Endiksyon nan iminite periferik ki fòme nan pankreyas la ankouraje aktivite anti-timè pou kontwole pwogresyon kansè nan pankreyas Pati 1

Malgre siksè remakab nan imunoterapi nan plizyè kalite kansè, adenokarcinom ductal pankreyas poko benefisye. Selil iminitè natirèl yo enpòtan anpil pou siveyans iminitè anti-timè ak etid resan yo te revele ke popilasyon sa yo posede yon fòm memwa, yo rele iminite natirèl ki antrene, ki rive atravè repwogram transcriptomik, epigenetik ak metabolik.

Isit la nou demontre ke patikil ki sòti nan ledven -glucan, yon pwodiktè nan iminite antrene, trafik nan pankreyas la, ki lakòz yon foul CCR2-depandan nan monosit / makrofaj nan pankreyas la ki montre karakteristik iminite ki antrene. Selil sa yo ka aktive lè yo ekspoze a selil timè yo ak faktè ki sòti nan timè yo, epi yo montre sitotoksisite amelyore kont selil timè pankreyas yo. Nan modèl ortotopik nan adenokarcinom ductal pankreyas, sourit trete-glucan montre siyifikativman redwi fado timè ak siviv pwolonje, ki se plis amelyore lè yo konbine avèk imunoterapi. Konklizyon sa yo karakterize mekanis dinamik ak lokalizasyon iminite periferik antrene epi idantifye yon aplikasyon iminite antrene nan kansè.

Iminite a gen anpil fonksyon, tankou netwaye selil fin vye granmoun ak domaje: Sistèm iminitè a kapab tou netwaye selil fin vye granmoun ak domaje, ki gen ladan selil timè, pou pwoteje kò a kont maladi. Li kapab tou kenbe balans kò a: sistèm iminitè a kapab tou balanse anviwònman an entèn nan kò a, kenbe balans ki genyen ant selil iminitè, epi evite aparisyon nan maladi tankou reyaksyon twòp oswa defisi iminitè, kidonk iminite trè enpòtan nan kò imen an.

An menm tan an, nou te jwenn ke Cistanche deserticola kapab tou amelyore iminite. Cistanche se moun rich nan yon varyete de engredyan biyolojik aktif, tankou polisakarid, flavonoid, sterol, elatriye. Engredyan sa yo ka ankouraje aktivite selil iminitè nan kò a, amelyore iminite selilè ak iminite umoral, ak anpeche kwasans ak repwodiksyon viris ak bakteri. Amelyore rezistans kò a ak iminite. Anplis de sa, Cistanche tou gen efè antioksidan, anti-enflamatwa, ak sedatif, ki ka ede soulaje fatig fizik ak elimine estrès amelyore iminite.

Klike pou w konnen sipleman cistanche deserticola

Dyagnostik adenokarcinom ductal pankreyas (PDAC) se yon bagay ki devaste, ak sèlman 10 pousan nan pasyan yo siviv 5 ane ki sot pase yo1. Malgre ke pousantaj siviv depi 2014 te ogmante de 6 a 10 pousan, kansè nan pankreyas rete refractory a majorite nan terapi ki disponib kounye a.

Anplis de sa, kòm demografik Etazini yo ap chanje, yo prevwa kansè nan pankreyas yo pral vin dezyèm kòz prensipal mòtalite ki gen rapò ak kansè nan 2030 e konsa prezante yon gwo defi nan lavni pou klinisyen yo2. Kansè pankreyas se patikilyèman letal paske nan premye etap yo raman gen sentòm klinik, ki lakòz 75-80 pousan nan pasyan yo te dyagnostike ak maladi avanse, ki pa-resekabl3,4. Menm nan pasyan ki elijib pou reseksyon, 5-pousantaj siviv ane a se sèlman 20–25 pousan 4. Anplis de sa, kansè nan pankreyas te montre yon ti reyaksyon nan imunoterapi ki te montre efè remakab nan lòt timè solid5–9. Faz I ak II esè klinik yo ki itilize CTLA-4 ak PD{-1 inibitè tou de pou kont yo ak nan konbinezon yo te jije inefikas pou tretman PDAC, ki gen anpil chans eksplike pa nati a ki pa iminojenik nan PDAC10– 12.

Yon gwo defi nan aplikasyon siksè nan imunoterapi nan PDAC se simonte microenvironment timè pankreyas imunosuppressive (TME). PDAC karakterize pa yon stroma desmoplastic pro-tumorigenic dans, yon abondans sou-ansanm selil imunosuppressive nan stroma sa a tankou makrofaj ki asosye ak timè (TAM), selil T regilasyon (T-regs), ak selil suppressor ki sòti myeloid (MDSCs). , yon mank de selil iminitè anti-timè aktive, ak hypervascularity ki prete nan yon mikwo-anviwònman ipoksik13-16. Ansanm kondisyon sa yo fè li eksepsyonèlman difisil pou efektivman delivre imunoterapi nan pankreyas la ak pou terapi sa yo aktive avèk siksè repons iminitè anti-timè si yo rive la. Se poutèt sa, nouvo terapetik yo bezwen dezespereman ki ka pa sèlman espesyalman vize pankreyas la, men yo ka tou enfiltre stroma desmoplastic dans la, epi yo kapab ankouraje gaya repons iminitè anti-timè malgre TME imunosuppressive la.

Iminite natirèl ki antrene se yon pwogram memwa imunolojik evolisyonèman ki fèk vini anba yon ankèt syantifik apwofondi. Yo te montre selil iminitè natirèl ki fòme yo sibi repwogram transcriptomik, epigenetik ak metabolik lè yo ekspoze a estimilis inisyal espesifik, epi lè selil iminitè natirèl sa yo reekpoze a yon estimilis segondè eterològ, yo "fòme" pou yo ka pi reponn a estimilis sa a. manifeste nan yon repons enflamatwa amelyore17-19. Anpil byolojik ka pwovoke iminite fòmasyon ki gen ladan vaksen Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ak konpoze natirèl la -glucan. Menmsi pifò etid konsènan iminite ki antrene konsantre sou patojèn tankou bakteri ak viris kòm yon estimilis segondè, nouvo etid sijere ke selil timè yo ka reaktive selil iminitè ki antrene yo tou. Tout rechèch ki fèt jiska prezan itilize modèl kansè anba lar, kidonk li pa konnen si prezans selil iminitè natirèl ki fòme yo ka envoke efè anti-timè sou timè ki nan ògàn solid, tankou kansè nan pankreyas20,21.

Nan etid sa a, nou te dekouvri san atann ke intraperitoneally (IP) enjekte ledven ki sòti patikil -glucan trafik nan gwo pwopòsyon nan pankreyas la. Trafik dirèk nan -glucan nan pankreyas la mete aksan sou yon chemen ki te deja pa karakterize pou endiksyon iminite periferik antrene. Anplis de sa, nou teste ipotèz ke trafik sa a ta ka lakòz endiksyon iminite anti-timè kont kansè nan pankreyas. Etandone echèk majorite terapi ak imunoterapi poukont yo ak nan konbinezon pou trete PDAC ak difikilte pou vize terapi sa yo nan pankreyas la, rezilta nou yo ansanm bay yon dekouvèt potansyèl nan non sèlman vize pankreyas la dirèkteman, men tou nan rekritman anti-timè. selil iminitè natirèl nan PDAC TME imunolojik frèt.

Rezilta yo

Patikil ki sòti nan ledven -glukan preferans trafik nan pankreyas la.

Li te byen dokimante ke administrasyon -glucans ki soti nan bakteri ak fongis ogmante kantite ak frekans nan progenitors ematopoyetik ak miltipotans ki gen patipri nan direksyon liyaj myeloid la, ki finalman fonksyone kòm yon etap enpòtan nan endiksyon iminite santral ak periferik ki antrene22. . Sepandan, li poko te montre ki kote egzakteman -glucan trafik apre administrasyon an gen efè sa yo.

