Spèmidin soulaje pitit ipoksi ki fèk fèt nan matris domaj nan mitokondriyo nan rat yo pa anpeche estrès oksidatif ak reglemante kontwòl kalite mitokondriyo pati 1.

Résumé

Jan nou koumanse: Ipoksi nan matris (IUH) ogmante risk pou maladi kadyovaskilè nan pitit pitit yo. Kòm yon espès oksijèn reyaktif (ROS), espèmidin polyamine (SPD) esansyèl pou siviv ak kwasans anbriyon ak fetis la. Sepandan, plis etid sou pwoteksyon SPD ak mekanis pou domaj kè IUH-induit nan pitit pitit yo nesesè.

Glycoside nan cistanche ka ogmante tou aktivite SOD nan kè ak tisi fwa, ak siyifikativman redwi kontni an nan lipofuscin ak MDA nan chak tisi, efektivman scavenging divès kalite radikal oksijèn reyaktif (OH-, H₂O₂, elatriye) ak pwoteje kont domaj ADN ki te koze. pa OH-radikal. Cistanche phenylethanoid glikozid gen yon kapasite gaya scavenging nan radikal gratis, yon pi wo kapasite diminye pase vitamin C, amelyore aktivite a nan SOD nan sispansyon espèm, redwi kontni an nan MDA, epi yo gen yon sèten efè pwoteksyon sou fonksyon manbràn espèm. Cistanche polisakarid ka amelyore aktivite SOD ak GSH-Px nan eritrosit ak tisi nan poumon nan sourit senesan eksperimantal ki te koze pa D-galaktoz, osi byen ke diminye kontni an nan MDA ak kolagen an nan poumon ak plasma, ak ogmante kontni an nan elastin, gen yon bon efè scavenging sou DPPH, pwolonje tan an nan ipoksi nan sourit senesan, amelyore aktivite a nan SOD nan serom, ak retade koripsyon fizyolojik nan poumon nan sourit senesan eksperimantal Avèk koripsyon selilè mòfolojik, eksperyans yo te montre ke Cistanche gen bon kapasite antioksidan. epi li gen potansyèl pou yo dwe yon dwòg pou anpeche ak trete maladi po aje. An menm tan an, echinacoside nan Cistanche gen yon kapasite enpòtan pou elimine radikal gratis DPPH epi li gen kapasite pou elimine espès oksijèn reyaktif epi anpeche degradasyon kolagen an radikal gratis, epi tou li gen yon efè reparasyon bon sou domaj anyon radikal gratis timin.

Klike sou Cistanches Herba Pou Anti-aje

【Pou plis enfòmasyon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Objektif: Etid sa a te vize mennen ankèt sou efè prevantif tretman SPD prenatal sou domaj kè IUH-induit nan rat pitit tibebe ki fèk fèt ak mekanis ki gen rapò ak mitokondriyo ki kache.

Metòd: Modèl rat IUH te etabli pa ekspoze a 10 pousan O2 sèt jou anvan tèm nan. Pandan se tan, pandan sèt jou, rat yo ansent yo te bay SPD (5 mg.kg-1.d-1; ip). Rat pitit yon sèl jou yo te sakrifye pou evalye plizyè paramèt, ki gen ladan devlopman kwasans, domaj kè, pwopagasyon kardyomyosit, estrès oksidatif myokad, apoptoz selil, ak fonksyon mitokondriyo, epi yo gen kontwòl kalite mitokondriyo (MQC), ki gen ladan mitofaji, byogenesis mitokondriyo, ak mitokondriyo fizyon/fizyon. Nan eksperyans nan vitro, kadyomyosit prensipal yo te sibi ipoksi avèk oswa san SPD pou 24 èdtan.

Rezilta yo: IUH diminye pwa kò, pwa kè, ekspresyon kadyak Ki67, aktivite SOD, ak nivo CAT ak adenosine 5'-trifosfat (ATP) epi ogmante ekspresyon BAX/BCL2 ak nimewo nwayo TUNEL-pozitif. Anplis de sa, IUH te lakòz tou anòmal estrikti mitokondriyo, malfonksyònman, ak diminye mitofagi (diminye kantite mitofagosòm), te bese byogenesis mitokondriyo (diminye ekspresyon SIRT-1, PGC-1, NRF-2, ak TFAM), ak mennen nan dezekilib fizyon / fizyon (ogmante pousantaj fragman mitokondriyo, ogmante ekspresyon DRP1, ak diminye ekspresyon MFN2) nan myokad la. Surprenante, tretman SPD nòmalize varyasyon yo nan paramèt IUH-induit yo. Anplis de sa, SPD te anpeche akimilasyon ROS ki te pwovoke ipoksi, dekonpozisyon potansyèl manbràn mitokondriyo, ak diminisyon mitofaji nan kardyomiosit.

