Pwogram Fibrogenesis Ren ki kontwole pa MicroRNAs ki kontwole metabolis oksidatif

Kontakte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob , Diego Rodríguez-Puyolc ,d

Santiago Lamesa,**

yon pwogram nan pwosesis fizyolojik ak patolojik, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), 28049, Madrid, Espay

b Genomic Facility, Parque Syantifiko de Madrid, Madrid, Espay

c Depatman Patoloji, Lopital Universitario "Ramn y Cajal", IRYCIS, Madrid, Espay

d Depatman Medsin ak Espesyalite Medikal, Fondasyon Rechèch nan Lopital Inivèsite "Príncipe de Asturias," IRYCIS, Universidad de Alcala´, Alcala´ de Henares, Madrid, Espay

Mo kle: MicroRNAS, fibwoz ren, oksidasyon asid gra, matris ekstraselilè, CPT1A, mitokondri

Gzèsis cistanche trè bon pou fonksyon ren

A B S T R A C T

Akimilasyon twòp nan matris ekstraselilè (ECM) se mak karakteristik maladi fibrotik. Nan ren an, li se dènye chemen komen nan maladi répandus, ki mennen nan ensifizans renal kwonik. Pandan ke cytokines tankou TGF- jwe yon wòl fondamantal nan transfòmasyon myofibroblast, travay resan yo te montre ke malfonksyònman mitokondriyo ak defo oksidasyon asid gra (FAO), ki konpwomèt sous prensipal la nan enèji pou selil epitelyal ren tubulaires, yo te pwopoze yo dwe kontribitè fondamantal. nan devlopman ak pwogresyon nan fibwoz ren. MicroRNAs (miRNAs), ki kontwole ekspresyon jèn post-transcriptionally, yo te rapòte pou kontwole fibrogenesis ren. Pou idantifye miRNA ki enplike nan deranjman metabolik nan fibwoz ren, nou te fè yon ekran etalaj miRNA nan modèl sourit obstriksyon ureteral inilateral (UUO). MiR-150-5p ak miR-495-3p yo te chwazi pou lyen yo ak patoloji imen, wòl yo nan metabolis mitokondriyo, ak vize yo nan anzim transpò asid gra CPT1A. Nou te jwenn yon 2- ak 4-pliye regilasyon miR-150-5p ak miR-495-5p, respektivman, nan tou de modèl UUO ak nefropati asid folik (FAN) , alòske TGF- 1 te regilasyon ekspresyon yo nan liy selil epitelyal ren imen HKC-8. MiRNA sa yo te fè sinèrji ak TGF- konsènan efè pro-fibrotic li yo lè yo amelyore makè ki asosye ak fibwoz Acta2, Col1 1, ak Fn1. Etid bio-enèjik yo te montre yon rediksyon nan pousantaj konsomasyon oksijèn ki asosye ak FAO (OCR) nan selil HKC-8 nan prezans tou de miRNA yo. Toujou, nivo ekspresyon jèn sib ki gen rapò ak mitokondriyo yo CPT1A, PGC1, ak faktè transkripsyon mitokondriyo A (TFAM), yo te redwi a mwatye nan selil epitelyal ren ki ekspoze a miRNA sa yo. Kontrèman, nou pa t 'detekte chanjman nan mas mitokondriyo ak potansyèl transmembrane (ΔѰm) oswa mitokondriyo superoksid radikal pwodiksyon anion. Done nou yo sipòte ke miR-150 ak miR{- 495 ka kontribiye nan fibrogenèz ren lè yo agrave echèk metabolik ki enplike nan selil epitelyal tubulaires, finalman mennen nan fibwoz.

1. Entwodiksyon

Maladi ren kwonik (CKD) se yon kondisyon klinik kote rediksyon nan fonksyon ren kenbe. Li jeneralman konsidere kòm irevokabl ak pwogresif. Li reprezante yon pwoblèm sante piblik enpòtan ki ka afekte 12-14 pousan nan popilasyon jeneral la [1]. Li ka prezan nan apeprè 30-40 pousan nan pasyan ki gen patoloji trè répandus tankou dyabèt melitus ak tansyon wo, kote li kontribye nan dikte evolisyon ak pronostik. Kèlkeswa etyoloji maladi a, pwogresyon CKD mennen nan tibil-entèrstisyèl ak glomerular fibwoz [2]. Fibwoz tubulo-entèrstisyèl enplike ekspansyon espas ki genyen ant manbràn tubulèr sousòl la ak kapilè peritubular atravè depo pwoteyin matris (ECM) (dominanman kolagen tip I ak III ak fibronektin) an asosyasyon ak selil enflamatwa, pèt selil tubulèr, ak akimilasyon myofibroblast. [3].

Faktè kwasans transfòmasyon- (TGF-) konsidere kòm yon kritik omniprésente pro-fibrotic cytokine ak regilatè a mèt nan diferansyasyon myofibroblast nan fibwoz [4]. Etid resan yo te demontre ke yon defo mondyal nan oksidasyon asid gra (FAO), ki mennen nan yon konpwomi nan sous prensipal enèji pou selil epitelyal tubulaires, jwe yon wòl enpòtan nan devlopman fibwoz ren [5,6]. TGF- siprime FAO nan yon fason ki depann de SMAD3-ak PGC1A, kidonk afekte regilatè transkripsyon absòpsyon ak oksidasyon asid gra, ki gen ladan CPT1A [5]. Chanjman nan FAO finalman lakòz akimilasyon lipid intraselilè ak rediksyon ATP, ki mennen nan fibwoz [5,7]. Kidonk, estrateji ki vize a retabli deranje metabolik opere nan CKD ka bay opsyon ki ka geri [8].

MicroRNAs (miRNAs) te parèt kòm regilatè kritik nan ekspresyon jèn atravè aksyon yo sou règleman posttranscriptional. Nan ren an, miR yo te montre yo jwe wòl enpòtan nan nefrogenesis, omeyostazi, ak maladi [9]. MiRNA yo kapab tou kontwole pwosesis fibrotik epi yo te rele "fibwoz" [10]. Anplis de sa, akòz mank de yon terapi efikas pou anpeche oswa retounen fibrogenèz ren [11], yo te pwopoze manipilasyon ekspresyon miRNA pa livrezon in vivo nan imite miRNA oswa inhibiteur kòm yon estrateji terapetik pwomèt pou CKD [12]. Anplis de sa, miRNAs sikile yo ka konstitye dyagnostik e menm biomarkers pronostik [13].

MiRNA-medyatè kontwòl fibwoz ren fèt sitou atravè règleman an nan siyal TGF- 1 nan yon fason ki depann de selil ak kontèks, itilize chemen Smad la kòm youn nan objektif prensipal yo [14]. Nan travay anvan yo, nou te idantifye plizyè miRNA ki gen yon enpak sou fibwoz ren pa reglemante wout metabolik espesifik [15,16]. Ekspresyon twòp nan miR-9-5p anpeche de-diferansasyon selil epitelyal ren tubulèr ak repwograme deranjman metabolik ki gen rapò ak fibwoz [16], pandan y ap pèt fonksyon miR{-33, swa jenetik oswa farmakolojik, rezilta nan ogmante. FAO ak prevansyon akimilasyon lipid nan selil epitelyal tubulaires. Sa a se asosye ak ogmante rezèv enèji, amelyore byoenergetik mitokondriyo, ak prevansyon nan fibwoz ren eksperimantal [15]. Kidonk, miRNAs ki kontwole bioenèjik selilè yo kapab tou kontwole fibrojenèz ren. Nan etid sa a, nou te anplwaye yon estrateji miRNA ki baze sou etalaj nan modèl inilateral ureteral obstruction (UUO) kwonik aksidan ren pou idantifye miRNA ki enplike nan fenotip fibrotik ren nan modifikasyon wout metabolik yo. Lè nou chwazi plizyè jèn ki gen rapò ak fonksyon mitokondriyo (CPT1A, TFAM, PGC1A), nou idantifye tou de miR-150 ak miR{-495 kòm miRNA ki kapab redwi pousantaj konsomasyon oksijèn ki asosye ak FAO (OCR) epi fè pwomosyon TGF{ {21}}pwovoke transfòmasyon fibrojenik nan liy selil epitelyal ren imen HKC-8. Konklizyon nou yo mete aksan sou enpòtans miRNA yo kòm regilatè metabolik mitokondriyo ki enplike nan fibrojenèz ren.

