Ekstrè Metanolik atire dejenerasyon restinal nan Rat dyabèt

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Abstrè:Li te sijere ke epina ekstrè methanolic (SME) anpeche fòmasyon an nan pwodwi glycation avanse (AGES), ki ogmante pandan pwogresyon dyabèt, kidonk li enpòtan pou konnen si SMEs gen efè benefisye sou retin dyabèt la. Nan etid sa a, nan atak vitro te montre ke SME inibit glikasyon, fòmasyon gwoup kabòn, ak redwi-thiol gwoup deplesyon gwoup nan albumin sewòm bovine ki enkyete swa diminye sik oswa methylglyoxal. Efè SME a nan rès la nan streptozocin-induit rat dyabèt (STZ2) te tou etidye (n = 10) nan gwoup la normoglycemic, STZ, RAT STZ trete ak SME, ak RAT RAT trete ak aminoguanidine (gwoup referans anti-AGES) pandan 12 semèn. Retin nan te seksyone ak iminostain pou Ne-carboxymethyl lysine (CML), reseptè RAGE, NADPH-Nox4, inducible oksid nitrik (iNOS), 3-nitrotyrosine (NT), nikleyè NF-kB, faktè kwasans vaskilè (VEGF), glial fibrillary asid (GFAP), S100B pwoteyin, ak TUNEL asasina. Lipid peroxidation te detèmine nan tout retin nan pa malondialdehyde (MDA) nivo. Rezilta yo te montre ke nan retin dyabèt la, SME redwi CML-RAGE ko-lokalizasyon, estrès oksidantal (NOX4, iNOS, NT, MDA), enflamasyon (NF-B, VEGF, S10B, GFAP), ak aparèy (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

Mo kle:epinèt; dyabetik retinopati; pwodwi glikasyon avanse; estrès oksidantif; enflamasyon; RAJ; kabòn

Tanpri klike la a pou konnen plis

1. Entwodiksyon

Rejim alimantè ki baze sou plant yo te asosye ak yon risk ki pi ba pou devlope maladi kwonik tankou obezite, kalite 2 dyabèt, ak maladi kè kowonè. Spinach (Spinacia oleracea L.) se yon legim fèy manjab boule nan tout mond lan akòz bay yon kantite lajan apresye nan fib, vitamin, ak mineral [1,2]. Plizyè nan fitozochimik li yo te idantifye, ki gen ladan klorofi, kartenoid (lutein ak zeaxanthin) [3], ak konpoze fenomèn (flavonoid, kolòn) [4-8] (gade sipleman 1). Li te rapòte ke epina, lè yo enjere kòm yon manje, ekstrè dlo-solib, oswa nan yon fòm friz-sèk, ak thylakoid li yo gen anti-kansè, anti-obezite, ak pwopriyete ipokritm [9]. Efè anti-enflamatwa nan epina te demontre nan modèl bèt andoksemi, bèt obezite, ak moun ki an sante [9]. Efè antioksidan li yo te etidye nan selil kansè nan pwostat imen, modèl bèt ak obezite, UV-iradye mice, ak adenocarcinoma nan pwostat la sourit transjenik [9,10]. Efè anti-glikoz ak efè anti-enflamatwa nan ekstrè methanolik (SME) yo te etidye nan modèl la nan glikoz-induit dyabèt nan zèb ak isoproteren-induit necrosis myocardial nan rat, respektivman [11,12]. SME diminye moglobin glikoz ak nivo fruktosamine, ki gen ladan nivo yo pwoteyin glise, pa diminye aktivite redwi nan lantiy la okilè [11]. Rezilta ki anwo yo sijere ke SMEs ta ka gen yon efè prevantif sou pwogresyon an nan konplikasyon melitisyen dyabèt tankou retinopatis dyabèt (DR).

