Asanble Transcriptome De Novo ki baze sou RNA-Seq ak dekouvèt jèn nan tij charnèl Cistanche Deserticola-Ⅰ

Orijin

Cistanche deserticola se yon plant parazit konplètman ki pa fotosentetik ak gwo valè medsin epi li sitou distribye nan dezè Nòdwès Lachin. Tij chèch li yo se yon tonik enpòtan nanmedikaman tradisyonèl Chinwaak wòl sitou amelyore fonksyon seksyèl gason ak ranfòse iminite, men kèk etid mekanik yo te fèt an pati akòz mank de resous jenomik ak transcriptomic.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA CHINESE TRADITIONAL MEDICINE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezilta yo

Nan etid sa a, nou te fè sekans transcriptom pwofon nan tij charnèl C. deserticola, epi anviwon 80 milyon lekti te pwodwi lè l sèvi avèk sekans Illumina pè-fen sou platfòm HiSeq2000 la. Sèvi ak Trinity assembler la, nou te jwenn 95,787 sekans transkripsyon ak longè transkripsyon ki sòti nan 200bp a 15,698bp, ki gen yon longè mwayèn 950 baz ak yon longè N50 1,519 baz. 63,957 transkripsyon yo te idantifye kòm aktivman eksprime ak FPKM pi gwo pase oswa egal a 0.5, kote 30,098 transkripsyon yo te anote ak deskripsyon jèn oswa tèm ontoloji jèn pa analiz resanblans sekans kont plizyè baz done piblik (Uniprot, NR, ak Nt nan NCBI, ak KEGG) . Anplis de sa, nou te idantifye jèn anzim kle ki enplike nan byosentèz lignin ak glikozid fenilethanoid (PhGs) ki konnen yo dwe engredyan prensipal yo aktif. Kat jèn phenylalanine amonyak-lyase (PAL), premye anzim kle nan biosentèz lignin ak PhG yo te idantifye ki baze sou konparezon sekans ak analiz filogenetik. De chemen biosentèz PhG yo te pwopoze tou pou premye fwa.

Konklizyon

An tou, nou te konplete yon analiz mondyal de transcriptome tij charnèl C. deserticola lè l sèvi avèk teknoloji RNA-seq. Yo te idantifye yon koleksyon jèn anzim ki gen rapò ak byosentèz lignin ak glikozid phenylethanoid nan relve nòt yo rasanble ak anote, e yo te prevwa fanmi jèn PAL la tou. Done sekans etid sa a pral bay yon resous enpòtan pou fè rechèch biosentèz glikozid feniletanoid nan lavni ak etid jenomik fonksyonèl nan plant medsin enpòtan sa a.

Entwodiksyon

C. deserticola se yon genus atravè lemond nan plant dezè kontinuèl ki soti nan fanmi Orobanchaceae epi li se yon espès konplètman ki pa fotosentetik epi anjeneral grandi plant oloparazit anba tè. Li se parazit sou rasin psammophyte Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae), ki sitou abite nan dezè ak semi-dezè akòz tolerans segondè li yo nan sechrès ak salinite. C. deserticola montre gwo rezistans nan kondisyon anviwònman piman bouk epi li se sitou distribiye nan Nòdwès Lachin, espesyalman nan Inner Mongolia, Gansu, ak Xinjiang. Li konsidere kòm yon espès sovaj ki an danje nan dènye ane yo akòz ogmante konsomasyon pa imen. C. deserticola ki souvan rele dezè ginseng se souvan ke yo rekonèt kòm dezè-broomrape ak tij la chèch charnèl te anpil itilize kòm yon tonik tradisyonèlman enpòtan nan Lachin ak Japon pou anpil ane. Li te okòmansman anrejistre nan Shen Nong Ben Cao Jing (Dictionary of Chinese Materia Medica, 1977) apeprè 1800 ane de sa e li te konsidere kòm youn nan sous prensipal yo nanChinwa zèb medsin Cistanche.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMÉLIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ekstrè yo nan C. deserticola posede yon pakèt fonksyon medsin, espesyalman pou itilize nan amelyore fonksyon seksyèl, tonifyan ren, pwoteje fwa a, aktivite aperient, amelyore memwa, imunomodulateur, aktivite antioksidatif, anti-enflamatwa, aktivite antiviral, elatriye. pi gwo konpozan bioaktif nan C. deserticola se glikozid Phenylethanoid (PheGs, PhGs). Jiska dat, plis pase 20 glikozid phenylethanoid yo te izole nan tij la sukulan nan C.deserticola. Pami yo,acteoside ak echinacosidese de eleman prensipal ak aktivite famasi enpòtan epi yo dokimante kòm estanda kalite C. deserticola nan farmakope Chinwa a (2005 ak 2010 edisyon). Twa konpozan chimik PhG yo se asid òganik, sakarid, ak fenylethanoid, sepandan, detay yo konsènan chemen biosentetik fenylethanoid rete mal konprann nan C.deserticola.

