Enpak Nephrotoxin Ochratoxin A sou selil ren imen etidye pa yon nouvo modèl ko-kilti enfliyanse pa prezans fibroblast.
Mar 01, 2022
Résumé:Larense menase pa yon anpil nan sibstans ki kapab toksik. Pou etidye enfliyans nefrotoksin okratoksin A (OTA) nou te etabli yon modèl ko-kilti selil ki fòme ak moun.ren selil tubul proximal ak fibroblast. Nou etidye efè OTA sou siviv selil, ekspresyon jèn ak / oswa pwoteyin ki gen rapò ak lanmò selil, matris ekstraselilè ak omeyostazi enèji. Necrosis pwovoke OTA te amelyore nan tou de kalite selil yo nan prezans lòt kalite selil respektif la, tandiske apoptoz pwovoke OTA te endepandan de li. Nan fibroblasts, men se pa nan selil tubul yo, yon efè ko-kilti te vizib konsènan ekspresyon de pwoteyin ki gen rapò ak sik selil la p21. Ekspresyon vimentin pwoteyin epithelial-a mesenchymal ki endike tranzisyon an te endepandan de kondisyon kilti a. Ekspresyon lncRNA WISP1-AS1 OTA-induit la te amelyore nan ko-kilti. Ekspozisyon OTA te mennen nan chanjman nan ekspresyon jèn ki gen rapò ak metabolis enèji ak yon efè mobilizasyon glikoz ak yon ekspresyon redwi nan pwoteyin mitokondriyo. Ansanm, nou demontre ke reyaksyon selil yo ka diferan nan prezans selil ki natirèlman tou pre, kidonk pèmèt yon diskisyon selilè. Se poutèt sa, pou evalye toksisite yon sibstans, li ta yon avantaj konsidere itilizasyon ko-kilti olye pou yo mono-kilti.
Mo kle:okratoksin A; kilti selil; metabolis enèji; balans apoptoz-necrosis; mitokondri; ren; ren
CISTANCHE AP AMELIORE ENFÒK REN/RENAL
Entwodiksyon
Akòz fonksyon ekskretè li yo, larense menase pa yon varyete sibstans danjere tankou dwòg oswa kontaminan manje, tankou mikotoksin ki mennen nan egi oswa - menm pi mal - kwonik.maladi renak yon prévalence de apeprè 10 pousan [1,2]. Pou konprann mekanis aksyon nefrotoksik la, li itil pou jwenn estrateji pou soulaje senaryo prejidis sa yo ak anpil etid yo te fèt pou rezoud kesyon poukisa ak ki jan.renyo an danje [3–5]. Pou etidye enfliyans yon sibstans sou yon òganis, li souvan difisil pou itilize bèt antye akòz enkyetid etik ak kondisyon òganizasyonèl, koute chè ak elabore. Anplis de sa, yon transfè konesans nan sitiyasyon imen an asosye ak ensètitid. Se poutèt sa, modèl kilti selil yo te etabli epi yo itilize lajman, epi yo gen avantaj ke yon kalite selil espesifik ak repons li yo nan yon sibstans oswa nan yon tretman ka etidye nan kondisyon kontwole. Malgre ke anpil konklizyon enpòtan yo te fè lè l sèvi avèk apwòch sa a, gen kèk dezavantaj nannan: selil nan yon liy selil souvan yo te imòtalize pa mutagenezis oswa lòt-pafwa radikal-metòd [6]. Sa a pèmèt manyen fasil ak itilizasyon long men ak danje a ki rezilta yo jwenn nan yon sistèm modèl espesifik ka pa transfere nan sitiyasyon an nan ògàn an antye oswa òganis. Pou depase dezavantaj sa a, olye pou yo imòtalize liy selil yo, selil prensipal yo ka itilize, men jenerasyon selil prensipal yo souvan trè difisil epi li mande ladrès teknik avanse. Anplis de sa, selil prensipal yo souvan pa siviv pou yon peryòd tan ki long epi yo bezwen kondisyon espesyal kilti endividyèl. Men, selil prensipal yo se yon etap pi pre kondisyon natirèl yo e omwen pafwa li te vin parèt ke yo pi sansib a, egzanp, stimuli toksik kòm liy selil yo [7], sa vle di ke liy selil yo ta ka pi solid. Yon lòt dezavantaj se lefèt ke selil yo souvan kenbe nan monokilti, sa vle di, san enfliyans yo nan lòt kalite selil, ki nan ògàn lakay yo anjeneral yo tou pre. Se poutèt sa, li ta ka yon etap nan direksyon pou yon sitiyasyon ki pi reyalis pou etidye repons yon kalite selil nan yon sibstans oswa tretman an prezans selil sa yo, ki nan ògàn natif natal la tou pre.