2. Materyèl ak metòd

Liy selilè ak kondisyon kilti. Selil epithelial proximal tubulaires ren imen (HKC{0}}) yo te kiltive nan DMEM/F12 (Mwayen Eagle's modifye Dulbecco a 1:1 (v/v)) (Corning, New York, NY) konplete ak 15 mM HEPES, 5 pousan. (vol/vol) serom fetal bovine (FBS)

(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x Ensilin-Transferrin-Selenium (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0.5 ug/ml idrokortizon (Sigma, St. Louis, MO), 50 inite/ mL penisilin ak 50 ug/mL streptomycin (Gibco, Rockville, MD) nan 37◦ C ak 5 pousan CO2. Se laboratwa Dr Susztak (Philadelphia, Pennsylvania, USA) ki te bay liy selilè sa a. Tretman ak moun recombinant 10 ng/ml TGF- 1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) yo te fèt apre grangou san serom nan selil HKC-8 pou 12 èdtan.

Pwosedi transfèksyon. Selil yo te simen nan asyèt kilti 60 mm pou rive nan yon konfluyans 70 pousan. Yo te transfekte ak 40 nM swa mirVana™ miRNA miR-150, miR{-495, oswa mirVana™ miRNA imite negatif kontwòl (Ambion konpayi, USA) lè l sèvi avèk lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Selil yo te enkube ak lipofectamine-pre-miRNA 37 ◦ C pou 6 èdtan. Imedyatman, yo te ajoute 5 ml mwayen fre ki gen 10 pousan FBS nan asyèt kilti yo, epi selil yo te kenbe nan kilti pou 6 èdtan jiskaske yo itilize pou eksperyans ki vin apre yo. Nan ka konbinezon ak tretman TGF- 1, li te aplike nan selil yo apre miRNAs twòp ekspresyon dapre seksyon anvan an.

Imunoblot. Selil yo te lave nan PBS, omojènize, epi liz nan 100 μL RIPA lysis tanpon ki gen 150 mM NaCl, 0.1 pousan SDS, 1 pousan deoxycholate sodyòm, 1 pousan NP-40, ak 25 mM Tris–. HCl pH 7.6, nan prezans proteaz (Konplete, Roche Diagnostics, Mannheim, Almay) ak inhibiteur fosfataz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ak rekòlte pa grate. Yon ka moso nan chak echantiyon ren (jwenn apre dissection nan mwatye tou de longè ak travèse) te omojeneize nan 300 ul RIPA tanpon ak 5 mm pèl asye pur (Qiagen, Valencia, CA) lè l sèvi avèk TissueLyser LT (Qiagen, Valencia, CA) vibre nan. 50 Hz pou 15 min nan 4 ◦ C. Echantiyon yo te klarifye pa santrifugasyon nan 10,000 g pou 15 min nan 4 ◦ C. Yo te jete grenn nan, epi yo te kenbe supernatant la kòm lisat pwoteyin. Konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine pa BCA Pwoteyin Assay Twous (Thermo Scientific, Rockford, IL) epi yo te mezire nan Glomax®-Multi Detection System (Promega, Madison, WI). Kantite egal pwoteyin (10-50 ug) ki soti nan ekstrè total la te separe sou 8-10 pousan jèl SDS-polyacrylamid epi transfere sou manbràn nitrocellulose blotting (GE Healthcare, Chicago, IL) nan 12 V pou 20 minit nan yon semi-sèk. Trans-Blot Turbo sistèm (Bio-Rad, Hercules, Kalifòni).

Manbràn yo te bloke pa enkubasyon pou 1 èdtan ak 5 pousan lèt ki pa gen anpil grès nan PBS ki gen 0.5 pousan Tween-20 ak efase lannwit lan ak antikò espesifik: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{). {26}}; 4 ◦ C lannwit lan), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4 ◦ C lannwit lan), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15000; 1 h, tanperati chanm ). Apre enkubasyon ak IRDye 800 kabrit anti-lapen ak IRDye 600 kabrit anti-sourit (1:15,000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) segondè antikò, manbràn yo te imajine an triple ak Odyssey Enfrawouj Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Band densitometry te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ 1.48 la (http://rsb.info.nih.gov/ij) ak ekspresyon relatif pwoteyin yo te detèmine pa nòmalize nan GAPDH. Chanjman pliye yo te nòmalize nan valè kondisyon kontwòl la.

RNA ekstraksyon. Yo te retire RNA total nan selil HKC-8 oswa nan ren sourit lè l sèvi avèk miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) dapre enstriksyon manifakti a. Yon espektrofotomèt Nanodrop-1000 te detèmine kantite ak kalite RNA nan 260 nm (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Analiz ekspresyon mRNA. Transkripsyon ranvèse (RT) te fèt ak 500 ng RNA total lè l sèvi avèk twous sentèz iScript™ cDNA (Bio-Rad, Hercules, CA). qRT-PCR te fèt ak iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA), lè l sèvi avèk yon sistèm 96-Bio-Rad CFX96 RT-PCR ak yon siklis tèmik C1000 (Bio-Rad, Hercules, CA) dapre enstriksyon manifaktirè yo. Yo te jwenn yon valè Ct nan chak koub anplifikasyon lè l sèvi avèk lojisyèl analiz CFX96 manifakti a bay. Ekspresyon mRNA relatif yo te detèmine lè l sèvi avèk metòd 2 - ΔΔCt [17]. Yo te itilize jèn 18S la pou rezon nòmalizasyon. Sekans Jadendanfan yo itilize pou quantifikasyon mRNA yo se te: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA- TAGCCACGCTCAG), COL1A1 (FW: CGGTTGAACGACCGACCTGCC, FGTCCTGCC: FW: CGGTGACGACCTGCC, FGTCC: GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CCACTCCGCCCTA- TAAGCATC), 18S: GGGGAATGCTGGGGGTAGG, 18S: GGGGAATG: GGGGAATG. Chanjman pliye yo te nòmalize nan valè kondisyon kontwòl la.

Kantifikasyon ekspresyon miRNA. Kantifikasyon ekspresyon miRNA yo te fèt lè l sèvi avèk miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Denmark). Apre RT, yo te anplifye modèl cDNA a lè l sèvi avèk primè LNA espesifik pou microRNA pou miR150-5p oswa miR-495-3p ki gen matirite (Exiqon, Feedback, Denmark). qRT-PCR te fèt nan yon 96-byen Bio-Rad CFX96 an tan reyèl PCR sistèm ak yon siklis tèmik C1000 lè l sèvi avèk iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) dapre enstriksyon manifakti yo. . Yo te jwenn yon valè Ct pou pwi triple nan chak koub anplifikasyon lè l sèvi avèk lojisyèl CFX Manager Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Valè Ct yo te nòmalize nan kontwòl andojèn 5S rRNA. Nivo plasma miRNA yo te nòmalize nan miR-103a-5p. Te ekspresyon relatif miRNA detèmine lè l sèvi avèk metòd la 2 - ΔΔCt [17]. Chanjman pliye yo te nòmalize nan valè kondisyon kontwòl la.

Modèl sourit fibwoz ren. Sourit yo te loje nan etablisman bèt patojèn espesifik (SPF) nan CBMSO a an akò ak règleman Inyon Ewopeyen pou tout pwosedi yo. Bèt yo te okipe an akò ak Gid pou Swen ak Itilizasyon Bèt Laboratwa ki nan Directive 2010/63/EU nan Palman an Ewopeyen an. Komite revizyon etik lokal Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" nan Madrid te bay apwobasyon, Komite Etik nan CSIC, ak Inite Regilasyon pou Pwosedi Eksperimantal Animal soti nan Comunidad de Madrid.

