Karakterizasyon estriktirèl nan polisakarid dezè cistanche ak efè pwoteksyon li yo sou segondè glikoz-induit HK -2 aksidan selil
Jan 23, 2025
1.2.5.8 Deteksyon potansyèl manbràn mitokondriyo
Selil HK -2 te vaksine nan 6- byen plak ak kiltive. Apre eksitasyon ki koresponn lan, medyòm nan kilti nan 6- plak yo byen te aspirasyon ak yon fò gwoup kontwòl pozitif (POS) te ajoute nan gwoup la anba "1.2.5.6". Rense yon fwa ak PBS, ajoute 1 mL nan medyòm kilti selil ak 1 ml JC -1 te solisyon travay tach byen epi yo mete yo nan yon enkibatè kilti selil nan fè nwa a pou 20 min. Selil yo te lave de fwa ak JC -1 tanpon tach (1 ×) ak imaj yo te ranmase lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fluoresans.
Benefis Cistanche
1.2.5.9 Hoechst33258 Metòd pou detekte apoptoz selil
Glisad selil yo te mete yo nan 6- byen plak, ak HK -2 selil ki nan faz nan kwasans logaritmik yo te smi nan 6- byen plak yo nan yon dansite selil nan 1 × 105 selil/byen. Apre entèvansyon dwòg ki koresponn lan, yo te itilize twous tach Hoechst33258 pou tach. Te selil apoptoz detekte ak imaj yo te ranmase lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fluoresans.
1.2.5.10 Western blot pou detekte
Ekspresyon pwoteyin ki gen rapò ak chemen siyal TLR4/NF-κB te analize pa gwoupman ak trete selil yo dapre metòd anba "1.2.5.6". Apre sa, pwoteyin total nan selil yo te extrait dapre enstriksyon twous ekstraksyon pwoteyin lan. Te quantification pwoteyin fè lè l sèvi avèk asid la bicinchonik (BCA) metòd quantification pwoteyin, ak pwoteyin la te denaturasyon ak ki estoke nan yon -20 frijidè degre.
10% sodyòm dodecyl silfat polyacrylamide jèl elèktroforèz (SDS-PAJ), polyvinylidene fliyò (PVDF) transfè manbràn, mete manbràn lan nan Tris ki gen Tween -20 tanpon
Selil yo te enkubasyon nan yon sal Tris tampone ak Tween -20 (TBST) chanm ak bloke nan tanperati chanm. Antikò primè TLR4, NF-κB p65, P-NF-κB p65, ak -ctin te itilize yodetekte tisi ren an(Antikò yo te dilye nan solisyon TBST nan yon rapò volim nan 1: 2000) nan 4 degre lannwit lan. TBST
Te manbràn lan dilye ak antikò segondè (antikò ak solisyon TBST yo te dilye nan yon rapò volim nan 1: 2000) ak enkubasyon nan tanperati chanm pou 1 h. Apre lave manbràn lan 3 fwa ak TBST, yo te ajoute ECL luminescent reyaktif pou deteksyon, ak ekspresyon pwoteyin te detekte avèk D 'jèl. Imaj J lojisyèl te itilize pou analize valè gri pwoteyin, ak -ctin kòm referans entèn lan.
1.3 Processing Done
SPSS 23. 0 ak GraphPad Prism 6.01 lojisyèl yo te itilize pou analiz done. Yo te itilize tès Shapiro-Wilk pou teste nòmalite done echantiyon yo, epi yo te itilize tès mawon-forsythe oswa Bartlett pou teste omojèn nan divèjans done echantiyon. Done mezi a ak distribisyon nòmal ak omojèn nan divèjans yo te eksprime kòm vle di ± devyasyon estanda. (x ± s) endike deskripsyon, yon sèl-fason ANOVA te itilize pou fè tès, ak metòd Dunnett a te itilize pou konparezon pè si estatistik enpòtan.
Pou post sa a konparezon pè nan divèjans inegal, metòd T3 Dunnett a te itilize, ak p <0.
2 Rezilta ak analiz
2.1 Detèminasyon nan sik total, asid pipi ak kontni pwoteyin nan CDPS
Ekwasyon retou annaryè lineyè nan kontni polisakarid te: y=5. 7628x - 0 0004, r=0. 999. Eksperyans lan te montre ke ant 7 ak 70 µg/mL, te gen yon bon relasyon lineyè ant konsantrasyon glikoz estanda a (X) ak valè absorption (Y). Pousantaj nan kalkile nan kontni polisakarid nan echantiyon an se: 81.02%.