Nan etid sa yo, tout patikil -Glucan (WGP) ki sòti nan Saccharomyces cerevisiae yo te itilize, ki se 2-4 mikron selil kre ledven ki fèt ak trè konsantre (1,3) -glucans. Karakterizasyon detaye WGP-glucan dekri nan youn nan lòt etid nou yo. Kontrèman ak lòt fòm -glucan yo itilize nan iminite ki antrene, fòmilasyon sa a inik paske li se patikil epi li mande fagositoz aktif pou egzèse efè li yo. Pou evalye trafik patikil -glukan sa a, yo te make WGP ak (5-(4,6- Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein) (DTAF) epi yo te enjekte IP nan sourit C57BL/6 sovaj (WT). Twa jou apre administrasyon IP (3-jou WGP), yo te rekòlte poumon, larat, gangliyon lenfatik inguinal ak mesenterik yo, selil kavite peritoneal yo, ak pankreyas yo, yo te lave yo ak PBS ki frèt anpil pou retire DTAFWGP nan peritoneum la. yo te respekte sifas ògàn lan, epi prezans DTAF-WGP nan chak ògàn te evalye pa flow cytometry. Pandan ke te gen kèk trafik nan DTAF-WGP a nan larat, nœuds lenfatik mesenteric, ak rezidyèl DTAF-WGP nan kavite peritoneal la, pankreyas la te montre yon prezans frape ak inatandi nan DTAF-WGP a (Fig. 1a).

Pou plis evalye trafik sa a ak asire ke etikèt la DTAF pa te enplike nan mekanis trafik la, WGP te radiolabeled ak 89Zr ak enjekte IP (Fig. 1b) oswa enkubasyon ak macrophages peritoneal ki te Lè sa a, sou fòm piki IP (Fig. 1c). Sourit yo te premye imajine lè l sèvi avèk yon eskanè PET / CT 48 èdtan apre piki ak ti sèk vèt yo te itilize pou endike akimilasyon preferansyèl obsève nan 89Zr-WGP nan pankreyas la. Lè sa a, yo te fè yon nekroskopi epi yo te mezire siyati radyo-aktif chak ògàn. Dapre done sikometri koule yo, 89Zr-WGP te trafike an gwo kantite nan pankreyas la epi yo te jwenn nan nivo ki pi ba nan larat, fwa, ak sistèm entesten. Makwofaj peritoneal ki te kiltive ak 89Zr-WGP ak Lè sa a, enjekte IP te gen menm jan ak yon ti kras plis divèsifye trafik pase 89Zr-WGP a pi, epi tou akimile pi enpòtan nan pankreyas la (Fig. 1d). Trafik makwofaj peritoneal ki chaje ak WGP nan pankreyas la endike ke tou de WGP toutouni ak makrofaj ki gen fagocytosed WGP montre tropism nan pankreyas la.

Pou evalye wòl ke reseptè WGP li te ye a te jwe nan trafik WGP, sourit ki manke reseptè lectin C-type, Dectin-1, (Dectin-1-/- sourit) yo te enjekte IP ak DTAF-WGP. Kòm konpare ak sourit WT, sourit Dectin -1-/- te montre yon diminisyon senk fwa nan kantite WGP ki te trafike nan pankreyas la, jan yo evalye pa sikometri koule (Fig. 1d). 89ZrWGP te tou enjekte IP nan sourit WT ak Dectin-1-/- sourit. Kòm konpare ak bèt WT, te gen siyifikativman mwens trafik nan 89Zr-WGP nan pankreyas la nan sourit Dectin -1-/- (Fig. 1e). Pou asire ke pwosesis sa a te -glucan espesifik, yo te enjekte IP yon patikil fliyoresan 3 μm an latèks ki baze sou polystyrène, menm gwosè ak yon patikil WGP, epi yo pa jwenn akimile nan pankreyas la (figi siplemantè 1a). Ansanm, done sa yo mete aksan sou yon tropism depandan dektin-1 ki pa te deja pa karakterize kote -glucan trafike nan pankreyas la.

Fig. 1 Patikil-glukan trafik nan pankreyas nan yon fason ki depann de dektin-1-. yo te enjekte yon DTAF-WGP IP epi 3 jou apre diferan tisi (n=3) yo te rekòlte ak evalye pou prezans DTAF-WGP la pa sikometri koule. Yo montre reprezantatif pwen ak done rezime yo. *p=0.032, **p=0.0057, ****p < 0.0001. b WGP te make ak 89Zr-WGP oswa c macrophages peritoneal yo te enkube ak 89Zr-WGP epi lave, ki te swiv pa piki IP. Imaj PET/CT montre trafik 89Zr-WGP apre 48 èdtan. Ògàn yo te evalye endividyèlman pou radyoaktivite apre yon nekroskopi lè l sèvi avèk yon kontwa gama. Nan c, yo rapòte siyifikasyon an konparezon ak pankreyas la (n=3). ****p <0.0001. d Dectin-1-/- sourit oswa sourit WT yo te sou fòm piki ak DTAF-WGP ak akimilasyon DTAF-WGP nan pankreyas la te evalye pa flow cytometry (WT PBS n=3, WT WGP n {{ 27}}, KO plis PBS n=3, KO plis WGP n=4). e Dectin-1-/- sourit oswa sourit WT (n=4) yo te sou fòm piki ak 89Zr-WGP epi 48 èdtan apre yo te itilize yon PET/CT pou evalye kantite lajan an nan pankreyas la. Siyal la te quantifye pa rapòte pousantaj nan dòz enjekte (pousan ID) nan pankreyas la. *p=0.046. Yo te itilize yon ANOVA yon sèl-fason ak konparezon miltip Tukey yo nan a–d, epi yo te itilize yon tès t elèv ki pa pè, de ke nan e. Done yo te reprezante kòm mwayen ± SEM. ns pa enpòtan; Chak echantiyon reprezante yon bèt byolojik endepandan yo jwenn sou yon sèl eksperyans endepandan ki te repete omwen de fwa pou verifikasyon rezilta yo.

-Glukan ki trafik nan pankreyas la incite yon foul de selil iminitè natirèl ki montre yon fenotip iminite ki resevwa fòmasyon.

Apre yo fin dekouvri ke -glucan montre tropism nan direksyon pankreyas la, li te tou obsève ke peyizaj iminitè a nan pankreyas la te siyifikativman chanje apre tretman WGP. Te rive nan WGP nan pankreyas la akonpaye pa yon foul diferan nan CD11b plis selil myeloid nan pankreyas la nan jou 3, kèk nan yo ki te fagocytosed WGP (Fig. 2a).

Konklizyon sa a te mennen nou egzamine kijan popilasyon iminitè an jeneral nan pankreyas yo afekte apre tretman IP WGP. Kòm yo te deja obsève ke chanjman iminitè ki asosye ak iminite antrene nan BM la pi pwononse 1-semèn apre ekspoze a -glucan22, yo te egzamine pwofil iminitè pankreyas la nan sourit ki te trete ak yon mikwopartikil polistirèn 3 μm oswa WGP 7 jou apre administrasyon an. Premyèman, li te obsève ke te gen apeprè yon ogmantasyon sèt fwa nan kantite total absoli CD45 plis selil iminitè nan pankreyas la apre tretman WGP (Fig. 2b). Kontwòl mikropartikul 3 μm polystyrène pa t 'gen efè sa yo (figi siplemantè 1b), ki endike ke foul selil iminitè sa a se WGP espesifik. Anplis de sa, te gen yon ogmantasyon obsève nan pousantaj CD45 plis selil iminitè (figi siplemantè 1c).

Pou plis klasifye ki kalite selil yo te responsab pou ekspansyon sa a nan CD45 plis popilasyon iminitè a, kantite absoli (figi 2b) ak pousantaj relatif (figi siplemantè 1c) selil myeloid (CD11b plis), selil T (CD3 plis). , B-selil (CD19 plis), ak selil NK (NK1.1 plis) yo te evalye. Chanjman kimilatif nan pankreyas yo reprezante pa tablo tat ki demontre ke ekspansyon lòj myeloid la responsab pou diminisyon relatif nan pousantaj lòt popilasyon selil yo ak ogmantasyon jeneral nan popilasyon CD45 plus apre tretman WGP (Fig. 2c) . Apre sa, nou te envestige si aflu CD11b plis selil iminitè sa a te pasajè, kidonk pousantaj selil CD45 plis an jeneral ak selil CD11b plis nan pankreyas la apre piki IP yo te mezire nan 7,10, 18, ak 30 jou.