Malgre enpòtans komèsyal ak medsin C.deserticola, done jenomik ak transcriptomic espès sa a trè limite. Pa gen okenn EST ki disponib nan baz done NCBI la epi enfòmasyon konplè sou genòm pou espès sa a pa disponib eksepte sekans genòm klowoplas la. Done transcriptomic limite yo anpeche etid mekanis biosentetik PhG yo. Teknoloji RNA-seq ka jenere sekans pati ki eksprime nan genòm vize a epi idantifye jèn [18] lè l sèvi avèk platfòm teknoloji NGS yo (tankou Applied Biosystems SOLiD, Illumina HiSeq, ak Roche 454). Li ap vin de pli zan pli popilè nan transcriptome de novo asanble, paske li se yon apwòch pri-efikas ak pwisan ak rezolisyon segondè ak gwo ranje dinamik, espesyalman paske li gen yon avantaj yo eksplore relve nòt ki ba-abondans. Akòz divès avantaj yo, RNA-seq espesyalman atire pou òganis ki pa modèl ki gen resous jenetik limite. Sepandan, pa gen okenn rechèch detaye sou C. deserticola transcriptome pa RNA-seq.

Nan etid sa a, nou globalman sekans transcriptome tij la pou C. deserticola lè l sèvi avèk platfòm Illumina Hiseq2000 la epi nou te resevwa done anvan tout koreksyon 7.9G. Pa asanble ak anotasyon, nou minye jèn ki enplike nan byosentèz PhG ak jèn ki responsab pou tout biosentèz lignin. Analiz RNA-seq nou an te pwodwi premye transcriptome konsansis C. deserticola e li te bay nouvo lide nan yon konpreyansyon konplè sou valè medsin C. deserticola. Anplis de sa, metòd ki dekri isit la ka lajman aplike nan transcriptomes pwofil pou fasilite dekouvèt jèn ki enplike nan chemen biosentèz espesifik konpozan medsin nan yon lòt plant medsin ak resous jenomik trè limite.

Materyèl ak Metòd

Koleksyon materyèl plant

Fre tij sukulan pou C. deserticola nan etap fouyman an te ranmase nan yon baz plant nan BayanHot City of Alxa League nan Inner Mongoli nan nòdwès Lachin. Pèmi a kolekte te jwenn nan men pwopriyetè a (HongKui CongRong Group) nan baz la plant. Yo te depoze echantiyon bon an nan Plant Genomic Nwayo nan Beijing Institute of Genomics, Akademi Syans Chinwa. Apre netwaye, tisi tij sukulan yo te koupe an ti moso epi imedyatman jele nan nitwojèn likid, epi answit estoke nan -80 degre jiskaske plis pwosesis.

Ekstraksyon RNA, konstriksyon bibliyotèk cDNA, ak sekans Illumina

RNA total yo te extrait nan tij sukulan an lè l sèvi avèk TRIzol Reagent (Invitrogen Inc., California, USA) dapre enstriksyon manifakti a. Echantiyon ki kapab lakòz yo te trete ak DNase I pou retire nenpòt ADN jenomik. RNAs ekstrè yo te mezire lè l sèvi avèk yon bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies) epi tcheke entegrite lè l sèvi avèk elektwoforèz jèl agarose denaturasyon ak tach bromur etidyòm. Echantiyon RNA ak rapò A260/A280 ant 1.9 ak 2.1, rapò RNA 28S:18S ki pi wo pase 1.0, ak nimewo entegrite RNA (RIN) -8.5 yo te itilize nan analiz ki vin apre yo.

