Sible Laktat Dehydrogenase A ak Catechin resansib SNU620/5FU Selil Kansè Gastrik Pou 5-Fluorouracil Pati 1

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Résumé:Rezistans nan terapi antikansè rive nan prèske tout kalite kansè epi li vin tounen yon gwo difikilte nan tretman kansè. Malgre ke 5-fluorouracil (5FU) se premye chwa terapi antikansè pou kansè nan gastric, efikasite li limite akòz rezistans dwòg. Dènyèman, metabolis kansè chanje, ki gen ladan efè Warburg, yon preferans pou glikoliz olye ke fosforilasyon oksidatif pou pwodiksyon enèji, yo te aksepte kòm yon mekanis pivotal reglemante rezistans nan chimyoterapi. Kidonk, nou te envestige mekanis an detay ak posiblite itilite ajan antiglikolitik nan amelyore rezistans 5FU lè l sèvi avèk etabli liy selil kansè nan gastric, SNU620 ak SNU620/5FU.SNU620/5FU, yon selil kansè nan gastric ki gen rezistans nan 5FU, te montre pi wo pwodiksyon ak ekspresyon laktat. nananzim ki gen rapò ak glikoliz, tankou laktat dehydrogenase A(LDHA), pase sa yo ki nan selil paran SNU620 yo. Pou limite glikoliz, nou egzamine katechin ak dérivés li yo, ki konnen yoanti-enflamatwaak pwodwi natirèl antikansè paske epigallocatechin gallate te deja rapòte kòm yon sipresyon ekspresyon LDHA. Catechin, konpoze ki pi senp nan mitan yo, te gen pi gwo efè inhibition sou pwodiksyon laktat ak aktivite LDHA. Anplis de sa, konbinezon an nan 5FU ak catechin te montre plis sitotoksisite ak pwovoke espès oksijèn reyaktif (ROS)-medyatè apoptoz nan selil SNU620 / 5FU. Kidonk, baze sou rezilta sa yo, nou sijere katechin kòm yon kandida pou devlopman yon nouvo dwòg adjuvant ki diminye chemoresistance nan 5FU lè li mete restriksyon sou LDHA.

Mo kle:5-fluorouracil;chemoresistant; glikoliz; laktat dehydrogenase; katechin

Tanpri klike la a pou w konnen plis

1. Entwodiksyon

Pwogrè remakab yo te reyalize nan tretman kansè nan gastric ak reseksyon chirijikal timè prensipal la ak chimyoterapi konbinezon ki baze sou 5-fluorouracil (5FU), tankou epirubicin, cisplatin, ak fluorouracil ak docetaxel, oxaliplatin, ak 5FU[1 ,21 Jiska prezan, 5FU, yon analòg uracil ki bloke sentèz ADN lè li anpeche thymidylate synthase [3], rete yon dwòg chimyoterapi souvan itilize pou tretman kansè nan gastric [1, A4]. Sepandan, efikasite nan klinik nan chimyoterapi pa satisfezan akòz rplonje nan kansè prensipal oswa metastatik ki gen rapò ak rezistans dwòg [1,5].

Cistanche ka amelyore iminite

Plizyè pwosesis selilè yo konsidere kòm mekanis kle ki kache kimorezistans, ki gen ladan aktivasyon oswa inaktivasyon dwòg, reparasyon machin nan domaj ADN, modifikasyon nan sib dwòg, inaktivasyon nan chemen apoptotik, ak ogmante otofaji [6,7]. Kansè se eterojèn ak divès kalite kansè itilize tou de glikoliz ak fosforilasyon oksidatif pou metabolis enèji [8]. Sepandan, repwogram metabolik, espesyalman glikoliz aerobic nòmal, yo te rapòte kòm yon jwè kle nan devlopman nan rezistans nan dwòg chimyoterapi, ki gen ladan 5FU, nan kansè nan gastric [9]. Lactate dehydrogenase A (LDHA) ak pyruvate dehydrogenase kinases (PDKs) yo konnen kòm regilatè kle nan glikoliz aerobic pwodwi laktat soti nan pyruvate [10,11]. Konbinezon dichloroacetate, yon inibitè etabli nan PDK, retabli sansiblite nan direksyon 5FU [12]. Anplis de sa, LDHA, yon anzim kle ki katalize konvèsyon piruvat nan laktat, yo te rapòte kòm yon sib potansyèl pou tretman kansè nan gastric [13,14]. Knockdown nan ekspresyon LDHA nan selil kansè yo anpeche tumorigenicity nan ogmante respirasyon mitokondriyo ak diminye viabilite selil [15]. Plizyè inibitè LDHA, tankou FX11, PSTMB, ak GSK 2837808A, diminye nivo ATP ak jenere estrès oksidatif, epi finalman lakòz lanmò selil apoptotik [16-18]. Malgre ke yon etid te demontre ke anpèchman nan LDHA pa microRNA-34a refè rezistans nan 5FU nan kansè nan kolon [19], pa gen okenn etid anvan te rapòte efè yo nan inibitè LDHA jenetik oswa famasi sou chimyorezistans.