Konklizyon: Tretman SPD matènèl te lakòz domaj kè IUH-pwovoke nan rat pitit ki fèk fèt pa amelyore fonksyon mitokondriyo myokad la atravè anti-oksidasyon ak anti-apoptoz, ak reglemante MQC.

1. background

Etid epidemyolojik ak bèt endike ke yon anviwònman adv se entrauterin asosye ak yon risk ogmante nan maladi kadyovaskilè nan adilt (1). Ipoksi prenatal, anviwònman ki pi komen nan matris negatif, ka fè fetis la kapab reyalize potansyèl kwasans jenetik li yo, ki manifeste kòm reta kwasans ak blesi nan fonksyon ògàn nan sezon prentan (2). Ipoksi fetis kwonik souvan soti nan gwosès ak ogmante rezistans vaskilè plasenta tankou pre-klanpsi, entè-gwosès nan gwo altitid, oswa maladi respiratwa matènèl. Plis siyifikativman, yon tyè nan yo afekte pa sendwòm ipoventilasyon obstriktif apne dòmi (OSAHS) nan fen gwosès, epi li asosye tou ak devlopman sendwòm tansyon wo jestasyonèl. Chanjman fizyolojik ki pi kritik SAHS se ipoksi kwonik tanzantan (3, 4). Nan plizyè modèl bèt, ipoksik andedan matris (IUH) mennen nan rediksyon efikasite kadyak, diastolik ak malfonksyònman sistolik, kwasans ipètrofik, diminye pwopagasyon kadyomiosit, ak reta spirasyon kadyomiosit nan kè fetis la ak neonatal, kidonk ogmante risk pou maladi kè nan pitit adilt yo. 5). Efè pwogramasyon ipoksi kwonik ka sitou eksplike mekanis nan etap enpòtan nan devlopman kè a, ki mennen nan amelyorasyon estrès oksidatif kadyak ak ogmantasyon apoptoz selil nan pitit (6-9). Kon pt pwogram devlòpmantal la gen sans paske fizyoloji nou an pi malleab ak pi plastik pandan bonè lavi. Kondisyon nan uterin detèmine ak pwogram konsèp yo nan fizyoloji ak metabolis ke lavi nou an. An konsekans, repons adaptasyon fetis la nan IUH mennen nan devlopman maladi kadyovaskilè granmoun (10). Mitokondri yo se òganèl konplèks ki jwe wòl enpòtan nan jenerasyon enèji selilè ak yon myriad de evènman siyal kav. Entegrite estriktirèl ak fonksyonèl mitokondri yo enpòtan anpil pou siviv kardyomyosit, epi lè yo konpwomèt, dezòd omeyostaz mit-hondrial rezilta nan devlopman maladi carac. Dènyèman, plizyè etid yo te konsantre sou wòl kwonik prenatal ipoksi ki pwovoke malfonksyònman mitokondriyo nan medyatè domaj kè pitit pitit yo. Yo te rapòte ke fonksyon mitokondriyatwa te andikape, ak ekspresyon plizyè règ mol mitokondriyo chanje kè perinatal ekspoze a IUH (11). Anplis, IUH mennen nan diminye aktivite konplèks mitokondriyo ak malfonksyònman tranch nan kè a nan ult desandan apre iskemi myokad (12). An konsekans, etid sa a te vize dekouvri lyen molekilè amo ipoksi prenatal, estrès oksidatif, aksyon dys mitokondriyo, ak blesi nan kè nan nouvo pitit (13).