Fig. {{0}}glukan stimul yon foul selil myeloid ki antrene nan pankreyas la. a Pousantaj CD45 plis CD11b plis DTAF plis selil nan pankreyas la 3 jou apre sourit WT te resevwa IP DTAF-WGP. b Sèt jou apre piki PBS oswa WGP, nimewo absoli CD45 plis (n=15), CD11b plis (n=18), CD3 plis (n {{1{{30}} }}}), CD19 plis (n=10), ak NK1.1 plis (n=14) selil yo montre. ****p < 0.0001. c Tablo ki reprezante chanjman frekans nan gwo popilasyon selil iminitè apre tretman WGP. d Sourit WT yo te enjekte ak PBS (n=5) oswa WGP (n=5) epi yo te mezire pousantaj CD45 plus ak CD45 plis CD11b plis 7, 10, 18, ak 30 jou apre ( n=3). **p=0.0034, ****p <0.0001 (CD45), **p=0.0023 (CD11b). e Nimewo absoli F4/80 plis (n=10), Ly6C plis (n=10), ak Ly6G plis (n=8) nan popilasyon CD11b plis la. **p=0.003, ****p <0.0001. f Sèt jou apre IP PBS oswa WGP pankreyas la te restimule ak LPS. Yo te mezire pwodiksyon TNF nan selil CD11b plis (n=28), CD11b plis F4/80 plis (n=9), ak CD11b plis Ly6C plis (n=8). *p=0.024, ***p=0.0001, ****p <0.0001. g Sèt jou apre PBS oswa WGP, popilasyon CD45 plis CD11b plis la te anrichi (n=4). Selil yo te restimulated avèk oswa san LPS pou 24 èdtan. Pwodiksyon TNF ak IL-6 te mezire lè l sèvi avèk ELISA. ****p <0.0001. h Pankreyas CD11b plis selil ki soti nan PBS ak sourit ki antrene WGP yo te klase. Yo te fè RT-qPCR pou quantifier TNF (n=4), IL-6 (n=4), iNOS (PBS n=4, WGP n=3) , ak IL-10 (PBS n=4, WGP n=5) nivo ekspresyon mRNA yo. *p=0.028, **p=0.0018, ****p <0.0001. I CD11b plis selil ki soti nan sourit PBS oswa WGP-enjekte (24 h) yo te klase (n=4). Istòn yo te izole epi yo te sibi analiz Western blot (anwo) oswa ELISA (anba) pou H3K4me3, H3K27Ac, ​​H3K27me3, ak H3 total. ****p <0.0001. j Sèt jou apre IP WGP oswa PBS, pankreyas CD45 plis CD1b plis popilasyon yo te klase. Yo te fè analiz RNA-Seq (PBS n=3, WGP n=3).

Distribisyon valè p (-log10(p-valè)) ak chanjman pli (log2 FC) nan jèn ki eksprime diferan yo reprezante. k t-SNE nan popilasyon CD11b plis nan sourit ki te antrene ak PBS oswa WGP 7 jou anvan epi analize ak CyTOF (PBS n=3, WGP n=3). Yo te itilize tès t pou elèv ki pa pè, de ke yo nan b, e, f, ak h. Yo te itilize yon ANOVA yon sèl-fason ak konparezon miltip nan d, g, ak i. Done yo reprezante kòm mwayen ± SEM. ns pa enpòtan. Chak echantiyon reprezante yon bèt byolojik endepandan yo jwenn sou yon sèl eksperyans endepandan.

Pandan ke pousan nan CD11b plis selil yo te pik nan jou 7, pousan nan CD45 plis selil yo te parèt nan pik nan jou 10 ki ka endike ke apre foul la nan CD11b plis selil nan pankreyas la, yon foul de lòt kalite selil iminitè ka swiv. Pousantaj nan selil iminitè nan pankreyas la diminye nan nivo fondamantal pa jou 30, ki demontre ke foul sa a se pasajè (Fig. 2d). Nan lòj myeloid la, nou te obsève nimewo absoli (figi 2e) ak pousan (figi siplemantè 1c) makrofaj (F4/80 plis), monosit (Ly6C plis), ak netrofil (Ly6G plis) yo te ogmante. Foul selil iminitè yo nan pankreyas yo te montre tou yo depann sou dòz WGP yo te enjekte, kote pi gwo dòz WGP yo te asosye ak ogmantasyon an jeneral CD45 plis CD11b plis selil myeloid ak CD45 plis CD11b plis F4/80 plis macrophages. (figi siplemantè 1d).

Kòm pankreatit ak destriksyon nan ilo pankreyas yo asosye ak enfiltrasyon selil iminitè nan pankreyas la, H plis E nan pankreyas la te fèt pou evalye entegrite acini 7 jou apre administrasyon WGP (Siplemantè Fig. 1e). Amylase serom, yon makè dyagnostik nan pankreatit, te mezire tou nan sourit WGP vs PBS-trete 7 jou apre piki (Siplemantè Fig. 1f). Ni ilo yo ni amilaz serik la pa te afekte negatif pa tretman WGP ak foul iminitè a obsève, ki endike ke foul selil iminitè a nan mekanis sa a pa lakòz destriksyon pankreyas.

Pou mennen ankèt sou si wi ou non selil yo te jwenn enfiltre pankreyas sourit la apre tretman WGP te montre yon fenotip iminite ki antrene, nou te itilize yon pwotokòl fòmasyon estanda kote sourit yo te trete ak WGP oswa PBS epi 7 jou apre yo te rekòlte pankreyas la epi answit restimulated ak LPS. Pwodiksyon TNF yo te itilize kòm yon makè ranplasan pou evalye repons fòmasyon an. An jeneral, CD11b plis selil myeloid, CD11b plis F4/80 plis makrofaj, ak CD11b plis Ly6C plis monosit yo te montre yo pwodwi plis TNF- akòz ekspoze anvan WGP, jan yo evalye pa pousantaj la nan TNF-plis selil ak MFI a (Fig. .2f). Pou plis evalye rezilta sa yo, selil CD11b plis yo te klase nan pankreyas sourit sa yo epi yo te restimulate ex vivo ak LPS, epi ELISA te mezire nivo TNF- ak IL-6 nan supernatant yo. Kòm konpare ak CD11b plis selil ki soti nan sourit PBS, selil ki soti nan sourit WGPtrained ki te restimulated ak LPS pwodui siyifikativman plis TNF- ak IL-6 (Fig. 2g), ki vle di ke WGP-trete selil CD11b plis pankreyas yo te fòme.

Rezilta sa yo te konfime plis lè l sèvi avèk RT-PCR, kote selil pankreyas CD11b plis klase nan sourit PBS oswa WGP ki antrene yo te montre yo pwodui plis TNF-, IL-6, iNOS, ak mwens IL{-10 akòz Tretman WGP (figi 2h). Depi iminite antrene ki asosye ak repwogram metabolik ak epigenetik23, nou mezire nivo laktat pou egzamine si glikoliz enplike. Vreman vre, selil WGPtrained CD11b plis sekrete plis laktat konpare ak selil ki pa antrene (figi siplemantè 1g). Nou menm tou nou mezire modifikasyon histon nan selil CD11b plis ki antrene WGP. Jan yo montre nan Fig. 2I, nivo ekspresyon H3K4me3 ak H3K27Ac yo te siyifikativman amelyore nan selil CD11b plis ki antrene WGP. Sa a te revele pa tou de analiz Western blot (Fig. 2i, tèt) ak ELISA tès quantitative (Fig. 2i, anba). Ansanm konklizyon sa yo endike ke non sèlman WGP ankouraje yon fenotip ki antrene nan selil yo ki fè trafik nan pankreyas la, men yo tou sibi repwogram metabolik ak epigenetik.

Lè sa a, yo te fè sekans RNA (RNA-Seq) sou selil FACS-triye CD45 plis CD11b plis 7 jou apre administrasyon PBS oswa WGP pou jwenn yon karakterizasyon san patipri ak konplè nan popilasyon myeloid nan pankreyas la. Yon total de 1459 diferan eksprime jèn (DEGs) te dekouvri, ak 661 upregulated ak 798 jèn downregulated nan anviwònman WGPtrained (Fig. 2j). Analiz anrichisman seri jenetik (GSEA) te konfime plis règleman ki te deja envestige nan chemen ki gen rapò ak pwodiksyon TNF- ak IL -6 (figi siplemantè 2a). Pa foul la obsève nan selil iminitè, DEG yo ki gen rapò ak chemotaxis leukocyte, migrasyon leukocyte (figi siplemantè 2a), chemotaxis monosit, migrasyon macrophage, ak migrasyon lekosit myeloid (figi siplemantè 2b) yo te tout siyifikativman rich nan gwoup WGP la. Anplis de sa, chemen Reactome CLEC7A dektin -1 siyal ak C-type lectin reseptè chemen yo te siyifikativman anrichi, plis konfime patisipasyon Dectin -1 nan pwosesis sa a (figi siplemantè 2c).