Nanren, selil tubul proximal yo antoure pa fifibroblast epi yo ka sipoze yon enfliyans—pwobableman mityèl. Sa a se tou ka a nandomaj nan rensenaryo ki nan pifò ka yo mennen nan enflamasyon tubulo-entèrstisyèl ak fibwoz [8,9], epi yo desizif pou n bès nanrenfonksyon. Akòz transpò yo ak kapasite anzimatik yo,renselil tubul proximal yo an danje pa yon varyete sibstans toksik potansyèl tankou, pa egzanp, dwòg oswa rès yo oswa mikotoksin. Youn nan wòl fibroblasts ki antoure yo se bay matris ekstraselilè a pa lage kolagen an ak lòt konpozan matris yo epi kidonk yo patisipe nan entegrite tisi a [10]. Men, yo tou—ansanm ak selil epitelyal—ki enplike nan pwosesis enflamatwa oswa nan fibrotik.maladi ren[11] ak risk pou yo devlopeensifizans ren.
Yon mikotoksin entansif etidye ak enpòtans pou sante moun se okratoksin A (OTA) [12,13]. Li ka jwenn nan yon varyete de manje [12,14] epi pou fè pou evite ekspoze li yo ak absòpsyon se prèske enposib [9,15]. Sa a mennen nan obsèvasyon ke OTA yo detekte souvan nan san moun nan konsantrasyon nanomolar ki ba [16]. Nan bèt ekspoze, OTA mennen nanechèk renak chanjman fifibrotic [17,18]. Yo sipoze ekspoze OTA yo patisipe nan mounmaladi ren[19]. Nan selil prensipal tubul proximal imen yo, yo montre yon efè toksik nan OTA, ki se tou obsèvab nan fifibroblast prensipal imen, byenke li pa enpòtan menm jan ak selil tubul proximal [7]. Mekanis ki dèyè aksyon toksik OTA yo toujou pa konprann konplètman epi yo sijè a anpil etid kontinyèl. Ki distans selil vwazen ak fonksyon diferan entèfere ak kidonk modil fonksyon selil yo prèske pa konnen men li espere. Nan yon etid anvan lè l sèvi avèk yon modèl ko-kilti ki fòme ak ratrentibil proximal ak selil fifibroblast, li te tounen soti ke yon kalite crosstalk ant tou de kalite selil pran plas, ki mennen nan obsèvasyon an ke efè OTA kòm tranzisyon epithelial-a-mesenchymal (EMT) te fèt sèlman nan kondisyon ko-kilti [20]. Yon lòt konklizyon ki soti nan etid sa a ak lòt moun se te ke selil rat yo pi solid konsènan tolerans pou OTA an konparezon ak selil tubul proximal imen [7,20] epi kidonk yon sistèm modèl ki baze sou selil imen yo oblije pi pre evalye sitiyasyon imen an ak risk pou yo ekspoze OTA.
Se poutèt sa, nan etid la prezan, nou etabli yon modèl avanse ko-kilti selil ki gen ladan selil tubul proximal imen (selil HK2) ak fifibroblast imen (selil CCD-1092SK) pou etidye efè OTA sou siviv selil (apoptoz). , nekroz) ak ekspresyon de kèk jèn egzanplè chwazi ki gen rapò ak sik selil, lanmò selil, matris ekstraselilè, ak metabolis. Menm jan ak etid anvan yo te itilize selil rat [20], yo te plase selil tubul proximal imen yo sou aparèy filtè yo epi yo te mete filtè yo anlè yon kouch fibroblast ki te simen sou anba yon plat Petri pou bò basolateral selil epitelyal yo te fè fas a. fibroblasts yo, ki pèmèt yon kalite konvèsasyon ant tou de kalite selil yo.
