Tuliposides H–J ak konpozan bioaktif ki soti nan anpoul Amana Edulis

Résumé:

Twa nouvo kote tulip H–J (1–3) ak 11 konpoze li te ye yo te jwenn nan ekstrè yo metanolik nan anpoul yo nan Amana edulis pou premye fwa. Estrikti yo te elisid pa done espektroskopik NMR, MS, ak IR, wotasyon optik, ak metòd Mosher a. Pwopriyete melanogenesis tout izolat yo te evalye nan selil melanom B16. Kontinwe, tributyl citrate (9) te gen aktivite anti-melanogenesis men li te cytotoksik nan direksyon B16. (plis )-asid piroglutamik (4), (plis )-butil 5-oxo pyrrolidine-2-carboxylate (6), (-)-3-idwoksi-2-methyl butyrolactone (10 ), ak 5- (hydroxymethyl)furfural (12) te ogmante pwodiksyon melanin ak aktivite tirozinaz. Konpozan aktif sa yo ta ka etidye plis kòm kandida kont melanom ak vitiligo pou maladi po oswa blanchiman / ipopigmantasyon pou cheve.

Nan rechèch la blanchiman, nou te jwenn ke Cistanche tou gen yon efè blanchiman

Premye a tout, Cistanche se moun rich nan polisakarid ak flavonoid. Konpoze sa yo aji kòm antioksidan epi yo ka ede kò a retire radikal gratis, ralanti aje nan po a epi konsa amelyore complexion la.

Dezyèmman, Cistanche tou gen yon varyete de asid amine, mineral, ak vitamin, ki trè benefik nan reparasyon po ak rejenerasyon. Cistanche ka ankouraje metabolis nan selil po yo, amelyore kapasite pou pwòp tèt ou-reparasyon nan po a, ak restore po a nan yon koulè ki an sante.

Finalman, Cistanche tou gen kèk asid òganik ak sibstans ki sou alkalin, ak engredyan sa yo tou gen yon efè sèten sou kondisyone a ak metabolis nan kutikul po. Sibstans sa yo ka efektivman balanse valè pH po a, amelyore epesè stratum corneum la, epi fè po a pi translusid ak delika.

Klike kote pou achte cistanche

1. Entwodiksyon

Amana edulis (A. edulis; Miq.) Honda, syn. Tulipa edulis (Miq.) Baker fè pati fanmi Liliaceae e li se yon plant medsin popilè yo itilize pou trete maladi kansè [1,2]. Sepandan, gen kèk etid fitochimik ak byolojik sou espès sa a rapòte jiska dat.

Pou egzanp, 95 pousan ak 50 pousan EtOH ekstrè ka pwovoke apoptoz nan gastric imen (SGC7901) [1] ak epatoma (BEL7404, HepG2, ak Huh7) [2] selil kansòm, respektivman. Polisakarid yo prepare nan A. edulis gen pwopriyete antioksidan, ki gen ladan DPPH, OH-, ak ABTS plis aktivite scavenging [3-5]. Nan rechèch nan nouvo ajan soti nan pwodwi natirèl pou maladi po, nou te jwenn ke ekstrè yo MeOH nan anpoul yo nan A. edulis montre potansyèl melanogenesis règleman ki poko fè rechèch. Lè yo ekspoze a radyasyon iltravyolèt limyè solè oswa pwodui chimik danjere ak faktè patojèn, melanogenesis modere ka pwoteje po nou kont jenerasyon espès oksijèn reyaktif nan keratinosit ak melanosit [6]. Tirozinaz se yon anzim enpòtan nan melanogenesis pou pwodui plis melanin pou nou defann kont kondisyon danjere yo mansyone pi wo a [7].

Se poutèt sa, konpozan aktif yo nan A. edulis yo merite yo dwe otorize pou plis aplikasyon medikal. Nan ankèt sa a, twa nouvo kote tulip H–J (1–3) ak 11 konpoze li te ye (4–14) (Figi 1) yo te izole nan A. edulis ak estriktirèl idantifye pa NMR, MS, ak done espektroskopik IR, wotasyon optik. , oswa reyaksyon Mosher ester. Konpoze 9 ta ka diminye kontni melanin men li ka cytotoxik nan direksyon selil B16 melanom. Konpoze 4, 6, 10, ak 12 te ogmante pwodiksyon melanin ak aktivite tirozinaz. An jeneral, travay sa a te pwouve ke A. edulis ak eleman aktif li yo ta ka nouvo ajan pou maladi melanin ki gen rapò, tankou melanom ak ipopigmantasyon (vitiligo po oswa blanchiman cheve).