DR pwogresivman mennen nan pèt nan akizisyon vizyèl oswa avèg ki te gen rapò ak enflamasyon, estrès oksidantal, ak akimilasyon nan pwodwi glycation avanse (AGES)[13,14]. AGES yo pwoteyin travèse pwoteyin, chanje estrikti / fonksyon ak woulman li yo / clearance. AGES ka pwodwi pa yon reyaksyon ki pa anzim ant glikoz la ak yon gwoup amine gratis nan pwoteyin, fòme entèmedyè revèsib tankou baz Schiff ak pwodwi Amadori (fructosamine)[15]. Lòt mekanis pou fòmasyon AGES gen ladan chemen "estrès kabòn" la, kote oksidasyon nan sik ak lipid kreye dyakarbonyl entè-medyatè tankou glyoxal ak methylglyoxal (MGO), ki mennen nan fòmasyon AGES kòm N:-kabòn lysine (CML)[ 16]. Ogmante nivo CML nan sewòm ak vire kapab yon makè byochimik pou tou de aparans ak pwogresyon nan DR [17,18]. Nan retin la, deklanchman an nan RAJ reseptè pa AGES (AGES-RAGE)) pwovoke ekspresyon an nan pwoteyin asid glisman (GFAP) ak faktè pro-enflamatwa, ki kontwole pa faktè a nu-klè kappa-limyè-amelyore nan selil aktive B (NF-kB)[ 19]. NF-kB pozitivman kontwole ekspresyon RAGE pa aji kòm yon mekanis fidbak pozitif [20].ki sa ki sispannNan lòt men an, konsantrasyon segondè nan S100B, yon pwoteyin kalsyòm-obligatwa, ka tou aktive NF-kB, pwovoke neuroinflamation ak deklanchman selil glise [21]. Ekspresyon an nan S100B nan astwonòt pwovoke efè nerotoksik manifeste pa astwogliotik reyèl [22].

Cistanche ka anti-aje

Estrateji yo te eksperyans devlope yo anpeche domaj restinal. Gen kèk fitochimik nan epina izole soti nan lòt plant yo te asosye ak anpèchman nan AGES ak estrès oksidantal [8,23-26]. Lutein, astaxanthin, ak kampferol te pwoteje selil restriksyon imen-sòti (ARPE-19) soti nan domaj nan anti-AGES yo, antioksidan, ak pwopriyete anti-apoptosis [26-28]. Rezilta sa yo sijere ke fitochimik yo nan epinachi gen yon wòl ki enpòtan nan prevansyon dejenerasyon retinal tankou DR. Yon lòt estrateji ki te lè l sèvi avèk aminoguanidine (AG) kòm yon inibitè potansyèl nan glikasyon ak iNOS aktivite, atann akimilasyon CML ak fòmasyon nan précurseurs reyaktif di-kabòn nan rat [29]. Sepandan, nan yon esè miltisan ak owaza klinik ak 690 pasyan dyabèt, efè a benefisye pa te etabli klèman [30].

Chanjman ki fèt nan dejenerasyon retinal anba kondisyon ipèrseksyèl yo te pè. Se poutèt sa, li enteresan konnen si SME pwoteje kouch restinal soti nan domaj ki gen rapò ak anti-AGES li yo, antioksidan, ak pwopriyete anti-enflamatwa nan retin nan streptozocin-induit rat dyabèt.

2. Materyèl ak metòd

2.1.Preparasyon nan Ekstrè Metòd la nan Epina (SME)

Fèy yo fre nan epinyè (S.oleracea L.) yo te rekòlte nan sezon otòn-sezon fredi nan yon jaden agrikòl nan Pwovens Puebla, Meksik, ak idantifye pa yon botanis nan herbarium nan Enstiti Polytechnic Nasyonal (IPN, Meksik, Meksik). Li nan konte, rejyon Nationale dUPN.

Fèy yo te dezidratasyon ak amann tè. Fèy sèk yo te macerated ak methanol nan tanperati chanm, filtè nan filtè cellulose (Ki sa ki, Maidstone, UK), ak sèk lè l sèvi avèk yon evaporatè rotatory evaporatè (BUCHI Rotavapor R-200, Swis)nan 45 ° Cto sede yon jansiv vèt (95.0g / kg fèy sèk).Anti aje sistansSME a te estoke nan fènwa a nan 4 °Cuntil itilize. Pou tout redaksyon, ekstrè a te rekonstwi nan dlo distile [11].