Bibliyotèk RNA-seq yo te pwodwi lè l sèvi avèk Illumina Truseq RNA Sample Preparation Kits. Poly(A)+ RNA te izole nan RNA total lè l sèvi avèk Dynal ligo(dT)25 pèl selon enstriksyon manifakti a. Apre pirifikasyon, yo te ajoute yon tanpon fwagmantasyon pou kraze mRNA an ti fragman. Premye-seksyon cDNA te sentèz lè l sèvi avèk fragman kout sa yo kòm modèl, ansanm ak SuperScript III transkriptaz ranvèse ak N6 primè hexamer o aza. Lè sa a, dezyèm seksyon cDNA yo te sentèz lè l sèvi avèk tanpon, dNTPs, RNaseH, ak ADN polymerase I. ADN cDNA ki te lakòz doub-chèn te sibi fen-reparasyon lè l sèvi avèk T4 DNA polymerase, DNA polymerase I Klenow fragman, ak T4 polinukleotid kinaz, ak ligated adaptè ki itilize T4 DNA ligase. Fragman adaptè-ligated yo te pirifye lè l sèvi avèk yon twous ekstraksyon QiaQuick PCR ak eluye ak tanpon EB. Apre analiz ak elektwoforèz jèl agarose, yo te chwazi fragman apwopriye kòm modèl pou anplifikasyon PCR. Sekans bibliyotèk cDNA ki te lakòz yo te fèt ak yon sistèm Illumina HiSeq 2000.

Transkripsyon de novo asanble ak quantifikasyon ekspresyon jèn

Lekti kri ki te pwodwi nan sekans yo te netwaye lè yo retire sekans adaptè yo (ATCTCGTATGCCGTC) lè l sèvi avèk yon metòd andedan kay la. Lè sa a, nou te pote soti yon sevè bon jan kalite filtraj pwosesis. Premyèman, baz ki gen yon nòt kalite phred ki pi ba pase 20 ta dwe koupe soti nan fen 3' nan sekans lan, jiskaske yo kouri nan yon baz ak yon bon jan kalite ki pi wo (Pi gwo pase oswa egal a 20). Si longè li a te pi kout pase 50bp, li ta jete. Dezyèmman, lekti yo pral plis filtre dapre kritè ke 70% nan baz nan yon sèl lekti gen bon kalite nòt (Pi gran pase oswa egal a 20). Twazyèmman, sèlman pè-fen lekti yo te itilize pou plis asanble. Yo te fè asanble transkripsyon de novo lè l sèvi avèk Trinity release_20130216 [30] ki te gen twa modil lojisyèl siksesif: Inchworm, Chrysalis, ak Butterfly. Paramèt asanble yo te fikse jan pi ba a:-seqType fq-JM 300G -min_contig_longè 200-CPU 20-inchworm_cpu {{21} }bflyCPU 20.

Pou mezire abondans transkripsyon yo, yo te re-aliyen lekti sekans yo nan fen pè yo ak transkripsyon rasanble yo lè l sèvi avèk yon script nan Trinity. Lekti kat yo te itilize pou quantification pa lojisyèl RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization). Jenn oswa abondans izofòm te reprezante pa fragman pou chak kilobaz transkripsyon pou chak milyon fragman kat (FPKM) valè, transkripsyon sa yo ki gen valè FPKM egal a oswa pi gwo pase 0.05 yo te defini jan yo eksprime.

Anotasyon fonksyonèl nan relve nòt eksprime

Pa gen okenn seri anotasyon jèn nan C. deserticola eksepte pou genomic klowoplast [1]. Nou te fè nòt transkripsyon eksprime yo lè nou konpare yo ak Genbank Nt, Genbank Nr, ak TAIR10_ pep_20101214_mezajou ansanm done separeman lè l sèvi avèk pwogram BLAST la (E< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.

