Karakterizasyon estriktirèl ak evalyasyon aktivite anti-enflamatwa ak anti-tirozinaz nan polifenol ki soti nan melastom nòmal pati 2

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Konpoze 3 a te gen menm fòmil molekilè ak konpoze 2 a, jan sa detèmine pa done HRESIMS li yo. Konparezon ant done NMR nan 3 ak 2 (Table 2) te revele ke gwoup la methoxyl nan galloyl-C -4 nan 2 deplase nan galloyl-C -3 'nan 3. Sa a te konfime pa korelasyon yo HMBC. (Figi 2) pwoton methoxyl (8y 3.88) ak pwoton aromat (bH7.24) ak galloyl-C-3'(6c 149.1) nan 3, ak chanjman chimik gwoup methoxyl, galloyl-C{ {24}}, galloyl-C-4, ak galloyl-C-3' ki te deplase soti nan bc60.8, 151.5, 141.3, ak 146.5 nan 2tobc56.7, 146.6, 140.7, ak 149.1 nan 3, respektivman. efè koton nan 237nm ak yon negatif nan 262 nm nan spectre CD endike konfigirasyon (S) gwoup HHDP pou 3 [24]. Konfigirasyon pati sik la te dedwi apati konstan kouple (=8.5 Hz) pwoton anomerik moyet glikozil la. Idwoliz asid nan 3 ak 1 M HCl bay D-glikoz, ki te konfime pa analiz TLC ak GC. Kidonk, yo te idantifye konpoze 3 a kòm 1-O-galloyl-6-O-({3-methoxygalloyl){-2,{3-O-(S)-hexahydroxydiphenoyl{{ 66}}D-glikoz.

Fòmil molekilè 4 la te dedwi nan spectre HRESIMS li yo (m/z 783.1032, [MH]-) kòm C35 H28 O21. Pwa molekilè li a te 16 inite mas mwens pase sa yo ki nan 3, ki ka atribiye a absans la nan yon idroksil ak prezans nan yon pwoton aromat (6H6.87) nan vanilloyl-C-5' nan 4 (Table2) . Sa a te konfime nan prezans yon 1,2,4-trisubstituted moyete aromat （μ7.60 （dd, J=8.3,1.8 Hz）,6.87 （d, J=8 .3 Hz）, ak 7.57 （d, J=1.8 Hz）） ak chanjman chimik galoyl-C-5' nan δc 145.8 in 3 nan vanilloyl-C-5 ' nan bc 115.9 nan 4. Methoxyl protons (6H 3.90) ak aromat proton (H 6.87) korelasyon ak vanilloyl-C-3' nan spectre HMBC (Figi 2) plis konfime pwoton aromat (H 6.87) nan vaniloyl-C-5'. Atropisomerism nan HHDP a te montre yo dwe yon konfigirasyon S pa aparans nan efè koton pozitif ak negatif nan 239 nm ak 263 nm, respektivman [24]. Konstan kouple pwoton anomerik la nan 4 yo te 8.5 Hz ki te raple konfigirasyon -anomeric. Idwoliz asid la te revele ke 4 te gen menm inite sik ak 3. Kidonk, yo te idantifye konpoze 4 kòm 1-O-galloyl-6-O-vanilloyl-2,3-O- (S)-hexahydroxydiphenoyl- -D-glikoz.

Tanpri klike la a pou w konnen plis

2.2. Anti-enflamatwa Actioity Assays

Four new compounds 1-4 were tested for potential anti-inflammatory activity by measuring the inhibition of nitric oxide (NO) production. Unfortunately, none of them displayed significantly anti-inflammatory activity. The IC5o values for the inhibition of NO production by compounds 1-4 are all>50um. Yo te rapòte ke flavonol yo konnen kaempferol(7)[26[, quercetin (10)[27l ak myricetin-3-O- -L-rhamnopyranoside(12)28 gen aktivite anti-enflamatwa, men kaempferol. -3-ramnozid (8) [26] ak quercetin-3-O- -L-ramnozid (11)[29] pa gen okenn aktivite anti-enflamatwa. Soti nan rezilta yo eksperimantal ak done literati, flavonoid yo nan plant la tit gen pi bon aktivite anti-enflamatwa pase ellagitannin, li ka engredyan aktif ki koresponn ak efè a anti-enflamatwa nan plant sa a.