2.2.In Vitro Assays nan SME Anti-Glycation

2.2.1. Fòmasyon nan Pwodwi Glycation Avanse Fen sòti nan Bovine Serum Albumin (BSA-AGES)

Agas BSA-AGEs te pote soti, jan sa dekri deja [31]. Yon ti tan,10 mg / mL BSA (fraksyon V; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)te ajoute swa nan D-glucose 0.5 M, D-fructose 0.5 M, oswa methylglyoxal 2.5 mM, epi li te fè nan yon solisyon 0.1 M PBS (pH 7.4)ak 0.02% sodyòm azid. Konsantrasyon SME (5, 10,25, 50, 100, ak 200 mg / mL) te ajoute nan chak melanj ak Lè sa a, enkyete nan 37 ° C pou 4 semèn. Apre sa, sik ki pa reyaktive yo te retire pa dyaliz kont dlo distilled pou de jou nan 4 °C. BSA-laj nivo yo te detèmine pa fliyò spectrophotometry (Ex370/ Em 440 nm; modèl LS 30, Perkinelmer LAS Ltd., Buckinghamshire, UK)[32]. Glycation nan pwoteyin BSA pa diminye sik ak MGO te yon kontwòl pozitif (BSA glise), pandan y ap enkubasyon an nan BSA glise ak aminoguanidine (1 mg / mL), yo te itilize kòm kontwòl negatif (BSA glycated-AG). Yo te fè aza nan triplicate.

2.2.2. Fructosamine Assay

Nivo fructosamine a te detèmine pa nitro tetrazolium (NBT) asasina [33], ki baze sou kapasite nan fructosamine diminye NBT, fòme fòma, yon fen ki gen koulè pal anba kondisyon alkòl. Dis mikwolitè nan swa nan kontwòl yo oswa glycated BSA-incubated konsantrasyon SME (BSA-SME) yo te ajoute nan 90 μL nan NBT nan 2.5 mM, prepare nan yon tanpon kabòn (0.1 M; pH 10.3); tout te enkyete nan 37 ° CC pou 30 min. Absòbe a nan 530 nm te mezire. Konsantrasyon fructosamine (nmol / mg) yo te kalkile dapre yon koub estanda nan fòma.

2.2.3. Detèminasyon nan Gwoup Kabonyl Fòmasyon ak Gwoup Thiol Depletion nan BSA-AGES

Kabonyl gwoup konsantrasyon te mezire nan BSA-SME ak kontwòl echantiyon, dapre Levine et al. [34]. Yon solisyon de 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH;10 mM)nan 400 μL nan 2.5 MCL te ajoute nan 100 μL chak echantiyon ak enkyete nan fènwa pou 60 min nan tanperati chanm.cistanche benefíciosLè sa a, 500 μL nan asyaj trichloroacetic (20%w / v)te ajoute epi kenbe yon fwa pou 5 min. Echantiyon yo te santrifye nan 4000 rpm pou 15 min, ak pellet pwoteyin la te lave twa fwa ak ethyl acetate / ethanol (1:1 v / v). Apre sa, echantiyon yo te sispann nan 250μL guidine idrokloride a 6 M. Konsantrasyon nan gwoup kabonyl (nmol / mg pwoteyin) te kalkile pa spectrophotometry nan 370 nm absòbe (EON, BioTek Enstriman, Inc., Winooski, VT, USA) lè l sèvi avèk koefisyan an absòpsyon nan DNPH (22,000 M-1 cm-1).