Lè nou konsidere ke popilasyon myeloid la te obsève responsab pou ekspansyon popilasyon an CD45 plis e ke selil myeloid yo se yon popilasyon divès, yo te fè analiz CyTOF sou pankreata nan sourit trete ak PBS oswa WGP 7 jou anvan. Popilasyon selil ki nan pankreyas yo te idantifye ak konpare ant gwoup tretman yo; Trase t-SNE te endike ke apre tretman WGP te gen yon diminisyon relatif nan popilasyon rezidan makrofaj la ki trè eksprime makè M2 tankou CD206. Nou menm tou nou te obsève aparans nan plizyè popilasyon myeloid nan pankreyas la ki te defini kòm Ly6C plis monosit ki sòti nan makrofaj, enfiltre monosit enflamatwa, aktive macrophages, ak CD206 plis aktive macrophages (Fig. 2k ak Figi siplemantè 2d). Trase viSNE ki fèmen sou popilasyon CD11b plis la te montre yon ekspansyon diferan nan monosit ak makrofaj, ak ogmantasyon adisyonèl nan selil dendritik (DCs), netrofil, ak popilasyon NK apre tretman WGP (figi siplemantè 2e).

Anplis de sa, analiz sa yo mete aksan sou ke apre fòmasyon WGP ak eksitasyon LPS, TNF te pwodwi prensipalman pa macrophages ak monosit, IL-6 ak iNOS te pwodwi prensipalman pa macrophages, Granzyme-B te pwodwi pa selil NK ak macrophages, e IFN te pwodwi. prensipalman ki pwodui pa netrofil (figi siplemantè 2f). Sa a revele ke pandan ke anpil popilasyon selil yo chanje akòz tretman WGP, selil prensipal yo antrene pa WGP, jan yo evalye ekspresyon TNF ogmante, se makrofaj ak monosit e ke pa gen yon sèl kalite selil ki responsab pou fenotip iminite ki fòme a ki te obsève.

Pou evalye si fenomèn sa a nan foul selil myeloid ak aktivasyon te depann sou lòt popilasyon iminitè oswa kondwi antyèman pa selil myeloid yo tèt yo, nou apovri popilasyon iminitè espesifik ak obsève fenotip la ki resevwa fòmasyon. AntiCD4 ak anti-CD8 mAbs yo te itilize poukont yo ak nan konbinezon pou diminye selil T yo, yo te evalye efikasite nan rediksyon (figi siplemantè 3a), epi yo obsève fenotip ki antrene nan selil myeloid (figi siplemantè 3b, c). Selil NK yo te tou apovri lè l sèvi avèk mAb PK136, yo te evalye efikasite rediksyon an (figi siplemantè 3d) epi yo te obsève fenotip ki resevwa fòmasyon (figi siplemantè 3e, f). Nan absans selil T ak selil NK, selil myeloid yo te toujou obsève yo dwe fòme pa WGP. Yo te evalye fenotip ki resevwa fòmasyon an tou nan sourit NSG ki manke selil B, selil T, ak selil NK (figi siplemantè 3g, h). Sourit sa yo toujou montre yon fenotip klè nan iminite ki antrene.

Finalman, nou apovri netrofil lè l sèvi avèk Ly6G mAb. Malgre rediksyon granulosit, nou toujou obsève fòmasyon WGP-induit nan CD11b plis lòj myeloid la (figi siplemantè 3i-k). Ansanm, done nou yo sipòte ke selil myeloid ki enfiltre nan pankreyas yo fòme pa -glucan san asistans oswa enfliyans nan popilasyon iminitè adaptasyon, selil NK, oswa granulosit.

Sekans RNA sèl-selil revele popilasyon espesifik nan macrophage/monosit proenflamatwa ki trafik nan pankreyas la sou tretman -glucan.

Kòm analiz CyTOF nou yo te revele aparans nan plizyè popilasyon ki te deja pa karakterize nan pankreyas la apre tretman WGP, pou jwenn yon konpreyansyon plis pwofondè sou popilasyon selil ki prezan nan pankreyas la, yo te fè yon sekans RNA yon sèl selil (scRNA-Seq). sou selil CD45 plis klase ki soti nan sourit trete ak PBS ak sourit trete ak WGP twa (3-jou WGP) ak sèt jou anvan (7-jou WGP). De-dimansyon reprezantasyon UMAP nan 11,132 selil agrégées de twa echantiyon yo genyen ak grap ki soti nan k-pi pre vwazen ak algoritm Louvain divize an 19 grap diferan (Fig. 3a, b). Yo te evalye frekans relatif chak gwoup nan chak gwoup eksperimantal.

Isit la, ogmantasyon siyifikatif nan frekans nan grap 3,4, ak 10 yo te obsève pa jou 7 apre tretman WGP, ansanm ak yon tou pre disparisyon nan grap 5 (Fig. 3c). Yo te montre tou frekans relatif plizyè lòt popilasyon diminye sou tan. Sepandan, tandans aparan sa a gen anpil chans akòz ogmantasyon relatif nan frekans lòt popilasyon yo. An jeneral, grap 3,4,10, ak 5 parèt pi siyifikativman chanje akòz tretman WGP (Fig. 3d).

Popilasyon yo te note anvan yo te pi siyifikativman chanje sou tan akòz tretman WGP yo te fè pati lòj la myeloid, jan yo idantifye pa ekspresyon CSF1R (Fig. 3d, e). Kòm done sa yo ansanm ak rezilta anvan yo sijere ke popilasyon myeloid kondwi chanjman iminitè ki asosye ak tretman WGP, dinamik CSF1R plis grap 3,4,10, ak 5 yo te envestige an plis detay jan yo montre nan trase violon (Fig. 3f) ak pwen. trase ki reprezante premye 12 jèn makè yo pa mwayèn Z-nòt pou chak gwoup (Fig. 3g). Cluster 5, ki te prezan nan sourit PBS men nòmalman te disparèt apre tretman WGP te idantifye kòm rezidan macrophages24,25. Gwoup sa a tou miyò eksprime MAF ak APO ki tou de ki gen rapò ak polarizasyon makwofaj M226-28. Cluster 19 te lajman chanje sou tan, kidonk li pa te dekri an plis detay, men ekspoze yon pwofil ekspresyon ki sanble ak gwoup 5, e konsa tou reprezante yon sous-ensemble nan tisi-rezidan makrofaj. Cluster 10, popilasyon Ly6Clo makwofaj la, te gen tou yon pwofil ekspresyon ki sanble ak gwoup macrophage rezidan 5, ak siyati ekspresyon remakab nan ARG1 ak FABP. Nou ipotèz popilasyon sa a dwe repolarize makwofaj rezidan yo bay mank de ekspresyon Ly6C, resanblans ak popilasyon an rezidan makrofaj, ak disparisyon nan popilasyon rezidan an apre tretman WGP. Gwoup 3 ak 4 pataje karakterizasyon fenotip jeneral kòm Ly6CHi enfiltre monosit / makrofaj. Cluster 4 te gen yon ekspresyon remakab nan Chil3 ak Plac8, ki ansanm te idantifye pa yon lòt gwoup yo idantifye Ly6Chi enfiltre macrophages29.

Finalman, gwoup 3, ki te absan nan sourit nayif epi ki te montre pi gwo ogmantasyon nan frekans relatif nan mitan tout grap apre tretman WGP te eksprime siyati sibstansyèl nan TNFAIP2, IL1B, SOD2, ak PRDX5, ki endike yon fenotip fòtman pro-enflamatwa. Se konsa, gwoup 3 te idantifye kòm Ly6CHi enflamatwa enfiltre monosit / makrofaj. Enteresan, nan subset myeloid la, popilasyon yo montre yo ogmante akòz tretman WGP yo se sèlman popilasyon ki eksprime TNFAIP2, ki endike ke selil yo k ap antre nan pankreyas yo gen anpil chans selil myeloid ki resevwa fòmasyon.