2.3. Tyrosinase Inhibitory Actioity Assays

Tout konpoze yo te envestige pou potansyèl aktivite inhibitor tirozinaz. Jan yo montre nan Tablo 3, nouvo konpoze 2-4 montre aktivite modere inhibition tirozinaz. Nouvo konpoze 1 te montre fèb aktivite inhibitor tirosinaz. Quercetin (10)[30] gen yon aktivite inhibitor tirozinaz enpòtan, ak aktivite anti-tirozinaz li pi bon pase quercetin-3-OwL-rhamnoside(11)[26] ak kaempferol (7) [26], ki konsistan. ak done literati yo. Sa a te endike ke gwoup 3'-ak 4/-idwoksi sou bag B la ak 3-group idwoksi sou bag C nan flavonol yo te enpòtan anpil nan aktivite yo. Aktivite anti-tirozinaz kaempferol (7)[26] se pi bon pase kaempferol-3-rhamnoside (8)[26]ak konpoze 8 ak 12 [31] pa gen okenn aktivite anti-tirozinaz enpòtan, ki plis sipòte sa ki anwo a. relasyon estrikti-aktivite.

3. Eksperimantal 3.1.Materyèl

Rasin M.normale yo te kolekte nan Yanshan Town, Guilin City, Guangxi Province, nan mwa septanm nan 2018, ak otantifye pa Pwofesè Yusong Huang (Guangxi Institute of Botany). Yon echantiyon bon (20180912) te depoze nan laboratwa kle Guangxi nan rechèch fonksyonèl Phytochemicals ak itilizasyon, Guangxi Institute of Botany, Lachin.

Cistanche ka amelyore iminite

3.2. Pwosedi Jeneral Eksperimantal

Wotasyon optik yo te mezire ak yon ADP440 plis polarimèt （λ 589 nm, longè chemen 1.0 cm). Spectre NMR yo te akeri sou yon espektromèt Bruker Advance 500 （Bruker Biospin AG, Fällanden, Swis）, epi yo te itilize pik sòlvan rezidyèl yo kòm referans. Konstan kouple ak chanjman chimik yo te bay an Hz ak sou yon echèl δ（ppm), respektivman. Done ESIMS ak HIRESIMS yo te anrejistre sou yon espektromèt mas BRUKER HCT ak espektromèt LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Kyoto, Japon), respektivman. GC te fèt sou yon sistèm Agilent 7890ON (Agilent Technologies, Inc. Chandler, AZ, USA) ak yon kolòn 0.32 mm id × 25 mL-Chirasil-Val. HPLC analitik te kouri sou yon sistèm Shimadzu LC-2030C HPLC(Shimadzu, Kyoto, Japon) lè l sèvi avèk yon kolòn 4.6id × 250 mm Agilent Eclipse XDB-C18 (5 um). semi-preparatif HPLC te fèt sou yon sistèm Shimadzu LC-20AT HPLC lè l sèvi avèk yon kolòn 20.0id × 250 mm Dr. Maisch reprosil 100 C18 (5 um) nan yon pousantaj koule nan 4 mL / min. Kwomatografi kolòn (CC) te fèt lè l sèvi avèk Sephadex LH -20 （25-100 μm; GE Healthcare Bio-Science AB, Upsala, Syèd）, kolòn jèl silica (200-300 may, Qingdao Marine Chemical Co Ltd, Qingdao, Lachin), MCI jèl CHP 20P (75-150 um; Mitsubishi Chemical Co, Tokyo, Japon), ak Chromatorex ODS (50 um, Merck, Darmstadt, Almay) kolòn.

3.3. Ekstraksyon ak separasyon

Rasin an poud (10 kg) nan M. normale yo te seche lè a ak 8{{20}} pousan aketòn (3 × 7 jou) nan tanperati chanm ak chak ekstrè filtre. Filtrate yo te cheche anba presyon redwi pou peye yon ekstrè bit (0.6 kg). Ekstrè a te sispann nan H2O (1 L) epi youn apre lòt divize ak etè petwòl (3 × 2 L), EtOAc (3 × 2 L). Fr.1-10)pa silica gel CC (8 id × 20 cm) eliye ak yon gradyan CH2Cl-MeOH (100:0,95:5,90:10,80:20, 70). :30,50:50,0:100,v/v). Fr.4 (32 g) te chaje sou yon kolòn jèl MCI (6i.d.×20 cm) ak eluye ak yon gradyan MeOH-H,O（0∶100-100∶0,v/ø）pou Separasyon soufraksyon Fr4-14(3.0g) te fè pa yon lòt kolòn jèl silica (3i.d.×20 cm) elisyon ak yon gradyan CH2Cl{{48. }}MeOH (97:3-80:20, o/v) ak Sephadex LH-20 CCelution ak CH2Cl{2-MeOH (1:1,v/o) pou bay 7(11.3 mg). ),8 (10.6 mg), 9 (9.3 mg), 10 (20.6 mg), 11 (7.6 mg), ak 12 (6.2 mg). Fr 6 (4.2 g) te aplike nan kolòn ODS C18 ak eluye ak MeOH-H2O (20:80-80:20) pou jwenn 9 soufraksyon (Fr 6-1-6-9). Pli lwen separasyon subfraksyon Fr 6-4 (1.2 g) lè l sèvi avèk Sephadex LH -20 CC (eluye ak MeOH-H2O,10:90-100:0) bay konpoze 1 (9.6 mg), 5( 7.2 mg), ak 6 (7.3 mg), respektivman. Konpoze 2 (tR 130.5 min, 5.2mg), 3 (tR 146.8min, 9.6 mg), ak 4 (tR 177.2min, 15.3mg) yo te jwenn nan Fr7 (2.5g) atravè semipreparative HPLCeluting ak yon gradyan nan MeOH-H2O ( 20:80-40:60, / u, 0-250 min).