Obstriksyon ureteral inilateral (UUO): Pwosedi operasyon UUO te fèt jan sa te dekri anvan [18]. Yon ti tan, sourit yo te anestezi ak isoflurane (3-5 pousan pou endiksyon ak 1-3 pousan pou antretyen) ak divize an de gwoup eksperimantal: gwoup la UUO ak gwoup la operasyon sham. Nan gwoup UUO a, sourit yo te kale sou bò gòch nan vant la, yo te fè yon ensizyon vètikal nan po a ak yon bistouri epi po a te retracte. Yo te fè yon dezyèm ensizyon nan peritoneum la pou ekspoze ren an. Te uretè gòch la ligated de fwa 15 mm pi ba pase basen nan ren ak swa chirijikal ak uretè a Lè sa a, te koupe ant de ligatures yo. Lè sa a, ren ligated la te plase dousman tounen nan pozisyon anatomik kòrèk li yo ak saline esteril yo te ajoute pou ranpli pèt likid la. Ensizyon yo te suture ak sourit yo te endividyèlman nan kaj. Operasyon simulacre a te fèt menm jan an men san ligature ureteral. Buprenorphine te itilize kòm yon analgesic. Yo te bay yon premye dòz 30 minit anvan operasyon an epi apre chak 12 èdtan pou 72 èdtan, nan yon dòz 0.05 mg/kg anba lar. Nan modèl sa a, sikilasyon san ren ak to filtraj glomerulè vin siyifikativman redwi nan lespas 24 èdtan ak enflamasyon entèrstisyal (pik nan 2-3 jou), dilatasyon tubulaires, atrofi tubulaires, ak fibwoz yo evidan apre 7 jou. Ren ki obstrue rive nan maksimòm malfonksyònman anviwon 2 semèn apre pwosedi a. Sourit yo te sakrifye pa surdozaj CO2 ak kontwòl ak ren obstrue ak echantiyon san yo te rekòlte apre perfusion ak PBS nan 3, 5, 7, 10, ak 15 jou apre UUO.

Nefropati asid folik (FAN): Nan modèl sa a, fibwoz ren te pwovoke pa piki intraperitoneal (ip) ak 250 mg asid folik (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pou chak kg pwa kò ki fonn nan 0.3 M sodyòm bikabonat (machin) jan sa te dekri anvan [19]. Bèt kontwòl yo te resevwa 0.3 ml machin (ip). Sourit yo te sakrifye pa surdozaj CO2 ak ren ak echantiyon san yo te rekòlte apre perfusion ak PBS apre 15 jou nan administrasyon FA.

Des microRNA. Pou idantifye miRNA espesifik ki kontwole rezilta fibrotik la, yo te chwazi yon seri microRNA Custom miRCURY LNA (Exiqon, Feedback, Denmark) kòm platfòm pou pwofil microRNA. Platfòm sa a se yon total de 175 analiz inik espesifik pou miRNA sourit ki prezan nan Sanger miRBase v22.1 (http://microrn a.sanger.ac. UK). Pou chak microRNA, yo te chwazi branch dominan an pou analiz. Seleksyon MiR te baze sou jèn sib prevwa ki gen rapò ak fibwoz ren, metabolis mitokondriyo, pwosesis redox, ak ritm sirkadyèn. Analiz sa a te fè ak zouti bioenfòmatik pou prediksyon sib miRNA ki baze sou sekans, microcosm [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org /vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) ak miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). Apre ekstraksyon RNA soti nan echantiyon ren 7 jou-UUO, fraksyon miRNA prezan nan 20 ng nan RNA total te sibi transkripsyon ranvèse lè l sèvi avèk miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Denmark) dapre enstriksyon manifakti a. Yo te analize cDNA yo ki te lakòz miRCURY miRNA PCR Panels yo nan yon sistèm PCR an tan reyèl Roche LightCycler 480 lè l sèvi avèk miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon, Feedback, Denmark). Chak echantiyon te analize an kopi. Pwosedi sa a te fèt nan Etablisman Genomics nan Fundacion Parque Scientífico de Madrid (Madrid, Espay). Yo te itilize lojisyèl LC480 pou jwenn valè Cq (Cq) pou chak miRNA. Valè delta Ct (ΔCt) yo te kalkile pa nòmalize valè Ct nan snRNAU6 endojèn snRNAU6. Kat chalè a te pwodwi ak done PCR an tan reyèl yo prezante kòm ΔCt. Regroupement yerarchique te konstwi selon valè ΔCt. Valè delta Ct (ΔΔCt) yo te kalkile lè w retire ΔCt gwoup echantiyon referans (ren kontwòl) nan ΔCt chak echantiyon ren ki obstrue. Kantifikasyon relatif (RQ) oswa chanjman pliye nan chak miRNA te pwodwi lè l sèvi avèk metòd 2 - ΔΔCt [17]. MiRNA ki eksprime diferan yo te idantifye pa tès parametrik Limma. Pou pran tès ipotèz miltip yo an kont, yo te ajiste valè P yo (adj.) lè l sèvi avèk koreksyon Benjamini-Hochberg fo dekouvèt (FDR) [25]. Rezilta yo te make nan yon trase vòlkan.

analiz miRNA nan plasma san nan pasyan CKD. Nivo miRNA yo chwazi yo te analize nan echantiyon plasma ki soti nan yon kòwòt 100 pasyan CKD, ki detaye anba a. San venn periferik yo te kolekte nan vacutainers espre EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ). Pou jwenn plasma, yo te santrifuje san nan 400 g pou 20 min, yo te transfere supernatant la nan yon nouvo tib epi santrifize nan 800 g pou 20 min. Plasma yo te kolekte epi estoke nan frizè nan alikòt nan - 80 ◦ C. Yo te retire plasma miRNA nan san lè l sèvi avèk miRCURYTM RNA Isolation Kit—Biofluids ak UniSp2 Spike-in RNA (Exiqon, Vedbaeck, Denmark). Analiz nivo miR-150 nan echantiyon sa yo te fèt jan sa dekri nan seksyon pwosedi ekspresyon miRNA quantification. Mezi pousantaj konsomasyon oksijèn. Asid gra oksidasyon ki asosye ak to konsomasyon oksijèn (OCR) (ligated to oksidatif fosforilasyon) ak to asidifikasyon ekstraselilè (ECAR) (ki asosye ak pwodiksyon laktat ak glikoliz) yo te etidye lè l sèvi avèk analizeur metabolik Seahorse Bioscience dapre enstriksyon manifakti a [26]. Selil HKC-8 yo te simen nan yon plak p60 epi yo te fè transfeksyon microRNA jan sa dekri pi wo a lè yo rive nan yon rankont 70 pousan 48 èdtan apre, selil HKC-8 yo te trete ak 10 ng/ml TGF{{ 18}} pou 48 h. Lè sa a, selil yo te simen nan 2 × 104 selil pou chak pi nan yon mikroplak kilti selil Seahorse Bioscience XFe24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Apre aderans selilè, yo te ranplase mwayen kwasans lan ak yon mwayen ki limite nan substrate, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complétée ak 0.5 mM Glikoz ak 1mM Glutamate. Yon èdtan anvan mezi tès la, selil yo te enkube ak mwayen tès Krebs-Henseleit Buffer (KHB) ki te konplete ak 0.2 pousan karnitin nan 37 ◦ C san CO2. Kenz minit anvan tès la, CPT1 inhibitor Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 400 μM te ajoute nan pwi korespondan yo, ak selil yo te enkubate nan 37 ◦ C san CO2. Finalman, imedyatman anvan tès la, yo te ajoute BSA oswa 200 μM Palmitate-BSA FAO Substrate (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA). Menm lè a, XF Cell Mito Stress Test la te fòme nan yon analizeur enèji Seahorse XFe24 lè li te ajoute yon fason sekans plizyè modulateur nan fonksyon mitokondriyo. Premyèman, ATP synthase inhibitor oligomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM) te itilize apre mezi fondamantal. Sa a diminye koule elèktron nan ETC a, sa ki lakòz yon rediksyon nan respirasyon mitokondriyo. Apre sa, dekoupling ajan cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) (3 μM), ki tonbe nan gradyan pwoton yo ak deranje potansyèl manbràn mitokondriyo a te ajoute. Kòm yon rezilta, koule elèktron nan ETC a se dekouraje, ak konsomasyon oksijèn pa konplèks IV rive nan maksimòm li yo. Twazyèm ak dènye piki a se yon melanj de konplèks III ak I inhibiteurs anti-mycin/rotenone (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). Konbinezon sa a fèmen respirasyon mitokondriyo ak pèmèt kalkil respirasyon ki pa mitokondriyo kondwi pa pwosesis deyò mitokondri yo. Substra/inibitè yo te prepare nan menm mwayen kote yo te fè eksperyans lan epi yo te enjekte nan pò reyaktif yo otomatikman nan moman yo endike yo. Mezi yo te anrejistre pou 3-min peryòd de tan (sou yon peryòd total de 2 h) ak valè yo te nòmalize pou kontni total pwoteyin. Pwoteyin yo te ekstrè nan pwi ak 0.1 pousan solisyon NP-40-PBS epi yo te mezire ak yon tès pwoteyin BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Kat pwi yo te itilize pou chak gwoup eksperimantal. Tès estrès mitokondriyal XFp selil ipozan yo te itilize pou detèmine paramèt kle fonksyon mitokondriyo yo: respirasyon mitokondriyo fondamantal, respirasyon ki lye ak ATP, koule proton (ki pa -- konsomasyon oksijèn ki lye ak ATP), respirasyon maksimòm, respirasyon ki pa mitokondrial. , ak rezève kapasite respiratwa, jan sa deja dekri [27].