Dapre metòd Ellman a, detèminasyon an nan deplesyon gwoup thiol nan BSA-SME ak echantiyon kontwòl te fèt. Yon ti tan, 10 μL nan 5,5'5-Disulfanediylbis (2-nitrobenzoic asid)(DNTB;10 mM, prepare nan PBS)ak 50 μL nan echantiyon glikoz te enkukib pou 15 min nan tanperati chanm, Lè sa a, absòbe a nan 410 nm te mezire. Nivo gwoup thiol gratis yo te kalkile lè l sèvi avèk yon koub estanda nan L-cysteine (0.4-11 μM) ak eksprime nan nmol / mg pwoteyin [34].

2.3. Efè SME sou Retin nan Rat dyabetik 2.3.1.Dyabèt Endiksyon nan Rat yo

Rat gason ki peze 250± 10 gr (N = 40) vit pou 8 h yo te itilize. Yon dòz entèraperitoneal nan streptozocin (60 mg/kg) nan sitrate buffer(10 mM, pH 4.5)(Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA)te administre [35]. Twa jou apre, nivo glikoz la te mezire (glikomèt; ACCU-CHEK aktif; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Almay) pa kolekte yon gout nan yon echantiyon san soti nan ke a. Bèt ak nivo glisemik pi wo pase 350mg / dL yo te rekrite pou etid la. Glikoz nan san an te mezire chak semèn pou 12 semèn.

2.3.2. Konsepsyon eksperimantal

Rat streptozocin-induit rat dyabèt (STZ) yo te divize owaza nan gwoup sa yo (n = 10): STZ trete intragastrically ak 2 mL nan dlo pou bwè (STZ); STZ trete ak SME nan 400 mg / kg (STZ-SME); rat nòmal (NG); ak STZ trete ak50 mg/ kg aminoganidine (AG; Sigma-Aldrich, Inc.) (STZ-AG). STZ-AG te itilize kòm yon gwoup referans anti-LAJ. Yo te administre dòz yo chak 24 h (9:00 a.m.) pandan 12 semèn. Nivo glycemic nan tout gwoup yo te kontwole chak semèn. Rejim dòz SME a nan 400 mg / kg te baze sou sa ki annapre yo: 7 g nan SME jwenn soti nan 100g nan vèmin fre (done pa montre). Kantite lajan sa a ekivalan a konsomasyon chak jou nan yon moun mwayèn de 70 kilogram nan rejim alimantè Ameriken an [36], ki koresponn ak 100 mg nan ekstrè / kg nan pwa kò.Cistanche ekstrè radyasyon anti radyasyonNan lòt men an, akòz diferans lan nan metabolis la akselere nan rat, li rekòmande pou ogmante konsomasyon an nan nenpòt ki ekstrè natirèl jiska 6.4 fwa pou etid konparezon ak moun [37]. Dòz la nan 400 mg / kg ke nou te itilize te baze sitou sou rezilta yo jwenn nan yon modèl nekwoz miocardial ki pwovoke nan rat Wistar, ki te montre ke efè anti-enflamatwa nan SME se pi enpòtan nan 300 mg / kg [12].

2.3.3. Istolojik ak Immunohisto chimi evalyasyon

Yo te mete je yo nan fòma net e apre sa yo te manke nan alkòl klase e yo te entegre nan parafin. Seksyon istolojik nan 2 μm yo te monte sou glise elektwokaraj, dwa, ak sere jiska solisyon antijèn rekiperasyon (K035;10× Citrate Buffer, pH6; Dyagnostik BioSystems, Pleasanton, CA, USA). Yon sistèm iminodeteksyon ki baze sou polyVuemouse / lapen DAB sistèm deteksyon, Diagnostic BioSystems) te itilize. Antikò prensipal sa yo te itilize: pwoteyin asid glise (anti-GFAP; MAB360; Chimik Entènasyonal, Inc., Temecula, CA, USA); faktè vaskilè grandi (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biyoteknoloji, Inc., Dallas, TX, USA), S100 kalsyòm-obligatwa pwoteyin B (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, UK), ak faktè nikleyè kappa-limyè-amelyore nan selil aktive B (anti-NF-kB p65;sc-8008). Tout dilisyon yo te nan 1:200 ak enkyete lannwit lan nan 4 °C. Yon antikò segondè (Mouse / Rabbit PolyVueTM) te ajoute dapre enstriksyon fourisè a.èrbSeksyon yo te tache ak DAB plis / substra kwomojèn ak ematoksiklin. Obsèvasyon istolojik ak kaptire imaj yo te pote soti nan yon Mikwoskòp Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Almay).