Polifenol te vèt, ki gen ladan Catechin (CA), epicatechin (EC), gallocatechin (GC), epigallocatechin (EGC), epicatechin-3-galat (ECG), ak epigallocatechin-3-galat (EGCG), ankouraje moun. sante pa anpeche ak trete plizyè maladi, tankou enflamasyon, dyabèt, maladi kadyovaskilè, ak kansè malfezan [20,21]. Pami polifenol, EGCG amelyore chemosansiblite 5FU nan kansè kolorektal ak selil karcinom epatoselilè pa aktive chemen AMPK ak mete restriksyon sou tij kansè [22,23]. Anplis de sa, yo te rapòte EGCG anpéché LDHA pa reprime ekspresyon li yo nan selil kansè nan tete ak pankreyas [24,25].

Nan etid sa a, nou te sipoze ke CA ta ka yon kandida pou yon dwòg adjuvant pou diminye rezistans nan 5FU nan selil kansè nan gastric. Li te egzamine ke efè inhibition nan CA, ak / oswa konbinezon li yo ak 5FU, sou aktivite a LDHA kidonk pwovoke espès mitokondriyo reyaktif oksijèn (ROS) ak lanmò selil apoptotik nan selil 5FU ki reziste.

2. Rezilta yo

2.1. Karakteristik glikolitik nan selil 5FU ki reziste

Pwopagasyon amelyore se yon karakteristik chimyorezistans ki gen ladan selil kansè 5FU ki reziste [26,27]. Premyèman, nou konfime rezistans nan 5FU ak to kwasans alontèm nan selil SNU620 ak SNU620/5FU. Lè selil sa yo te kiltive ak konsantrasyon ki endike nan 5FU pou 48 èdtan, dòz la estime ki lakòz 50 pousan anpèchman kwasans (Gl50) nan selil SNU620/5FU (100.63 uM) te pi wo pase sa ki lakòz GIso nan selil SNU620 paran li yo （288888. ）（Figi 1A ak Figi Siplemantè S1）. Anplis de sa, to kwasans selil SNU620/5FU yo te pi vit pase selil SNU620 yo (Figi 1B ak Figi Siplemantè S2). Depi chimyorezistans ak karakteristik k ap grandi rapid yo ta ka gen rapò ak pwopriyete glikolitik ki wo nan selil kansè nan gastric [28], pousantaj asidifikasyon ekstraselilè (ECAR) ak to konsomasyon oksijèn (OCR) yo te mezire nan tou de selil yo nan prezans oksamat, yon byen li te ye. inibitè glikoliz, oswa ou pa. Rezilta yo demontre ke selil SNU620/5FU siyifikativman sekrete plis laktat pase sa ki sekrete pa selil SNU620 epi imedyatman asidifye mwayen kilti a (Figi 1C ak Figi Siplemantè S3). Sepandan, pa gen okenn chanjman enpòtan nan OCR yo te obsève ant selil sa yo (Figi 1D). Yo te mezire nivo ekspresyon mRNA ak pwoteyin nan LDHA. Ekspresyon LDHA te pi wo nan selil SNU620/5FU pase nan selil SNU620 (Figi 1E, F). Anplis de sa, nou te egzamine nivo ekspresyon mRNA ak pwoteyin izotip PDK epi nou te jwenn ke sa yo ki nan PDK2 ak PDK3 yo te pi wo nan selil SNU620 / 5FU pase nan selil SNU620 (figi siplemantè S4A, B). Fosforilasyon nan subunit E1 nan piruvat dehydrogenase (PDHA1), ki te ogmante pa PDKs, te tou evalye, epi li te jwenn yo dwe pi wo nan selil SNU620 / 5FU pase nan selil SNU620 (Siplemantè Figi S4C) .Anplis de sa, nou te itilize. oxamate kòm yon inibitè LDHA pou simonte rezistans 5FU nan selil SNU620/5FU. Konpoze sa a anpeche kwasans selil nan tou de selil SNU620 ak SNU620 / 5FU (figi siplemantè S5). Pli lwen, cotreatment ak oxamate ak 5FU siprime kwasans selil, konpare ak tretman endividyèl ak oxamate oswa selil 5FUin SNU620/5FU (Figi 1G). Done sa yo sijere ke selil SNU620/5FU trè eksprime LDHA, ak anpèchman aktivite LDHA ka simonte rezistans selil SNU/5FU a 5FU.