Lisiferaz tès. Pou karakterize sit obligatwa miRNA-150 ak miRNA-495 kandida yo nan CPT1A 3′-UTR imen an, yon tès repòtè luciferase ki gen CPT1A 3′-UTR (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, Product ID S814347) te itilize. Mitasyon ki dirije sou sit nan rejyon semans yo nan sit prevwa miR-150 ak miR{-495 nan 3′ - UTR yo te pwodwi lè l sèvi avèk twous mutajenèz ki dirije Multisite-QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA) dapre nan pwotokòl manifakti a. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), Tout konstriksyon yo te sekans anvan yo itilize yo pou konfime yo se bon estrikti. Selil HKC-8 yo te simen nan yon plak ap24-byen epi yo te ko-transfekte tanporèman ak 200 ng pLightSwitch_CPT1A_3′-UTR (konstriksyon entak oswa mitasyon) ak 4 ng pGL3-Promotè (yon luciferase koukouy ki anba kontwòl pwomotè SV40) (Promega Corporation, Madison, WI, USA) plasmid repòtè yo ak 40 nM nan swa mirVana™ miRNA imite miR-150, miR -495 oswa mirVana™ miRNA imite kontwòl negatif (konpayi Ambion, USA) lè l sèvi avèk lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) lè yo rive nan yon rankont 70 pousan jan sa dekri pi wo a. Kat pwi yo te itilize pou chak gwoup eksperimantal. Test Luciferase yo te fèt 24 èdtan apre lè l sèvi avèk sistèm repòtè Doub-Luciferase (Promega, Madison, WI). Siyal luciferase vaniy ak koukouy yo te detekte lè l sèvi avèk yon sistèm deteksyon milti Glomax (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Aktivite renilla luciferase te nòmalize pa aktivite luciferase koukouy la.

Potansyèl manbràn mitokondriyo (MMP). Chanjman nan MMP yo te detèmine kòm diferans ki genyen nan fluoresans tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Li akimile nan mitokondri polarize chaje negatif ak fliyoresan nan zoranj. Lè potansyèl manbràn mitokondriyo a tonbe nan selil apoptotik oswa metabolik ensiste, reyaktif TMRM a gaye nan tout sitosol selilè a ak nivo fliyoresans tonbe dramatikman. Selil HKC-8 yo te kiltive ak transfekte jan sa dekri nan seksyon kilti selil ak pwosedi transfeksyon yo. Apre sa, mwayen kwasans lan te ranplase pa Solisyon Sèl Balanse Hank a (HBSS) ak 10 mM Hepes. Tretman ak oligomycin (5 μM) ak FCCP (4 μM) pou 5 min yo te itilize kòm kondisyon kontwòl pozitif ak negatif. Apre sa, selil yo te tache ak 250 nM TMRM pou 30 minit nan 37 ◦ C. Selil yo te rekòlte ak tripsin, santrifuje (3000 rpm, 5 min) epi yo te repoze granules a nan 200 μL HBSS ak 1 pousan. Albumin serik bovin (BSA) ak 5 mM asid ethylenediaminetetraacetic (EDTA). Entansite fliyoresan yo te mezire pa sikometri koule lè l sèvi avèk yon longèdonn emisyon 570 nm pou TMRM (FL2) [28] nan yon sistèm BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) epi analize ak lojisyèl FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland). , OSWA). Pou chak kondisyon eksperimantal, omwen 20,000 singlets te analize an triple.

Mitokondriyo superoksid radikal pwodiksyon anion. Evalyasyon pwodiksyon anion radikal superoksid te fèt lè l sèvi avèk Mito- SOX ™ endikatè mitokondrial superoxide radikal anyon wouj (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), yon lank fluorojenik trè selektif pou mitokondriyo superoksid radikal anion nan selil vivan, dapre manifakti a. enstriksyon yo. Selil HKC-8 yo te kiltive epi transfekte jan sa dekri nan seksyon kilti selil ak pwosedi transfeksyon yo. Apre sa, mwayen kwasans lan te ranplase pa Solisyon Sèl Balanse Hank a (HBSS) ak 10 mM Hepes. Tretman ak antimycin A (150 μM) ak carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) (50 μM) pou 5 min yo te itilize kòm kondisyon kontwòl pozitif ak negatif. Apre sa, selil yo te tache ak 5 μM MitoSOX™ Wouj pou 30 min nan 37 ◦ C. Selil yo te rekòlte jan sa dekri nan seksyon potansyèl manbràn mitokondriyo a. Entansite fliyoresans te mezire pa sikometri koule lè l sèvi avèk yon longèdonn emisyon 580 nm pou MitoSOX™ Red (FL2) nan yon sistèm BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) epi analize ak lojisyèl FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland, OSWA). Pou chak kondisyon eksperimantal, yo te analize omwen 20,000 singlets an triple.

Etikèt mitokondriyo. Evalyasyon kontni mitokondriyo te fèt lè l sèvi avèk MitoTracker™ green FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ki pasif difize atravè manbràn plasma a epi akimile nan mitokondri aktif kèlkeswa potansyèl manbràn mitokondriyo, dapre enstriksyon manifakti a. Selil HKC-8 yo te kiltive ak transfekte jan sa dekri nan seksyon kilti selil ak pwosedi transfeksyon yo. Apre sa, mwayen kwasans lan te ranplase pa Solisyon Sèl Balanse Hank a (HBSS) ak 10 mM Hepes. Selil yo te tache ak 150 nM ak MitoTracker™ green FM pou 30 min nan 37 ◦ C. Pou analiz sikometri koule, selil yo te rekòlte jan sa dekri nan seksyon potansyèl manbràn mitokondriyo a. Entansite fliyoresans te mezire lè l sèvi avèk yon longèdonn emisyon 516 nm pou ak MitoTracker™ green FM (FL1) nan yon sistèm BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) epi analize ak lojisyèl FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC). , Ashland, OSWA). Pou chak kondisyon eksperimantal, yo te analize omwen 20,000 singlets an triple. Pou imaj fluoresans, nwayo yo te tou tache ak DAPI (Sigma, St. Louis, MO) pou 5 min nan RT. Selil vivan yo te vizyalize pa yon mikwoskòp konfokal envèse Zeiss LSM 710 ak yon selil obsève, yon objektif 63X/1.2 Water C-Apochromat Corr UV-VIS-IR M27 epi analize ak lojisyèl Zeiss Zen2010B sp1 (Zeiss, Oberkochen, Almay) .

