Tubuloside B ki soti nan Salsa Cistanche sove selil newòn PC12 yo soti nan 1-Methyl-4-phenylpyridinium Ion-pwovoke apoptoz ak estrès oksidatif.

Entwodiksyon

Patolojikman, maladi Parkinson la (PD) detanzantan karakterize pa yon pèt newòn katekolaminèjik, patikilyèman newòn dopaminèjik nan substantia nigra pars compacta (SNc), ak prezans nan karakteristik intraneurona| enklizyon yo rele kò Lewy nan rejyon sèvo ki afekte yo. Malgre yon varyete de faktè ki te enplike nan patojèn nan PD, mekanis ki enplike nan inisyasyon ak pwogresyon nan PD rete ensèten, Menm si kòz la nan PD rete reponn, plizyè liy prèv fòtman sijere patisipasyon nan estrès oksidatif, finalman mennen. nan lanmò newòn oswa apoptoz pa jenerasyon an twòp nan radikal gratis. Lefèt ke sistèm dopaminergic nigral la ka pwodwi nivo segondè nan radikal gratis epi li gen nivo relativman ba nan sistèm defans oksidatif plis sipòte ipotèz sa a. Tou de etid in vivo ak in vitro te montre neurotoksisite oksidatif estrès medyatè nan MPP ＋, yon metabolit aktif nan l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) sou newòn dopaminergic. Patisipasyon nan radikal gratis twòp pwodwi pa estrès oksidatif kòm kòz la pwoksimite nan maladi neurodegenerative tankou PD sijere yon wòl esansyèl pou antioksidan. Tubuloside B (figi l) se te youn nan konpoze phenyletha noid izole nan tij salsa Cistanche. Etid anvan yo te jwenn anpil phenylethanoids ki gen ladan tubuloside B te montre yon gwo aktivite radikal gratis.

Lè nou konsidere rezilta sa yo, nou te envestige nan etid aktyèl la efè tubu]nside B sou MPP+-pwovoke nerotoksisite nan vitro, lè l sèvi avèk liy selilè feochromocytoma nè senpatik PC12 ki te itilize avèk siksè pandan ane yo pou etidye fonksyon newòn.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU PREVENTION MALADI PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materyèl ak Metòd

Materyèl

Tubuloside B soti nan Cistanche Salsa te byen apwovizyone pa Dr Li Lei (Depatman nan pwodwi natirèl, Lekòl nan Syans famasetik, Peking University, Beijing, Lachin). Pite konpoze an te plis pase 98% pa analiz HPLC. Dulbecco's modifyed Eagle's medium (DMEM), serom chwal ak serom fetis ti towo bèf yo te achte nan men GIBCO BRL, 1-methyl~-phenylpyridi onium ion (MPP+ ), poly-L-lysine, 3-(4,{ {8}}dimethyl thiazole-2 -yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromur (MTT), propidium yodide (PI), RNase A, proteinase K, ak 2; 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) yo te achte nan men Sigma.

Kilti selilè

Selil PCI2 yo te konsève nan DMEM ki te konplete ak 10% serom cheval, 5% serom fetis ti towo bèf, 100U/ml penisilin ak 100ug/ml streptomycin. Selil yo te kiltive nan yon enkibatè imidite aere ak 95% lè ak 5% CO2 nan 37 degre. Tout eksperyans yo te fèt 24-48 èdtan apre selil yo te simen. Selil yo te regilyèman rekòlte pa trypsinization 0.25% lè selil yo pwoche bò etap subconfluent la epi yo plake nan flakon kilti 25 cm fann nan 1: 8.