Figi 1. Dapre rezilta yo, selil ki reziste 5-fluorouracil (5FU) gen yon karakteristik glikolitik ki wo: (A)SNU620 ak SNU620/5FU selil yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan 5FU pou 48 èdtan. Yo te evalye viabilite selil sa yo atravè tès MTT; (B) nivo kwasans selil SNU620 ak SNU620/5FU yo te mezire chak jou pandan 4 jou ak tès MTT; (C,D)SNU620 ak selil SNU620/5FU yo te trete ak oxamate. 5mM) oswa ou pa pou 24 èdtan, ak Seahorse XF analyser te evalye valè ECAR ak OCR; (E, F) ekspresyon LDHA nan selil SNU620 ak SNU620/5FU yo te detekte atravè qRT-PCR ak analiz Western blot; (G) Selil SNU620 ak SNU620/5FU yo te trete ak oxamate (25 mM) ak/oswa 5FU（10μM） pou 48h. Rezilta yo montre kòm mwayen ± SEM.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA Siprime Aktivite LDHA

Pwodiksyon laktat te analize ak CA ak dérivés li yo, ki gen ladan EC, GC, EGC, ak EGCG, nan selil SNU620/5FU. Konpare ak dérivés sa yo, CA redwi pwodiksyon laktat pi efikas (Figi 2A). Pli lwen, nan vitro, aktivite LDHA kòm-di te konfime, ak CA te montre yon efè inhibition pi fò sou aktivite LDHA pase sa yo ki nan dérivés li yo (Figi 2B). Efè inhibition CA sou aktivite in vitro LDHA ak LDHB yo te mezire nan yon fason ki depann de dòz la. CA inibit aktivite LDHA san yo pa afekte aktivite LDHB (Figi 2C, D). Anplis de sa, aktivite LDHA ak LDHB yo te mezire ak EGCG, ki se li te ye pou anpeche aktivite LDHA, epi yo te jwenn yo te diminye dòz-depandans (figi siplemantè S6A, B). Anplis, aktivite intraselilè LDHA ak LDHB yo te evalye ak konsantrasyon ki endike nan CA nan selil SNU620/5FU. CA inibit aktivite LDHA nan yon fason ki depann de dòz nan rezilta vitro men pa aktivite LDHB (Figi 2E, F). Nivo ekspresyon pwoteyin nan p-PDHA1, PDK2, PDK3, ak LDHA yo te mezire tou nan selil SNU620 / 5FU apre tretman CA (Siplemantè Figi S7), epi nou obsève ke tretman sa a pa afekte. Rezilta sa yo sijere ke CA kontwole aktivite LDHA san yo pa afekte ekspresyon li.

2.3. Mòd aksyon LDHA anpèchman pa CA

Pou analize mekanis anpèchman aktivite LDHA sou CA ak dérivés li yo, nou te fè modèl molekilè entèraksyon obligatwa ant LDHA recombinant imen ak CA (Figi 3A, B). Rezilta yo te montre ke CA ka kominike avèk résidus T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192, ak T247 nan LDHA. Pami yo, R105, S136, ak R168 yo kritik pou substra (pyruvate) obligatwa. Kidonk, nou te sipoze ke CA ta ka entèfere ak sit yo substra-obligatwa. Okontrè, EGCG mare ak LDHA atravè yon sit diferan. Pou verifye mòd aksyon anpèchman LDHA pa CA plis, Michaelis-Menten ak Lineweaver-Burk konplo yo te konfime ak divès kalite konsantrasyon nan piruvat ak CA. Aktivite LDHA te ogmante nan yon fason ki depann de dòz piruvat. Sepandan, li te ranvèse pa ogmantasyon nan CA. Kidonk, rezilta yo nan konplo Michaelis-Menten ak Lineweaver-Burk te montre ke CA a se yon inibitè ki pa konpetitif nan LDHA (Figi 3C, D). valè 197 uM (figi siplemantè S8). Rezilta sa yo bay enfòmasyon ke CA siprime aktivite LDHA atravè lye sit la ki gen substra-obligatwa nan LDHA.

