Etid pwoteomik Quantitative demaske chemen fibrinojèn nan maladi fwa polikistik Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Rezilta yo
3.1. Ren ak fwa pa swiv menm mekanis sistik yo
Etid anvan yo te montre ke inaktivasyon bonè nan jèn Pkd1 (anvan p12) deklanche devlopman rapid nan maladi polikistik (fenèt sistik), tandiske inaktivasyon apre p14 mennen nan fòmasyon sis an reta apre 4-5 mwa, ak yon fenotip modere (fenèt ki pa sistik) [19]. Sèvi ak menm modèl orthologous ADPKD (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], nou te envestige si fenèt devlopman ren sa a te koresponn nan tan ak yon fenèt ki sanble nan devlopman epatik. Pou fè yon konparezon dirèk ak etid anvan nou yo [37], sourit yo te pwovoke ak tamoksifèn pou inaktive jèn Pkd1 nan jou apre akouchman 14 (p14) ak 12 (p12) epi yo te sakrifye nan laj 30 jou (p30). Enteresan, nou te obsève yon fenotip sistik nan tou de pwen tan yo ak yon degre diferan nan maladi (lejè ak grav), sijere ke ren an ak fwa gen fenèt devlopman sistik endepandan (Figi 1a), ak / oswa posib diferan tan ak pwogresyon nan maladi a. . Yo pa jwenn okenn diferans ant gason ak fi nan laj sa a pou touye ant tou de fenèt inaktivasyon (n=6 yo te itilize pou chak gwoup mutan). Bèt mutan p14 yo te prezante yon fenotip pi modere pase gwoup mutan p12 ak pi ba valè endèks sistik, kantite spor ak fonksyon epatik dapre valè serik ALP (Figi 1b-d). Sa a se premye etid ki montre diferan fennèt/mekanis devlopman pou Pkd1 fwa ak ren deficiency. Diferans molekilè sa yo pral gen pou detèmine nan etid nan lavni.
Figi 1. Karakterizasyon fenotip fwa sistik nan 3 jou 0 fòm p12 ak p14 etap. Sipresyon Pkd1 nan p12 pote yon cystogenesis pi grav. (a) Imaj makwoskopik ak mikwoskopik reprezantatif ematoksilin-eozin tache nan fwa Pkd1cond/cond; Tam-Cre sourit Wild Type (WT, Pkd1cond/cond; Tam-Cre−) ak mutan (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+). ) ak sipresyon jèn Pkd1 pwovoke pa tamoksifèn nan jou apre akouchman 14 (gwoup p14) ak 12 (gwoup p12). Tout sourit yo te sakrifye nan p30. Ba echèl, 2 mm (panèl anwo) 100 µm (panèl ki pi ba). n reprezante kantite echantiyon pou chak gwoup, ak Bd vle di kanal bile. (b, c) Endèks sistik epatik ak kantite spor nan fenotip diferan yo. (d,e) Valè ALP ak ALT nan serik san. Ba reprezante vle di ± SEM nan tout ka yo. p < 0.05 pa tès t Elèv la (de-ke) te konsidere kòm yon rezilta enpòtan. ns reprezante pa siyifikasyon. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.
Klike sou cistanche herba pou maladi ren
3.2. Shotgun ak SWATH-MS Pwoteomik analiz nan PLD
Jan yo refere nan Figi 2, nou te fè analiz pwoteòm diferans nan tou de etap sistik (p12—maladi sistik grav- ak p14—maladi sistik modere) nan mutan (KO) an konparezon ak bèt sovaj (WT), yo nan lòd yo idantifye ak karakterize mekanis molekilè ki enpòtan ki sibi sistogenez fwa ak pwogresyon maladi.