Pou plis karakterize estati aktivasyon chak nan kat gwoup dinamik myeloid yo, yo te konstwi trase pwen pou montre ekspresyon relatif jèn ki asosye ak yon estati pro-enflamatwa ak yon estati anti-enflamatwa (Fig. 3h). Gwoup 3 ak 4, monosit/macrophages enfiltre yo, yo te montre yo dwe pro-enflamatwa, macrophages rezidan yo te anti-enflamatwa, ak makrofaj yo nan gwoup 10 te montre yon fenotip entèmedyè. An akò ak CyTOF anvan ak done sitometri koule, done scRNA-Seq sa yo plis karakterize selil myeloid sa yo ki fèk idantifye nan pankreyas la yo dwe yon popilasyon eterojèn nan makrofaj rezidan Ly6CLo transfòme ak repolarize ak pro-enflamatwa Ly6CHi enfiltre makrofaj ki sòti nan monosit ki eksprime siyati. nan iminite ki antrene.

Foul WGP-kondwi ak fòmasyon nan selil myeloid nan pankreyas la depann de CCR2-epi yo rive osi bonè ke 24 èdtan apre tretman WGP.

Apre sa, nou te egzamine ki mekanis ki responsab pou aflu selil sa a nan pankreyas la. Done RNA-Seq yo te itilize pou karakterize chemokin ak sitokin ki gen ekspresyon ki te siyifikativman regilasyon sou tretman WGP (Fig. 4a). Pandan ke plizyè chemokin ak sitokin yo te regilasyon, obsèvasyon nou an nan foul makrofaj ak monosit nan pankreyas la pike yon enterè espesifik nan CCR2 akòz patisipasyon li nan rekritman monosit ak macrophage ak monosit soti nan mwèl zo a 30-32. Done CyTOF yo te montre tou yon ogmantasyon enpòtan nan CCR2-selil pozitif apre tretman WGP (figi 4b) ak scRNA-Seq te montre yon ekspresyon diferan nan CCR2 nan gwoup 3 ak 4, ki te de popilasyon ki te montre ki pi diferan. fenotip iminite ki antrene (figi 4c). Anplis de sa, 24 èdtan apre tretman WGP, lisat pankreyas antye te montre yon ogmantasyon 30- pliye nan CCL2, ki se ligand pou CCR2 epi ki enplike nan medyasyon chemotaxis monosit (figi 4d).

Done RNA-Seq yo te montre yon siyati klè nan rekritman selil iminitè ak trafik, ak done sa yo tou endike ke WGP upregulated pwopagasyon lekosit ak selil mononikleyè (figi 4e). Pou envestige si CCR2 plis selil myeloid yo te pwopagasyon yon fwa yo rive nan pankreyas la, yo te evalye pousantaj CCR2 plis selil ki eksprime Ki67 nan sourit PBS ak WGPtreated. Apre tretman WGP te gen yon ogmantasyon nan selil proliferasyon an jeneral (Fig. 4f) ak yon gwo pousan nan selil proliferasyon sa yo te CD11b plis CCR2 plis (Fig. 4g). Lè sa a, nou te envestige kontribisyon CCR2 plis selil nan fenotip ki resevwa fòmasyon an. 7 jou apre tretman an vivo ak PBS oswa WGP, CCR2 plis, ak CCR2– popilasyon yo te mezire pou yon repons ki resevwa fòmasyon (Fig. 4h). Done sa yo te endike ke majorite selil ki fòme apre tretman WGP yo te CCR2 plus.

Pou plis egzamine wòl CCR2 nan monosit / makrofaj ki fòme -glucan, sourit CCR2-/- yo te resevwa fòmasyon ak WGP -glucan. Sourit CCR2-/- pa t 'sibi yon foul CD45 plis (Fig. 4i) oswa CD45 plis CD11b plis selil myeloid (Fig. 4j) nan pankreyas la, epi yo pa t' montre yon repons ki antrene jan pwodiksyon TNF- revele (Fig. 4k). Done sa yo endike ke CCR2 jwe yon wòl enpòtan nan migrasyon selil iminitè natirèl yo nan pankreyas la ak endiksyon iminite periferik antrene nan pankreyas la.

Kòm te note deja, CCR2 enpòtan pou rekritman bonè monosit, men mwens pou rekritman an reta33. Jiskaprezan, nou te tou obsève ke nan 7 jou apre fòmasyon WGP, CCR2 te kritik nan rekritman an nan selil myeloid ki resevwa fòmasyon nan pankreyas la. Apre sa, nou te egzamine si foul sa a te fèt byen bonè nan fòmasyon WGP ak si wi ou non CCR2 plis selil myeloid yo te rekrite nan pankreyas la. Pou sa ka fèt, sourit yo te trete ak PBS oswa WGP, ak tisi pankreyas yo te analize 24 ak 48 èdtan pita. Surprenante, osi bonè ke 24 èdtan apre fòmasyon WGP, ogmante nan CD45 plis (figi siplemantè 4a), CD11b plis (figi siplemantè 4b), F4 / 80 plis (figi siplemantè 4c), Ly6C plis (figi siplemantè 4d) , ak CD11b plis CCR2 plis (Siplemantè Fig. 4e) selil yo te obsève.

Anplis de sa, li te montre ke selil myeloid sa yo te fòme osi bonè ke lè 24 èdtan apre tretman WGP (Siplemantè Fig. 4f). Obsèvasyon sa a mete aksan sou yon divergence ant rezilta sa yo ak fenotip iminite antrene yo te obsève deja ki anjeneral yo pa inisye jiskaske omwen 3 jou apre fòmasyon.

Fig. 4 CCR2 obligatwa pou trafik selil iminitè nan pankreyas la. yon Heatmap kimokin ak sitokin ki te kontwole nan 7-jou WGPtreated CD11b plis selil ki baze sou done RNA-Seq. b trase viSNE nan popilasyon an CD11b plis pankreyas nan PBS ak 7-jou WGP ki antrene sourit, ki mete aksan sou ekspresyon CCR2. Imaj ki fèt ak done CyTOF. c done scRNA-Seq ki montre yon UMAP grap myeloid ki eksprime CCR2. d Ekspresyon CCL2 nan lisat pankreyas antye 24 èdtan apre tretman WGP a mezire pa RT-PCR (n=6). ****p=0.0001. e GSEA te pwodwi trase anrichisman nan jèn ki gen rapò ak pwopagasyon lekosit nan CD11b plis selil pankreyas soti nan 7-jou WGP-fòme an konparezon ak sourit PBS. PBS te itilize kòm kontwòl ak konpare ak WGP. f Done rezime pousantaj CD45 plis selil pankreyas ki se Ki67 plis nan PBS ak 7-sourit ki antrene WGP jou (n=4). ***p=0.0007. g Selil yo te premye fèmen sou popilasyon CD45 plis Ki67 plis la. Trase yo montre pousantaj CD45 plis Ki67 plis pwopagasyon selil pankreyas ki se CD11b plis CCR2 plis nan PBS ak 7-sourit ki antrene WGP jou (n=4). *p=0.0261. h Selil pankreyas ki soti nan PBS ak sourit 7-jou WGP ki antrene (n=5) yo te restimule ak LPS epi yo te mezire pousantaj selil CCR2 pozitif ak negatif ki pwodui TNF nan chak kondisyon. Selil yo te premye fèmen sou CD45 plis CD11b plis sou-a. Yo te montre reprezantatif pwen ak done rezime yo. *p=0.022, **p=0.0073, ***p=0.0007. i–k WT ak CCR2−/− sourit yo te trete ak PBS oswa WGP epi yo te evalye pousantaj I CD45 plis selil nan pankreyas la (****p <0.0001) ak j pousantaj selil CD45 plis ki te CD11b plus. . **p=0.0013. k Pousantaj CD45 plis CD11b plis selil ki pwodui TNF. Yo montre trase reprezantatif koule ak done rezime. Chak pwen reprezante done ki sòti nan yon sourit. ***p=0.0002. (i–k: WT PBS n=9, WT WGP n=9, CCR2−/− PBS n=8, CCR2−/− WGP n=8).

Yo te itilize yon tès t pou elèv ki pa pè, de keu nan d, f, ak g, alòske yo te itilize yon ANOVA yon sèl ak konparezon miltip nan h–k. Done yo te reprezante kòm mwayen ± SEM. ns pa enpòtan. Nan f–k, chak echantiyon reprezante yon bèt byolojik endepandan yo te jwenn sou yon sèl eksperyans endepandan ki te repete omwen de fwa pou verifikasyon rezilta yo.

