan mikrografi fluoresans. Pandan ke kilti ki manke tretman anvan ak inibitè JNK la te montre koripsyon nerit apre yo te ekspoze a 6-OHDA, anpèchman JNK te lakòz yon rediksyon ki make e siyifikatif nan 6- OHDA-pwovoke dejenerasyon neriti (p= 0.0001). , d= 2.0209; Fig. 7). Konklizyon sa yo sipòte yon wòl kle pou siyal JNK nan koripsyon neurit pwovoke pa estrès oksidatif nan selil mesencephalic imen yo, e sa ki enpòtan, demontre itilite nouvo metòd nou an pou jenere dekouvèt syantifik nan fasilite mezi rapid ak egzat nan koripsyon neurit.

Diskisyon

Dejenerasyon Neurite asosye ak yon varyete kondisyon neropatolojik, men mekanis molekilè ki kache degradasyon neurit yo rete enkonplètman konprann. Metòd fasilite analiz egzat ak efikas nan koripsyon neurit yo esansyèl nan idantifikasyon siksè nan nouvo faktè reglemante evènman selilè enpòtan sa a. Nan etid sa a, nou revele plizyè sous erè ki asosye ak yon metòd souvan itilize pou quantifier dejenerasyon nerite. Nou rapòte done eksperimantal ki sipòte modifikasyon pwosedi ki ka aplike pou diminye erè analiz DI, epi modifikasyon sa yo enkòpore nan yon nouvo makro ImageJ pou bay yon zouti pou analiz DI rapid, egzat ak objektif lè l sèvi avèk sous louvri ak lojisyèl gratis. Anplis, nou demontre ki jan metòd amelyore yo ka aplike pou mezire koripsyon nerit nan yon modèl kilti selil nan PD, yon maladi nan ki fwagmantasyon axonal nan newòn dopaminèrjik se yon evènman bonè ki vin anvan pèt newòn evantyèlman (Tagliaferro and Burke, 2016). .

Nan etid sa a, nou demontre itilite ANDI Macro a nan mezire koripsyon nerit nan yon modèl kilti selil PD ki gen selil LUHMES diferansye ki ekspoze a 6-OHDA.

Nou rapòte rezilta eksperimantal ki sipòte substrats optimal yo sou ki kilti yo ta dwe etabli, osi byen ke demontre dansite nan plating ki pi apwopriye pou analiz dejenerasyon neurite. Itilizasyon sistèm modèl sa a pou etidye koripsyon neurite gen plizyè avantaj. Selil yo devlope neurit ki byen konekte ak tipikman .500 mm nan longè, ak kilti yo sansib a nerodejenerasyon pwovoke pa modèl klasik, nerotoksin nan PD tankou 6-OHDA, 1-methyl{{4 }} phenylpyridinium ion (MPP1), ak rotenone (Lotharius et al., 2005; Zhang et al., 2014; Smirnova et al., 2016; Kraemer et al., 2021). Anplis de sa, orijin imen an nan selil LUHMES ogmante tradiksyon nan konklizyon ki asosye ak modèl la, ak imortalizasyon nan kondisyonèl fasilite jenerasyon an rapid ak pwopagasyon nan kilti (Scholz et al., 2011). Kidonk, makonnen ak analiz otomatik ki fèt lè l sèvi avèk ANDI, selil LUHMES yo ka itilize pou fè dekouvèt roman ki gen rapò ak koripsyon neurit ki asosye ak PD pandan y ap fasilite debi konsiderableman pi wo konpare ak analiz ki pa otomatik ki fèt ak kilti prensipal newòn yo.