Ekwasyon retou annaryè lineyè asid uronik se: y=1. 1571x + 0 0015, r=0. 9968. Eksperyans lan te montre ke ant 20 ak 100 µg/mL, te gen yon bon relasyon lineyè ant konsantrasyon estanda asid uronik (X) ak valè absorption (Y). Kontni asid uronik nan echantiyon an se: 4.43%.
Ekwasyon estanda retou annaryè pwoteyin la se: y=1. 2671x + 0. 2145, r=0. Eksperyans lan te montre ke ant 20 ak 1 00 µg/ml, te gen yon bon relasyon lineyè ant konsantrasyon pwoteyin estanda a (X) ak valè absorption (Y). Kontni an pwoteyin nan echantiyon an se: 4.00%.
2.2 Distribisyon pwa molekilè nan CDPS
Te pwa a molekilè nan CDPs detèmine pa pèfòmans segondè permeation jèl kwomatografi deteksyon tandem kolòn. Ak RT AS (X) ak LGMP kòm (Y), ekwasyon an nan LGMP-RT koub kalibrasyon te kalkile kòm: y=-0. 1951x + 11. 661, r²=0. RT se (x), LGMW se (y), ekwasyon koub kalibrasyon LGMW-RT a se: y=-0. 1973x + 11. 738, r²=0. 9956; RT se (x), lgmn se (y), koub kalibrasyon lgmn-rt ekwasyon an se: y=-0. 1964x + 11. 7, r²=0. 9955; Baze sou koub la estanda, se fòmil la kalkil jwenn yo kalkile pwa a molekilè nan chak echantiyon. Spectrum nan pwa molekilè nan echantiyon an se jan sa a, ak rezilta yo kalkil yo montre nan tablo 2.. Rezilta yo te montre ke CDPs te gen plizyè tèt elution, ak pwa a molekilè nan polisakarid te sitou distribye ant 3 ak 8 kDa, ki te yon etewojèn ti molekilè heteropolysaccharide. Jan yo montre nan Figi 1.
2.3 konpozisyon monosakarid CDPS
CDP yo te analize pa kwomatografi ion, ak kromatogram la yo montre nan Figi 2. rezilta yo te montre ke konpare ak tan an retansyon nan 16 estanda monosakarid, 5 monosakarid yo te detekte nan CDPs. Pa konpare spèktr yo ak sa yo ki nan estanda monosakarid, CDP yo te sitou ki konpoze de glikoz, galakto, rhamnose, mannose ak sikwoz. , Arabinose. Rapò a molè se 0. 734 0 5: 0. Soti nan rapò a molè, li ka wè ke CDPs yo sitou ki konpoze de glikoz, galakto ak rhamnose. Pami yo, glikoz konte pou 73.405%, galakto kont pou 5.381%, ak rhamnose kont pou 5.02%.
Remak: Man.Mannose, Glc n.glucosamine hydrochloride, rha.rhamnose, glc-ua.glucuronic asid, gal-ua.galacturonic asid, Gal n.galaktosamin hydrochloride, glc.glucose, gal.galactose, xyloride, Glc.glucose, gal.galactose, xyloride, Glc.glucose, Gal.Galactose, xyloride, Glc.glucose, Gal.Galactose, Nxyloride, Glc.glucose, Gal.Galactose, Nxyloride, Glc.Glucose, Gal.galactose, Nxyloride, Glc. arabinose, fuc.fucose.
2.4 CDPS Fourier analiz enfrawouj
Peak a tou pre 3246 cm -1 se ki te koze pa OH a etann Vibration nan gwoup la idroksil, pik la absòpsyon tou pre 2900 cm -1 se CH a Vibration Peak nan -CH3, ak pik la absòpsyon nan 1594 CM {{{{ ki endike ke prezans CDPs nan asid uronik, 1374.31 cm -1: sa a pik absòpsyon ka ki gen rapò ak vibrasyon an deformation nan CH lyezon, espesyalman nan methyl a (-CH3) oswa metilèn (-h 2-) gwoup polysaccharides. Pik la absòpsyon nan 1018.38 cm -1 ka ki gen rapò ak vibrasyon an etann nan kosyon an CO, ki se souvan yo te jwenn nan lyezon yo etè oswa estè bon nan polisakarid. Twa tèt absòpsyon fèb nan seri a nan 1200-1000 cm -1 endike prezans nan piranose nan CDPs. Pik yo absòpsyon nan 870 ak 930 cm -1 endike ke -kalite lyezon glikozidik ka egziste nan CDPs. Gade Figi 3.