Detèminasyon nimewo kopi mitokondriyo. Yo te retire ADN jenomik nan selil HKC-8 yo lè l sèvi avèk DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) dapre enstriksyon manifakti a. Yo te detèmine abondans mitokondriyo ak Twous Test Nimewo Kopi ADN Mitokondrial Imèn (Detroit R&D, Detroit, MI). Nimewo kopi relatif mtDNA te prezante kòm rapò ADN mtDNA-a-nikleyè.

Echantiyon pasyan CKD imen. Yo te chwazi yon gwoup 100 pasyan CKD (etap 3-4) nan lopital Principe de Asturias pou analiz nivo plasma miRNA yo. Li te enkli de sougwoup diferan ki klase dapre evolisyon fonksyon ren yo ki baze sou endikatè GFR MDRD [29] sou yon peryòd 24 mwa: 50 pasyan te prezante mwens pase 10 pousan nanrendeteryorasyon fonksyon pandan rès yo te fè eksperyans omwen 40 pousan rediksyon nan fonksyon ren oswa te inisyerenterapi ranplasman (dyaliz). Nou menm tou nou mezire degre nan fibwoz nanrenbyopsi ki soti nan yon kòwòt diferan nan 26 pasyan ki gen malfonksyònman grèf swivanrentransplantasyon nan Lopital Ramn y Cajal. Tout byopsi yo te evalye selon kritè Banff 2007 [30].

Analiz estatistik. Done yo te analize lè l sèvi avèk tès nonparametric eksepte kote yo endike. Diferans ki genyen ant de gwoup endepandan yo te egzamine ak tès Mann-Whitney, pandan y ap plis pase de gwoup yo te konpare ak tès Kruskall-Wallis. Yon valè P nan 0.05 oswa mwens yo te konsidere estatistik enpòtan (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0.001).="" done="" yo="" te="" analize="" lè="" l="" sèvi="" avèk="" graphpad="" prism="" 6.0="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca).="" done="" yo="" rapòte="" kòm="" mwayen="" ±="" estanda="" erè="" mwayen="">

3. Rezilta yo

Done ekspresyon miRNA nan fibrotik UUO-induitren. Pou dechifre kontribisyon miRNAs nan règleman metabolik la nanrenfibrogenesis, modèl UUO 7days la te fèt nan sourit WT. RNA te izole nan kontwòl ak fibrotikrenechantiyon ak pwofil ekspresyon miRNA yo te analize nan yon etalaj mikroRNA Customized. Seleksyon miRNA yo te baze sou vize potansyèl yo nan anzim kle ki enplike nan metabolis mitokondriyo, pwosesis redox ak ritm sirkadyèn apre analiz "in silico" (plis detay nan seksyon an Metòd). Kat jeyografik chalè a revele klèman modèl ekspresyon diferan nan kèk miRNA lè w konpare fibrotik ak kontwòlrenechantiyon (figi 1A). Analiz volkan an te montre ke 73 nan 175 miRNA yo te eksprime diferan, 17 moute- ak 56 desann-reglemante, nan echantiyon ren fibrotik yo konpare ak sa yo kontwòl (Fig. 1B, Siplemantè Table1). Pami yo, yo te chwazi miRNA espesifik ki ta ka kontwole rezilta fibrotik nan ren an atravè chemen metabolik yo. Pou rezon sa a, analiz silico de 3′UTR (rejyon ki pa tradui) nan jèn espesifik ki enplike nan fonksyon metabolik ak mitokondriyo, yo te fè CPT1A, TFAM, PGC1A ak twa zouti prediksyon endepandan (Targetscan, miRWalk ak miRanda). Kritè seleksyon yo enkli tou nivo ekspresyon ren, kado sib, degre konesans sou wout metabolik la ak siyifikasyon byolojik. Lyen ak patoloji imen, nivo ekspresyon tisi ren yo, wòl yo nan metabolis mitokondriyo ak vize potansyèl yo nan anzim transpò asid gra CPT1A ankouraje nou konsantre sou twa miRNA, miR-150-5p, miR-495-3p ak miR -33-5p, kòm kandida ki kapab kontwole chanjman metabolik ki asosye ak fibrojenèz ren (Fig. 1C). Nòt, CPT1A 3′-UTR gen yon sit semans pou miR-150 ak de sit semans pou miR-495. Nou te obsève ke miR-150 ak miR{-495 diminye aktivite yon tès repòtè luciferase ki gen CPT1A 3′-UTR pa ~ 15 pousan ak 25 pousan, respektivman. Regilasyon sa a te konplètman anile nan ka mitasyon pwen (PM) nan 3′-UTR nan CPT1A pou sit obligatwa miR-150 (PM2) ak pasyèlman absan nan tou de sit obligatwa miR{-495 (PM1). ak PM3) (figi siplemantè 1A ak B). Done sa yo endike yon entèraksyon dirèk nan CPT1A ak miR-150 ak miR-495. MiR-33-5p te objè a nan yon etid apa [15]. MiR-150-5p ak miR-495-3p te regilasyon anlè nan echantiyon ren fibrotik konpare ak sa yo kontwòl, ak yon chanjman pli nan 3.69 (P-valè: 0.012). ) ak 1.95 (P-valè: 0.012), respektivman.

MiR-150 ak miR-495 amelyore repons TGF-profibrotic nan moun.renselil epitelyal tubulaires. Yo te fè yon seri reyaksyon transkripsyon ranvèse-polymerase (qRT-PCR) pou konfime chanjman ekspresyon miR-150-5p ak miR-495-3p ki te idantifye pa pwofil ekspresyon miRNA nan UUO la.renechantiyon (figi 2A ak B). Anplis de sa, sinetik ekspresyon miR-150-5p ak miR- 495-3p nan ren yo 3, 5, 7, 10 ak 15 jou apre pwosedi UUO yo te analize pa qRT-PCR. Ekspresyon miRNA sa yo te siyifikativman amelyore pa 2-pliye nan 5 jou apre UUO epi li te rete elve 15 jou apre UUO (Fig. 2C ak D). Nivo ekspresyon miRNA sa yo te evalye tou nan modèl nefropati asid folik (FAN). Nou jwenn yon 4- ak 2-pliye regilasyon miR-495-3p ak miR-150-5p, respektivman, nan fibrotik.renechantiyon ki soti nan modèl FAN (Fig. 2E). TGF- 1, youn nan regilatè yo mèt nan fibrogenesis, tou pwovoke miR-150 ak miR-495 ekspresyon nan selil HKC-8 plis pase 2-pliye ak {{ 6}} pliye, respektivman, apre 48 èdtan, sipòte yon wòl potansyèl pou miRNA sa yo nan evènman ki gen rapò ak siyal TGF (figi 3A ak B). Pou evalye si miR-150 ak miR{-495 te enplike nan transfòmasyon pro-fibrotic nan selil epitelyal tubulaires pa TGF- 1, liy selil imen HKC-8 yo te transfekte ak miR. -150-5p oswa miR-495-3p epi trete ak TGF- 1 pou diferan moman. Ogmante nivo miR-150-5p ak miR-495-3p amelyore ekspresyon nivo mRNA TGF- 1-pwovoke nan makè ki asosye ak fibwoz Acta2, Col1 1, ak Fn1 ( Figi 3C ak D). Menm jan an tou, twòp ekspresyon miR-150-5p oswa miR-495-3p redwi CPT1A ak plis abondans pwoteyin -SMA (figi 3E ak F). Done sa yo sijere ke miRNA sa yo ka patisipe nan patojèn nanrenfibwoz nan pwomouvwa dediferansasyon epitelyal TGF- 1-depandan nan selil tubulaires, epi tou pa konpwomèt ekspresyon yon anzim kritik ki enplike nan FAO.