Rezilta yo
Pwoteyin, Laktat Dehydrogenase ak Aktivite Caspase-3Pou jwenn yon premye enpresyon sou efè posib kondisyon kilti li menm ak sou efè sou chanjman OTA-induit, nou te konpare aktivite kaspase-3 kòm yon mezi pou apoptoz nan selil ki grandi nan monokilti ak aktivite a nan selil ki grandi nan ko. -kilti enkubasyon ak oswa san 100 nM OTA pou de pwen nan tan, 24 ak 48 h. Anplis de sa, laktat dehydrogenase (LDH) lage kòm yon mezi pou necrosis te detèmine kòm byen ke kontni pwoteyin bay yon enpresyon jeneral sou sitiyasyon selil. Se poutèt sa, kantite egal selil yo te mete swa nan anba a byen (fifibroblasts) oswa sou yon fifilter (selil tubul proximal). Apre yo te rive nan konfli, fifiltè yo te mete nan pwi yo kote fifibroblast yo te lokalize (gade grafik abstrè). Jan yo montre nan Figi 1A, prèske pa gen okenn efè depandan kilti-kondisyon sou kontni pwoteyin yo ka obsève nan tou de kalite selil apre 24 oswa 48 èdtan (gade tou Fichye Siplemantè S1). Nan fifibroblasts, ekspoze OTA te mennen nan yon ti ogmantasyon nan kontni pwoteyin tandiske nan selil tubul OTA te mennen nan yon diminisyon ti tay nan kontni pwoteyin ki montre ke OTA ta ka gen yon efè negatif sou selil tubul yo. Efè sa yo te prèske endepandan de kondisyon kilti a nan tou de kalite selil yo
Figi 1. Efè okratoksin A (OTA) ak/oswa kondisyon kilti sou kontni pwoteyin (A), aktivite caspase -3 (B), ak laktat dehydrogensase (LDH) (C). Selil yo te kiltive swa nan mono- oswa nan ko-kilti ak ekspoze a 100 nM OTA pou 24 oswa 48 èdtan. N=3–6, n=14–18 (pwoteyin, LDH) oswa 8–9 (kaspase-3). * endike ap <0.05 nan="" selil="" ki="" pa="" ekspoze="" a="" ota="" (konpare="" efè="" ota="" yo,="" resp.="" bò="" gòch)="" oswa="" nan="" selil="" nan="" mono-kilti="" (konpare="" efè="" kilti,="" resp.="" bò="" dwat).="" pou="" plis="" eksplike="" efè="" a="" sou="" kontni="" pwoteyin,="" nou="" etidye="" apoptoz="" ak="" nekwoz.="" konpare="" ak="" fifibroblasts,="" ota="" te="" gen="" yon="" efè="" klè="" sou="" apoptoz="" nan="" selil="" tubul="" apre="" 24="" èdtan="" ekspoze="" ak="" apeprè="" 2.="" 5-="" ogmantasyon="" nan="" aktivite="" (figi="" 1b).="" apre="" 48="" èdtan="" ekspoze="" ogmantasyon="" an="" te="" toujou="" obsèvab,="" men="" se="" pa="" menm="" diferan="" ke="" apre="" 24="" èdtan.="" sepandan,="" ogmantasyon="" sa="" yo="" te="" prèske="" endepandan="" de="" kondisyon="" kilti="" eksepte="" ke="" apre="" 48="" èdtan="" nan="" prezans="" fifibroblasts="" aktivite="" a="" caspase="" nan="" selil="" tubul="" yo="" te="" yon="" ti="" kras="" redwi,="" ki="" endike="" yon="" modès="" efè="" pwoteksyon="" nan="" ko-kilti="" a.="" sepandan,="" yon="" efè="" pwoteksyon="" nan="" ko-kilti="" te="" obsèvab="" pou="" fifibroblast="" yo,="" espesyalman="" nan="" prezans="" ota.="" nan="" ko-kilti,="" lage="" ldh="" te="" byen="" klè="" amelyore="" nan="" fifibroblast="" ak="" selil="" tubul="" lè="" yo="" konpare="" ak="" kondisyon="" monokilti="" endepandan="" de="" prezans="" ota="" (figi="" 1c).="" nan="" selil="" tubul="" yo,="" ota="" te="" mennen="" nan="" yon="" ogmantasyon="" nan="" ldh="" lage="" nan="" medya="" yo="" espesyalman="" apre="" 48="" èdtan="" ekspoze,="" ki="" pa="" t="" 'tankou="" pwononse="" nan="" fibroblasts.="" ansanm,="" prezans="" nan="" lòt="" kalite="" selil="" respektif="" la="" te="" mennen="" nan="" necrosis="" ranfòse="" men="" nan="" mwens="" apoptoz="" pou="" kontni="" an="" jeneral="" pwoteyin="" pa="" te="" konsiderableman="" chanje.="" efè="" ota="" sou="" apoptoz="" ak="" nekwoz="" yo="" te="" sitou="" endepandan="" de="" prezans="" oswa="" absans="" lòt="" kalite="" selil="">
Western Blot ak ekspresyon mRNA
CDKN1A/p21Sik selilè yo te montre yo dwe enfliyanse pa OTA epi li ta ka montre ke pwoteyin p21 ki enplike nan sik selil yo te upregulated pa OTA nan selil tubul yo [21]. Pou envestige nan ki distans pwoteyin nan, osi byen ke ekspresyon an nan kodaj mRNA pou p21, enfliyanse pa prezans nan fibroblast, nou fè Western blots ak RT-PCR. Jan yo montre nan Figi 2A, B ak 3, 48 èdtan ekspoze a 100 nM OTA te mennen nan yon ogmantasyon nan kantite pwoteyin p21 nan mono, men tou nan kondisyon ko-kilti nan selil tubul. Nan fibsoblast nan kondisyon ko-kilti, OTA pa te gen okenn efè sou ekspresyon pwoteyin p21-byenke ekspresyon mRNA an te ogmante pa OTA endepandan de prezans lòt kalite selil la. Enteresan, anba kondisyon ko-kilti, ekspoze OTA pa t 'plis ogmante ekspresyon pwoteyin p21. Nan selil tubul yo, ekspresyon RNA yo pa te chanje pa prezans fibroblast, men nan fibroblast nan ko-kilti, ekspresyon ZlmRNA te amelyore pa sèlman nan OTA-ekspoze, men tou deja nan selil ki pa ekspoze a OTA (gade tou Fichye Siplemantè S1). Sa montre ke p resenee nan lòt kalite selil la gen yon enfliyans sou ekspresyon pwoteyin p21, espesyalman nan fibroblasts.