Devlopman ak spirasyon nan sistèm mitokondriyo gwo volim sa a nan myokad la sitou fèt nan etap devlopman perinatal ak apre akouchman, sitou akòz chanjman metabolik kadyak ki soti nan itilize glikoz oswa asid gra pou jenerasyon adenozin 5'-trifosfat (ATP) apre nesans. (14). Prèv émergentes sijere mekanis kontwòl kalite mitokondriyo (MQC) yo se detèminan kritik pou spirasyon kardyomyosit (15). Kontwòl kalite mitokondriyo, sitou ki gen ladan byogenesis mitokondriyo, mitofagi ansanm ak dinamik, yon rezo regilasyon byen branche, òkestre kantite ak bon jan kalite mitokondriyo ak amelyore fonksyon mitokondriyo ak siviv cardiomyocyte anba kondisyon estrès (16). Peroxisome proliferators-active receptors (PPAR) coactivator 1 (PGC-1) ​​jwe yon wòl enpòtan nan kondwi byogenesis mitokondriyo ak fonksyon nan kè a (17). Peroxisome proliferators-aktive reseptè coactivator 1 / (-/-) kè sourit montre siyati yo f defo nan matirite ak anòmal grav nan fonksyon mitokondriyo ak dansite (18). Anplis de sa, efase mitofagi-medyatè Parkin la anpeche mitokondri mòfolojik ak fonksyonèl nan etap neonatal la (19). Mitokondri yo se òganèl trè dinamik, sibi fisyon konstan ak evènman fizyon ki asosye ak fonksyon yo. Nan fen peryòd anbriyon an, machin ak-espesifik ablasyon jenetik mitokondriyo fizyon pro nan MFN1 ak MFN2 nan sourit montre gwo malfonksyònman mitokondriyo apre nesans epi devlope kadyomiopati (20). Etonan, yon etid resan te revele ke hyp kwonik ia deranje dinamik mitokondriyo nan gui fetal la yon forbrain kochon (21). An konsekans, MQC ka aji kòm yon pwen fokal nan devlopman blesi myokad nan pitit neonatal IUH. Sepandan, yo konnen ti kras sou efè ipoksi prenatal sou sistèm MQC kadyak neonatal la ak efè malfonksyònman MQC sou sante kè neonatal la. Etid sa a te pran sou misyon sa a pou eksplore mekanis ki gen rapò ak mitokondriyo nan domaj myokad IUH-induit nan nouvo pitit pitit ak plis eksplore estrateji prevantif pou diminye blesi kadyak nan IUH.

Polyamines (PAs), ki gen ladan putrescine (PU), espèrmidin (SPD), ak espèmin (SP), yo prezan nan prèske tout òganis vivan epi yo esansyèl pou sivivan anbriyon ak fetis, kwasans, ak devlopman (22-24) . Etid yo te jwenn ke mouton ki ekspoze a IUH ka amelyore displazi anbriyon lè yo konplete poliamin ekzojèn (25, 26). Anplis de sa, kò a ap grandi nan literati endike wòl nan polyamines nan scavenging radikal gratis ak pwoteje ADN, pwoteyin, ak lipid kont domaj la prejidis nan estrès oksidatif. Li revele tou ke sipleman polyamine ogmante lavi a nan òganis modèl yo atravè antioksidan, anti-enflamatwa, ak mitofaji-pwovoke pro-esye (27-29). Etid resan yo te dokimante ke sipleman ak SPD nan dyetetik se kadyopwotektif ak pwolonje lavi nan tou de sourit ak imen pa ankouraje mitofaji ak respirasyon mitokondriyo ak amelyore fonksyon kè (30, 31). Sa ki pi enpòtan, nou te deja rapòte ke ekspoze ipoksik matènèl pandan etap yo an reta nan devlopman fetis la te lakòz lis la dased ana ak ogmante katabolism polyamines nan tisi carac nan rat tibebe ki fèk fèt. SPD te anpeche blesi nan kè nan rat pitit ven-jou ki te ekspoze a IUH pa inhibition mentation mitokondriyo (32).

2. Objektif

Nan etid sa a, IUH ipotèz pwovoke estrikti mitokondriyo ak defisi fonksyon lè yo ogmante estrès oksidatif ak detwi mekanis MQC nan kè pitit tibebe ki fèk fèt yo, ak tretman SPD matènèl nan matris yo sipoze diminye blesi myokad pa diminye pwogram nan devlopman nan mitokondri. Etid sa a ka kontribye nan devlopman estrateji prevantif oswa terapetik pou pitit IUH pou anpeche maladi kadyovaskilè granmoun.