MiR-150 ak miR-495 pwovoke chanjman mitokondriyo bioenèjik epi redwi ekspresyon jèn ki enplike nan fonksyon mitokondriyo enpòtan. Pou jwenn yon konesans sou konsekans metabolik yo te pwovoke pa administrasyon miR-150-5p oswa miR-495-3p nou etidye pwofil bioenèjik imen an.renselil epitelyal tubulaires.

Fig. 1. Done ekspresyon miRNA nan fibwoz UUO-induit. (A) Kat chalè ki montre ekspresyon miRNA relatif nan kontralateral ak obstruerennan sourit C57/BL6-J sibi pwosedi UUO pou 7 jou (n=6). Ba echèl la varye ant vèt ak wouj (espresyon ki wo rive ki ba) ak nimewo reprezante valè ΔCt. Sou bò gòch yo endike miRNA yo chwazi pou etid. (B) analiz trase vòlkan nan miRNAs UUO-module. Log10 quantification relatif (RQ) ak negatif (-) log10 ajiste (adj.) P-valè yo trase sou aks x ak y, respektivman. Chak miRNA reprezante pa yon pwen. 73 nan 175 miRNA te montre yon ekspresyon ki chanje nan echantiyon fibrotik yo (adj. P-valè pi gran pase oswa egal a 0.05). MiRNA yo chwazi pou plis analiz yo make. (C) yo te chwazi miR-150-5p ak miR-495-3p sou baz pouvwa yo pou vize in silico jèn CPT1A, TFAM ak PGC1A. Pou chak mikroRNA chwazi, sit sib grenn konsève nan 3'UTR jèn sa yo, yo endike chanjman pliye yo ak siyifikasyon (adj. P-valè).

Fig. 2. Nivo ekspresyon miR-150-5p ak miR-495-5p nanrensoti nan modèl yo UUO ak FAN. (A, B) analiz qRT-PCR nan ekspresyon miR-150-5p (A) ak miR-495- 3p (B) nanrensoti nan sourit 7 jou apre UUO nan echantiyon yo te deja analize ak etalaj la microRNA. (C–E) analiz qRT-PCR nan ekspresyon miR-150-5p ak miR-495-3p apre modèl FAN (C) ak 3, 5, 7, 10 ak 15 jou apre UUO pou miR-150-5p (D) ak miR{{10}}p (E). Grafik ba yo reprezante mwayèn nivo ekspresyon chanjman pliye yo ± sem soti nan 6 (A, B, E) ak 3 (C ak D) sourit pou chak gwoup. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" konpare="" ak="" kondisyon="" kontwòl="" korespondan="" yo;="" #p=""><0.05, ##p=""><0.01 konpare="" ak="">rensoti nan sourit ak menm tretman eksperimantal la.

TGF- 1 te itilize kòm cytokin modèl ki enplike nan chanjman ki asosye pro-fibrotik. Pou detèmine estati bioenèjik selil sa yo, yo te mezire pousantaj konsomasyon oksijèn ki asosye ak FAO (OCR) ak pousantaj asidifikasyon ekstraselilè (ECAR) nan selil HKC-8 pandan tretman sekansyal ak konpoze ki modile aktivite mitokondriyo an prezans palmitate. , lè l sèvi avèk yon Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer (plis detay nan seksyon an Metòd). Apre 48h ak TGF- 1, selil HKC-8 nan prezans miR-150-5p te montre yon diminisyon konsistan nan baz, OCR makonnen ak jenerasyon ATP, respirasyon ki lye ak ATP ak respirasyon maksimòm, ki gen rapò ak FCCP-sansib OCR (figi 4A). Defisyans nan OXPHOS la te reflete pa yon diminisyon nan kontni ATP nan selil HKC-8 ki eksprime miR-150-5p (figi 4C). Nou pa t 'obsève ke miRNAs sa yo pwovoke varyasyon nan ECAR (done yo pa montre). Konfòm ak sa a, nivo ekspresyon mRNA nan mitokondriyo yo-.

Jèn sib ki gen rapò CPT1A, PGC1 ak faktè transkripsyon mitokondriyo A (TFAM), yo te redwi a mwatye nan selil trete ak miR -150 imite an konparezon ak miRNA imite selil NC-trete (figi 4E). Etid yo te itilize menm apwòch eksperimantal ak miR-495-3p bay rezilta menm jan an (figi 4B, D, F). Sepandan, mas mitokondriyo, ki detèmine pa nimewo kopi mtDNA a ak tach mitokondriyo ak MitoTrackerTM green FM, pa te siyifikativman modulation pa miRNA-150 ak miRNA- 495 tou de nan kondisyon fondamantal ak anba tretman TGF-. Yo te obsève yon tandans diminye nan paramèt sa a fondamantalman (figi siplemantè 2A, B, C). An jeneral, done sa yo sipòte ke miR-150 ak miR-495 ankouraje a

aksyon pro-fibrotik nan selil epitelyal tubulaires atravè andikap fonksyon mitokondriyo.

MiR-150 ak miR-495 pa chanje potansyèl transmanbràn mitokondriyo (ΔѰm) ak radikal mitokondriyo superoksid.

Fig. 3. MiR-150 ak miR-495 amelyore repons pro-fibrotik depandan TGF- 1-nan moun.renselil epitelyal tubulaires. (A, B) RT-PCR analiz miR{{0}}p (A) ak miR-495-3p (B) ekspresyon nan selil HKC-8 trete ak 1{{24 }} ng/ml TGF- 1 pou tan ki endike yo. (C, D) nivo mRNA nan aktin nan misk alfa-lis (-SMA), kolagen tip alfa 1-1 (Col1 1), fibronectin (FN) ki soti nan selil transfekte ak miR-NC ak miR miR. -150-5p (C) oswa miR-495-3p (D) yo te detèmine pa qRT-PCR lè l sèvi avèk Sybr green. Selil yo te trete ak TGF- 1 (10 ng/ml) apre miRNA twòp ekspresyon kote sa endike (gade tou seksyon metòd). (E, F) Immunoblots ki dekri nivo CPT1A ak -SMA nivo pwoteyin nan selil transfekte ak miR-NC ak imite miR-150-5p (E) oswa miR{{20}}p (F) pou pwen tan ki endike yo. GAPDH te itilize pou rezon nòmalizasyon. Grafik ba (panèl adwat yo) reprezante mwayen ekspresyon chanjman pliye ± sem ki soti nan 3 eksperyans endepandan. *P <{{30}}.05, **p=""><0.01, ***p=""><0.001 konpare="" ak="" kondisyon="" kontwòl="" korespondan="" yo;="" #p=""><0.05, ##p=""><0.01, ###p=""><0.001 konpare="" ak="" selil="" trete="" ak="" mir-nc="" ak="" menm="" kondisyon="" eksperimantal="">

Fig. 4. MiR-150 ak miR-495 amelyore TGF 1-pwovoke represyon FAO nan selil HKC-8 yo. (A, B) To konsomasyon oksijèn (OCR) nan selil HKC-8 transfekte ak

