Estati aktyèl la nan neropwoteksyon nan maladi kè konjenital Pati 2

Lè sa a, imaj mikwoskopik yo te sibi kalkil imaj lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Siyal Hsp60 te miltipliye pa "x".

Hsp60 se yon molekil pwoteyin enpòtan ki jwe yon wòl byolojik enpòtan nan kò imen an. Rechèch nan dènye ane yo te montre ke prezans nan Hsp60 se pre relasyon ak memwa imen.

Hsp60 se yon pwoteyin chaperone molekilè ki enplike sitou nan plisman pwoteyin, dewoulman, estabilizasyon, ak degradasyon. Pwosesis sa yo trè enpòtan pou metabolis nòmal ak fonksyon selilè nan kò imen an. An menm tan an, Hsp60 tou gen efè antioksidan, anti-enflamatwa, ak imunomodulateur, epi li jwe yon gwo wòl nan kenbe sante moun ak balans nan sistèm iminitè a.

Rechèch te jwenn ke Hsp60 jwe yon wòl enpòtan nan fòmasyon memwa ak antretyen. Pandan pwosesis aprantisaj ak memwa, selil nan sèvo pwodui yon gwo kantite molekil Hsp60. Molekil sa yo ka pwoteje selil yo kont entèferans ak domaj nan anviwònman ekstèn pou asire pwogrè lis nan aprantisaj ak memwa. Anplis de sa, Hsp60 ka afekte panse ak konpòtman moun tou lè yo chanje transdiksyon siyal selil nan sèvo ak devlopman newòn epi li gen yon enpak pozitif sou koyisyon ak rezistans estrès.

Malgre ke wòl nan Hsp60 te montre efè pozitif sou kò imen an, moun tou bezwen reyalize ke tou de depase ak deficiency nan Hsp60 ka gen efè negatif sou sante moun. Se poutèt sa, nou ta dwe aktivman eksplore ak etidye mekanis Hsp60 nan divès kondisyon fizyolojik ak patolojik nan kò imen an pou pi byen konprann pozisyon ak wòl Hsp60 nan sante moun. Li ka wè ke nou bezwen amelyore memwa, ak Cistanche deserticola ka siyifikativman amelyore memwa, paske Cistanche deserticola gen efè antioksidan, anti-enflamatwa, ak anti-aje, ki ka ede diminye oksidasyon ak reyaksyon enflamatwa nan sèvo a, kidonk pwoteje sante nan sistèm nève a. Anplis de sa, Cistanche deserticola kapab tou ankouraje kwasans ak reparasyon nan selil nève, kidonk amelyore koneksyon ak fonksyon rezo neral yo. Efè sa yo ka ede amelyore memwa, kapasite aprantisaj, ak vitès panse, epi yo ka anpeche tou devlopman nan malfonksyònman mantal ak maladi neurodegenerative.

Klike sou Konnen pou amelyore memwa a kout tèm

Valè "x" la te detèmine jan sa a: soustraksyon "x"-pliye Hsp60signal la nan siyal ADN mitokondriyo a nan gwoup kontwòl la te fè valè ADN mitokondriyo a mwens pase oswa egal a zewo. Siyal histon H2B te miltipliye pa "y".

Valè "y" la te detèmine jan sa a: soustraksyon "y"-pliye siyal hisstone-H2B nan siyal nikleyè-ADN nan gwoup kontwòl la te fè valè nikleyè-ADN mwens pase orequal a zewo. Si siyal background nan vin wo nan miltiplikasyon an, kontras nan imaj miltipliye a ka ajiste pou menm kondisyon yo nan tout echantiyon yo.

Imaj la nan tach dsDNA, mwens imaj ajiste Hsp6 miltipliye 0 ak histon H2B, yo te itilize pou analiz ki vin apre. Sèvi ak fonksyon "Ajiste-Papòt la", imaj sa yo te binarize. Nou te chwazi dsDNA puncta ki varye nan gwosè soti nan 2 a 2 0 µm2 (sikilarite 0.1–1.0), epi yo te konte lè l sèvi avèk fonksyon "Analize-Analize Patikil".

2.3. Mikwoskopi elektwonik

Yon jou anvan transfèksyon, selil HeLa yo te plake nan yon dansite 600 selil/µL. Yo te fèmen ekspresyon jèn ki enterese yo nan selil HeLa lè l sèvi avèk Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) nan Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) enstriksyon manifakti a (ak yon konsantrasyon final RNA 10 nM).

Kat jou apre siRNA knockdown, selil yo te sibi fixation.Cell-kilti echantiyon yo te fikse ak 2% PFA ak 2% glutaraldehyde nan 0.1 M phosphatebuffer, pH 7.4, nan 37 ◦C, Lè sa a, mete yo nan yon 4. ◦C frijidè pou 30 min. Yo te fikse echantiyon yo nan 2% glutaraldehyde nan 0.1 M tanpon fosfat lannwit lan nan 4 ◦C. Echantiyon yo te lave twa fwa ak 0.1 M tanpon fosfat pou 30 min epi apre yo te fikse ak 2% osmiumtetroxide nan 0.1 M tanpon fosfat nan 4 ◦C pou 1 èdtan.

Echantiyon yo te dezidrate solisyon etanòl engraded, transfere nan résine (Quetol -812, Nisshin EM Co., Tokyo, Japon), epi polimerize nan 60 ◦C pou 48 èdtan. Rezin polymerize yo te koupe an seksyon ultramens 70-nm ak yon kouto dyaman lè l sèvi avèk yon ultramicrotome (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Almay) epi yo te monte sou griy kwiv.