WGP-fòme pankreyas enfiltre selil myeloid montre repons antrene nan faktè sekrete nan kansè nan pankreyas ak fagositoz ranfòse ak ROS-medyatè sitotoksisite nan selil timè yo.

Kòm nou te montre ke lè l sèvi avèk WGP kòm yon premye estimilis rezilta nan selil iminitè natirèl ki resevwa fòmasyon pou reponn pi solid nan ekspoze segondè a LPS e ke selil sa yo akimile nan pankreyas la apre tretman an, nou te vle konnen si stimuli segondè ki gen rapò ak timè pankreyas yo. kapab tou pwovoke repons fòmasyon sa a. Pou sa ka fèt, nou premye envestige si selil kansè nan pankreyas tèt yo kapab pwovoke repons fòmasyon WGP-induit la. Pou sonde kesyon sa a, yo te kiltive makrofaj peritoneal ak PBS oswa WGP in vitro epi 7 jou apre yo te restimule ak LPS, supernatant ki soti nan selil ki kiltive nan pankreyas sourit nayif, ak supernatant ki soti nan selil KPC kiltive yo, ki se yon liy selilè. timè pankreyas sou yon background C57BL/6 ki sòti nan LSL-KrasG12D/plus; LSL-Trp53R172H/ plis ; Sourit Pdx1-Cre (KPC) oswa selil kansè pankreyas Pan02 pou 24 èdtan. Pwodiksyon TNF nan supernatant la te mezire pa ELISA.

Konpare ak supernatant ki soti nan kiltive selil pankreyas nòmal yo ki pa t aktive macrophages deja antrene, supernatant ki soti nan kiltive selil kansè nan pankreyas KPC ak Pan02 ankouraje plis TNF - - pwodiksyon-nan -glucan makrofaj ki fòme (figi siplemantè 5a). Anplis de sa, pou kontwole posibilite ke pwosesis la nan fagositoz tèt li ka lakòz selil yo vin aktive, makrofaj peritoneal yo te kiltive ak 3 μm pèl mikropartikil polistirèn epi yo te Lè sa a, restimulated ak PBS oswa LPS (Siplemantè Fig. 5b). Rezilta yo te montre ke pwodiksyon amelyore nan TNF te espesifik nan fòmasyon WGP.

Sa a te Lè sa a, teste nan yon anviwònman ansyen vivo nan ki sourit yo te trete ak PBS oswa WGP ak 7 jou apre pankreyas yo te rekòlte, selil myeloid pankreyas yo te rich, ak Lè sa a, restimulated ak supernatant yo nan kiltive KPC (Siplemantè Fig. 5c) oswa Pan02. selil (figi siplemantè 5d). Li te montre ke WGP in vivo te antrene CD11b plis myeloid selil nan pankreyas la te pwodwi siyifikativman plis TNF- an repons a timè-kondisyone medya yo. Selil timè yo sekrete yon pakèt faktè ki ka espesyalman fonksyone kòm dezyèm estimilis nan iminite ki antrene. Li konnen ke selil timè pankreyas yo eksprime nivo segondè nan modèl molekilè domaj ki asosye (DAMPs) ak faktè pro-enflamatwa, tankou faktè inhibitor migrasyon macrophage (MIF). MIF se yon sitokin ke yo konnen yo sekrete nan gwo konsantrasyon pa timè pankreyas ki ka aji dirèkteman sou selil myeloid34,35.

Vreman vre, MIF te prezan nan supernatant nan selil KPC ak Pan02 jan yo evalye pa ELISA (figi siplemantè 5e). Se konsa, nou te ipotèz ke MIF ta ka yon faktè potansyèl timè-sekre ki ka aji kòm yon dezyèm siyal nan anviwònman an nan iminite fòmasyon WGP-induit. Pou mennen ankèt sou sa a, selil pankreyas myeloid ki soti nan sourit in vivo ki antrene WGP yo te restimule ak yon konsantrasyon ki sanble nan MIF recombinant (rMIF) kòm prezan nan medya timè-kondisyone. Jan yo montre nan Figi Siplemantè 5f, selil myeloid pankreyas ki te deja antrene ak WGP te montre ogmante pwodiksyon TNF sou restimulasyon rMIF. Ansanm, done sa yo sijere konsèp ke selil timè pankreyas yo, atravè faktè idrosolubl ke yo lage, ka sèvi kòm dezyèm siyal pou aktive selil myeloid nan pankreyas ki te fòme pa WGP.

Apre sa, nou te egzamine si selil iminitè natirèl sa yo ki fòme ak WGP yo te amelyore pwopriyete anti-timè. Done sekans RNA yo endike ke mekanis ki gen rapò ak fagositoz yo te regilasyon nan anviwònman WGP (Fig. 5a), ki nou te ipotèz ta ka yon mekanis nan fonksyonalite anti-timè. 20 pi gwo chemen KEGG anrichi ak pwosesis byolojik Gene Ontology (GO) sou fòmasyon WGP yo endike nan Tablo Siplemantè 1 ak 2. CD45 plis selil iminitè pan ak CD11b plis selil myeloid ki soti nan pankreyas sourit ki antrene WGP yo te rekòlte epi teste pou potansyèl fagocytotic. Tretman WGP te mennen nan yon ogmantasyon siyifikatif nan potansyèl la fagositik nan an jeneral CD45 plis selil iminitè (Fig. 5b) ak nan CD11b plis selil myeloid (Fig. 5c).

Anplis de sa, selil myeloid ki fòme nan vivo te montre yon ogmantasyon nan fagositoz selil timè KPC (figi 5d). Lè sa a, nou te evalye si selil myeloid ki fòme pa WGP te montre sitotoksisite ogmante nan selil KPC. Done RNA-Seq yo endike ke DEG ki gen rapò ak espès oksijèn reyaktif (ROS) pwosesis byosintetik ak règleman pozitif nan pwosesis metabolik ROS yo te siyifikativman rich nan selil myeloid trete WGP (Fig. 5e).

Kòm yon rezilta, nou te fè ipotèz ke WGP regilasyon pwodiksyon ROS ta lakòz yon ogmantasyon cytotoxicity selil myeloid pankreyas nan selil timè KPC yo. Pou eksplore ipotèz sa a, selil CD11b plis ki soti nan pankreyas yo te izole nan sourit ki antrene oswa ki pa antre nan glucan epi yo te plake ak selil KPC ki eksprime luciferaz (KPCLuc plus) pou 24 èdtan. Selil myeloid ki antrene WGP yo te montre twa fwa ogmante sitotoksisite nan direksyon pou selil timè KPC yo, ak anpèchman pwodiksyon ROS lè l sèvi avèk ROS inhibitor N-Acetyl Cysteine ​​(NAC) konplètman anile ogmantasyon nan sitotoksisite WGP-elicite (Fig. 5f). Peroksidasyon lipid ROS-induit jwe yon wòl enpòtan nan apoptoz, otofaji, ak ferroptosis36. Se konsa, nou te itilize de inibitè ROS adisyonèl, Trolox ak deferoxamine (DFO), pou egzamine efè yo sou sitotoksisite.Anplis de sa nan Trolox ak DFO siyifikativman anpeche WGPtrained CD11b plis cytotoxicity medyatè selil (Fig. 5g), sijereke ROS-induit peroksidaz lipid ki enplike, omwen an pati, nan ROS-medyatè cytotoxicity sa a.