Pou imunofluoresans tach, glisad yo te enkoni lannwit lan nan 4 °CC ak antikò prensipal: kabòn Lysine (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, UK), reseptè laj (anti-RAGE; sc-365154), NADPH oksid 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotyrosine (anti-NT; ab110282), ak nitric oksid (endikid) (anti-iNOS; A00368-1; Boster Bio, Pleasanton, CA, USA). Lè sa a, antikò segondè sa yo te itilize: pou anti-RAGE, kabrit anti-sourit (FITC)-konjige (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); pou anti-CML ak anti-NT, sourit anti-lapen IgG-PE (SC-3753); ak pou anti-iNOS ak anti-Nox4, m-IggkBP-PE (Sc-516141) . Tout te enkyete nan tanperati chanm pou 60 min. Apre sa, seksyon yo te monte nan yon mwayen ki gen 4',6-Diamidine-2'phenylindole dihydroloride (DAPI). Anti-CML ak antikò anti-RAGE yo te ko-ibridize nan glise nan menm glise. FloidTM Selil Imaging Estasyon (lavi teknoloji Carlsbad, San Diego, CA, USA) te itilize pou imaj fluoresans.

2.3.4.Apoptosis Evalyasyon

Apoptoz la nan selil retinal yo te detekte dapre manyèl la ki dekri pa transfè tèminal dekonpoze pa transfè tèminal deteksyon (TDT)-medyatè deklarasyon vwayaj deksikoloji (dUTP)nick-fen etikèt (TUNEL) lè l sèvi avèk nan Situ Cell Deteksyon Kit, TMR (tetramethyl-rhodamine-5-dUTP) wouj, vèsyon 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Yon ti tan, glise yo dewaxed yo te rated ak rense de fwa ak PBS. Lè sa a, yo te inogire ak melanj lan reyaksyon TUNEL nan yon atmosfè imid pou 60 min nan 37 C. Apre sa, seksyon yo te monte ak DAPI ak obsève nan mikwoskòp fluoresans (FloidTM Estasyon Imaging). IOD pou TUNEL te kalkile pou kouch restinal yo.

2.3.5. Lipid Peroxidation Assayé

Pou evalyasyon an nan malondialdehyde (MDA)nivo nan tisi yo retinal, apeprè 3 mg nan tisi fre (n = 3) yo te omojèn ak trete kòm deja re-rapòte [38]. Nivo MDA yo te quantified apre enstriksyon founisè a (OXItek-TBARS aza twous, Enzo Life Syans, Agrikilti, NY, USA).

2.4.Analiz estatistik

Pou analiz estatistik, tout mikwograf retinal yo te kaptire ak yon grandè nan 200× nan 100 μm pi lwen pase rejyon an nè optik. Apeprè 40 imaj pou chak gwoup bèt (n = 7) yo te analize. Analiz imaj te fèt ak lojisyèl Imaj-Pro Premier Version 9.0 (Medya Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Nou te itilize lojisyèl prism GraphPad (La Jolla, CA, USA; vèsyon 8.0). Figi yo montre valè graf nan bwat ak-whisker konplo (medyàn, premye twazyèm-twazyèm katye, valè minimòm-maksimòm) pou kouch selil gangliyon (GCL), kouch enteryè nikleyè (INL), ak kouch nikleyè (ONL). Devyasyon an vle di ak estanda (vle di ± SD) yo montre nan Apendix A (tab A1-A3). Nan tout ka yo, yon tès YON sèl-fason ANOVA ki te swiv pa tès Tukey a te fèt. p<0.05 was="" considered="" statistically="">