Analiz de viabilite selil

Yo te detèmine viabilite selil la lè l sèvi avèk yon analiz MTT modifye jan sa dekri anvan [10], An brèf, selil PC12 yo te simen nan 96-plak byen nan yon dansite I × 104 selil pou chak pi. Kilti yo te grandi pou 48 èdtan, epi Lè sa a, yo te chanje mwayen an nan sa ki gen plizyè konsantrasyon nan burnside B oswa MPP. Apre enkubasyon pou jiska 48 èdtan ak 72 èdtan, yo te ajoute solisyon MTr (5 mg/ml nan DMEM) nan plak 96-byen yo, epi selil yo te pèmèt yo enkubate pou 4 èdtan nan 37 degre. Apre yo te retire mwayen an, kristal selil ak lank yo te idrosolubl lè yo ajoute 200μL DMSO, epi yo te mezire absòpsyon nan 570nm (540 nm kòm referans) ak yon lektè microplate modèl 550 (Bio-Rad). Yo te analize viabilite selil yo tou lè l sèvi avèk metòd esklizyon ble tripan an. Selil yo te kolekte, dousman pelleted, ak tache ak yon solisyon 0.6% nan ble tripan pou 3 lapli. Pousantaj selil ki pa gen koulè yo te evalye imedyatman nan dis jaden mikwoskòp chwazi owaza. Kòm yon dwòg pozitif, yo te itilize 100 ng／ml epidèm kwasans faktè (EGF).

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU GRATIS AKTIVITE RADICAL SCAVENGING PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Deteksyon apoptoz pa sikometri koule

Selil apoptotik yo te detekte pa sikometri koule lè l sèvi avèk yodid propidium (PI) [11]. Yon ti tan, apeprè 1 × 106 selil enkubate ak sibstans ki sou tès yo te rekòlte pa santrifujasyon epi yo te lave yon fwa ak PBS. Selil yo te fikse ak 70% etanòl pou 24 èdtan nan - 20 degre epi yo te lave yon fwa ak PBS. Lè sa a, selil yo te resuspend nan 300μL nan PBS ki gen 0.5 mg / ml RNaseA ak 0.5 mg / ml PI. Apre plis enkubasyon pou 30 minit nan fè nwa a, yo te fè sitometri koule ak yon FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Almay).

Analiz fragmentation ADN pa elektwoforèz

Nou te aplike pwotokòl Moore [12] ki izole sèlman ADN fragmenté ak eksperyans yo te nòmalize lè nou itilize yon kantite egal kilti nan chak gwoup tès. Yon ti tan, 3 × 106 newòn ki soti nan chak echantiyon trete yo te lave nan solisyon sèl balanse Hank (1000g pou 10 min), epi granules ki te fòme nan pati anba tib la te omojeneize. ak 1 ml tanpon liz (10 mM Tris nan pH 7.4. 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) pou 20 min sou glas. Apre santrifujasyon nan 11,000 g pou 20 lapli nan 4 degre, supernatant ki gen ADN fragmenté yo te retire ak dijere ak 20 mg/ml RNase A nan 37 degre pou 1 èdtan, ak 0.1 mg/ml proteinaz K nan 56 degre. pou 1 h anplis. ADN fragmenté a te ekstrè lè l sèvi avèk fenol ak klowofòm, epi yo te santrifuje nan 1O,000g pou 1 lapli nan 4 C. Yo te transfere faz akeuz la nan yon nouvo tib Eppendorf, melanje ak 2 volim etanòl frèt epi apre sa. mete a 20 degre pou omwen 1 èdtan pou presipite ADN. Apre santrifugasyon nan 15, 000g pou 20 min nan 4 degre, supernatant yo te retire, epi granules ADN yo te lave ak 80% etanòl yon fwa (15,000 g pou 15 min nan 4 degre), lè-seche, epi fonn nan 20μL. Tanpon TE nan pH 7.6. Lè sa a, tout echantiyon an te electrophoresed sou yon jèl agarose 1.5% pou 1h nan 85 V. Yo te egzamine jèl la ak foto pa yon Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Mezi fòmasyon entraselilè ROS