3.4. Done espektwoskopik

Tanen wiski C (1): poud mawon amorphe; [ ]-12.6 degre (c= 0.16, MeOH);UV （MeOH）λmaxnm （log e）∶203（2.02）,276（1.19）; CD （MeOH）λmax（△e）263（-7.8）,240（10.9）,225(2.9).1Men done 13C RMN, gade Tablo 1; HRESIMSm/z:[MH]{{24} }.1240(kalki pou C4sH33O27-, 1005.1215). 1-O-(4-methoxygalloyl)-6-O-galloyl-2,{3-O-(S)-hexahydroxydiphenoyl- -D-glikoz( 2): Brown amorphe poud amorphe poud; 【 】5-5.5 degre （c=0.17, MeOH）; UV（MeOH） 入max nm （log e）∶203 （2.52）,275（2.01）; CD （MeOH）λmax（△8）264（-8.0）,238（30.6）,218（1.3）.'H ak done 13C-NMR, gade Tablo 2; HRESIMS m/z:799,0983[MH]-(kalki pou C3sH2O22-, 799,099).

{{0}}O-galloyl-6-O-(3-methoxygalloyl)-2,{3-O-(S)-hexahydroxydiphenoul-6- D-glikoz (3); Brown amorphe poud;【 】7-33.5 degre （c=0.12, MeOH）; UV（MeOH）入max nm （log e）∶203 （2.40）,273（1.68）; CD （MeOH）λmax（△e）262（-3.1）,237（11.1）,210（-2.7）.'Hand13CNMR done,gade Tablo 2;HRESIMS m.10:7699 [MH]-(kalki pou C35H2O22-,799.0999). 1-O-galloyl-6-O-vanilloyl-2,3-O-(S)-hexahydroxydiphenoyl- -D-glikoz (4): Poud mawon amorphe; 【 】7-20.6 degre （c=0.15, MeOH）; UV（MeOH）λmax nm （log e）∶203 （2.42）,278（1.86）; CD（MeOH）λmax（△e）263（-12.1）,239 （42.5）, 219（0.9）.'H ak 13CNMR done, gade Tablo 2; HRESIMS m/z: 783 [MH]-03283. (kalki pou C35H27O21-,783.1050).

3.5. Idwoliz asid nan 2-4

Konpoze 2 (2 mg) te trete ak 1 M HCl (5 mL) nan 8 0 degre pou 4 èdtan, ak Lè sa a, ekstrè ak ethylacetate (3 × 5 mL). Faz akeuz la te cheche anba yon kouran N2 pou jenere yon rezidi net ki te analize lè l sèvi avèk TLC (SiO2) ak EtOAc-pyridine-EtOH-H, O (7:1:1:2) kòm sistèm sòlvan. Valè R nan rezidi net la te menm jan ak sa ki nan D-glikoz natif natal ki endike eleman sik la nan 2 te glikoz. Rezid net la ak 5 mg L-cysteine ​​methyl ester idroklorid te fonn siksesif nan 3 mL nan piridin anidrid ak chofe nan 80 degre pou 1 èdtan. Apre yo fin retire sòlvan an pa evaporasyon anba presyon redwi, yo te imedyatman reyaji melanj reyaksyon an ak 0.6 mL N-trimethylsilylimidazole nan 80 degre pou 1 èdtan. Te melanj reyaksyon an patisyone ak n-hexane ak H, O, ak Lè sa a, kouch n-hexane la analize pa yon enstriman GC. Tanperati enjektè a ak detektè yo te fikse nan 250 degre ak 280 degre, respektivman. Tanperati kolòn inisyal la te kenbe nan 160 degre pou 1 min, Lè sa a, ogmante a 280C nan 5 degre / min, epi li te kenbe pou 10 min. D-glikoz natif natal ak L-glikoz natif natal yo te silylated ak analize nan menm fason an, ak tan retansyon yo te 19.09 ak 19.25 min, respektivman. Rezilta analiz GC a te endike ke eleman sik nan 2 te D-glikoz (t 19.1 min). Konpozan sik yo nan 3 ak 4 yo te detèmine lè l sèvi avèk menm pwosedi a.