3. Metòd

3.1. Bèt

Rat Wistar gason ak fi (3 mwa fin vye granmoun) yo te achte nan men Depatman Bèt Laboratwa nan Harbin Medical University. Tout pwosedi yo te apwouve pa Komite Revizyon Etik nan Harbin Medical University (Lachin), ak tout eksperyans yo te fèt pa direktiv Enstiti Nasyonal Sante yo. Rat yo ak yon rapò gason ak fi nan 2: 1 yo te owaza mete nan yon kaj pou kwazman. Yo te fè tès vajinal jou apre a pou detekte prezans espèm nan ploge vajinal oswa smears vajinal, ki te konfime kòm zewo-jou gwosès la. Rat ansent yo te kenbe nan yon chanm ak imidite kontwole (60 pousan) ak tanperati kontwole (21 degre), ak sik la limyè-fè nwa te 12: 12 èdtan.

3.2. Modèl ipoksi nan matris

Soti nan 15yèm jiska 21yèm jou gwosès la, yo te mete rat yo nan gwoup ipoksi (n=10) nan yon chanm plexiglass fèmen, yo te enjekte ak lè ak nitwojèn, epi yo te kontwole pa yon analizè oksijèn (Pro OX12{{13). }}; BioSpherix, New York, USA), epi yo respire ak yon kontni oksijèn 10 pousan pandan kat èdtan pa jou. Echantiyon san atè yo te pran nan atè femoral dwat la, yo te mezire gaz san ak valè pH pou kenbe presyon pasyèl oksijèn atè 50 - 55 mmHg, saturation oksijèn san an te kenbe nan 80 - 85 pousan, epi pwosedi espesifik yo te fèt jan sa dekri deja (32). Rat fi eksperimantal yo te owaza divize an kat gwoup: gwoup kontwòl (kontwòl), gwoup ipoksi andedan matris (Hpx), ipoksi entrauterin plis gwoup spermidin (Hpx-Spd), ak ipoksi entrauterin plis spermidine plis gwoup inhibitor (Hpx-Spd-DFMO). ). Yo te bay sis rat pou chak gwoup nan 15yèm - 21èm jou gwosès la. Yo te bay rat yo 0.9 pousan saline (1 mL/kg/d) nan gwoup kontwòl ak Hpx, SPD (5 mg/kg/d) nan gwoup Hpx-Spd, ak SPD (5 mg/kg/d) ak difuoromethy. -L-ornithine (DFMO, yon inibitè nan anzim kle nan sentèz polyamine ODC) (5 mg / kg / d) nan gwoup la Hpx-Spd-DFMO, respektivman. Apre akouchman, 1-tibebe ki te gen yon jou yo te sakrifye, epi yo te retire kè yo pou etid eksperimantal swivi.

3.3. Analiz histolojik

Tisi vantrikul gòch rat yo te koupe nan yon epesè nan <1 cm, fiks ak 4 pousan paraformaldehyde, dezidrate ak alkòl, ak entegre nan parafine. Yo te koupe parafine entegre a an tranch 5 mm epè, Lè sa a, seche nan yon tanperati fou konstan nan 60 degre, deparafine ak ksilèn, epi ki te swiv pa tach ematoksilin-eozin (HE). Yo te obsève tranch tisi yo pou evalye chanjman ki fèt nan mòfoloji kadyak ak estrikti ak yon mikwoskòp optik (Eclipse E200; Nikon, Tokyo, Japon).

3.4. Analiz imunofluoresan

Ki67 tach imunofluoresan te fèt jan sa dekri deja (33). Yon ti tan, tisi vantrikul gòch rat yo te fikse nan fòmalin 4 pousan, entegre nan parafine; dewaxing, hydrasyon, ak reparasyon antijèn yo te premye konplete. Tisi sa yo te bloke ak 0.5 pousan albumin serom bovin pou 2 èdtan epi apre sa yo te enkube ak Ki67 Antikò Monoklonal Lapen (1: 100, AF1738, Beyotime, Lachin) nan 4 degre lannwit lan. Apre lave ak PBS, tisi a te enkube ak Alexa fliyò ki make Goat anti-lapen IgG (1: 500, A 0468, Beyotime, Lachin) ak counterstained ak DAPI pou nwayo. Imaj yo te wè ak tcheke anba mikwoskòp lazè konfokal (OLYMPUS, FV1000, Japon). Lojisyèl la te itilize pou analize colocalisation zidòl fizyone yo.