Gene Ontology ak anotasyon chemen KEGG Pa aliyman resanblans sekans ak baz done Uniprot (yo te jwenn anotasyon Gene Ontology (GO) tout transkripsyon rasanble yo lè l sèvi avèk yon dosye asosyasyon telechaje nan (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/). databases/GO/goa/UNIPROT/gene_asosyasyon goa_uniprot.gz te fè gwoupman GO nan jèn ki eksprime yo lè l sèvi avèk scripts koutim, epi nou te fè anote jèn nan katriyèm nivo a. CC, BP, ak kategori MF separeman.

Enfòmasyon sou chemen KEGG yo te asiyen pou tout sekans pwoteyin prevwa lè l sèvi avèk zouti sou entènèt KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) [34]. Yo te soumèt sekans nan fòma fasta a demann KAAS, epi yo te telechaje dosye yo tout enfòmasyon sou chemen ki gen rapò ak transcriptom tij C. deserticola. Yo te itilize 13 seri done jèn òganis plant yo nan KEGG pou anotasyon lè l sèvi avèk metòd BBH (bi-direksyon pi bon frape).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE EXTRACT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiz RT-qPCR

Apre dijesyon ak DNase I, yo te konvèti apeprè 5ug total de RNA nan premye strand cDNA atravè reyaksyon ranvèse-transcription ak oligo(dT)15 primè ak GoScript Reverse Transcription System (Promega). Lè sa a, pwodwi cDNA yo te dilye 10-pliye ak dlo deyonize san nukleaz anvan yo itilize kòm yon modèl nan PCR an tan reyèl. Sistèm GoTaq 2-Step RT-qPCR (Promega) te anplifye cDNA espesifik yo nan yon volim 20 ul. Anplifikasyon PCR te fèt nan tanperati rkwir 60 degre ak sistèm deteksyon PCR an tan reyèl 7500 (Applied Biosystems) dapre enstriksyon manifakti a. Abondans transkripsyon relatif yo te kalkile pa metòd papòt sik konparatif la ak jèn "comp10579_c0" kòm yon estanda entèn, lè l sèvi avèk lojisyèl 7500 Manager la.

Premye pè pou RT-PCR yo te fèt baze sou lojisyèl sou entènèt (http://primer3.ut.ee/) epi yo ekri nan S1 Dataset la.

Rezilta yo

Sekans RNA ak asanble transcriptom de novo nan tij charnèl C. deserticola

Tij C. deserticola te itilize anpil kòm yon tonik tradisyonèlman enpòtan nan Lachin ak Japon pou anpil ane. Pou jwenn yon BECA mondyal ekspresyon jèn nan tij charnèl C. deserticola, nou kolekte echantiyon tij C. deserticola nan menm baz plant nan 2013 ak 2014, respektivman. RNAs total yo te ekstrè ak RNAs polyA + yo te pirifye pou konstwi bibliyotèk RNA-seq pè-fen. 79,433,734 ak 86,019,176 pè-fen lekti ki koresponn ak prèske 8 milya ak 8,6 milya baz nan sekans lan te jwenn lè l sèvi avèk sekans Illumina HiSeq 2000.

platfòm nan echantiyon 2013-ane ak 2014-ane (Tablo 1). Apre yo fin retire sekans adaptè yo ak filtraj lekti ki pa bon kalite (gade detay nan Metòd), yo te itilize 64,831,040 lekti-wo kalite pè nan echantiyon 2013-ane a pou asanble transcriptome de novo. Lè l sèvi avèk asanblaj sekans Trinity [30], yo te pwodwi 51,719 jèn ak 95,787 sekans transkripsyon ak longè transkripsyon ki sòti nan 200 bp rive 15,698 bp. Longè an mwayèn nan transkripsyon reyini se 950 baz ak longè N50 a se 1,519 baz. Nimewo a nan relve nòt nan longè diferan revele ke 57.32% nan relve nòt yo reyini yo te apeprè 500 bp oswa pi long (figi 1A). Lekti-wo kalite pè-fen nan echantiyon 2014-ane a te trase sou transkriptòm reyini an. Anplis, nou te jwenn ke nimewo transkripsyon an pou chak jèn reyini varye ak 69% nan jèn ak yon sèl izofòm eksprime pandan y ap 31% nan jèn eksprime de oswa plis transkripsyon (figi 1B).