Yo te detekte fòmasyon peroksid intraselilè ak yon mikwoskòp lazè konfokal ak yon konpoze ki pa fliyoresan, 2"7"-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) [13], ki se de-esterifye nan selil pa esteraz andojèn nan iyonize gratis. asid, 2;7"-dichlorofluorescein. 2",7-Dichlorofluorescein kapab soksid nan fluorescent 2"7"-diklorofluorescein (DCF) pa hydroantioxidants. Selil yo te enkube ak 10 μM DCFH-DA pou 30 min nan 37 degre. Kilti yo te lave de fwa ak solisyon sèl balanse Hank a epi imajine nan menm mwayen an. Imaging te fè lè l sèvi avèk yon mikwoskòp lazè konfokal optik, DCF te eksite nan 488 nm ak filtè emisyon an te yon filtè baryè 510nm, Pou bay yon konparezon valab, yo te itilize menm paramèt akizisyon yo pou tout obsèvasyon yo. Pi bon pozisyon vètikal la nan mitan selil yo te fikse, ak Lè sa a, jaden an te rapidman analize. Paske lumières nan longèdonn eksitasyon 488 nm te lakòz fliyoresans ogmante akòz oksidasyon lank sa a, chak jaden te ekspoze a Iight pou menm tan an. Yo te itilize valè debaz ki soti nan selil ki pa ankouraje yo kòm valè kontwòl pou konpare ak MPP＋ selil trete an prezans oswa absanstwouble B. Apre optik, entansite fliyoresans relatif mwayèn nan 15-20 kò selil newòn pou chak jaden mikwoskòp yo te mezire nan kat kilti separe pou chak kondisyon tretman.

Analiz estatistik

Tout valè yo jwenn yo te eksprime kòm vle di ± SD. Siyifikasyon estatistik diferans ant gwoup yo te detèmine pa tès t Elèv la; Valè p kalkile ki mwens pase 0.05 yo te konsidere estatistik enpòtan.

Rezilta yo

Jan yo montre nan Fig. 2, MPP + te pwodwi yon diminisyon dòz-depandan nan viabilite nan selil PCI2 yo. Kontrèman, EGF, yon faktè neurotrophic byen li te ye, te pwodwi pwoteksyon enpòtan nan viabilite selil nan 100ng/mL MPP＋-pwovoke efè sitotoksik yo te tou diminye nan prezans tubuloside B (5, 10, 50 oswa 100 ug-ml{{12} }), byenke ak mwens puisans pase referans la

dwòg (figi．3)． Tubuloside B nan konsantrasyon sa yo te montre efè cytoprotective nan yon fason ki depann de dòz la epi konpoze an pou kont li pa t lakòz okenn sitotoksisite aparan (done yo pa montre). Elektwoforèz jèl nan ekstrè ADN ki soti nan selil PCI 2 trete ak 200 µM MPP+ pou 48 èdtan te montre yon nechèl ADN. yon karakteristik klasik nan apoptoz, tubuloside B, nan dòz 10 ak 100μ g·ml-1edui fòmasyon nan ADNAlasder (figi．4) ． Fig．5 montre istogram tipik nan analiz sikometrik koule nan lanmò selil apoptotik pwovoke pa MPP＋ nan selil PC12 nan prezans oswa absans tubuloside B．Kantitasyon nan pwofil la sik selil ak PI revele kantite selil ki gen karakteristik subdiploid (rejyon M1) endike fragmentasyon ADN apoptotik. Nan selil ki pa trete yo, fraksyon subdiploid apoptotik la te minim jiska 5．94％nan total 10000 selil yo (figi．5 A)．. Apre 48 èdtan ekspoze a MPP＋, pousantaj apoptoz ogmante a 43．02;j;(Fig．5 B)． Lè yo ajoute nan kilti selil la, tubuloside Banpeche apoptoz +-pwovoke MPPnan yon fason ki depann de dòz la. Nan yon konsantrasyon 10 ug·ml-1pwoteksyon tubuloside B pa t 'estatistik enpòtan, men nan 50 ak 1 00ug·ml{-1, yon 45 ％e 63％diminye, respektivman, te obsève. ogmante pousantaj selil siviv (figi．5D, E)．

Yo ka detekte akimilasyon ROS intraselilè lè w itilize DCFH-DA．Selil PC12 trete ak 200 uM MPP＋ pou 48 h montre fliyoresans entans andedan selil la apre yo fin tache ak lank DCFH-DA (Fig. 6). Tretman an similtane ak tubuloside B (nan dòz 10 ak 100ug·ml) anpeche MPP＋一 pwovoke pwodiksyon ROS (pousantaj redwi yo te 24．52％ak 55．63％, respektivman)．