Cyclooxygenase 2 (COX2)Li te montre ke cyclooxygenase 2 (COX2) pwoteyin ak nivo mRNA yo ogmante pandanechèk ren[22]. Jan yo montre nan Figi 2C, D ak 3, sèlman nan fifibroblasts ekspresyon pwoteyin lan te ogmante pa ekspoze OTA. Anplis de sa, nan prezans selil tubul yo, ekspresyon pwoteyin COX2 te amelyore nan selil ki pa trete yo ak nan selil ki ekspoze a OTA, ki montre yon enfliyans klè nan selil tubul yo. Ekspresyon mRNA a, sepandan, pa te enfliyanse pa OTA ak yon efè trè ti tay nan ko-kilti ki te fèt pa ekspoze OTA. Kontrèman, nan selil tubul yo, mRNA ak ekspresyon pwoteyin COX2 te konplètman endepandan de OTA oswa prezans fifibroblast. Sa montre ke konsènan selil tubul COX2 yo ka enfliyanse fifibroblast men fifibroblast pa gen okenn enfliyans sou selil tubul yo.
FibronektinEnsifizans rense souvan akonpaye pa fifibroz. Pandan fifibroz, yon akimilasyon nan matris ekstraselilè pran plas ak yon obsèvasyon san konte lòt se yon ogmantasyon nan kantite pwoteyin fifibronectin [23]. Se poutèt sa, chanjman depandan OTA nan mRNA fibronectincoding ak ekspresyon pwoteyin yo te detèmine nan kondisyon mono- oswa ko-kilti. Jan yo montre nan Figi 3 ak 4A, B, 48 èdtan ekspoze nan selil tubul yo nan 100 nM OTA te mennen nan yon diminisyon nan fifibronektin entraselilè tou de nan mono-ak ko-kilti. OTA-efè a te pi ba nan ko-kilti. Anplis, kantite kodaj mRNA pou fifibronectin te redwi pa ekspoze OTA poukont li nan kondisyon kilti yo ak prezans fifibroblasts te mennen nan pi ba ekspresyon mRNA nan kontwòl ak selil ki ekspoze OTA. Nan kontras, nan fifibroblasts ekspresyon fifibronectin la te prèske pa chanje ni pa OTA ni pa kondisyon kilti paske nan yon gwo varyasyon, espesyalman nan Western blots yo. Yon tandans pou ekspresyon OTAinduced ta ka vizib nan mono-kilti.
VimentinVimentin se yon pwoteyin ki gen abondans ogmante lè tranzisyon epithelial-a-mesenchymal (EMT) pran plas epi devlopman EMT ka mennen nanechèk ren[23]. Se poutèt sa, yo te detèmine chanjman OTA-depandan nan vimentin mRNA ak ekspresyon pwoteyin nan kondisyon mono- ak ko-kilti. Jan yo montre nan Figi 3 ak 4C, D, 48 èdtan ekspoze nan selil tubul yo a 100 nM OTA te mennen nan yon pi ba abondans nan pwoteyin vimentin tou de nan kondisyon mono- ak ko-kilti. Sepandan, nan prezans fifibroblasts ekspresyon nan pwoteyin vimentin te endepandan de kondisyon kilti. Ekspresyon kodaj mRNA pou vimentin prèske pa t chanje ni pa OTA ni pa kondisyon kilti ak eksepsyon ke ekspoze OTA nan ko-kilti te montre yon ti ogmantasyon. Nan fifibroblasts, ekspresyon nan pwoteyin vimentin te konplètman endepandan de ekspoze OTA kòm byen ke nan prezans nan selil tubul yo. Anplis de sa, ekspresyon mRNA vimentin-kode prèske pa chanje
Ekspresyon kèk jèn seleksyonePou plis teste egzanplè nan ki jan kondisyon kilti yo ka afekte ekspresyon lòt RNA yo, nou chwazi kèk jèn, ki jwe yon wòl nan apoptoz-necrosis, devlopman kansè, oswa metabolis enèji (gade tou Fichye Siplemantè S1).
WISP1-AS1se yon long RNA ki pa kode (lncRNA) pwovoke pa OTA ki afekte règleman transkripsyon ak jwe yon wòl nan balans apoptoz-necrosis ak pwobableman nan devlopman kansè [24]. Jan yo wè nan Figi 5A, 48 èdtan ekspoze a 100 nM OTA te mennen nan tou de kalite selil yo nan yon ogmantasyon make nan ekspresyon lncRNA sa a. San yo pa OTA, prezans nan lòt kalite selil respektif la te prèske pa gen okenn enfliyans sou ekspresyon an. Sepandan, nan prezans OTA, ekspresyon li te pi wo nan ko-kilti kòm konpare ak mono-kilti.