Seksyon yo te tache ak 2% acetate uranyl nan RT pou 15 min epi lave ak dlo distile, ki te swiv pa segondè tach ak yon solisyon tach plon (Sigma-Aldrich, Tokyo, Japon) nan RT pou 3 min.

Yo te obsève grid yo anba yon mikwoskòp elèktron transmisyon (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokyo, Japon) nan yon vòltaj akselerasyon 80 kV (sèvo pwason zèb) oswa 100 kV (sèlil), ak imaj yo te anrejistre lè l sèvi avèk yon kamera charge-coupled-device (CCD) (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Mikwoskopi imunoelektron

Echantiyon yo sou disk lò yo te jele nan pwopan likid nan -175 ◦C. Apre echantiyon yo te jele, yo te friz-ranplase ak 1% asid tannik nan etanòl ak 2% dlo distile nan -80 ◦C pou 24 èdtan.

Lè sa a, echantiyon yo te kenbe nan -20 ◦C pou 4 èdtan, swiv pa enkubasyon nan 4 ◦C pou 1 èdtan. Apre sa, echantiyon yo te dezidrate nan etanòl anidrid 3 fwa pou 30 min. chak fwa, ki te swiv pa enfiltrasyon ak yon melanj 50:50 nan résine etanoland (LR blan: London Resin Co Ltd, Berkshire, UK) nan 4 ◦C pou 1 èdtan. Echantiyon yo te transfere nan fre 100% résine ak enkubasyon nan 4 ◦C pou 30 min, epi pwosesis sa a te repete twa fwa.

Echantiyon yo te transfere nan fre 100% résine epi yo te polymerize nan 50 ◦CO / N. Rezin yo polymerize yo te ultra-mens seksyon nan 90 nm ak yon kouto dyaman lè l sèvi avèk yon ultramicrotome (Ultracut UCT; Leica), ak seksyon yo te plase sou griy nikèl. Kadriyaj yo te enkube ak antikò anti-dsDNA (35I9 ADN) (1/800, Abcam, Cat # ab27156, RRID: AB_470907) nan 1% BSA/PBS nan 4 ◦CO/N, ki te swiv pa twa rense avèk 1% BSA/PBS pou 1 min chak.

Apre sa, yo te enkube ak antikò segondè yo konjige ak patikil lò {{{0}}nm (Goat anti-Mouse IgG polyclonalantibody) pou 2 èdtan nan RT. Apre rense ak PBS, yo te mete gri yo nan 2% glutaraldehydein 0.1 M tanpon kakodilat.

Apre sa, griyaj yo te cheche epi answit tache ak 2% acetate uranyl pou 15 min ak yon solisyon tach plon (Sigma-Aldrich) nan RT pou 3 minit. Yo te obsève kadriyaj yo atravè yon mikwoskòp elèktron transmisyon (JEM-1400 plis; JEOLLtd.) nan yon vòltaj akselerasyon 100 kV. Imaj dijital yo te jwenn ak yon kamera CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Rezilta

3.1. Diminye TFAM oswa GBA pwovoke yon ogmantasyon nan ADN mitokondriyo ektopik

Premyèman, nou te montre yon egzanp deteksyon cytoplasmicDNA mitokondriyo ki sòti nan selil HeLa kote pwoteyin TFAM te frape pa siRNA (Figi 1A). TFAM se yon faktè kle transkripsyon mitokondriyo epi tou li fonksyone nan replikasyon ak reparasyon mitokondrial DNA [20] .

Yo rapòte polimorfism sekans nan jèn sa a ki asosye ak maladi Parkinson la [21,22]. Apre 3 jou nan kraze pwoteyin TFAM, yo te detekte yon anpil nan pwen ADN doub-cheche nan sitoplasm selil HeLa yo.

Istòn yo se makè pozitif pou ADN orijin nikleyè nan sitoplasm la, ak makè negatif pou ADN mitokondriyo ak ADN orijin mitokondriyo nan sitoplasm la [23].Pwen sa yo pa t 'ko-lokalize ak histones, ki sijere ke yo pa t' ADN ki sòti nan nikleyè. Anplis de sa, kèk nan pwen sa yo sitoplasmik, ADN ektopik pa t 'ko-lokalize ak Hsp60, yon makè pou matris la mitokondriyo, ki endike ke yo abite deyò mitokondri yo (Figi 1B, C).

Mikwoskopi elektwonik te montre tou ke DNA ektopik la te koule soti nan mitokondri yo (Figi 2A, B). An rezime, ogmantasyon nan ADN ektopik nan sitoplasm nan debat TFAM te akòz ADN mitokondriyo koule soti nan mitokondri yo. Dezyèmman, nou te montre yon lòt egzanp deteksyon ADN sitoplasmik ki sòti nan mitokondri yo nan selil HeLa kote pwoteyin GBA te frape desann pa siRNA. (Figi 1A).

GBA se jèn ki lakòz maladi Gaucher, men yon mitasyon eterozigòt nan GBA se tou yon faktè risk pou maladi Parkinson la [24]. Yo te detekte yon anpil nan pwen ADN doub-cheche nan sitoplasm selil HeLa yo apre 3 jou nan knockdown pwoteyin GBA. Gen kèk pwen ADN yo te ko-lokalize ak histones, ki sijere ke yo te nikleyè-derivedDNA.

Lòt pwen ADN pa t ko-lokalize ak histones, sa ki sijere ke yo pa t ADN ki sòti nikleyè men ADN ki sòti nan mitokondri (Figi 1D). An rezime, ogmantasyon nan pwen ADN ektopik nan sitoplasm nan pa kraze GBA te omwen an pati akòz ADN mitokondriyo koule soti nan mitokondri yo.

For more information:1950477648nn@gmail.com