3.5. Kantifikasyon fibwoz

Fibwoz kadyak te evalye pa tach trikrom Masson a. Jan sa dekri pi wo a, seksyon tisi kadyak ki soti nan rat neonatal yo te dewaxed ak idrate pa metòd estanda ak Lè sa a, tache ak trichrome Masson a dapre pwotokòl yo. Yo te itilize de koup transvèsal ki pa adjasan pou chak kè. Pousantaj nan zòn fibrotik nan zòn total nan vantrikul gòch yo te analize lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. TdT-medyatè dUTP Nick End Labeling ak mezi selil apoptotik

Yo te itilize yon tès TdT-medyatè dUTP nick end labeling (TUNEL) pou detèmine kantite selil apoptotik nan kè rat neonatal ki gen yon jou. Tisi kè yo te trete apre pwosedi nou te dekri deja lè l sèvi avèk yon Twous deteksyon lanmò selil (Roche, Almay) dapre enstriksyon manifakti a. Twa glisad ki soti nan chak blòk yo te evalye pou pousantaj selil apoptotik yo. Kat jaden glise yo te owaza egzamine ak 200 × agrandisman. An total, 100 selil yo te konte nan chak jaden.

3.7. Mezi nan aktivite anzim antioksidan

Yo te mezire aktivite superoksid dismutase (SOD) ak katalaz (CAT) lè l sèvi avèk twous komèsyal yo (SOD: A001-3- 1 ak CAT: A007-1-1; Jiancheng Bio. Institute, Nanjing, Lachin) ak yon espektwofotomètr (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, Etazini). Dapre enstriksyon manifakti a, operasyon an te konplete, epi konsantrasyon pwoteyin yo te mezire lè l sèvi avèk metòd asid bicinchoninic (Pierce, Rockford, Etazini) ak albumin serom bovine (BSA) kòm yon estanda (34).

3.8. Mezi kontni Adenosine 5'-Triphosphate

Kontni ATP nan tisi kadyak yo te mezire lè l sèvi avèk yon twous tès ATP (S0026B, Beyotime, Bio. Enstiti, Lachin). Dapre enstriksyon manifakti a, lisat la te ajoute nan pwopòsyon dapre pwa tisi a, omojeneize ak yon homogenizer vè, ak Lè sa a, santrifuje nan 4 degre 12000 g. Yo te pran supernatant la, epi yo te detekte kontni ATP nan chak echantiyon ak yon luminomètr (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, USA) BCA twous (P0012s, Beyotime, Bio. Enstiti, Lachin). Metòd asid bicinchoninic te itilize pou detèmine konsantrasyon pwoteyin a epi konvèti konsantrasyon ATP nan pwoteyin nmol/g.

3.9. Mikwoskopi elektwonik transmisyon

Tisi apical kadyak la te diseke nan apeprè 1 mm × 1 mm × 1 mm ti moso epi yo te fikse nan tanpon fosfat glutaraldehyde a 4 degre. Apre dezidratasyon woutin, tranpe, entegre, ak tach, seksyon ultramins nan 50 - 70 nm yo te fèt. Yo te obsève ultrastructure tisi kadyak la anba yon mikwoskòp elèktron transmisyon (TEM) ak foto (H600 Hitachi, Tokyo, Japon). Single mitokondri ak myofilaments yo te trase anba kondisyon 10000 fwa agrandisman ak vèsyon lojisyèl Image J 1.80 (National Institutes of Health), ak zòn yo te mezire nan chak kè (35). Antretan, fragman mitokondriyo <1 µm3, ki pa t divize (anjeneral wonn), yo te idantifye, epi yo te konte pousantaj mwayèn nan fragman mitokondriyo nan jaden an gade lè l sèvi avèk Endèks Fragmantasyon Mitokondriyo (MFI).

3.10. Izolasyon mitokondriyo

Mitokondri yo te izole nan 4 degre lè l sèvi avèk santrifujasyon diferans ak yon Twous Izolasyon Mitokondri (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Lachin). Yon ti tan, yo te koupe tisi kè fre an moso tisi ak santrifuje ak 10 volim PBS pre-refwadi, yo te jete surnatant la, yo te dijere presipite a ak tripsin pou 20 minit, yo te santrifuje tanpon izolasyon A te ajoute, yo te transfere surnatant la nan yon lòt. tib, santrifuje ankò, ak fraksyon nan presipite te mitokondri izole yo. Dènye granules mitokondriyo kadyak la te resuspende nan tanpon omojèn, ki estoke sou glas, epi yo te itilize pou eksperyans sou fonksyon respirasyon mitokondriyo nan 4 èdtan.