2.4. CA resansibilite rezistans 5FU atravè redui aktivite LDHA

Nou evalye efè sitotoksik CA sou selil SNU620 ak SNU620/5FU epi nou te jwenn ke CA te siprime kwasans nan tou de gwoup selil yo (Figi 4A). Pou verifye ke anpèchman kwasans lan te gen rapò ak repwesyon aktivite LDHA, ekspresyon LDHA te aboli pa asid ribonukleik kout (shRNA) pou LDHA (shLDHA) epi ekspresyon li te refè pa transfeksyon LDHA eksprime plasmid (figi siplemantè S9A, B). ).Nan selil SNU620/5FU shLDHA-transfected, pwodiksyon an laktat ak viabilite selil pa te ansibleman chanje pa tretman CA, konpare ak sa yo nan selil mock-transfected (Figi 4B, C) .Anplis de sa, efè inhibition kwasans nan CA te. ogmante pa rekiperasyon ekspresyon LDHA nan selil SNU620/5FU LDHA-knockdown (Figi 4D). Pli lwen, selil SNU620 ak SNU620/5FU yo te egzamine apre tretman CA ak 5FU endividyèlman oswa konbinezon tou de. Kotreatman ak CA ak 5FU siyifikativman anpeche kwasans selil SNU620/5FU (Figi 4E). Anplis de sa, efè konbinezon CA ak 5FU yo te egzamine nan plizyè lòt liy selil, tankou kansè nan gastric imen AGS, kansè nan pankreyas Panik-1, MIA PaCa-2, ak kansè nan kolon LS174T ak selil RKO, konpare ak SNU620 ak SNU620/5FUcells. Pwodiksyon laktat ak ekspresyon LDHA te montre yon bon korelasyon youn ak lòt, ak pwopriyete glikolitik sa yo relativman wo nan SNU620 / 5FU, AGS, ak RKO (figi siplemantè S10A, B). Anplis, tretman an konbinezon nan CA ak 5FU siyifikativman redwi viabilite nan selil yo, konpare ak yon sèl tretman nan 5FU nan selil glikolitik ki gen ladan AGS ak RKO (Figi Siplemantè S10C). Sepandan, kotreatman ak CA ak 5FU pa t 'siyifikativman anpeche kwasans nan selil SNU620, Panik-1, MIA PaCa-2, ak LS174T, ki te montre ekspresyon LDHA ki ba. Rezilta sa yo sijere ke efè a sansibilize nan CA nan selil 5FU ki reziste ta ka gen rapò ak efè inhibition li yo sou aktivite LDHA.

Figi 2. Catechin(CA) inibit aktivite LDHA men se pa ekspresyon li: (A) pwodiksyon laktat nan SNU620/5FU te mezire apre tretman ak dérivés CA （10 μM） pou 24 èdtan; (B) yo te evalye aktivite LDHA an vitro apre tretman an. ak dérivés CA (10 uM) ak oxamate (20 mM); (C, D) nan vitro, aktivite LDHA ak LDHB yo te estime ak konsantrasyon ki endike nan CA; (E, F) selil yo te trete ak konsantrasyon endike nan CA pou 24h. Aktivite intraselilè LDHA ak LDHB yo te mezire lè l sèvi avèk lysate selil yo kòm yon sous anzim. Yo montre rezilta yo kòm mwayen ± SEM. **p<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Figi 4. Vitabilite selil yo te anpeche pa cotreatment ak catechin (CA) ak 5-fluorouracil (5FU) nan selil 5FU ki reziste: (A) yo te evalye viabilite selil SNU620 ak SNU620/5FU apre tretman ak konsantrasyon ki endike nan CA pou 48 h;（B）SNU620/5FU-pLKO.1 ak selil SNU620/5FU-shLDHA yo te trete ak CA（10 μM） pou 24 h. Pwodiksyon laktat te mezire nan medya kilti SNU620/5FU-pLKO.1 ak selil SNU620/5FU-shLDHA; (C, D) SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA plis EV , ak SNU620/5FU-shLDHA plis LDHA#2 selil yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan CA pou 48 èdtan. Vitabilite selil la te mezire lè l sèvi avèk yon tès MTT; (E) selil SNU620 ak SNU620/5FU yo te trete ak CA (10 μM) ak/oswa 5FU (10μM) pou 48 èdtan. Viabilite selil sa yo te mezire atravè tès MTT. Yo montre rezilta yo kòm mwayen±SEM.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Atik sa a extrait de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms