Asanble transcriptom ak dekouvèt jèn nan tij charnèl Cistanche Deserticola-Ⅱ

Klasifikasyon Fonksyonèl Tout Transkripsyon Eksprime ki baze sou Ontoloji Gene ak baz done KEGG

Gene Ontology (GO) te jwenn anotasyon UniProt ak dosye asosyasyon idantite yo. An total, 20,907 relve nòt, kontablite pou 32.69% nan total sekans eksprime yo, yo te asiyen nan 1,745 tèm fonksyonèl. Nan total fonksyon GO tèm, plasman nan pwosesis byolojik la te fè majorite (1,116, 63.95%) ki te swiv pa eleman selilè (329, 18.85%) ak fonksyon molekilè (300, 17.20%). Fonksyon transkripsyon eksprime yo te bay yo te kouvri yon pakèt kategori GO, epi 10 pi gwo tèm GO ki gen transkripsyon ki pi annote yo te endike nan Tablo 3. Nou bay tout distribisyon transkripsyon eksprime yo nan twa kategori Ontoloji Gene (Fonksyon Molekilè, Konpozan Selilè, ak pwosesis byolojik) nan dosye siplemantè a (S3 Dataset). Tèm GO ki gen rapò ak fonksyon obligatwa ak aktivite transferaz yo te reprezante sitou nan kategori fonksyon molekilè. Konsènan fonksyon yo obligatwa, kasyon obligatwa (4,394 transkripsyon) reprezante ki pi abondan, ki te swiv pa obligatwa nukleotid / nukleozid (3,404 transkripsyon an mwayèn) ak pwoteyin obligatwa (2,422 transkripsyon). Pandan ke yo nan gwoup aktivite transferaz la, pi plis yo se moun ki gen transfere gwoup ki gen fosfò (2,256 relve nòt, 65.77%). Pami kategori eleman selilè yo, relve nòt yo te plis lokalize andedan selilè (10,581 relve nòt an mwayèn), pandan y ap nan kategori pwosesis byolojik la, relve nòt yo te plis patisipe nan pwosesis metabolik biopolymer (6,683 relve nòt an mwayèn), ki te swiv pa règleman sou pwosesis selilè (4,841 relve nòt). ), ekspresyon jèn (4,678 transkripsyon) ak transpò (3,512 transkripsyon).

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU PREVENTION MALADI ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Pou m 'jèn ki enplike nan byosentèz la nan lignin ak PhG, yo te fouye 21,358 sekans pwoteyin potansyèl ki pa redondants kont sekans jèn nan 13 òganis plant nan baz done a KEGG, epi yo te asiyen nan 275 chemen KEGG ak omwen 5 frape. 10 pi gwo chemen ki gen plis sekans ki aliye yo nan Tablo 4. Pifò nan chemen yo te enplike nan pwosesis metabolik prensipal yo, tankou metabolis asid amine oswa pwoteyin (ko01230, ko04141, ak ko04120), metabolis idrat kabòn (ko01200 ak ko00500), oswa nukleotid. metabolis nukleozid (ko03018, ko00230, ak ko00240). Anplis de sa, gen 27 wout segondè ki gen rapò ak metabolis (figi 2), tankou biosentèz zo rèl tè terpenoid, biosentèz fenilpropanoid, biosentèz karotenoid, biosentèz alkaloid izoquinolin, ak byosentèz tropane, piperidin ak piridin alkaloid. Rezilta sa yo bay plis endikasyon ke pwosesis metabolik aktif yo te sou pye nan laC. deserticolatisi tij. Tout transkripsyon eksprime ki asosye ak chemen KEGG yo te nan lis dosye siplemantè a (S4 Dataset). Malgre ke gen kèk chemen siyifikativman chanje ant C. deserticola ak lòt plant, tankou diri (S5 Dataset), objektif prensipal nou an nan etid sa a se revele pwofil transcriptom antye nan tij C. deserticola ak imajine chemen ki gen rapò ak byosentèz PhGs. ki ta ka itil pou gide kiltivasyon an.

Jèn kandida ki kode anzim ki enplike nan byosentèz lignin

Lignin se dezyèm pi abondan natirèl polymère terrestres nan wayòm plant la, ki konpoze jiska yon tyè nan materyèl yo jwenn nan mi selil plant yo. Kòm yon eleman enpòtan nan mi selil yo, lignin ede transpòte dlo, bay sipò mekanik ak entegrite estriktirèl, ak defann kont patojèn ak èbivò. Wòl lignin sa yo gen anpil valè nan sipòte kwasans erektif anba tè C. deserticola nan dezè a. Nan etid sa a, nou te prezante foto konplè sou chemen biosentèz lignin nan C. deserticola (figi 3), kote monomère lignin yo biosynthesized soti nan fenilalanin atravè yon seri reyaksyon anzimatik, ki gen ladan idroksilation, methylation, rediksyon, ak pwosesis polimerizasyon oksidatif. Lignin anzim ki gen rapò ak biosentèz yo te detekte pou twa fòm sitou sentèz nan tisi vaskilè (p-hydroxyl-phenyl (H), guayacyl (G) ak syringyl (S) lignin) ak 5- hydroxyl-guayacyl lignin ki te sèlman idantifye nan COMT (asid kafeyik 3- O-methyltransferase, EC 2.1.1.68) plant ki ensufizant (tankou knock-down).

Phenylalanine amonyak-lyase (PAL, EC 4.3.1.24) se premye anzim kle nan chemen biosentèz lignin (figi 3) ki transfòme fenilalanin nan asid cinnamic pa deaminasyon ki pa oksidatif. Yon total de 6,297 lekti PAL yo te sekans ak 7 transkripsyon PAL yo te rasanble nan C. deserticola (Tablo 5). Nan konparezon sekans resanblans, nou te jwenn ke 4 nan yo (comp28550_c1_seq1/2/3/5) te gen plis pase 95% resanblans ak sekans mRNA li te ye nan C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), pandan ke comp28550_c1_seq4 ak comp25940_c0_seq1 te gen 77% ak 82% resanblans, respektivman. Prediksyon ORF te revele 5 transkripsyon yo te gen potansyèl pou kode pwoteyin epi yo te pote ak domèn aromat asid amine lyase (PF00221.14). Pami yo, se sèlman transkripsyon comp28550_c1_seq4 ki kapab kode yon sekans pwoteyin konplè ki gen 718 résidus asid amine. Yo te rapòte ke PAL te kode pa yon ti fanmi miltijèn nan pifò espès plant, tankou 4 nan Arabidopsis thaliana, 5 nan Populus trichocarpa, 3 nan Scutellaria baicalensis, ak 7 Cucumis sativus, elatriye. Analiz filojenetik nou an sijere ke te gen 4. Jèn PAL-kode nan C.

deserticola epi nou te rele yo CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 ak CdPAL4, respektivman (S2 Fig). 4-coumarate-CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12) ak trans-cinnamate 4-monooxygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) se de anzim ki responsab pou transfòme asid cinnamic nan dicoumarol-CoA nan de ranvèse. lòd. Yo tou nan zo rèl do, ak valè ekspresyon FPKM yo se 39.57 ak 51.93, respektivman.

Kat kalite lignin yo te biosynthesized pa chemen diferan ki te kontwole pa twa anzim kle, cinnamoyl-CoA reduktaz (CCR, EC 1.2.1.44), shikimate o-hydroxycinnamoyltransferase (HCT, EC 2.3.1.133), ak ferulate {{1{{1} {56}}}}idwoksilaz (F5H, EC 1.14.-.-). Yo te rapòte CCR kòm yon pwen kontwòl nan chemen lignin [50, 51] ki katalize X-CoA (X ki gen ladan dicoumarol, kafeyil, feruloyl, 5-hydroxyl-feruloyl, ak sinapoyl) nan Y-aldehyde (Y ki gen ladan p. -cougar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroxyl-coniferyl, ak menen), pandan ke HCT katalize p-coumaroyl-CoA nan p-coumaroyl asid shikimic / p-coumaroyl asid kinik. De anzim yo, menm jan ak yon switch, reglemante biosentèz P-hydroxyl-phenyl lignins oswa twa lòt kalite lignins. F5H se te yon lòt switch branch ki reglemante syringyl lignin ak 5-hydroxyl-guayacyl lignin. Lòt anzim enpòtan ki gen ladan asid kafeyik 3-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104), ak cinnamil-alkòl dehydrogenase (CAD, EC 1.1.1.1955). ) yo te detekte tou eksprime. Enfòmasyon detaye sou ekspresyon ki nan lis nan Tablo 6. Jèn anzim sa yo idantifye nan etid sa a pral bay yon resous valab pou etid jenomik fonksyonèl nan plant medsin enpòtan sa a. 10 jèn ki gen rapò ak chemen biosentèz lignin nan Tablo 6 yo te chwazi pou verifikasyon RT-qPCR pou konfime rezilta RNAseq nou an (Fig 4), ak gwo korelasyon yo (koyefisyan korelasyon Pearson: 0.90343) endike gwo presizyon ak repwodiksyon analiz transcriptom nou an. S1 Dataset bay lis sekans primè yo itilize nan analiz sa a.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMÉLIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Jèn kandida ki kode anzim ki enplike nan byosentèz PhG yo

Phenylethanoid glycosides (PhGs) yo konnen yo dwe engredyan prensipal yo aktif nan C. deserticola ak aktivite nan amelyore puisans seksyèl, scavenging radikal gratis, ak anti-aje. Twa konpozan chimik PhG yo se asid òganik, sakarid, ak phenylethanol aglicon (figi 3). Asid òganik ki gen ladan asid kafeyik, asid ferulik, ak asid koumalik yo se pwodwi nan chemen biosentèz fenilpropanoid la. Konpozan sakarid ki gen ladan glikoz ak ramnoz yo se pwodwi nan metabolis idrat kabòn, tankou metabolis lanmidon ak sikwoz, sik amine ak metabolis sik nukleotid, fruktoz ak metabolis mannoz, elatriye Sepandan, chemen an biosentèz nan pati feniletanol pa klè ankò. Isit la, nou pwopoze de posib phenylethanol biosentèz chemen ki baze sou done sekans nou an. Youn nan se asid kafeyik rapòte oswa chemen asid ferulik, ke yo rele tou chemen asid cinnamic ki sanble ak chemen zo rèl do lignin biosentèz la. Yon lòt baze sou wout metabolis phenylalanine (figi 3), nan ki phenylalanine nan phenylethanol te reyalize pa yon 'chemen Enrlich' li te ye ki te premye jwenn nan ledven yon syèk de sa ak valide nan flè petunia, tomat, ak leve. Kat jèn anzim ki kode aspartate / tirozin aminotransferaz, histidine-fosfat aminotransferaz, ak prensipal-amine oksidaz ki responsab pou konvèsyon fenilalanin nan feniletanòl yo te detekte eksprime nan tij C. deserticola. Pwodui phenyl etanòl ka plis soksid pa monooxygenase oswa methylated pa methyltransferase nan dérivés li yo (phenyl etanòl aglycon) ki patisipe nan byosentèz PhG. An rezime, yo te pwopoze de wout byosentèz phenylethanol aglikon pouC. deserticolamen toujou bezwen plis etid nan plis.

Diskisyon

Nan dènye ane yo, genomic plant te devlope rapidman ak aplikasyon an nan teknoloji sekans pwochen jenerasyon, pandan y ap kèk rechèch yo te konsantre sou jenomik nan plant medsin dezè. Li nesesè ijan pou fè rechèch jenomik oswa transkriptomik pou konprann adaptasyon li nan anviwònman sechrès ak salinite ak chemen biosentèz pi gwo konpozan bioaktif yo. Dekouvèt transcriptome de novo pou kèk plant medikal,

tankou Panax ginseng, Ginkgo biloba, ak Glycyrrhiza uralensis yo te premye eksplwate lè l sèvi avèk platfòm Roche 454 pou longè lekti long li yo. Akòz kapasite asanble efikas ak lekti kout, espesyalman lekti nan fen pè ki avantaje, sekans ak asanblaj transcriptom ki baze sou Illumina yo te itilize anpil tou pou òganis modèl ak ki pa modèl. Nan etid la prezan, nou te pwodwi apeprè 8G nan 101 bp pè-fen lekti ak pwodwi pi long sekans unigene ak longè mwayèn 725 bp. Gwo-echèl tij-espesifik done transcriptome ta ka bay done referans itil epi yo dwe itilize nan min nan metabolis segondè nan eleman byoaktif nan C. deserticola. Gen 81.62% nan total lekti anvan tout koreksyon yo te pase filtè bon jan kalite sevè (ki gen ladan rediksyon adaptè ak bon jan kalite lekti jete) anvan asanble, sijere kalite siperyè done sekans nou yo, ak 82.08% nan bon jan kalite lekti yo te itil pou asanble. Lòt lekti ki echwe pou yo itilize pou asanble ka soti nan erè sekans, paramèt asanble et al. Lekti bon jan kalite ki pa itilize yo te rete itil nan amelyore asanble de novo ansanm ak lekti ki pi long nan yon lòt platfòm (tankou Roche 454) alavni.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMÉLIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Yon gwo kantite relve nòt reyini (30,098) te montre gwo resanblans sekans ak jèn li te ye nan baz done piblik, ki sijere ke done Illumina ki baze sou pè-fen nou an kouvri yon fraksyon sibstansyèl nan transkripsyon C. deserticola. Transkripsyon ki pa gen okenn frape BLAST yo ka akòz rejyon 3' oswa 5' ki pa tradui, RNA ki pa kode, oswa nouvo sekans jèn C. deserticola. Transkripsyon eksprime yo te anote nan yon pakèt kategori GO ak chemen KEGG (Tablo 3 ak 4), kote anpil transkripsyon yo te asiyen nan chemen segondè ki gen rapò ak metabolis. Kòm nou konnen, phenylpropanoid ka fonksyone kòm yon konpoze antimikwòb enduzib ak gwo salye pou yon vi anba tè [1], epi tou li aji kòm yon molekil siyal nan entèraksyon plant-mikwòb san konte itilite medsin li yo [68, 69]. Terpenoid yo itilize pou byosentèz konpozan bioaktif (tankou 6- deoxycatalpol) [70]. Nou te jwenn jèn ki enplike nan phenylpropanoid ak tèrpenoid zo rèl do biosentèz chemen yo te trè abondan nan C. deserticola. Sa ki pi enpòtan, dekouvèt chemen ki byen reprezante nan biosentèz lignin (figi 3) endike pwosesis metabolik aktif lignin nan tij C. deserticola la. Tout jèn anzim li te ye ki enplike nan byosentèz lignin (figi 3) te detekte eksprime, ak kat anzim kle ki gen ladan PAL, CCR, HCT, ak F5H te gen pi ba abondans ekspresyon (FPKM 26.47, 3.89, 3.4, ak 3.83, respektivman) konpare ak lòt jèn anzim (Tablo 6). Si wi ou non chanjman nan ekspresyon nan twa jèn sa yo ta ka enfliyanse pwodiksyon lignin nan C. deserticola merite pou plis etid. PAL se yon anzim kle nan biosentèz lignin epi li patisipe tou nan biosentèz fenilpropanoid, resveratrol, flavonoid ak koumarin [71-74]. Nou te detekte kat jèn PAL diferan nan genòm C. deserticola (S2 Fig) ki te kode ak PAL sa a te kode pa yon ti fanmi multigene [39, 43, 45-49] ak plis pwouve ke li ka jwe wòl enpòtan nan metabolik kabòn flux. .

PhG se engredyan prensipal aktif nan C. deserticola. Jèn ki enplike nan byosentèz phenylethanol yo enpòtan pou bon jan kalite a nan C. deserticola. Nou dedwi de wout byosentèz diferan nan phenyl etanòl ak 17 jèn anzim ki enplike nan byosentèz PhG nan tij C. deserticola. Pwosesis posib pòs-kafeik / ferulik asid (figi 3) yo te tou dedwi pou premye fwa ki baze sou yon fòmil estriktirèl nan entèmedyè ak pwopriyete katalitik nan anzim korespondan, nan ki asid la kafeik / ferulic ta dwe premye soksid nan phenylpyruvate derive; Lè sa a, gwoup karboksil la te prive pa decarboxylases; finalman, gwoup aldehyde te konvèti tounen nan gwoup alkòl pa dehydrogenase. Sa a se premye aplikasyon teknoloji sekans Illumina pou mennen ankèt sou tout transcriptom C. deserticola epi rasanble lekti RNA-seq san yon genòm referans. Etid sa a pral bay resous itil ak sekans jèn pou jenomik fonksyonèl ak rechèch proteomik sou C. deserticola alavni.

Konklizyon

Nan etid sa a, nou profile transcriptome nan tij C. deserticola ki baze sou done sekans segondè-debi, idantifye jèn ki enplike nan chemen biosentèz nan lignin, epi tou li dedwi chemen an potansyèl byosentèz PhGs la pou premye fwa, ki pral sètènman akselere konpreyansyon an. nan pwosesis yo fizyolojik Limit ak gwo valè medsin nan nivo molekilè. Jiska kounye a, sa a se premye tantativ pou rasanble transcriptom antye tij C. deserticola a epi detekte chemen biosentèz konpozan medsin yo lè l sèvi avèk seri done sekans ki baze sou Illumina. Etid nou an ka ankouraje devlopman nan medikaman natirèl ak seleksyon an nan cultivar ki gen karakteristik medsin.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMÉLIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%