3.11. Mezi Konsomasyon Oksijèn Mitokondriyo

Konsomasyon oksijèn mitokondrial yo te mezire pa yon elektwòd oksijèn Clark-type (Hansatech Instruments, Norfolk, UK) nan yon tanpon respirasyon mitokondriyo. Piruvat (5 mM) ak malat (5 mM) yo te itilize kòm yon substra pou mitokondri konplèks ki gen I nan konsantrasyon final la nan 500 µg pwoteyin / mL. Yo te mezire konsomasyon oksijèn ki ankouraje ADP (respirasyon eta 3) an prezans 200 µM ADP, epi yo te kontwole konsomasyon oksijèn endepandan ADP (respirasyon eta 4). Rapò kontwòl respiratwa a (RCR, eta 3 divize pa eta 4) reflete konsomasyon oksijèn pa fosforilasyon (kouplage). Pwosedi yo kontinye, jan sa te dekri deja (36).

3.12. Analiz Western Blot

Yo te rekòlte echantiyon tisi kadyak la epi estoke nan -80 degre. Tisi kadyak nan vantrikul gòch jele yo te omojènize nan tanpon lysis RIPA frèt (Beyotime Inc., Shanghai, Lachin P0013B). Konsantrasyon pwoteyin yo te mezire lè l sèvi avèk yon twous tès pwoteyin BCA (Beyotime Inc., Shanghai, Lachin P0006C). Echantiyon yo ki gen pwoteyin total yo te separe pa 10 pousan (w/v) SDS-PAGE epi yo transfere sou yon manbràn PVDF (Millipore, Bedford, MA, Etazini). Yo te itilize antikò sa yo: Antikò pou GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1- AP), SIRT-1 (1:1000,{{16} }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,{19998-1-AP), ak BAX (1.1000,509599-2-Ig) yo te achte nan men Proteintech (WuHan, Lachin), BCL2 (1: 2000, sc-7382) ak DRP1 (1:1000, sc{-271583) yo te achte nan men Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) ak PGC. -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Cambridge, MA, UK). Antikò segondè a (refor peroksidaz ki make kabrit anti-lapen IgG) te soti nan Beyotime Corporation (Shanghai, Lachin). Entansite bann pwoteyin yo te mezire lè l sèvi avèk yon sistèm D 'jèl Fluor Chem Chemiluminescence (Protein Senp, USA). Te dansite optik nan bann pwoteyin yo analize ak imaj J lojisyèl vèsyon l.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Modèl Cardiomyocyte ipoksik

Neonatal rat cardiomyocytes (NRMCs) yo te izole ak kiltive pa metòd estanda, jan yo dekri deja (32). Yon ti tan, kè yo nan twa jou rat neonatal yo te ekstrè, mens, kiltive, ak Lè sa a, dijere nan 0.25 pousan tripsin ak 0.02 pousan EDTA (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Lachin). Apre santrifijasyon, presipitasyon yo te transfere nan DMEM siplemantè ak 10 pousan serom ti towo bèf fetis (Biolot, Larisi) epi yo te enkube nan lè imid ki gen 5 pousan 2. Twa jou apre yo te fin simen, selil yo te mete nan yon chanm ipoksik vè (Biospherix OxyCycler C42). , Redfield, NY), epi ranpli ak nitwojèn pou 8 min pou dechaje oksijèn rezidyèl la. Kardyomiosit sa yo te owaza divize an gwoup sa yo: (1) Gwoup kontwòl (kontwòl), selil kiltive nan kondisyon enkubasyon nòmal; (2) gwoup ipoksi (Hpx), selil yo mete nan chanm ipoksik la pou 24 èdtan epi yo kiltive nòmalman pou 24 èdtan; (3) Gwoup Hpx-Spd, selil yo mete yo nan chanm ipoksik la epi yo enkube ak 10 µmol/L SPD pou 24 èdtan; (4) Gwoup Hpx-SpdDFMO, selil yo mete yo nan yon chanm ipoksik epi yo enkube ak 10 µmol/L SPD plis 2 mmol/L DFMO pou 24h.

3.14. Mezi nan espès oksijèn reyaktif

Yo te mezire jenerasyon ROS pa tès tach dihydroethidium (DHE) (Cat No. S0063, Beyotime, Lachin). Yon ti tan, kardyomyosit prensipal yo te enkube ak 5 µmol / L DHE nan 37 degre pou 30 min, lave ak PBS, ak Lè sa a, deplase anba mikwoskòp la yo obsève chanjman ki fèt nan entansite fluoresans. Imaj yo te pran ak yon mikwoskòp fliyoresan Olympus FluoView FV1000 (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Japon) nan yon longèdonn eksitasyon 535 nm, ak longèdonn maksimòm emisyon an te 610 nm, n> 20 selil pou chak gwoup.