3.6. Aktivite anti-enflamatwa

3.6.1.NO Pwodiksyon pa LPS-Stimulated RAW 264.7 Cells

Selil RAW 264.7 yo te kiltive nan DMEM siplemantè ak 10 pousan FBS nan 37 degre degre nan yon atmosfè imidite 5 pousan CO2 pou 24 èdtan. Selil nan yon plak 24-byen (5 × 104 selil/byen) yo te trete ak 200 ng/mL LPS ak konpoze tès yo. Apre 22 èdtan, yo te kolekte medya yo, epi yo te mezire nivo nitrite lè l sèvi avèk Griess Reagent System (Promega, Madison, WI, USA).

3.6.2. Viabilite selilè

Yo te pote tès MTT pou mezire sitotoksisite echantiyon tès yo sou liy selil RAW264.7 la. Selil ki te nan faz kwasans logaritmik yo te simen nan yon plak 96-byen nan dansite 5 × 10 plis -6 × 10 * selil/pi epi yo te enkube a 37 degre ak 5 pousan CO, pou 24. h. Apre sa, selil yo te trete ak 100 μL medyòm kilti nan divès konsantrasyon echantiyon tès pou 24 èdtan. Mwayen an te jete epi yo te ajoute 100 uL medyòm gratis FBS ki gen MTT (1 mg/mL) nan chak pi. Apre enkubasyon nan enkibatè a pou 4 èdtan, yo te jete supernatant la epi yo te ajoute 100 μL DMSO nan chak pi pou fonn formazan an. Yo te mezire absorbans nan 570 nm lè l sèvi avèk yon lektè mikroplak.

3.7. Aktivite anti-Ty/rosinaz

Aktivite anti-tirozinaz izolan yo te envestige dapre pwosedi ki dekri pa Aoki et al. ak ti modifikasyon [21]. L-DOPA ak asid kojik yo te itilize kòm substra ak kontwòl pozitif, respektivman. Solisyon L-DOPA nan 5.0 mM, tyrosinase djondjon nan 100 U/mL, osi byen ke echantiyon nan diferan konsantrasyon yo te prepare nan tanpon fosfat （pH6.8）.20 μL nan solisyon echantiyon an ak 10 μL nan solisyon tirozinaz djondjon yo te melanje ak pre-enkube nan 37 degre pou 10 min, Lè sa a, 40 uL nan solisyon L-DOPA te ajoute ak enkube nan 37 degre pou 5 min. Sistèm reyaksyon eksperyans aktivite anti-tirozinaz la montre nan tablo 4. Absòbsyon an te mezire nan 475 nm lè l sèvi avèk lektè microplate Spark 10M multimode (Tecan Trading AG, Zurich, Swis). Tout tès yo te repete twa fwa epi chak fwa an twa fwa. Pousantaj anpèchman aktivite tirozinaz la te kalkile lè l sèvi avèk fòmil sa a:

kote T reprezante absorbans ak echantiyon ak tirozinaz; Pou reprezante absorpsyon an ak yon echantiyon men pa gen tirosinaz; C reprezante absorbans ak tirozinaz men pa gen echantiyon; Ko reprezante absòbe san tirozinaz ak echantiyon.

4. Konklizyon

Etid la gen entansyon eksplore plis aktivite anti-enflamatwa ak anzim inhibition nan polifenol soti nan rasin yo nan M.normale sou baz travay anvan nou an [20]. Kòm espere, yo te jwenn douz polifenol nan plant mozayik la pou premye fwa ak konpoze 1-4 yo te nouvo ellagitannin. Izolasyon siksè ak idantifikasyon estrikti ellagitannin bay materyèl pou tès depistaj dwòg anti-enflamatwa ak inhibiteur anzim epi tou kontribye nan devlopman ak itilizasyon M.normale. Ellagitannins 1-4 pa gen okenn aktivite inhibitor tirozinaz enpòtan ak aktivite anti-enflamatwa, ki fè li mwens chans yo dwe yon potansyèl dwòg anti-enflamatwa oswa inibitè anzim. Erezman, yo posede nouvo efè, tankou anti-obezite [6,7]. Flavonoid yo gen pi bon aktivite anti-enflamatwa ak inhibitor anzim pase ellagitannin nan rasin yo nan M. normale, epi yo gen plis chans yo dwe anti-enflamatwa ak anti-nzim inhibiteur. Etid la nan relasyon estrikti-aktivite se itil pou jwenn nouvo dwòg anti-enflamatwa ak inhibiteur anzim.

Atik sa a soti nan Molecules 2021, 26, 3913. https://doi.org/10.3390/molecules26133913 https://www.mdpi.com/journal/molecules