Plizyè gwoup rechèch te fè analiz DI lè l sèvi avèk imaj kontras faz pou jwenn yon konesans sou faktè ki kontwole koripsyon nerit (Press and Milbrandt, 20{{10}}9; Kraemer et al., 2014. ; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Geisler et al., 2019). Isit la, nou rapòte yon dezavantaj enpòtan ki asosye ak metòd sa a lajman itilize pou mezire koripsyon nerit: binarizasyon nan imaj kontras faz lakòz yon pwopòsyon enpòtan nan neurit entak parèt fragman. Pandan ke nivo nan kontras ki ka reyalize lè kaptire mikwograf varye selon sistèm mikwoskòp ki disponib pou envestigatè yo, pwoblèm sa a gaye nan mitan divès gwoup rechèch, kòm yon DI 0.2 souvan aksepte kòm yon papòt pi wo pase kilti yo konsidere yo gen dejenere. axons, ak pifò rapò syantifik ki prezante mezi DI ki soti nan mikrograf kontras faz yo rapòte nòt DI pou newòn ki an sante ant 0.1 ak 0.3 (Sasaki et al., 2009, 2016; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Loreto et al., 2020). Analiz DI nou yo jwenn nan mikrografi fluoresans, ansanm ak nòt subjectif nan men envestigatè avèg yo, endike ke 10-20% fwagmantasyon neurit pa komen nan kilti newòn ki an sante. Olye de sa, kilti sa yo montre sèlman 2.5% fwagmantasyon neurite an mwayèn. Kidonk, rezilta nou yo souliye nesesite pou metòd ki amelyore presizyon nan analiz dejenerasyon neurite lè yo diminye sous komen ak siyifikatif erè mezi sa a.

Pandan ke majorite syans ki enplike mezi DI yo te itilize imaj kontras faz pou fè analiz dejenerasyon nerit yo, plizyè gwoup rechèch te fèk fè mezi DI lè l sèvi avèk imaj newòn imunolabeled pou filaman cytoskeletal tankou neurofilament medyòm polypeptide oswa b-b-tubulin (Wakatsuki). et al., 2011; Li et al., 2017; Pease-Raissi et al., 2017; Hernandez et al., 2018; Sundaramoorthy et al., 2020). Sepandan, ki fòm mikwoskospi ki pi byen adapte pou mezi dejenerasyon nerit yo te rete klè, paske yo te bezwen envestigasyon pou konprann si chanjman ki fèt nan lokalizasyon pwoteyin cytoskeletal sa yo pandan koripsyon nerit yo kòmsadwa modèl chanjman total nan mòfoloji nerite, osi byen ke yo evalye. degre nan ki mezi DI yo te jwenn ak mikrograf fluoresans korelasyon ak mezi menm jan yo te jwenn nan mikrograf faz-kontras. Isit la, nou demontre ke mikrograf fliyoresan ki dekri b III-tubulin tach non sèlman reprezante avèk presizyon fwagmantasyon neurit, men tou, fasilite mezi DI pi egzak paske nan kontras siperyè yo ak diminye sansiblite nan fwagmantasyon atifisyèl sou binarizasyon. Kidonk, rezilta nou yo mete aksan sou itilite lè l sèvi avèk b III-tubulin tach pou mezire koripsyon nerit.

Pami etid yo pibliye ki enplike analiz DI pou mezire koripsyon nerit, gwosè yo rapòte ak paramèt sikilè yo itilize pou detekte fragman nerit yo te konsiderableman varye. Pa egzanp, yon etid resan ki enplike evalyasyon dejenerasyon nerit nan newòn ipokanp kiltive yo te itilize paramèt gwosè 4-9 00 piksèl (Li et al., 2017), pandan yon etid ki enplike newòn DRG kiltive yo te itilize paramèt deteksyon yo. 0–10,000 piksèl (Wakatsuki et al., 2011). Youn nan rezon potansyèl pou varyasyon sa yo se ke efikasite nan paramèt gwosè analiz patikil nan detekte fragman neurit varye depann sou rezolisyon an nan imaj la depi paramèt yo gwosè pou deteksyon patikil yo asosye ak inite pixel. Malerezman, pifò etid pibliye ki enplike analiz DI yo pa genyen yon deskripsyon rezolisyon imaj yo itilize pou analiz yo. Se konsa, etablisman an nan paramèt analiz estanda atravè yon pwotokòl ki konplètman divilge detay enpòtan tankou rezolisyon an imaj rekòmande yo te nesesè. Isit la, nou rapòte ke paramèt ki pi souvan site pou deteksyon fragman nerit, 20-10,000 piksèl (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2016; al., 2020; Shin and Cho, 2020), lakòz gwo kantite fragman newòn yo pa detekte. Diminye kritè gwosè minimòm pou deteksyon fragman neurit amelyore sansiblite deteksyon fragman, pandan y ap ogmante an menm tan kantite objè imaj ak debri ki pa neurite ki fo detekte kòm fragman neurite. Nan rechèch pou paramèt ki ta pi byen balanse sansiblite deteksyon ak pousantaj fo pozitivite, nou idantifye paramèt analiz 10-10,000 kòm ki bay deteksyon ki pi egzak nan fragman neurit nan imaj binarize yo jwenn nan mikrograf kontras faz, pandan y ap paramèt 5-10,000 fasilite deteksyon ki pi egzak nan fragman neurit nan imaj binarize yo jwenn nan mikrografi fluoresans. Pandan ke yo te fè detèminasyon sa yo lè l sèvi avèk yon rezolisyon imaj 1280 1024, paramèt sa yo ta dwe pèmèt tou deteksyon egzat fragman neurit nan imaj yo te kaptire nan lòt rezolisyon ki gen yon gwosè vètikal 1024 piksèl, tankou rezolisyon komen plen ekran an nan {{ 27}}, paske newòn ki dekri nan imaj sa yo ta gen menm gwosè pixel.