GDF15Faktè diferansyasyon kwasans 15 (GDF15) se yon manm nan superfamiy faktè kwasans transfòmasyon ki reponn a estrès. Li diskite kòm yon biomarker tou poumaladi renoswa kòm yon prediktè pou siviv nanrenpasyan transplantasyon [25,26]. Ekspresyon kodaj mRNA pou GDF15 te amelyore nan tou de kalite selil apre ekspoze OTA jan yo montre nan Figi 5B. Efè OTA-pwovoke sa a te favorize nan fifibroblasts lè selil tubul yo te nan vwazinaj la. Nan selil tubul yo, sepandan, ekspresyon an te endepandan de prezans fifibroblasts (Figi 5B).CDK2Kinaz kinaz 2 depandan siklin (CDK2) te idantifye pa analiz rezo korelasyon filaplon kòm yon gwo regilatè nan disregulasyon sik selilè OTA-induit [21]. Nan fifibroblast nan monokilti ekspresyon kodaj mRNA pou CDK2 pa te chanje pa OTA. Anplis de sa, prezans selil tubul yo pa afekte ekspresyon mRNA an. Sepandan, nan selil tubul yo, OTA te mennen nan yon ekspresyon yon ti kras amelyore sèlman nan prezans fifibroblasts (Figi 5C).
Glikojèn ak pwoteyin ki gen rapò ak glikoz: PYGM, GYS1 ak GLUT1 (SLC2A1)Larense tou patisipe nan omeyostaz glikoz epi li ka bay kò a ak glikoz swa pa glikoneogenesis oswa pa mobilize magazen glikojèn [27]. Glikojèn fosforilaz (PYGM) jwe yon wòl nan dekonpozisyon magazen glikojèn, kidonk mobilize glikoz [28]. Jan yo wè nan Figi 6A, 48 èdtan ekspoze a 100 nM OTA te mennen nan yon ogmantasyon make nan ekspresyon kodaj mRNA pou fosforilaz glikojèn, espesyalman nan selil tubul yo. Sepandan, nan selil tubul ogmantasyon sa a pa t depann de kondisyon kilti tandiske nan fifibroblast ekspresyon OTA-induit te pi wo nan prezans selil tubul konpare ak kondisyon an san selil tubul, Glycogen synthase 1 (G^YSl) katalize reyaksyon opoze a. ak Lè nou konsidere ke ekspresyon fosforilaz la te regilasyon, ekspresyon sintaz la te desann reglemante pa OTA nan selil tubul yo ak nan fibroblasts nan ko-ktilite (Figi 6B). Sa a endike yon efè mobilizasyon glikoz nan OTA, Enteresan, ekspresyon mRNA nan transpò glikoz GLUTl (SLC2A1) te kontwole pa OTA, tou (Figi 6C), souliye lide a nan yon demann glikoz amelyore akòz ekspoze OTA petèt akòz
Pwoteyin ki gen rapò ak mitokondri yo: NDUFB10 ak MRPS16
Gen endikasyon ke ekspoze OTA ka mennen nan yon diminisyon nan potansyèl la mitokondriyo nanrenselil [24] ki montre ke fonksyon mitokondriyo ka enfliyanse pa ekspoze OTA, ki ta ka anplis enfliyanse pa prezans nan fibroblast. Se poutèt sa, reprezantan lòt RNA kodaj pou pwoteyin mitokondriyo, nou montre isit la ekspresyon mRNAs kodaj pou NDUFB10 ak MRPS16. Kòd NDUFBt0 pou NADH mitokondriyo a: ubiquinone oxidoreductase subunit B10, ki se yon pati nan konplèks respiratwa mitokondriyo I ak trè eksprime nan kè akren(Jèn NCBI. Disponib sou entènèt: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (aksè sou 17 mas 2021)). Kòd jèn MRPS16 pou pwoteyin mitokondriyo ribosomal S16, ki jwe yon wòl nan sentèz pwoteyin mitokondriyo. Jan yo montre nan Figi 7, ekspoze OTA 24 èdtan te mennen nan tou de kalite selil yo nan yon ekspresyon diminye nan tou de mRNAs. Nan selil tubul yo, ekspresyon jèn NDUFB10 la pa te enfliyanse pa prezans fibroblast, tandiske nan fibroblasts rediksyon ekspresyon NDUFB10 ki te pwovoke OTA a te yon ti kras sove nan prezans selil tubul (Figi 7A). Nan selil tubul yo, ekspresyon ki deja bese nan kodaj jèn pou mitokondriyo ribosomal subunit pa OTA te anplis pi ba nan prezans fibroblasts, tandiske nan fibroblast prezans nan selil tubul yo te mennen nan yon ekspresyon yon ti kras pi wo nan MRPS16 mRNA (Figi 7B). Sa a montre ke fonksyon mitokondriyo ka afekte pa OTA men ke efè a OTA ka Anplis de sa dwe modifye lè de kalite selil yo fèmen ansanm.