Figi 2. Konplo workflow ilistre. Nou te itilize yon modèl murin ADPKD (Pkd1cond/cond; sourit Tam-Cre) kote inaktivasyon jenetik Pkd1 te pwovoke pa administrasyon tamoksifèn nan jou apre akouchman 10 (p10) ak p11 (pwogresyon maladi rapid) oswa p15 ak p16 (pwogresyon maladi reta). ) dapre chanjman nan devlopman pou cystogenesis ren, defini de gwoup yo nan etid la yo te rele p12 ak p14 respektivman [19]. Pou tou de gwoup yo, nou te itilize yon n egal oswa pi gran pase sis kalite sovaj (WT) ak mutan (KO) moun nan chak kondisyon, ak tout bèt yo te sakrifye nan p30. Nou etidye pwoteòm diferans nan fwa WT ak KO nan tou de severite maladi sistik fwa (Figi 1), lè l sèvi avèk tou de pwoteomik quantitative SWATH-MS ak analiz DDA-MS akizisyon ki depann de fizi. Nan pwoteyin yo ak yon chanjman enpòtan nan abondans, nou te itilize byoinformatik Figi 2. Konplo workflow ilistre. Nou te itilize yon modèl murin ADPKD (Pkd1cond/cond; sourit Tam-Cre) kote inaktivasyon jenetik Pkd1 te pwovoke pa administrasyon tamoksifèn nan jou apre akouchman 10 (p10) ak p11 (pwogresyon maladi rapid) oswa p15 ak p16 (pwogresyon maladi reta). ) dapre chanjman nan devlopman pou cystogenesis ren, defini de gwoup yo nan etid la yo te rele p12 ak p14 respektivman [19]. Pou tou de gwoup yo, nou te itilize yon n egal oswa pi gran pase sis kalite sovaj (WT) ak mutan (KO) moun nan chak kondisyon, ak tout bèt yo te sakrifye nan p30. Nou etidye pwoteòm diferans nan fwa WT ak KO nan tou de severite maladi sistik fwa (Figi 1), lè l sèvi avèk tou de pwoteomik quantitative SWATH-MS ak analiz done-depandan akizisyon DDA-MS. Nan pwoteyin ki gen yon chanjman enpòtan nan abondans, nou te itilize zouti byoenfòmatik pou detekte nouvo objektif terapetik ak chemen ki enplike nan maladi. Finalman, nou valide objektif sa yo lè l sèvi avèk premye in silico (DDA vs SWATH analiz) epi finalman nan estrateji vivo, osi byen ke RT-qPCR, Western blotting ak imunohistochimi. p vle di jou apre akouchman
Modèl ekspresyon pwoteyin nan sistojenèz epatik Premyèman, nou te fè analiz pwoteomik mas spèktrometri pa akizisyon fizi ki depann de done DDA-MS oswa DDA. Analiz sa a pèmèt karakterize proteome a soti nan echantiyon konplè ak endividyèl, bay prezans / absans nan pwoteyin ak sansiblite segondè, men san yo pa bay quantification yo. Nou sèlman konsidere tout pwoteyin yo eksprime diferans nan plis pase senk echantiyon endepandan nan yon total de sis echantiyon, pou etap p14 ak p12 nan Wild Type ak moun mutan, respektivman (Figi S1). Nan p14, 1 WT-eksklizif (oswa desann-reglemante pou maladi a) ak 7 MUT eksklizif (up-reglemante) pwoteyin yo te idantifye, pandan y ap nan p12, uit WT-eksklizif ak sis MUT-eksklizif pwoteyin yo te obsève (Figi S1).
Apre sa, nou te itilize yon metòd ki te pèmèt nou quantifier protéines diferan eksprime. Nou te fè yon analiz pwoteomik quantitative SWATH-MS sou menm echantiyon nou te itilize pou DDA, nou te jwenn ~ 1500 pwoteyin pou chak echantiyon ak plis pase 2000 pwoteyin nan chak gwoup etid. Premyèman, nou te fè nòmalizasyon total zòn (TAS) pou evalye echantiyon nou yo te swiv yon modèl distribisyon nòmal, jan yo montre nan Figi S2 ak S3. Apre sa, nou etidye pwoteyin nan ak diferans enpòtan ant Wild Type ak gwoup mutan. Tablo 1 montre pwoteyin yo ak yon chanjman siyifikatif nan abondans ak yon ogmantasyon de pli (up-reglemante) oswa diminisyon (desan-reglemante), ak yon siyifikatif ajiste p-valè (dapre parametrik t-tès Elèv la) nan WT vs. Echantiyon MUT nan p14 ak p12. An total, sis pwoteyin te montre diferans enpòtan nan abondans pwoteyin ant gwoup WT p14 ak MUT-p14 (senk pwoteyin monte-reglemante ak yon sèl pwoteyin desann-reglemante). Ant WT-p12 ak MUT-p12, 26 pwoteyin (20 pwoteyin moute-reglemante ak 6 pwoteyin desann-reglemante) te montre diferans enpòtan (Figi 3a ak Tablo 1). Grafikman, yo ka obsève varyasyon sa yo atravè trase vòlkan yo, ki te pwodwi lè yo trase chanjman log(2)-pliye pou tout pwoteyin idantifye kont valè p-log(10) yo (Figi 3b). Diferans enpòtan nan mitan nivo abondans pwoteyin yo ka vizyalize nan kat chalè a ak valè endividyèl dapre zòn yo nan bibliyotèk la espèk, ak nivo gwoupman li yo nan analiz la kat chalè grap (Figi 3c ak S4). Gwoup sa yo detekte pa analiz SWATH-MS ede nou idantifye echantiyon kalitatif separe sa yo, yo dwe konsidere pou analiz quantitative a (Figi S5). Yo te fè yon analiz estatistik miltivarye san sipèvizyon lè l sèvi avèk analiz eleman prensipal (PCA) pou konpare done ki genyen ant echantiyon yo (Figi S6). Map chalè a ak done PCA yo te demontre repwodibilite nan mitan echantiyon triplike yo kòm twa kopi yo byen gwoupe nan tou de analiz yo. Nou ka obsève tou de nan PCA a ak nan analiz gwoup heatmap la (Figi S5 ak S6) ki jan kèk echantiyon pa t gwoupe kòrèkteman, sipèpoze ant tou de grap yo. Sepandan, nou ka wè tandans separe done nan gwoup Wild Type ak Mutant. Nimewo a pi ba nan pwoteyin ki gen diferans enpòtan nan p14 vs p12 ta ka jistifye pa diferan degre nan severite (Figi 2), sijere ke kantite pwoteyin ak chemen ogmante ki baze sou gravite a ak estati maladi nan fenotip sistik la.