Kantifikasyon ekspresyon ak anotasyon fonksyonèl nan transkripsyon reyini

Gen oswa abondans transkripsyon yo te quantifye lè l sèvi avèk pake RSEM, kote lekti yo sekans yo te re-aliyen ak jèn yo reyini oswa sekans transkripsyon lè l sèvi avèk Bowtie, ak lekti sa yo te itilize pou quantification. Yo te kalkile valè FPKM pou chak jèn oswa transkripsyon, epi finalman, nou te idantifye 63,957 ak 52,857 transkripsyon ki eksprime aktivman (valè FPKM pi gran pase oswa egal a 0.5) nan echantiyon tij charnèl C. deserticola nan 2{{17} }13 ak 2014, respektivman. 44,776 transkripsyon (70.01% nan echantiyon 2013-ane a, 84.71% nan echantiyon 2014-ane) yo te souvan eksprime nan de kopi yo, ak korelasyon an (koyefisyan korelasyon Pearson: 0.91979) nan done ekspresyon yo te yo montre nan S1 Fig. Done anvan tout koreksyon sekans yo te telechaje nan baz done NCBI SRA (nimewo aksesyon: SRX857402 ak SRX858938). Nou itilize jèn eksprime yo idantifye nan echantiyon 2013-ane a pou plis analiz. Yo te jwenn enfòmasyon annotasyon fonksyonèl pou tout transkripsyon eksprime yo lè l sèvi avèk de metòd. Premyèman, tout transkripsyon eksprime yo te aliyen ak baz done nukleotid li te ye (GenBank nt) ak sekans peptide (GenBank nr ak peptide Arabidopsis) separeman pa algorithm BLAST la. Sou 63,957 relve nòt eksprime,

29,220 (45.7%) yo te anote epi yo te montre omoloji nan sekans nan nenpòt nan twa baz done sijè yo ak E-valè koupe 1e -20. Pandan se tan, rejyon kodaj kandida yo pou tout sekans transkripsyon eksprime yo te prevwa lè l sèvi avèk lojisyèl TransDecoder, epi yo te itilize ORF ki pi long yo pou chak transkripsyon pou rechèch domèn Pfam. Kòm yon rezilta, 21,358 (33.4%) transkripsyon yo te anote ki baze sou baz done Pfam. An jeneral, 30,098 (47.1%) transkripsyon yo te siyifikativman matche ak jèn li te ye nan baz done piblik yo lè yo konbine de metòd ki anwo yo. Lis konplè eksprime transkripsyon yo ak anotasyon fonksyon yo te montre nan done siplemantè (S2 Dataset).

Nou te fè sondaj sou 20 transkripsyon ki pi eksprime yo (Tablo 2) ki koresponn ak 18.99% nan tout lekti sekans yo, epi nou te jwenn ke pi fò nan yo se jèn ki reponn a abyotik.

estimilis estrès. Dehydrin (DHNs), yon klas nan pwoteyin estrès idrofil ak tèrmostab ak yon gwo kantite asid amine chaje ki fè pati fanmi Gwoup II Late Embryogenesis Abundant (LEA), se jèn ki pi eksprime. Twa diferan transkripsyon Dehyrin (comp28713_c0_seq1/2/4) yo te detekte kòm trè eksprime nan tij charnèl ki ka patisipe nan pwoteje selil yo kont domaj ki te koze pa estrès sechrès. Lòt jèn ki gen rapò ak estrès tankou pwoteyin chòk chalè, pwoteyin ki gen rapò ak patojèn, ak metalothionein yo te jwenn tou eksprime trè, ki ka gen rapò ak anviwònman siviv grav li yo. Anplis de sa, gen kèk jèn konstititif ki gen ladan jèn RNA ribozomal 26S (konp22329_c2_seq1), pwoteyin ki asosye ak oksin ki reprime/ki asosye ak dòmi (konp20999_c0_seq1), Faktè ADP-ribosilasyon (konp20499_ c0_seq1) yo te transkri anpil tou.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMELIORE IMINITE PHGS75% ECH 30% ACT 12%