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU TRETE MALADI PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskisyon

Patojèn nan PD enplike estrès oksidatif fò, nivo redwi antioksidan, ak domaj mitokondriyo. tout li te ye pou pwovoke apoptoz nan plizyè sistèm selilè. An patikilye, yo te montre radikal gratis yo deklanche lanmò selil aktif nan newòn [14]. MPTP pwodui yon sendwòm irevokabl ak grav tankou Parkinsonyen ki lakòz koripsyon selektif nan newòn dopaminèjik nigrostriatal yo nan imen. Yo te itilize nerotoksin sa a pou kreye. te manje modèl bèt nan PD[15]．MPTP konvèti pa monoamin oksidaz B nan Mpp＋, ki akimile nan mitokondri. kote li anpeche konplèks mitokondriyo I ak maladi mitokondriyo sa a. fonksyon lakòz apoptoz[16]． Se poutèt sa, MPP + 一induit nerotoksisite nan newòn dopaminergic yo te anplwaye anpil kòm yon modèl etyolojik nan PD pou tès depistaj ajan neropwotektif yo.

Nan etid sa a, nou te demontre ke MPP+-pwovoke lanmò selil atravè estrès oksidatif nan selil PC12 te redwi pa tubuloside B. Anplis de sa, nou demontre ke tubuloside B tou pwoteje nan yon fason ki depann de dòz kont MPP a{{ 3}}pwovoke nechèl ADN ak apoptoz, jan yo mezire lè l sèvi avèk elektwoforèz jèl ADN ak analiz sitometrik koule. Anplis, tretman similtane ak pi wo konsantrasyon nan tubuloside B anpeche pwodiksyon ROS MPP-induit. Kidonk, tubuloside B te montre efè neuro-pwotektif multifonksyonèl. Plizyè mekanis, separeman oswa an asosyasyon, ka patisipe nan aksyon yo nan tubuloside B. Efè a antioksidan se yon mekanis posib pou neropwoteksyon tubuloside B-medyatè. Xiong Q te jwenn ke tubuloside B te montre yon gwo aktivite netwayaj radikal gratis sou 1,1-diphenyl-2-pikrylhydrazyl radikal ak xanthine]xanthine oksidaz ki te pwodwi sipèoksid anyon radikal.

Gen plizyè feniletanoid dènyèman rapòte ke yo posede pwopriyete radikal gratis ak pwoteje blesi toksik ki lakòz estrès oksidatif. ROS ki te pwodwi pa MPP + tankou oksijene idwojèn, anion superoksid, ak radikal idroksil fasilman domaje molekil byolojik, ki ka finalman mennen nan lanmò selil apoptotik oswa nekrotik. Kidonk, tubuloside B ka gen efè scavenging dirèk kont ROS. Pandan ke done nou yo pa etabli sit egzak kote tubuloside B aji pou siprime akimilasyon ROS, yo sijere ke mekanis neuroprotective a enplike eksitasyon nan chemen antioksidan. Yon etid sou estrikti molekilè tubuloside B tou endike ke li posede yon kapasite ki pisan pouretire radikal gratis(kominikasyon pèsonèl).

Lòt mekanis ta ka enpòtan tou. Pou egzanp, tubuloside B ka gen kapasite pou kontrekare toksisite MPP＋ pa anpeche ouvèti porositë tranzisyon pèmeyabilite mitokondriyo ak malfonksyònman. Anplis de sa, si wi ou non tubuloside B gen yon efè dirèk-pwomosyon kwasans sou selil newòn yo ta dwe konsidere tou. Mekanis egzak nan aksyon neropwotektif tubuloside B rete klè. Lòt etid yo oblije elucide foto an plen nan efè neuroprotective li yo.

Konklizyon, tubuloside B soti nanCistanche salsa ekstrègen efè pwoteksyon evidan sou apoptoz +-pwovoke MPP ak estrès oksidatif. Efè neropwotektif li yo kont MPP ＋ toksisite ta ka enpòtan epi sijere li ka gen potansyèl terapetik nan prevansyon ak tretman nan PD.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU TRETE MALADI PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%