Anpil gwoup rechèch te itilize yon kritè gwosè minimòm lè yo konfigirasyon paramèt analiz patikil yo pou evite ti debri ki pa neurite yo pa enkli nan mezi fragman nerit (Shin et al., 2012; Cosker et al., 2013; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Li et al., 2017; Loreto et al., 2020; Shin and Cho, 2020; Sundaramoorthy et al., 2020). Sepandan, syans sa yo te erè enkli ti matyè ki pa fragman nan mezi zòn total neurite yo, paske mezi sa yo jwenn lè yo rezime zòn nan tout piksèl nwa nan imaj la. Isit la, nou demontre sèvis piblik la nan Plugin nan retire patikil yo retire ti, ki pa fragman debri nan imaj la anvan analiz DI. Itilizasyon plugin a siyifikativman ogmante sansiblite mezi dejenerasyon neurite yo jwenn nan imaj kontras faz yo. Kidonk, rezilta nou yo mete aksan sou valè Plugin Particle Remover pou envestigatè k ap fè analiz DI lè l sèvi avèk mikrograf kontras faz. Enteresan, mikrograf fluoresans prezante mwens ti, debri ki pa neurite, e konsa, yon kritè gwosè pi ba nan senk piksèl ta ka itilize pou deteksyon fragman. Pandan ke retire patikil nan debri ki pa neurite mwens pase senk piksèl nan gwosè pa t 'siyifikativman afekte mezi DI yo jwenn nan mikrograf fliyoresan, operasyon sa yo bay valè ki teyorikman pi egzak e Se poutèt sa yo te enkli nan ANDI.

Piske analiz DI yo dwe fèt lè l sèvi avèk imaj ki gen sèlman neurit, aplikasyon metòd analiz la te limite sitou pou itilize ak sistèm kilti ki kapab retire kò selilè yo, tankou kilti eksplant kote kò selil yo ka fizikman retire (Catenaccio et al. , 2017; Shin and Cho, 2020) oswa kilti nan aparèy mikrofluidik fasilite segregasyon soma ak konpatiman axon (Cosker et al., 2013; Pease-Raissi et al., 2017; Tan et al., 2018). Altènativman, fè analiz DI ak kilti disosye yo ka reyalize atravè travay fatigan ak tan konsome ki asosye ak retire dijital nan kò selil ki soti nan mikrograf (Kraemer et al., 2014). Nan etid sa a, nou revele ke ANDI pèmèt pèfòmans nan mezi DI soti nan mikwograf ki prezante selil LUHMES ki disosye ak mozayik-distribiye atravè yon sistèm kilti 2D. Konklizyon nou yo montre tou ke ANDI fasilite yon 24-diminisyon pliye nan tan ki nesesè pou fè analiz yo, epi operasyon yo nan ANDI ki gen rapò ak retire soma bay rezilta analiz DI ki korelasyon 98% ak analiz menm jan yo fèt apre retire soma manyèl lè l sèvi avèk la. zouti freehand nan ImageJ. Kidonk, makro a ogmante anpil efikasite nan analiz yo lè li fè otomatik retire soma atravè yon pwosesis ki pa sakrifye presizyon, ak operasyon sa yo elaji konvnab metòd la pou analize kilti dissociated ak kò selil mozayik distribye.