2.5 efè toksik nan CDPs sou nòmal HK -2 selil
Konpare ak CON, nan 24 h apre administrasyon an, viabilité selil la te kòmanse diminye siyifikativman apre konsantrasyon nan CDPS rive nan 1000 ug/ml (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.
3 diskisyon ak konklizyon
Polisakaridyo wo polymers pwa molekilè ki konpoze de plis pase 10 monosakarid. Li te rapòte ke polisakarid genyenimunomodulateur, antioksidan, anti-enflamatwa ak ipoglisemi efè[15]. Kòm youn nan prensipal sibstans ki sou yo farmakolojik aktif nan Cistenche deserticola, CDPs gen siyifikatif valè medsin. Etid sa a preliminè karakterize estrikti a nan CDPs epi yo te jwenn ke yo ka amelyore domaj nan HK -2 selil pwovoke pa anviwònman sik segondè.
Estrikti a konplèks nan polisakarid pre relasyon ak aktivite byolojik yo, nan mitan ki kalite a ak pwopòsyon nan monosakarid, mas la relatif molekilè nan polisakarid, ak ki kalite lyezon glikozidik yo se kle enfliyanse faktè [16]. Modere relatif mas molekilè a bay polisakarid pi aktif sit epi yo ka montre pi fò aktivite byolojik.
Sepandan, gwo pwa molekilè ap ogmante rezistans transmembrane, anpeche polisakarid absòpsyon, ak afekte aktivite. Kontrèman, ti polisakarid pwa molekilè ka pa kapab fòme estrikti aktif aktif, sa ki lakòz aktivite redwi [17]. Lè eksplore aktivite byolojik polisakarid yo, li nesesè pou konsidere konpozisyon monosakarid la, mas molekilè relatif ak kalite kosyon glikozidik [18]. Nan etid sa a, kwomatografi ion detèmine ke CDP yo te sitou ki konpoze de glikoz, galakto ak rhamnose, ki se ki konsistan avèk rapò a nan Xu et al. [19]. Pwa yo molekilè pwa-mwayèn nan CDPs mezire pa pèfòmans segondè kwomatografi jèl likid yo te 3444, 4198 ak 8031 kDa, respektivman. Pwa molekilè yo nan twa polisakarid cistanche soti nan kat materyèl medsin kat-ciste mezire pa Yang et al. [20] te menm jan an. CDPs ka gen ladan -kalite lyezon glikozidik, epi yo ka gen ladan -glucose oswa -mannose. Polysaccharides ki konpoze de -glucose oswa -mèn yo pi fasil rekonèt pa Toll -tankou reseptè 4 (TLR4) oswa TLR2 [21].
DN se youn nan konplikasyon ki pi grav mikrovaskulèr nan dyabèt, ak patojenèz li yo pre relasyon ak estrès oksidatif, malfonksyònman mitokondriyo, ak apoptoz selil [22]. Etid sa a envestige efè pwoteksyon CDPs sou segondè glikoz-pwovoke HK -2 selil pa reglemante chemen an siyal TLR4/NF-κB ak mekanis molekilè li yo.
Anba kondisyon glikoz segondè, HK -2 selil yo montre siyifikatif estrès oksidatif [23]. Etid yo te jwenn ke nivo sik segondè siyifikativman ogmante pwodiksyon an nan entranglè ROS. Sa a kantite lajan twòp nan ROS ka dirèkteman domaje lipid manbràn selilè, ki mennen ale nan yon ogmantasyon nan kontni an nan pwodwi peroksidasyon lipid MDA [24]. An menm tan an, aktivite yo nan SOD ak GSH-PX, enpòtan sistèm defans antioksidan, yo te siyifikativman redwi, ki endike ke yo te kapasite nan antioksidan nan selil grav domaje [25]. Sa a move balans nan sistèm nan oksidasyon-antioksidasyon plis ankouraje ekspresyon an ak deklanchman nan TLR4 [26]. Etid anvan yo montre ke ROS twòp ka rekonèt pa TLR4 kòm danje ki asosye modèl molekilè (DAMPs), fòme yon bouk fidbak pozitif [27]. Nan etid sa a, CDPs pretrateman siyifikativman redwi nivo ROS, ogmante SOD ak GSH-PX aktivite, ak diminye kontni MDA. Sa a efè antioksidan konplè sijere ke CDPs ka kontwole repons estrès oksidatif nan objektif miltip.