40 nM miR-NC ak imite miR-150-5p (A) oswa miR-495-3p (B) epi ekspoze a 10 ng/ml TGF{{5} } apre ekspresyon miRNA (gade tou seksyon metòd). Grafik ba (panèl adwat yo) montre pousantaj OCR ki asosye ak kapasite fondamantal, pwoton-fuit, ATP ki lye, maksimòm ak rezèv kapasite ak eta respiratwa ki pa mitokondriyo. Done yo reprezante apre nòmalizasyon pa kantite pwoteyin. (C, E) Nivo ATP nan selil HKC-8 transfekte ak miR-NC ak imite miR-150-5p (C) oswa miR-495-3p (E). (D, F) nivo mRNA CPT1A, PGC1A ak TFAM nan selil HKC-8 transfekte ak miR-NC ak miR-150-5p (D) oswa miR-495-3p (F) yo te detèmine pa qRT-PCR lè l sèvi avèk Sybr green. Grafik ba yo montre mwayèn ± sem nan 4 eksperyans endepandan. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" konpare="" ak="" kondisyon="" kontwòl="" korespondan="" yo;="" #p=""><0.05, ##p=""><0.01, ###p=""><0.001 konpare="" ak="" selil="" trete="" ak="" mir-nc="" ak="" menm="" kondisyon="" eksperimantal="">

pwodiksyon anion. Potansyèl manbràn mitokondriyo (ΔΨm) ki te pwodwi pa ponp proton (Konplèks I, III, ak IV) se yon eleman esansyèl nan pwosesis depo enèji pandan fosforilasyon oksidatif. Ogmantasyon ΔѰm ka mennen nan perturbation redox mitokondriyo, pandan y ap diminisyon li lakòz yon rediksyon nan pwodiksyon ATP, konpwomèt viabilite selil [254]. Anion radikal superoksid (O2•−) se yon radikal gratis ki ka pwodwi nan mitokondri yo kòm yon konsekans flit elèktron ki ka rive nan plizyè etap nan ETC la. Jenerasyon O2•− nan matris mitokondriyo a tou depann anpil de NADH/NAD plis ak rapò CoQH2/CoQ ak konsantrasyon lokal O2 [255]. Pwodiksyon twòp li ka mennen nan pèt mitokondriyo redox omeyostaz atravè diferan mekanis, yon kondisyon ki te gen rapò ak anpil eta patolojik ki gen ladan AKI ak CKD [201]. ΔѰm te egzamine ak lank TMRM ak pwodiksyon anion radikal superoxide ak lank MitoSOX. Premyèman, nou valide tès sa yo pa tretman selil ak FCCP ak CCCP kòm kontwòl negatif, pou TMRM ak MitoSOX respektivman, ak Oligomycin ak Antimycin A kòm kontwòl pozitif, pou TMRM ak MitoSOX respektivman, nan liy selil imen HKC {{7} }. Nan ka tès TMRM a, tretman oligomycin te pwovoke yon ogmantasyon 3-pliye nan mwayen fliyoresan TMRM la konpare ak lank kontwòl la, pandan tretman FCCP te lakòz yon diminisyon 9-pliye. Antimycin A ak CCCP te pwodwi yon ogmantasyon 35-pliye ak yon diminisyon 2-pliye, respektivman, nan tès MitoSOX (figi siplemantè 3A ak B). Pou detèmine si efè miR-150 ak miR{-495 sou metabolis mitokondriyo te deklanche chanjman nan paramèt sa yo, selil HKC-8 yo te transfekte ak yon miR-150-5p oswa miR{{17} }p imite oswa miR-NC ki koresponn lan. Pa gen okenn diferans estatistik siyifikatif nan quantification fliyoresan nan sond TMRM oswa MitoSOX yo te jwenn ant kondisyon tretman yo ak miRs yo chwazi ak miR-NC (figi siplemantè 3C).

Nivo MiR-150 ak miR-495 yo pa afekte nan echantiyon plasma ak ren pasyan CKD yo. Nou evalye ekspresyon miRNA yo chwazi nan plasma ak byopsi ren nan pasyan ki gen CKD. Analiz de byopsi ren ki soti nan 26 pasyan (Lopital Ramn y Cajal) pa t montre yon korelasyon ant degre fibwoz ak nivo miR-150-5p ak miR-495-3p, respektivman (figi siplemantè 4A ak B) . Nivo plasma k ap sikile nan miR-150-5p, miRNA ki gen pi gwo ekspresyon ren nan de yo, yo te detèmine tou nan yon kòwòt 100 pasyan CKD (Hospital Príncipe de Asturias). Akòz limit nan disponiblite echantiyon, nou pa t 'kapab detèmine valè serik miR- 495-3p nan kòwòt sa a. Pasyan sa yo te deja divize an de sougwoup ki baze sou evolisyon fonksyon ren yo sou yon peryòd 24 mwa konsa ke 50 pasyan te prezante mwens pase 10 pousan deteryorasyon fonksyon ren pandan rès yo te fè eksperyans omwen yon rediksyon 40 pousan nan ren. fonksyon. Kantifikasyon qRT-PCR nan nivo plasma miR -150-5p pa t 'montre yon tandans klè nan direksyon pou yon ekspresyon diferans nan de sougwoup pasyan yo (figi siplemantè 4C).

4. Diskisyon

Dekouvèt miRNAs kòm regilatè kle nan pwosesis fizyopatoloji te ankouraje rechèch sou itilizasyon yo kòm ajan terapetik nan prèske chak anviwònman klinik, ki gen ladan maladi ren [31]. Fibwoz ren se yon rezilta trè répandus nan maladi ren kwonik (CKD) ak endepandans etyoloji a, ak prezans li se yon prediktè klè nan evolisyon. Pakonsekan, yo te konsakre yon efò enpòtan nan idantifye miRNA ki lye ak fibwoz ren [32,33]. Nan etid sa a, nou konsantre sou wòl de pli zan pli enpòtan nan deranje metabolik nanrendomajepi nou te idantifye de miRNA, miR-150 ak miR-495, ki te deja aktè enkoni nan sèn nan. Anplis, nou te jwenn ke yo egzèse yon efè pwofon sou bioenergetics selilè pa sinèrjize ak TGF- ak modifye wout metabolik kle ki gen rapò ak gra.asid oksidasyon.

Blesi epitelyal ko-egziste ak yon defo nan graasidoksidasyon, sous prensipal enèji pou selil epitelyal tubulaires [5]. Li mennen nan dedifferentiasyon yo pwovoke defisyans fonksyon tubulèr, deklanche arete sik selilè, ak ankouraje liberasyon an nan sitokin pro-fibrotik kritik ki ka kontribye nan aktive myofibroblasts entèrstisyal [5,34]. MiR-150 ak miR-495 ekspresyon yo te ogmante nan souritfibrotikrenak nanimen renselil epitelyal (HKC-8) apre tretman ak TGF-, ki sijere patisipasyon yo nan repons pro-fibrotik la. Enterè, analiz in silico nan rejyon jenomik yo kode pou miR-150 ak miR{-495 pèmèt idantifikasyon sit obligatwa pou faktè transkripsyon ki gen rapò ak siyal TGF- ak lòt chemen ki enplike nan domaj UUO (rechèch nan genecards.org pou miR-150 ak miR-495). Tou de miR-150 ak miR-495 diminye nivo ekspresyon jèn sib yo CPT1A, PGC1, ak TFAM, ki te reflete nan yon diminye kontni OCR ak ATP fondamantal, ki lye ak ATP ak maksimòm apre tretman ak miR-150 ak miR-495. Efè sa a te akonpaye pa yon repons amelyore TGF-pro-fibrotic nan selil HKC-8. Nou te jwenn ke TGF- diminye mas mitokondriyo ak ADN mitokondriyo. Apre tretman ak miRNA-150 ak miRNA-495, yo te obsève yon tandans diminisyon nan kontni mitokondriyo nan kondisyon fondamantal, menmsi yo pa rive nan siyifikasyon. Sa a montre yon mekanis endepandan de wòl PGC1 oswa TFAM ak gen plis chans ki gen rapò ak yon efè metabolik ki lye ak downregulation CPT1A kòm varyab prensipal ki afekte nan prezans miRNA yo. Chanjman nan byoenergetik mitokondriyo yo se kritik nan maladi ren [35]. Nan kenbe, nou te dènyèman montre ke CPT1A se yon anzim kritik pou prezèvasyon yon lòj tubulaires ki an sante, paske twòp ekspresyon li pwoteje kont fibwoz ren [6]. Sepandan, PGC1

ak jèn TFAM yo tou pre relasyon ak fonksyon mitokondriyo ak byogenesis [36]. Ekspresyon ki gen pwoblèm nan jèn sa yo asosye ak CKD, pandan y ap prezèvasyon li kontribye nan entegrite ren jan yo montre nan plizyè modèl domaj. Kidonk, Han et al. te jwenn ke genyen-of-fonksyon tubulaires PGC1 pwoteje sourit kont fibwoz ren Notch-induit ak ranvèse malfonksyònman mitokondriyo ki asosye ak modèl sa a [37]. Menm jan an tou, re-ekspresyon nan Tfam nan selil tubul anpeche Notch-induit metabolik ak pro-fibrotic rprogramasyon [38]. Kidonk, li posib ke ekspresyon mRNA diminye nan jèn mitokondriyo sa yo, pwovoke pa miR-150 ak miR{-495, kontribye tou nan yon fenotip epitelyal domaje.