Fig. 5 Selil myeloid pankreyas ki antrene WGP yo montre fagositoz amelyore ak ROS-medyatè sitotoksisite. Trase anrichisman (GSEA) ak kat chalè jèn ki gen rapò ak règleman pozitif fagositoz nan selil CD11b plis ki soti nan 7-jou WGP-fòme an konparezon ak sourit PBS. b Pousantaj CD45 plis selil pankreyas yo ki te fagocytoze yon patikil pHrodo Green Staph Aureus nan sourit PBS (n=10) ak 7-day WGP (n=9) ansanm ak MFI pHrodo a. Patikil vèt Staph Aureus. Chak pwen reprezante done ki sòti nan yon sourit. *p {{10}}.043, ****p <0.0001. c Pousantaj CD11b plis selil pankreyas myeloid ki te fagozite yon patikil pHrodo Green Staph Aureus nan sourit PBS (n=13) ak 7-day WGP (n=13). Selil yo te premye fèmen sou popilasyon an CD45 plus. Yo montre MFI patikil pHrodo Green Staph Aureus la. **p=0.0021, ***p {= 0.0002. d Pousantaj CD11b plis selil pankreyas myeloid ki fagocytoze KPCGFP plis selil timè nan sourit PBS (n=5) ak 7-day WGP (n=5). *p=0.0103. Selil yo te premye fèmen sou popilasyon an CD45 plus. Yo montre tou MFI rezime GFP plis siyal la. *p=0.0379. e Trase anrichisman (GSEA) ak kat chalè jèn ki gen rapò ak pwosesis biosentetik espès oksijèn reyaktif yo ak règleman pozitif pwosesis metabolik espès oksijèn reyaktif nan selil CD11b plis ki soti nan 7-jou WGP-fòme an konparezon ak sourit PBS. f Rezilta rezime nan yon tès sitotoksisite kote selil CD11b plis ki soti nan PBS ak sourit 7-jou WGP ki antrene yo te klase ak enkubasyon nan yon rapò 1:20 KPCLuc plus : selil CD11b plis pou 24 èdtan. Yo te itilize NAC pou bloke ekspresyon ROS epi yo te evalye sitotoksisite timè a pa luminesans (PBS n=3, WGP n=4). g Done rezime ki soti nan tès sitotoksisite kote selil CD11b plis ki soti nan 7-jou sourit ki resevwa fòmasyon WGP yo te klase ak enkubasyon nan yon rapò 1:20 KPCLuc plus : selil CD11b plis pou 24 èdtan. Trolox oswa DFO oswa kontwòl machin respektif yo te ajoute ak sitotoksisite timè yo te detèmine pa mezire luminesans (n ​​= 3). *p=0.0255, **p {= 0.0019. Yo te itilize yon tès t pou elèv ki pa pè, de keu nan b–d, epi g epi yo te itilize yon ANOVA yon sèl ak konparezon miltip pou f. Done yo te reprezante kòm mwayen ± SEM. ns pa enpòtan. Nan b–g, chak echantiyon reprezante yon bèt byolojik endepandan yo jwenn sou yon sèl eksperyans endepandan ki te repete omwen de fwa pou verifikasyon rezilta yo.

Alafen, done sa yo idantifye ke selil timè pankreyas yo kapab reaktive WGPtrained enfiltre selil myeloid nan pankreyas la e ke selil sa yo montre fagositoz ranfòse ak ROS-medyatè sitotoksisite.

WGP-induit iminite antrene diminye kwasans timè ak pwolonje siviv nan modèl ortotopik nan kansè nan pankreyas.

Apre sa, nou te envestige si wi ou non repons iminitè natirèl ki antrene nan pankreyas la ki te antrene ak glucan-medyatè ta ka lakòz etablisman yon mikwo-anviwònman anti-timè ki ka ase pou simonte TME ki karakteristik imunosuppressive nan PDAC. An konsekans, sourit yo te bay 1 dòz swa PBS oswa WGP nan jou -7, ak nan jou 0, 1 × 105 KPC oswa KPCLuc plis selil yo te implante orthotopically nan ke pankreyas la (Fig. 6a). Nan jou 21 sourit yo te euthanized ak pwa timè a te mezire (Fig. 6b). Nan anviwònman an nan piki nan selil KPCLuc plis, sourit yo te sou fòm piki ak substra luciferase, ak timè yo te imaj (figi 6c).

Tou de etid yo te montre yon rediksyon remakab nan fado timè kòm yon rezilta nan tretman WGP, ak siviv te tou siyifikativman pwolonje nan sourit ki resevwa fòmasyon ak WGP (Fig. 6d). Immunofenotip nan timè yo te montre yon ogmantasyon ki pèsistan nan CD45 plis selil iminitè, CD11b plis selil myeloid, ak F4 / 80 plis macrophages nan anviwònman ki antrene WGP (Fig. 6e). CD11b plis selil myeloid (Fig. 6f) ak CD11b plis F4/80 plis makrofaj (Fig. 6g) nan timè a te montre tou yon ogmantasyon siyifikatif nan pwodiksyon TNF akòz WGP. Tou de yon kantite ogmante nan CD11b plis selil myeloid (Fig. 6h, agoch) ak yon ogmantasyon nan pousantaj la nan CD11b plis selil pwodwi TNF- (Fig. 6h, adwat) siyifikativman Koehle ak diminye fado timè. Ni CD4 plis ni CD8 plis T-selil te montre ogmante IFN-, plis sipòte ke rediksyon nan fado timè te kondwi pa selil yo myeloid ki antrene WGP (Fig. 6i). Menm jan efè anti-timè yo te obsève tou nan sourit orthotopically implanté ak timè Pan02 (Siplemantè Fig. 6a).

Pou plis konfime ke selil iminitè natirèl yo responsab pou repons iminitè anti-timè yo obsève, timè ortotopik KPC yo te implanté nan sourit NSG. Menm jan ak sourit WT, sourit NSG yo te montre tou yon rediksyon enpòtan nan gwosè timè akòz fòmasyon WGP, ki konfime ke efè anti-timè WGP yo te kondwi pa selil iminitè natirèl yo ak fonksyone poukont repons adaptasyon (Siplemantè Fig. 6b). Kalafati et al. te montre ke fòmasyon iminitè natirèl nan granulopoiesis ankouraje iminite anti-timè21.

Pandan ke nou pa t 'wè yon kontribisyon enpòtan nan granulosit nan fenotip nou an nan iminite ki antrene, nou egzamine si granulosit yo patisipe nan rediksyon WGP-depandan nan timè pankreyas pa diminye netrofil ak obsève kwasans timè nan PBS ak sourit WGP-trete. Efikasite rediksyon netrofil nan pankreyas la (figi siplemantè 6c) ansanm ak fado timè pankreyas yo te evalye (figi siplemantè 6d). Rezilta nou yo te montre yon rediksyon enpòtan nan gwosè timè nan gwoup WGP la nan absans netrofil yo.

Fig. 6 Endiksyon iminite antrene nan pankreyas la gen efè anti-timè. yon chema eksperimantal. b C57BL/6 sourit te resevwa yon sèl piki IP WGP oswa PBS ak sourit 7 jou yo te implanté orthotopically ak selil kansè nan pankreyas KPC. Yo montre foto reprezantan timè yo ak analiz quantitative pwa timè yo. Pwa timè yo te mezire nan jou 21 (PBS n=10, WGP n=12). ***p=0.0004. c C57BL/6 sourit (n=4) te resevwa yon sèl piki ip nan WGP oswa PBS epi 7 jou apre yo te implanté orthotopically ak KPC plis Luc selil kansè nan pankreyas. Nan jou 21 apre enplantasyon timè, sourit yo te bay IP luciferin substra bioluminesan epi yo te mete yo nan yon imager foton pou mezire gwosè timè nan vivo. *p=0.0403. d Siviv sourit nan chema eksperimantal yo montre nan a, lè l sèvi avèk selil KPC (n=5). **p=0.0018. e Fenotip timè yo ki montre pousantaj selil solid ki se CD45 plus , pousantaj popilasyon CD45 plus ki CD11b plus , ak pousantaj selil CD11b plus ki F4/80 plis (PBS n=10, WGP n=9). *p=0.0165 (CD45), ***p=0.0001 (CD11b), **p=0.0034 (F4/80). f Pwodiksyon TNF nan CD11b plis selil ki soti nan PBS ak 7-jou WGP-fòme ki te restimulate ak LPS. Yo montre pousantaj TNF plis selil yo ak MFI TNF yo (PBS n=10, WGP n=9). **p=0.007, ***p=0.0002. g Done rezime pwodiksyon TNF nan CD11b plis F4/80 plis selil ki soti nan PBS ak 7-jou WGP-fòme ki te restimule ak LPS. Yo montre pousantaj TNF plis selil yo ak MFI TNF yo (PBS n=10, WGP n=9). *p=0.0155, ***p {= 0.0001. h Pwa timè a te gen rapò ak pousantaj CD45 plis selil iminitè ki te CD11b plis (agòch) ak pousantaj CD45 plis CD11b plis TNF plis selil (adwat). (PBS n=10, WGP n=9). i Rezime done pousantaj CD4 plis ak CD8 plis T-selil ki eksprime IFN (PBS n=10, WGP n=9) Done yo te reprezante kòm mwayen ± SEM. Koefisyan korelasyon Pearson yo te itilize pou mezire fòs asosyasyon lineyè yo epi yo te itilize tès t elèv ki pa pè, de keu yo otreman. ns pa enpòtan. Chak echantiyon reprezante yon bèt byolojik endepandan yo jwenn sou yon sèl eksperyans endepandan ki te repete omwen de fwa pou verifikasyon rezilta yo.