3.15. Detèminasyon potansyèl manbràn mitokondriyo

Dye tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) se pozitivman chaje epi yo ka selektivman sitiye nan mitokondri. Li lajman itilize pou detèmine potansyèl manbràn mitokondriyo (∆Ψm). Nan ti bout tan, yo te ajoute solisyon k ap travay pou tach TMRE nan yon konsantrasyon 200 µmol/L nan kadyomyosit ki te gwoupe yo trete, byen melanje epi yo mete l nan yon enkibatè selil a 37 degre pou 20 minit. Supernatant a te aspire, epi selil yo te lave ak PBS epi yo te deplase nan yon mikwoskòp Envèse yo obsève chanjman nan entansite fliyoresans. Longèdonn eksitasyon an te 549 nm, ak limyè emisyon an te 579 nm. Entansite fluoresans wouj la te endike chanjman ∆Ψm, n > 20 selil pou chak gwoup.

3.16. Eksperyans lokalizasyon mitokondriyo ak lisosomal

Dapre enstriksyon an, Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, Lachin) ak Lyso-Tracker Wouj (NO.C1046, Beyotime, Lachin) te itilize analiz colocalization mitokondriyo ak lizozomal. NRCMs yo te chaje ak 200 nM MitoTracker Green FM ak 50 nM LysoTracker Wouj nan HBSS pou 30 minit anvan eksperyans, selil yo te lave ak PBS, ak Lè sa a, imaj selil yo te jwenn lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan Olympus FluoView FV1000. Liy lazè 488 nm te itilize pou eksite MitoTracker Green fluoresans, ki mezire ant 505 ak 515 nm. Pou LysoTracker Wouj, yo te itilize liy lazè 577 nm ak yon mezi 590 nm. Yo te detèmine sipèvizyon entansite pixel wouj ak vèt lè l sèvi avèk lojisyèl quantification sou Nikon Eclipse Microscope, n > 20 selil pou chak gwoup.

3.17. Analiz estatistik

Tout done ki soti nan gwoup eksperimantal yo te konpare lè l sèvi avèk yon sèl-fason ANOVA ki te swiv pa tès post hoc Bonferroni ak GraphPad Prism lojisyèl vèsyon 8 (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) ak SPSS lojisyèl vèsyon 17.1 (SPSS, Chicago, IL, Etazini). Etazini). Done yo te eksprime kòm mwayen ± SEM, epi nivo siyifikasyon an te fikse yo dwe P < 0.05.

4. Rezilta yo

4.1. Pitit ak Karakteristik kè

Pwa kò (BW) ak pwa kè (HW) yo te mezire, epi yo te kalkile rapò HW a BW (HW/BW) (Figi 1). Rezilta yo te montre ke BW ak HW rat tibebe ki fèk fèt yo diminye, ak HW/BW yo te ogmante akòz ipoksi nan matris. Konpare ak gwoup IUH a, BW ak HW nan rat neonatal nan gwoup SPD a te ogmante (P <0.05), ak HW/BW a diminye (P <0. 05); Konpare ak gwoup SPD, tou de BW ak HW nan gwoup tretman DFMO diminye (P <0.05), ak HW / BW ogmante siyifikativman (P <0.05).

4.2. Efè SPD sou estrikti mòfolojik myokad, pwoliferasyon selilè, ak pitit fibrozizin ki fèk fèt ki ekspoze a

Rezilta tach HE kadyak yo te montre ke kè pitit yon sèl jou ki te ekspoze a IUH te parèt anfle ak fib myokad ki te ranje yo. Sepandan, kè IUH yo trete ak SPD kenbe yon estrikti tisi myokad akseptab (Figi 2A). Apre sa, nou evalye kantite kardyomyosit binikleyè ak tisi HE-tache tranch la; kantite kardyomyosit binikleyè te pi gwo nan gwoup IUH pase nan gwoup kontwòl la (P <0.05). Konpare ak gwoup IUH a, pwopòsyon kardyomyosit binikleyè nan gwoup tretman SPD la diminye anpil (P <0.05); DFMO atenye efè SPD (P <0.05) (Figi 2C). Nou te detekte plis ekspresyon Ki67 (yon makè selil proliferasyon) nan myokad rat lè l sèvi avèk metòd imunofluoresans la. Plis ekspresyon Ki67 ki pi wo a, se pi fò fliyoresans woz la pa fusion wouj ak ble (Figi 2E). Rezilta yo te montre ke konpare ak gwoup kontwòl la, ekspresyon Ki67 nan gwoup IUH diminye anpil (P <{23}}.{25}}5), ekspresyon Ki67 siyifikativman ogmante apre administrasyon SPD la (P <{ {28}}.05), ak efè SPD te aboli pa DFMO (P <0.05) (Figi 2F). Rezilta sa yo endike ke SPD ka anpeche retrè a twò bonè nan kardyomyosit soti nan sik selil la pwovoke pa IUH ak ankouraje pwopagasyon nan kardyomyosit nan nouvo pitit ki ekspoze a IUH. Lè sa a, nou te itilize tach Masson pou detekte chanjman ki fèt nan kontni kolagen an myokad epi evalye fibwoz myokad pa mezi zòn kolagen an (Figi 2BandD). Nou te jwenn ke depozisyon kolagen myokad nan kè yo nan rat yo ki fèk fèt ekspoze a IUH ogmante (P <0.05), nivo a ki te pi wo konpare ak gwoup kontwòl la. Okontrè, zòn nan fibwoz myokad apre tretman SPD a siyifikativman redwi (P <0.05). Sepandan, konpare ak gwoup tretman SPD, zòn fibwoz la siyifikativman ogmante nan gwoup HpxSpd-DFMO (P <0.05).

4.3. Efè espèrmidin sou estrikti mitokondriyo myokad, fonksyon respiratwa, ak kontni adenozin 5'-trifosfat nan pitit ki fèk fèt ki ekspoze a ipoksi entraterin.

Chanjman estrikti ultrastruktural nan tisi kadyak ak karakteristik mitokondriyo yo te analize pa TEM (Figi 3A). Imaj J lojisyèl te itilize pou quantifier pousantaj kontni mitokondriyo (zòn mitokondriyo nan zòn selil tout antye) ak zòn mitokondriyo (Figi 3B ak C). Rezilta yo te montre ke nan gwoup kontwòl la, myofilaments myokad yo te ranje lòd, estrikti sarcomere la te klè, mitokondri yo te kontra enfòmèl ant, matris la te pi dans, ak mitokondriyo kristae yo te ranje lòd. Sepandan, mitokondri yo anfle, epi yo te obsève matris detachman ak dansite diminye nan kèk kardyomyosit nan gwoup IUH la. Konpare ak gwoup kontwòl la, pwopòsyon mitokondri nan kardyomyosit ak zòn mitokondri yo tou de te redwi (P <0.05). Sepandan, nan kè rat yo nan tretman SPD a, myofilaments myokad yo te pwòp, estrikti sarcomere a te klè, matris mitokondriyo a te kontra enfòmèl ant, ak anfle mitokondriyo a diminye. Konpare ak gwoup IUH a, pwopòsyon mitokondri nan kardyomyosit ogmante (P < 0.0 5), ak zòn nan mitokondri ogmante (P < 0.05). DFMO anpeche efè SPD-induit sa yo (P <0.05).

Nou itilize piruvat/malat kòm substra pou evalye fonksyon respiratwa mitokondriyo a, ki gen ladan to respiratwa eta 3 ak 4 ak RCR (Figi 3D - F). Nou te remake ke konpare ak gwoup kontwòl la, to respiratwa a nan eta 3 ak 4 ak RCR nan gwoup IUH a te tout siyifikativman pi ba (P <0.{{10}}5). Enteresan, RCR nan eta 3 ak 4 refè apre tretman SPD la (P <0.05). Kontrèman, efè SPD sa yo te siyifikativman anpeche nan gwoup tretman DFMO (P <0.05). Menm jan an tou, konpare ak gwoup kontwòl la, kontni ATP myokad nan gwoup IUH a siyifikativman redwi (P <0.05). Konpare ak gwoup IUH a, kontni ATP a konsiderableman ogmante nan gwoup SPD trete (P <0.05), ak DFMO diminye efè SPD (P <0.05) (Figi 3G). Konklizyon sa yo sijere ke SPD ka pwoteje estrikti mitokondriyo myokad la ak domaj fonksyon epi anpeche n bès nan nivo ATP nan rat pitit neonatal ki ekspoze a IUH.

【Pou plis enfòmasyon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】