Anplis de sa nan fasilite otomatize retire kò selilè nan imaj, ANDI prezante plizyè revizyon nan metòd tradisyonèl la pou fè analiz DI, ki gen ladan itilizasyon mikrograf fluoresans, revize paramèt analiz patikil, ak itilizasyon retire patikil la pou retire ti debri ki pa neurite. soti nan imaj. Konklizyon nou yo endike ke optimize sa yo kolektivman bay valè DI ki pi byen apwoksimatif valè yo jwenn nan nòt avèg ak sibi. Kidonk, anplis diminye anpil tan ki nesesè pou fè analiz yo, ANDI fasilite mezi DI ki, konpare ak metòd tradisyonèl la, reflete pi byen koripsyon neurite ke envestigatè yo te obsève nan analiz imaj kalitatif.

Youn nan dezavantaj nan metòd tradisyonèl la pou fè analiz DI se ke analiz sa yo mande pou fòmasyon nan itilizasyon ImageJ pou itilizatè a abitye ak yon seri fatigan nan operasyon ImageJ. Anplis, pou fè analiz yo avèk efikasite, plis fòmasyon nesesè pou itilizatè a fè analiz pakèt oswa ekri scripts pou semi-otomatize ekzekisyon etap patikilye yo. Lè analiz la konplètman otomatize, ANDI fasilite mezi DI nan sèlman kèk etap ki gen rapò ak telechaje ak egzekite macro a. Pou ogmante convivialité, makro a gen ladan kòd pou bay yon koòdone pou chwazi repèrtwar ki gen imaj yo dwe analize, osi byen ke fasilite pwodiksyon an nan imaj rezilta ak tab done nan yon anyè ke itilizatè a chwazi. Anplis, script la gen anpil karakteristik ki fèt pou anpeche erè mezi oswa erè itilizatè yo, tankou netwaye otomatik rezilta ImageJ anvan yo; retire enfòmasyon echèl imaj pou asire mezi yo fèt avèk presizyon lè l sèvi avèk inite pixel; konfigirasyon apwopriye nan paramèt koulè ImageJ, paramèt mezi, ak paramèt analizè patikil; prezantasyon mesaj erè si itilizatè yo chwazi anyè ki gen yon kantite inegal imaj ki montre b III-tubulin tach ak tach DAPI; deskripsyon boutèy demi lit ki endike pwogrè analiz; ak kodaj pou anpeche ensèk ki asosye ak jenerasyon otomatik .ini fichye pa Windows 10. An jeneral, karakteristik sa yo fè analiz DI yo pi fasil pou itilize, sa ki ka ankouraje enterè nan etid ki gen rapò ak koripsyon neurite.

Pou demontre itilite li nan yon eksperyans, nou itilize ANDI pou evalye kontribisyon JNK nan koripsyon neurit nan kilti selil LUHMES ki ekspoze a 6-OHDA. JNK se yon kinaz aktive estrès ki te rapòte kòm kle nan koripsyon nerit nan newòn periferik ki gen orijin nonprimate (Shin et al., 2012), men plis etid yo bezwen konprann wòl kinaz la nan koripsyon nerit nan selil imen mesencephalic. . Isit la, nou demontre ke anpèchman nan JNK siyifikativman pwoteje selil mesencephalic imen soti nan koripsyon nerit ki asosye ak estrès oksidatif. Konklizyon sa yo pa sèlman revele yon wòl enpòtan pou JNK nan koripsyon nerit ki asosye ak yon modèl maladi imen, men tou montre itilite ANDI pou fè analiz imaj otomatik ak objektif pou fè nouvo dekouvèt syantifik.