CCR2 ki antrene plis selil myeloid yo se selil efèktè prensipal nan mekanis anti-timè a.

Bay anpèchman konplè nan trafik selil iminitè natirèl nan pankreyas la ak fòmasyon nan selil myeloid pankreyas apre tretman WGP nan sourit CCR2-/-, nou te rezone ke sourit CCR2-/- ta tou pa montre efè iminitè anti-timè benefisye fòmasyon WGP. . Nan liy ak ipotèz sa a, sourit CCR2-/- ki te resevwa WGP pa t 'montre yon fado timè redwi (Fig. 7a) konpare ak sourit WT.

Sa a te demontre ke CCR2 se nesesè pou foul WGP-kondwi selil iminitè ki fòme nan pankreyas la e ke sa yo se konsekans pou efè anti-timè yo. Menmsi yo te idantifye siyal CCL2-CCR2 kòm kritik nan rekritman makwofaj ki soti nan monosit ki resevwa fòmasyon nan pankreyas la, nou te vle konnen tou si prezans HSC ki resevwa fòmasyon nan mwèl zo a ak jenerasyon iminite ki antrene santralman. pou kont li te ase yo ralanti kwasans lan nan timè pankreyas ortotopik.

Pou plis konfime fonksyonalite dirèk anti-timè selil CCR2 plis myeloid ki enfiltre yo, popilasyon myeloid CCR2 plis ak CCR2- ki soti nan sourit ki antrene WGP yo te klase, melanje ak selil timè KPC yo, epi yo te implante orthotopically nan sourit yo. Timè ki te melanje ak selil CCR2 plis yo te pi piti pase sa yo ki te melanje ak selil CCR2-, plis sipòte ke CCR2 ki antrene plis selil myeloid tèt yo se yon selil efèktè prensipal nan mekanis anti-timè a (Fig. 7b). Analiz CyTOF nan timè sa yo te revele ke CCR2 plis timè yo te gen siyifikativman mwens CD11b plis selil myeloid ak siyifikativman ogmante CD8 plis T-selil prezan nan timè a (Fig. 7c, d). Rapò CD8 plis T-selil yo: CD11b plis selil myeloid yo te ogmante tou siyifikativman nan kondisyon CCR2 plis admix (figi 7e).

Fig. 7 Mekanis efèktè anti-timè nan tretman WGP ak modèl klinik ki enpòtan. yon sourit WT ak CCR2-/- yo te trete ak PBS oswa WGP epi 7 jou apre yo te implanté ak ortotopik selil timè pankreyas KPC. Yo rapòte pwa timè nan jou 21. (WT PBS n=5, WT WGP n=6, CCR2 PBS n=6, CCR2−/− WGP n=6). **p=0.0027 (WT PBS kont WT WGP), *p=0.0118 (WT WGP kont CCR2−/− PBS), **p=0.0034 (WT WGP vs CCR2−/− WGP). b Yo te melanje selil CCR2 plus ak CCR2− pankreyas CD11b plis ki soti nan sourit ki antrene WGP ak selil KPC epi yo te implante ortotopikman. Gwosè timè yo te evalye 21 jou apre (CCR2 plis n=5, CCR2− n=5). *p=0.0247. c trase t-SNE ki te pwodwi pa analiz CyTOF nan timè admix yo soti nan b. Gwoup ki montre diferans enpòtan ant gwoup yo endike pa sèk yo. Yo montre done total (agòch) ak reprezantatif t-SNE chak gwoup. d Rezime pousan nan selil CD8 plus ak CD11b plis nan timè admix (PBS n=4, WGP n=3). *p=0.01, **p=0.007. e Rapò CD8 plis:CD11b plis selil nan timè admix (PBS n=4, WGP n=3). *p=0.0474. f Ekspresyon PD-L1 sou selil timè KPC, CD11b plis ak selil F4/80 plis nan yon timè KPC 21 jou apre enplantasyon (KPC n=5, CD11b plis n=6, F4/80 plis n=6). g Chema eksperimantal nan terapi WGP ak anti-PD-L1. Sourit (n=5) yo te trete ak PBS oswa WGP epi 7 jou apre yo te implanté ak timè pankreyas ortotopik KPC. Nan jou 3, 7, ak 11 apre implantasyon, sourit yo te bay kontwòl izotip anti-PD-L1 mAb oswa anti-rat IgG2b mAb. Siviv yo te kontwole. **p=0.0018 (WGP vs PBS oswa PD-L1), **p=0.0021 (WGP vs WGP plis PD-L1). h Schema eksperimantal WGP yo itilize nan anviwònman terapetik la. Sourit yo te implanté ak orthotopic KPC timè pankreyas epi yo te bay WGP yon fwa sourit te refè apre operasyon an nan jou 4, ak 1 semèn pita nan jou 11. *p=0.0163. Done yo te reprezante kòm mwayen ± SEM. Yo te itilize yon ANOVA yon sèl-fason ak konparezon miltip pou a epi yo te itilize yon tès t elèv ki pa pè, de keu pou b, d, ak e. Yo te itilize tès Log-rank pou g ak h. ns pa enpòtan. Chak echantiyon reprezante yon bèt byolojik endepandan yo jwenn sou yon sèl eksperyans endepandan ki te repete omwen de fwa pou verifikasyon rezilta yo.

WGP fè sinèrji ak terapi anti-PD-L1 mAb pou pwolonje siviv nan modèl PDAC.

Malgre ke yo te montre yon rediksyon enpòtan nan fado timè akòz fòmasyon WGP, li se ka a ke tout sourit devlope timè fatal. Etid nou yo te idantifye ke tretman WGP te afekte drastikman fenotip popilasyon myeloid nan pankreyas la.

Menmsi nou te idantifye selil efèktè prensipal ki responsab efè anti-timè WGP yo se CCR2 plis enfiltre monosit/makrofaj, nou te rezone ke chanjman iminitè sa yo ka afekte TME an jeneral nan yon fason ki ta ka fè selil iminitè adaptab yo pi reponn a. terapi blokaj pòs kontwòl. Espesyalman, paske nou te obsève yon ogmantasyon nan pwopòsyon CD8 plis T-selil prezan nan CCR2 plis timè melanje (Fig. 7c) epi nou te obsève tou siyifikatif ekspresyon PD-L1 sou selil myeloid prezan nan timè KPC (Fig. 7f), nou te ipotèz ke tretman WGP ka potansye efè terapi anti-PD-L1 mAb.

Pou evalye si terapi anti-PD-L1 mAb synergizes ak WGP-induit iminite antrene nan pankreyas la, sourit PBS oswa WGPtreated ki te implanté ak timè KCP orthotopic yo te bay swa anti-PD-L1 mAb oswa rat IgG2b izotip kontwòl mAb. Kòm yo te montre nan plizyè esè klinik, terapi antiPD-L1 pou kont li echwe pou pou prolonje siviv menm pi lwen pase sourit yo trete mAb kontwòl izotip IgG2b (figi 7g). Sourit ki resevwa fòmasyon WGP siviv siyifikativman pi lontan pase sourit izotip IgG2b ak anti-PD-L1treated. Sepandan, yon konbinezon de WGP ak anti-PD-L1 ansanm pwolonje siviv pi efikas. Sa a montre ke gen yon benefis klinik nan konbine WGP ak antiPD-L1 terapi blokaj imuno-checkpoint.

Jiskaprezan, yo te dekri itilizasyon WGP nan yon anviwònman kote WGP yo administre anvan selil timè yo implanté. Lè nou konsidere rediksyon nan gwosè timè nan modèl sa a, nou menm tou nou teste yon modèl ki pi enpòtan nan klinik kote sourit yo te implanté ak timè ortotopik KPC ak WGP te itilize pou ankouraje iminite ki antrene apre sa Fig. 7h). Nan anviwònman ki ka geri ou, yo te montre ke WGP-kondwi aflu selil myeloid ki antrene nan pankreyas la pwolonje siviv. Ansanm, done sa yo sijere ke inisyasyon iminite antrene nan pankreyas la lè l sèvi avèk WGP gen aplikasyon klinik ki enpòtan nan trete kansè nan pankreyas ki nesesite plis rechèch translasyonèl ak envestigasyon.

For more information:1950477648nn@gmail.com