Diskisyon
Larense an danje pa yon varyete de sibstans nefrotoksik ak risk pou yo egi oswa chronitechèk ren[1]. Pou etid enpak sibstans nefrotoksik sou diferan kalite selil ak diminye manyen bèt, kilti selil yo te lajman aplike. Kilti selil sa yo gen avantaj adisyonèl ke kondisyon eksperimantal yo ka kontwole ak efè espesifik nan yon sibstans envestige lè l sèvi avèk yon kalite selil defini. Anplis de avantaj sa yo, gen kèk konsiderasyon rete: pa egzanp, nan "ògàn lakay" yon sèl kalite selil (egzanp, selil tubul proximal nanren) antoure pa lòt kalite selil (egzanp, fibroblast) ak entèdepandans manifolb. Se poutèt sa, reyaksyon an nan yon sibstans obsève lè w ap itilize sèlman yon sèl kalite selil ka pa menm jan ak nan prezans selil yo tou pre nan tisi orijinal la. Nan yon modèl ki gen de diferan kalite selil ren rat, yo montre ke gen yon kwaze ant selil tubul ak fibroblast, ki mennen nan reyaksyon parèt sèlman lè de kalite selil yo te pwòch ansanm [20]. Sepandan, lè w konpare rezilta yo nan stitdy sa a ak rezilta yo obsève lè l sèvi avèk selil tubul ren imen, li parèt ke selil rat yo evidamman yo pi solid pase moun nan di kortcerning reyaksyon yo nan tretman ak yon nefrotoksin omniprésente, ochrafoxin A (OTA) [7]. Se poutèt sa, yon modèl ko-kilti ki gen ladan selil imen nesesè. Nou te etabli yon modèl sa yo lè nou itilize liy selil imen HK2 ak fibroblast imen. Selil HK2 yo grandi sou foure filtè yo epi yo pote ansanm ak fibroblasts, yo grandi sou anba yon plak 6-byen. Apre anrejistreman paramèt debaz yo kòm apoptoz ak nekwoz, nou itilize modèl sa a pou jwenn premye done sou efè okratoksin A sou eksperyans kèk pwoteyin ak RNA ki gen rapò ak sik selilè, EMT, ak metabolis selilè.
Siviv selil Ki baze sou kontni pwoteyin, li te sanble ke ni OTA ni kondisyon kilti a te gen yon efè remakab. Sepandan, relasyon ki genyen ant apoptoz ak nekwoz te deplase nan direksyon nekwoz nan tou de kalite selil lè selil yo te kiltive ansanm. Yo konnen OTA pwovoke apoptoz nan selil tubul [29] ak nan yon pwolonje pi piti tou nan fibroblasts [7]. Sa a reflete tou nan rezilta prezan yo. Enteresan, prezans nan lòt kalite selil respektif la te mennen nan diminye pousantaj apoptoz nan tou de kalite selil yo men nan amelyore lage LDH. Sa a se yon premye allusion ke deja prezans nan yon lòt kalite selil ka enfliyanse fonksyon selilè ak ke reyaksyon an nan selil yo nan yon sibstans toksik ka diferan nan ko-kilti konpare ak mono-kilti.
Pwoteyin ak ekspresyon RNA Nou pwolonje etid nou yo pa detèminasyon nan ekspresyon pwoteyin ak RNA nan kèk pwoteyin egzanplè chwazi ak RNA yo kode pou yo. Kòm yo te montre OTA enfliyanse sik selil [21,30], ekspresyon CDKN1A/p21 te etidye. Dapre rezilta yo pa Dubourg et.al [21], OTA te mennen nan yon ekspresyon amelyore pa sèlman nan CDKN1A mRNA, men tou nan CDKN1A / p21 pwoteyin nan selil tubul. Nan selil sa yo, prezans fibroblast pa t enfliyanse ekspresyon mRNA CDKN1A, tandiske nan fibroblast yo te vizib yon efè klè ko-kilti ak abondans mRNA amelyore sèlman vizib nan ko-kilti. Sepandan, ogmantasyon sa a nan abondans mRNA pa te konplètman reflete pa ekspresyon pwoteyin, sijere plis mekanis regilasyon. Etid sik selilè yo ka ajoute pou jwenn yon insight plis sou enpak la sou sik selilè. Cyclin-depandan kinaz 2 (CDK2) te jwenn yo jwe yon wòl nan OTA-induit dysregulation nan sik selilè [21]. Nan selil tubul yo, ekspresyon mRNA li yo te amelyore pa OTA nan ko-kilti tandiske fibroblast yo pa te enfliyanse pa selil tubul yo. Ansanm, rezilta yo sijere ke sik selil la nan selil tubul yo enfliyanse pa prezans nan fibroblast.