Pandan ke ANDI te okòmansman fèt pou fasilite mezi rapid ak egzat nan koripsyon neriti nan kilti selil LUHMES diferansye ki ekspoze a 6-OHDA, rezilta nou yo endike tou ke makro a ka itilize pou detekte koripsyon neriti ki pwovoke pa lòt kòz, tankou ekspoze a oksijene idwojèn oswa retrè nerotrofin. Anplis de sa, vèsyon 1.1 nan makro a prezante yon bwat dyalòg ki pèmèt envestigatè yo Customize operasyon yo retire soma pou newòn nan gwosè espesifik. Done nou yo sipòte tou ke metòd tach lòt pase imunolabeling pou b III-tubulin ka itilize pou mezi egzat nan koripsyon nerite. Malgre ke nou rekòmande pou yo sèvi ak etid pilòt pou verifye presizyon nan mezi DI lè w ap itilize ANDI ak kalite selil oswa metòd tach ki pa te deja teste, rezilta sa yo sipòte ke macro a se yon zouti jeneralman versatile pou mezire koripsyon nerit nan newòn kiltive. Depi ANDI pa te optimize pou mezire koripsyon nerit nan tisi, nou kounye a sèlman rekòmande pou itilize li pou analize koripsyon nerit ki asosye ak selil kiltive yo. Sepandan, kòd la pou ANDI disponib piblikman e konsa ka itil tou pou envestigatè ki enterese nan modifye script la adapte nan etid in vivo oswa lòt aplikasyon.

An konklizyon, atik sa a prezante done ki revele sous komen nan erè ki asosye ak yon metòd lajman itilize pou quantifier dejenerasyon nerite. Apwòch eksperimantal yo te itilize pou amelyore metòd la, e amelyorasyon sa yo te enkòpore nan yon makro ImageJ gratis ak sous ouvè ki ka itilize pou fè analiz rapid, egzat ak objektif nan mikrograf fluoresans pou koripsyon neurite. Konklizyon nou yo revele efikasite ANDI pou quantifier dejenerasyon nerit nan mikrograf ki dekri yon modèl kilti selil nan PD, epi tou bay prèv prensip ke macro a ka detekte koripsyon nerit ki asosye ak lòt kontèks byolojik. Makro-zanmitay itilizatè a pral redwi tan ki nesesè pou envestigatè yo aprann quantifier fwagmantasyon neurite pandan y ap ogmante debi ak presizyon etid ki evalye faktè ki kache dejenerasyon nerite. Macro ANDI a disponib nan URL sa a: https://github.com/kraemerb/kraemerlab.

Referans

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) bès kognitif nan maladi Parkinson la. Nat Rev Neurol 13:217–231.

2. Adalbert R, Coleman MP (2013) Revizyon: patoloji axon nan maladi neurodegenerative ki gen rapò ak laj. Neuropathol Appl Neurobiol 39:90-108.

3. Bové J, Perier C (2012) Neurotoxin ki baze sou modèl maladi Parkinson la. Neurosyans 211:51–76.

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Tribinal FA (2017) Molekilè analiz de axonal-intrinsic ak glial-asosye ko-règleman nan koripsyon axon. Cell Death Dis 8: e3166.

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) Neurotrofin ki sòti nan objektif kowòdone transcription.

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR, et al. (2015) Yon ogmantasyon nan NAD précurseur nikotinamid mononukleotid (NMN) apre aksidan ankouraje koripsyon axon. Cell Death Differ 22:731–742.

7. Fukui K (2016) espès oksijèn reyaktif pwovoke koripsyon neurit anvan endiksyon lanmò selil. J Clin Biochem Nutr 59:155–159.

8. Geden MJ, Deshmukh M (2016) Axon koripsyon: kontèks defini chemen diferan. Curr Opin Neurobiol 39: 108-115.

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) Vincristine ak bortezomib sèvi ak mekanis distenk en pou aktive yon koripsyon komen SARM1-depandan axon. pwogram. JCI Insight 4:e129920.

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Tribinal FA (2018) Axonal dejenerasyon pwovoke pa glutamate excitotoxicity se medyatè pa necroptosis. J Cell Sci 131:jcs214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com