3.3. Clustering, anrichisman chemen ak analiz entèraksyon pwoteyin-pwoteyin nan ekspresyon jèn nan PLD
Pou etabli fonksyon ki gen rapò ak pwoteyin diferan eksprime yo idantifye pa analiz SWATH-MS, nou te itilize plizyè zouti byoenfòmatik ak fòm analiz. Gene Ontology (GO) tèm ak analiz chemen yo te fèt lè l sèvi avèk FunRich [39,40], String [41] ak Reactome [42]. Pwoteyin yo te klase nan analiz anrichisman jèn FunRich. Konsènan pwosesis byolojik la, gwoup ki pi rich nan pwoteyin pou gwoup p14 (modè sistik) te gen rapò ak transpò asid gra ak biosentèz prostaglandin, ak pou gwoup p12 (kistik grav) ak aktivite fibrinojèn / fibrin, adezyon selil-selil / matris ak metabolis. pwosesis (Figi 4a, panèl anwo). ANXA2 ak konplèks fibrinogen an te de eleman selilè ki pi rich nan gwoup p14 ak p12, respektivman. Anplis de sa, espas ekstraselilè a te eleman selilè ki gen pi gwo pousantaj pwoteyin nan tou de gwoup (Figi 4a, panèl ki pi ba). Menm jan an tou, menm analiz la te etabli ak analiz fisèl, idantifye diferan pwosesis metabolik kòm pwosesis byolojik prensipal la, ak espas ekstraselilè a kòm eleman selil ki pi rich; ki konsistan avèk rezilta GO (Figi S7a). Finalman, nou repete analiz la ak platfòm Reactome la, nou jwenn ke metabolis ak sistèm iminitè yo se chemen ki pi rich (Figi S7b).
Pwoteyin-pwoteyin oswa analiz gwoup ki baze sou analiz fisèl yo te fèt tou pou mennen ankèt sou posib entèraksyon pwoteyin-pwoteyin (entèraksyon ak prèv eksperimantal). Anpil entèraksyon pwoteyin yo te idantifye nan diferan gwoup (Figi S8), men yon gwoup nan p14 ak yon lòt nan p12 te pi enpòtan an ki baze sou kantite entèraksyon ant pwoteyin ak nivo ekspresyon (Figi 4b). Gwoup p14-la gen pwoteyin anèksin A2 (ANXA2_P{07356) ki asosye ak plizyè fonksyon selilè, tankou fibrinoliz, mobilite selil (nan selil epitelyal), yon pwoteyin ki gen rapò ak aktin. cytoskeleton ak selil-matris entèraksyon [43], kominike avèk de lòt pwoteyin ki enplike nan transpò lipid intraselilè (FABP1_P12710 ak FABP5_Q05816). Enteresan, yo te idantifye yon lòt gwoup pwoteyin enpòtan nan gwoup p12-ki gen yon entèraksyon pwoteyin-pwoteyin trè fò ant plizyè fibrinogen (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22). }}E9PV24 ak FIBGG_Q8VCM7). Fibrinogens yo patisipe nan kwasans epatosit, epi yo medyatè gaye plakèt san, kolagen entèstiti ak blesi fibrotik [44]. Anplis de sa, pwoteyin adisyonèl yo te jwenn kominike avèk fibrinogens (Figi S8), tankou serik amiloid p-konpozan (SAMP_P12246), hemopexin (HEMO{_Q91X72) oswa idwoksisid oksidaz 2 (HAOX{). {37}}Q9NYQ2). An konsistan avèk rezilta fisèl, ANXA2 ak konplèks fibrinogen yo te tou eleman selilè ki pi rich yo idantifye pa analiz FunRich (Figi 4a). Enteresan, lè w konpare done yo jwenn nan analiz DDA ak SWATH, nou konfime ke plizyè pwoteyin idantifye pa SWATH te idantifye tou pa analiz DDA, ki gen ladan plizyè ki gen rapò ak pwoteyin konplèks fibrinogen (SAMP / Apcs ak S10A9 / S100a9; Tablo S3).