Yo te obsève yon lòt efè ko-kilti pou ekspresyon COX2 nan fibroblasts. Pou fibroblasts, prezans selil tubul yo te mennen nan yon ekspresyon pwoteyin byen klè (menm jan ak rezilta yo obsève nan selil rat [20]), ki pa t vizib pou selil tubul yo ki pa t montre okenn depandans kilti. Sa a endike ke wòl nan fibroblasts nan enflamatwamaladi renka yo te souzèstime pa etid ki itilize fifibroblasts nan mono-kilti. Pwoteyin filaman entèmedyè vimentin la eksprime nan fibroblasts epi li eksprime de pli zan pli pandan tranzisyon epitelyal-a-mesenchymal (EMT) nan selil epitelyal [10]. Malgre ke li te montre ke ekspoze pwolonje OTA ka mennen nan ekspresyon amelyore nan kolagen III oswa fibronectin nan selil tubul [7], nan etid la prezan ekspresyon an nan vimentin nan pwoteyin EMT ki endike nan selil tubul te menm pi ba apre ekspoze OTA, endepandan. nan kondisyon kilti. Anplis de sa, ekspresyon an nan mRNA fibronectin ak pwoteyin te pito pi ba epi yo pa amelyore. Anplis de sa, nan fibroblasts, pa gen okenn ekspresyon ki chanje yo te demontre pou ke rezilta sa yo pa diskite an favè yon EMT pwovoke pa OTA, jan lòt moun montre [31].
CISTANCHE AP AMELIORE FONKSYON REN/REN
Pou plis teste si kilti ko ka enfliyanse repons selilè a estrès pwovoke pa OTA, nou detèmine ekspresyon de kèk RNAs chwazi egzanplè ki gen rapò ak apoptoz-necrosis, devlopman kansè ak metabolis enèji. Long ki pa kodaj RNAs jwe yon wòl enpòtan nan anpil pwosesis regilasyon selilè ak deraye yo, epi tou nan fibwoz ren oswa kansè [32]. WISP1-AS1 se yon long RNA ki pa kode pwovoke pa OTA epi ki eksprime nan selil timè ren [24]. Nou te jwenn regilasyon li yo pa OTA nan tou de kalite selil ak ko-kilti amelyore regilasyon an. Sa a pèmèt efè WISP1-AS1 agrave sou balans apoptoz-necrosis ak pwobableman fòmasyon timè. Se poutèt sa, amelyore lage LDH yo obsève nan ko-kilti a kapab eksplike omwen yon pati nan kontni amelyore WISP1-AS1, ki te montre nesesè pou necrosis OTA-induit [24].
WISP1-AS1te tou sispèk jwe yon wòl nan metabolis ki gen ladan mitochon dria [24]. Nan selil epitelyal gastric, OTA te montre ki lakòz malfonksyònman mitokondriyo [33]. Pourenselil yo, gen rezilta kontwovèsyal sou si ekspoze OTA gen yon enfliyans sou potansyèl mitokondriyo oswa ou pa [21,24]. Yon potansyèl mitokondrial redwi ta ka rezilta nan mitokondri ki gen pwoblèm oswa ka kontinye domaj mitokondriyo. Ekspresyon redwi nan pwoteyin mitokondriyo ka mennen nan fonksyon ki gen pwoblèm reflete oswa ki te swiv pa potansyèl mitokondriyo chanje. Fonksyon mitokondriyo andikape fòse selil la itilize chemen altènatif pou asire rezèv enèji. Pwovizyon enèji anba kontribisyon mitokondriyo ki pa apwopriye ka kenbe pa yon itilizasyon ogmante nan glikoliz ki mennen nan pwodiksyon amelyore nan laktat. Sepandan, nan selil HEK293, yon anbriyon imenrenliy selilè, yo te jwenn ke OTA te mennen pito nan yon rediksyon nan glikoliz ak kantite lajan an ogmante nan laktat akòz pwodiksyon laktat nan glutamin te depann sou ekspresyon nan lncRNA WISP 1-AS1 [24]. Kontrèman, nan selil epiteli gastric yo, li ta ka montre ke ekspoze OTA mennen nan yon repwogram metabolis glikoz nan direksyon pou glikoliz ak mwens aktivite sik asid tricarboxyic [34]. Nou ka montre isit la ke (1) OTA mennen nan yon ekspresyon mRNA redwi nan de pwoteyin mitokondriyo chwazi reprezante, ki jwe yon wòl nan sentèz pwoteyin mitokondriyo (MRPS16) ak pwodiksyon enèji (NDUFB10) ak (2) ke anzim glikojèn-manyen yo te reglemante. nan yon fason ki amelyore glikoz ka mobilize (GYS1 desann ak PYGM moute). Anplis de sa, yon pi wo kapasite transpò GLUT1 sanble ap pwovoke. Sepandan, chanjman sa yo OTA-induit te prèske endepandan de kondisyon kilti.