Nan chemen siyal TLR4/NF-κB, aktive TLR4 fè pwomosyon aktivasyon konplèks IKK a nan rekritman pwoteyin adaptè en, ki vire mennen nan fosforilasyon ak degradasyon IκB [28]. Etid la prezan obsève ke glikoz segondè siyifikativman ogmante nivo a fosforilasyon nan IκB, ki mennen ale nan translokasyon an nan NF-κB p65 soti nan sitoplas la nan nwayo a. Etid yo montre ke translokasyon nikleyè nan p65 pa sèlman agrave estrès oksidatif, men tou afekte fonksyon mitokondriyo [29].
Li te obsève pa JC -1 tach ke tretman glikoz segondè ki te koze yon diminisyon enpòtan nan potansyèl manbràn mitokondriyo, ki montre yon chanjman soti nan fluoresans wouj nan fluoresans vèt, ki endike ke gradyan nan pwoton ant manbràn yo enteryè ak ekstèn nan mitokondri te deranje. Mitokondriyo malfonksyònman plis agrave pwodiksyon an nan ROS, fòme yon sik visye [30]. Pretratman CDP yo ka kenbe estabilite nan potansyèl manbràn mitokondriyo, ak efè sa a pwoteksyon ka reyalize pa anpeche ekspresyon an nan TLR4 ak deklanchman an nan NF-κB.
Mitokondriyo malfonksyònman ak pèsistan estrès oksidatif finalman mennen nan apoptoz selil [31]. Tach Hoechst revele ke nwayo selil la nan gwoup la tretman segondè glikoz te montre evidan tipik apoptotic chanjman mòfoloji tankou kondansasyon, kondansasyon ak fwagmantasyon [32]. Chanjman sa yo pre relasyon ak chemen an apoptoz mitokondriyo-medyatè intrinsèques: pèt la nan manbràn mitokondriyo potansyèl mennen nan liberasyon an nan sitokrom C, deklanchman nan cascade nan caspase, epi finalman apoptoz selil [33]. Mòfoloji nikleyè nan selil ki nan gwoup la pretrateman CDPS te fondamantalman nòmal ak tach la te inifòm, sijere ke CDPs anpeche apoptoz selil pa kenbe fonksyon mitokondriyo ak anpeche estrès oksidatif.
An rezime, etid sa a sistematik detekte endikatè estrès oksidatif (ROS, MDA, SOD, GSH-PX), fonksyon mitokondriyo (JC -1) ak selil apoptoz (hoechst), konbine avèk TLR4/NF-κB siyal chemen kle yo ki elucatate mekanis nan CEDS: CETS: CETS: CEDS MOLECULES KETS: CETSTS: CETS: CETS: CETS: CETSS: CETS: CETS: CETS: CETS: CETS: CETS: CETS: CETSS: CETS: CETS: CETS: CETSS:
Premyèman, pa amelyore kapasite a antioksidan nan selil yo, diminye nivo a nan ROS ak diminye deklanchman an nan TLR4; Dezyèmman, pa anpeche ekspresyon an nan TLR4 ak fosforilasyon nan IκB, bloke translokasyon an nikleyè nan NF-κB; Finalman, pa amelyore fonksyon mitokondriyo, inhibition apoptoz selil. Lanmò, konsa jwe yon wòl pwoteksyon kont DN. Sa a efè milti-sib sinèrjetik fè CDPs montre bon aplikasyon kandida nan tretman an nan DN. Nan etid ki vin apre, yo pral estrikti a polisakarid pli lwen detèmine pa difraksyon X-ray, nikleyè mayetik spèktroskopi sonorite, ak gaz kromatografi-mas spèktrometri. Anplis de sa, mwayèn rezilta yo pwa molekilè montre ke CDPs yo se polisakarid heterogeneous. Next, nou pral separe ak pirifye polisakarid omojèn, detekte estrikti a polisakarid ak aktivite byolojik, ak klarifye relasyon an estrikti-aktivite.