3.4. Validasyon analiz SWATH-MS demaske Konplèks Fibrinogen an kòm yon nouvo mekanis molekilè ki gen rapò ak PLD.
Dapre done sa yo, nou chwazi nan analiz SWATH-MS (Figi S9) pwoteyin ki chanje ki gen rapò ak konplèks fibrinogen nan etap p12 ak p14 pou validation in vivo ak RT-qPCR, Western blotting ak imunohistochimi, pou etabli konfimasyon yo ke posib. sib maladi. Uit sou 1 0 nan pwoteyin sa yo chwazi yo te valide nan nivo mRNA pa RT-qPCR (Figi 5); yon sèl-reglemante nan 14-etap la (ANXA2_P07356) ak nan p12-gwoup (SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 ak FIBG_Q8VCM7), ak youn desann- reglemante nan gwoup p12 la (HAOX2_Q9NYQ2). Enteresan, ekspresyon jèn nan de pwoteyin yo ki gen plis distans oswa mwens entèraksyon nan gwoup la fibrinogen (ILK ak S10A9) se yo menm sèlman ki pa te valide (Figi 5c).
Up-regleman nan konplèks la fibrinogen (ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG ak pwoteyin HAOX2) te konfime plis pa analiz Western blot (WB) (Figi 6). An jeneral, ekspresyon jèn ak WB yo te trè konsistan avèk done pwoteomik SWATH-MS. Finalman, nou menm tou nou te fè validation imunohistochemistry nan konplèks la fibrinogen nan echantiyon fwa mutan ak polikistik (Figi 7). Fibrinogen tach te fòtman moute-reglemante nan sis-pawa selil epitelyal ak dilatasyon kanal kòlè (Figi 7a). Rezilta sa yo demaske, pou premye fwa, konplèks fibrinogen an kòm yon chemen posib ki gen rapò ak cystogenesis epatik ak kòm yon sib posib nan lavni terapetik pou PLD.
Figi 5. Validasyon sib posib PLD pa RT-qPCR. Ekspresyon jèn 8 a 10 sib chwazi ki gen rapò ak done SWATH-MS. RT-qPCRs nan up-reglemante chwazi p14 sib anexin A2 (Anxa2) (a); up-reglemante p12 vize eleman amiloid p, serom (Apcs, jèn SAMP), fibrinogen tankou 1 (Fgl1), fibrinogen beta chèn (Fgb), hemopexin (Hpx), fibrinogen alfa chèn (Fga), fibrinogen gama chèn (Fgg) (b), kinaz ki lye integrin (Ilk) ak S10{{30}} kalsyòm ki konekte pwoteyin A9 (S100a9) (c); ak desann-reglemante p12 sib hydroxy asid oksidaz 2 (Hao2) (d). n=6 te itilize pou chak gwoup pwoteyin. Gapdh te itilize kòm yon jèn antretyen. Ba reprezante vle di ± SEM. Yo te itilize tès t elèv la ak de ke epi yo te konsidere yon valè p <0.05 siyifikatif. ns: pa enpòtan (p pi gran pase oswa egal a 0.05), * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.
Figi 7. Konplèks fibrinojèn yo kontwole nan epiteli sistik la. (a, b) Imaj reprezantatif nan imunohistochimi fibrinogen nan kanal bile (panèl anwo) ak parenchyma fwa (panèl ki pi ba) (a) ak quantification li yo (b). n=6 te itilize pou chak gwoup. Analiz imunohistochimik la te montre yon regilasyon monte nan fibrinogen nan epiteli sistik. Echantiyon yo koresponn ak gwoup p12. Ba echèl reprezante 100 µm. Bd la vle di Kannal bile. Ba reprezante vle di ± SEM. Yo te itilize tès t elèv la ak de ke epi yo te konsidere yon valè p <0.05 siyifikatif. *** p < 0.001.
Sèvis sipò Wecistanche-Pi gwo ekspòtatè cistanche nan Lachin nan:
Imèl:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Achte pou plis detay espesifikasyon:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