An konklizyon, nou te montre ke nan kondisyon ko-kilti, reyaksyon selil yo ka diferan de reyaksyon yo obsève nan mono-kilti, byenke se pa tout paramèt etidye isit la yo te depann de kilti. Sepandan, dapre rezilta yo prezante isit la, yo ta dwe prefere itilize ko-kilti si sa posib, konsa evite posiblite pou sipèvize efè yo pa pran plas lè sèlman yon sèl kalite selil yo etidye. Kesyon an rete sou ki jan selil yo kominike youn ak lòt. Etid nan yon modèl ko-kilti rat te revele yon mekanis ki depann de COX2-[20] epi nan sourit, asid retinoik sanble patisipe nan diskisyon selilè.renselil [35]. Anplis de sa, kesyon an rete, si, poukisa ak ki jan OTA entèfere ak metabolis enèji selilè ak wòl nan mitokondri ladan l.
Detèminasyon Aktivite LDH ak Caspase-3 ak Kontni PwoteyinPou liz, selil yo te lave de fwa nan tanpon PBS frèt, kolekte epi liz nan tanpon MOPSTriton (2 0 mM 3- (N-morfolino) asid propansulfonik, pH 7.4, 0. 1 pousan Triton X100). Kontni pwoteyin nan lisat selil yo te detèmine lè l sèvi avèk asid bicinchoninic [36,37]. Aktivite LDH nan medya oswa lysate selil kòm yon mezi pou necrosis te detèmine dapre Bergmeyer [38] jan sa dekri an detay nan [20]. Aktivite kaspas-3 kòm yon mezi pou apoptoz te detèmine lè l sèvi avèk substra kaspase-3 florigenic (DEVD-AFC) jan sa dekri nan [39]. Yon ti tan, yo te enkube 60 µL lisat selil ak 65 µL tanpon reyaksyon (20 mmol/L piperazin-1,4-bis(2ethanesulfonic acid (PIPES), 4 mmol/L EDTA, 0.2 pousan {{26}) }[(3-kolaminopropil)dimetilammonio]-1-propansulfat (CHAPS), 10 mmol/L dithiotreitol (DTT), pH 7.4) ki gen 42 µmol/L DEVD-AFC (Aspglu-val-asp{{ 36}}amino-4-trifluoromethylcoumarin, fen-konsantrasyon) nan 37 ◦C. Yo te mezire fliyoresans nan pwodwi clive a (AFC) nan eksitasyon 400 nm ak emisyon 505 nm. AFC clivage te quantifye pa yon koub kalibrasyon lè l sèvi avèk AFC li te ye. konsantrasyon.
RT-PCR Izolasyon total asid ribonukleik (RNA) te fèt lè l sèvi avèk Trizol reyaktif (Life Technologies, Darmstadt, Almay). Selil yo te lave epi apre sa liz ak reyaktif Trizol epi transfere nan yon tib reyaksyon. Apre adisyon klowofòm ak santrifujasyon (12, 000 × g), yo te kolekte faz anwo a epi melanje ak izopropanol glas frèt. Apre santrifugasyon (12,000×g) yo te retire supernatant la epi granules la lave de fwa ak etanòl 75 pousan epi finalman rezoud nan dlo. Transkripsyon ranvèse te fèt lè l sèvi avèk yon twous komèsyal ki soti nan Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dapre enstriksyon yo. Yo te fè PCR an tan reyèl lè l sèvi avèk yon reyaktif SYBR Green (Invitrogen). Premye yo te sentèz pa Microsynth AG, Balgach, Swis. Sekans Primer yo montre nan Tablo 1. Yo te kalkile chanjman pliye nan ekspresyon jèn pa metòd 2∆∆Ct lè l sèvi avèk ekspresyon EEF2 ak RPS17 kòm referans. Ekspresyon de jèn sa yo te vin mwens chanje (si yo fè tout) nan done sekans RNA lè w konpare OTA trete ak selil HK2 ki pa trete (rezilta ki pa pibliye).
Western Blots Apre separasyon nan pwoteyin yo pa elektwoforèz jèl sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE), pwoteyin yo te transfere sou yon manbràn nitrocellulose. Apre sa, sit obligatwa gratis nan manbràn an te bloke pa yon solisyon 5 pousan nan lèt sèk ki pa gen anpil grès nan TRIS-tanpon saline (3 mM TRIS baz, 140 mM NaCl, 0.17 mM Tris. -HCl, pH 7.4) ki gen 0.1 pousan Tween20. Premye antikò yo te dilye nan TRIS saline plis 5 pousan albumin serom bovin (TRIS-BSA, pou dilusyon gade Tablo 2) yo te ajoute ak manbràn enkubasyon lannwit lan. Apre lave, yo te ajoute antikò segondè fliyoresans nan TRIS-BSA pou 90 min. Fliyoresans nan dezyèm antikò yo te anrejistre lè l sèvi avèk yon sistèm deteksyon LICOR.
CISTANCHE AP AMELIORE DOULÈ REN/REN