N bès nou te obsève nan OCR ki asosye ak domaj selil epitelyal yo an akò ak rapò anvan yo, ki gen ladan etid nou yo ak miR-33 ak miR-9 [15,16]. Lè nou konsidere ke Kang et al. te rapòte tou ke oksidasyon glikoz te pi ba nan modèl fibwoz ren moun ak sourit [5], done nou yo montre ke diminisyon nan microRNA-medyatè nan OCR pa pwovoke per se varyasyon nan ECAR, sijere ke fèmen glikolitik la nan kondisyon fibroz gen plis chans depann de. sou stimuli fibrotik olye ke sou fosforilasyon oksidatif ki gen pwoblèm. Plizyè miRNA yo te idantifye kòm pi gwo modifye nan fonksyon mitokondriyo, ki gen ladan miRNA a arketip pro-fibrotic, miR -21 [39]. Sipresyon ekspresyon PPAR pa miR-21 yo te envoke kòm yon mekanis pa ki miRNA sa a egzèse aksyon pro-fibrotic li. Anplis anpeche FAO, jèn yo sib pou miR-21 endike ke miRNA sa a silans yon pakèt pwosesis mitokondriyo. Lòt egzanp gen ladan mir-9 [16], miR-33 [15] ak miR-30e [40,41]. Sepandan, nan konesans nou, gen kèk rapò ki adrese règleman microRNA nan jèn CPT1A, PGC1 ak TFAM nan yon kontèks fibwoz ren. Enteresan, microRNA-214 ki ankouraje tranzisyon epithelial-a-mesenchymal (EMT) pandan fibwoz ren, vize dirèkteman TFAM nan selil kansè nan kolon [42]. Yo te rapòte represyon sa a tou pou miR-590-3p [43]. Fanmi miR-29, youn nan regilatè ki pi byen karakterize nan pwodiksyon ECM nan fibwoz ògàn, vize dirèkteman PGC1 , prezève omeyostazi kadyak. Kidonk, silans patolojik miR-29 mennen nan regilasyon PGC1, jenere chanjman pwofon nan byogenesis mitokondriyo ki kontribye nan maladi kadyak [44]. Pandan ke done nou yo klèman sipòte yon wòl pou miR-150 ak miR{-495 nan fibwoz ren, plis etid in vivo ta nesesè pou konfime kont sa a.

Pou evalye entegrite chèn transpò elèktron mitokondriyo (ETC), nou konsantre sou de karakteristik: ΔѰm ak pwodiksyon anion radikal superoksid. Nou te obsève ke miR-150 ak miR-495 pa t chanje paramèt sa yo. Yon ΔѰm ki estab te mande pou viabilite selil yo ak mayitid li yo varye pami kalite selil [45]. Antretyen li se entèdi amann kòm yon ogmantasyon nan ΔѰm ka mennen nan perturbation nan eta a redox, pandan y ap diminisyon li lakòz yon rediksyon nan pwodiksyon ATP epi li ka deklanche apoptoz. Nan etid nou an, chanjman nan ΔѰm yo te quantifye ak lank fliyoresan kationik TMRM, pandan y ap mitokondriyo superoksid radikal pwodiksyon anion mezire ak lank fluorojenik MitoSOX Wouj la. Travay zouti sa yo nan kondisyon ki afekte fonksyon ren yo pa evidan nan literati a. Men, an fas a absans chanjman nan etid nou an, nou pa t pouswiv apwofondi lòt estrateji pou evalye ormèsis redox, e pakonsekan, nou pa ka eskli ke miRNA sa yo ka chanje ton nukleofil oswa fonksyon plizyè eleman nan. ETC a.

Nan anviwònman klinik la, miR-150 te sijere kòm yon miRNA pro-fibrotic nan nefrit lupus pa modulation TGF-siyal [46,47], pandan ke miR-495 te asosye ak yon wòl pwoteksyon nan dyabetik kadyak. fibwoz [48]. Pou chèche konnen patisipasyon potansyèl yo nan CKD, nou evalye nivo serom ak parenchymal yo nan de gwoup pasyan diferan. Nivo serom nan miRNA yo te pwopoze kòm biomake potansyèl pou pwogresyon CKD [49,50]. Kidonk, nivo miR-21 ki sikile nan serik ak abondans miR-29c nan exosomes urin yo gen rapò ak fibwoz ren, sa ki sijere wòl potansyèl yo kòm byomarkè [51, 52]. Sepandan, nivo miR-150 ak miR-495 pa t diferan ni nan echantiyon plasma oswa ren ki soti nan pasyan CKD. Diferan modèl ekspresyon microRNA pami espès ak kalite selil yo ka eksplike absans diferans sa a nan nivo miR-150 ak miR{-495 nan tisi fibroz [53]. Pandan ke nan kèk ka yo rapòte nivo plasma microRNA yo ka reflete sa yo ki nan tisi ren yo, yo ta dwe konsidere lòt mekanis ki gen rapò ak sekresyon miRNA nan sistèm sikilasyon an oswa yon kontrekilib sekresyon sa a pa lòt ògàn yo ta dwe konsidere tou [13,54].

An jeneral, rezilta nou yo sipòte sa miR-150 ak miR{-495 ankourajerenepitelyalselildediferansasyon gen plis chans atravè privasyon enèji, transmèt pa represyon nan CPT1A, PGC1, ak TFAM fonksyon mitokondriyo ki gen rapò ak jèn. Yo menm tou yo prete yon baz pou pouswiv wòl yo nan vivo, osi byen ke itilite potansyèl yo kòm byomarkè dyagnostik oswa pronostik.

Kontribisyon otè

SL vin ansent ak dirije rechèch. VM fèt, fè, ak analize majorite eksperyans yo. RR te ede ak analiz microRNA etalaj la. DRP ak LGB te fè etid nan de kowòt diferan nan pasyan CKD. Tout otè te ede ak diskisyon rezilta yo ak SL ak VM te ekri maniskri a.

Deklarasyon enterè konpetisyon

Otè yo pa gen okenn konfli enterè.

Rekonesans

Travay sa a te sipòte pa sibvansyon Ministè Syans Panyòl SAF2015-66107-R ak PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/01513 (DRP) ki te ko-finanse pa Ewopeyen an. Fon Devlopman Rejyonal, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 ak RD16/0009/0016 (SL ak DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Comunidad de Madrid "NOVELREN" B2017/BMD3751 (SL ak DRP), yon sibvansyon nan èd nan men Sosyete Panyòl Nefroloji (Fundacin Senefro 2017) bay SL ak Fundacion.Ren"Iigo Alvarez de Toledo" (SL) tout soti nan Espay. CBMSO resevwa sipò enstitisyonèl nan men Fundacion "Ramn Areces". VM te sipòte pa yon bous predoktoral nan Pwogram FPI (BES- 2013-065986) ki soti nan Ministè Syans Panyòl la.