2. Rezilta ak Diskisyon

2.1. Elisid Estrikti Izola 1–3

Ekstrè MeOH (TEM) nan anpoul yo nan A. edulis te divize an EtOAc-idrosolubl (TEE), n-BuOH-idrosolubl (TEB), ak HO-idrosolubl (TEW) fraksyon separeman. Fraksyon an. aksyon an nan ekstrè TEE ak TEB bay nouvo glikozid izoprenoid 1-3 ak konpoze li te ye 4-14 (Figi 1). Anplis de sa, eleman prensipal yo nan ekstrè TEW la te idrat kabòn.

HRESIMS (wo rezolisyon electrospray ionizasyon mas spectrometri) nan 1 te montre yon (M - H- ion nan m/z 351.1652, ki endike yon fòmil molekilè CsH2gOg (calcd forC; 5HoOg; 351.1655) ak de degre ensaturasyon. te montre absòpsyon pou fonksyonalite idroksil (3376 cm-l) ak karbonil (1725 cm-l). Yo te obsève kenz siyal kabòn, ki gen ladan de methyls, senk methylene, sèt methines, ak yon kabòn kwatènè, yo te obsève nan yon dimansyon (1D) RMN. spectre nan 1 (Tablo 1). Yo te idantifye kabòn nan kwatènè kòm yon kabònil kabòn ki baze sou chanjman chimik 6c 176.6. 1D ak HSOC (eteronuclear single quantum coherence) spectre RMN te montre yon anomeric (0/8c: 4.27). (d, J=8.{0 Hz)/1{{30}}4.9), senk oxymetholone ({0h/8c: 3.21 (t, J { {34}}.0 Hz)/75.1, 3.28 (sipèpoze)/71.6, 3.28 (sipèpoze)/78.0, 3.35 (t, J=8.{{67} } Hz)/77.9, and3.89 (td, I=7.{0, 2.5 Hz)/73.6), ak twa oksimetilèn (6,/6c: 3.57 (dd, J {{64}) }.5, 7.0 Hz)4.01 (jj, I {{70}}.5, 2.5 Hz)/73.1, 3.66 (jj, I { {78}}.0, 5.0 Hz), 3.85 (brd, I=12.0 Hz)/62.7and 4.10 (2H, t, J {= 7.5 Hz)/65.5) siyal. Korelasyon HMBC (korelasyon lyezon miltip eteronikleyè) (Figi 2) konpoze 1 nan pwoton metin H-2 (8 2.67, kint ak C-1 (6 176). 6)/C-3 (6 73.6)/C-4 (6 73.1)/C-5 (6 13.9) , H-3 (6 3.89, td) ak C{-1/C{-2({6 44.6)/C{-4/C -5, H-1' (6 4.27, d) ak C-4, ak pwoton metil H-5 (8 1.14 , d) avèk C-1/C-2/C{-3 te sigjere ke metil ak idroksil yo te pozisyone nan C{-2 ak C{-3, respektivman Anplis de sa, pwoton metilèn yo nan H, -1" (8 4.10, t) ak H-4 (6 3.57dd; 4.01, dd) te montre 3 entèraksyon ak C{{ 142}} ak C-1' (8 104.9), respektivman, nan HMBCspectrum a (Figi 2) ki sipòte plasman gwoup n-butil nan C-1 ak yon sèl beta. -glikoz (H-1', 8 4.27, d, J=8.0 Hz) nan C{-4 8].

Figi 2 montre korelasyon kle COSY ak HMBC yo obsève pou 1. Konfigirasyon relatif yo nan C-2 ak C-3 (3-hydroxy-2-methyl moety) nan 1 ta ka detèmine anti. -fòm pa 3 JH2-H3 valè 7.0 Hz (anti-form: 7.0 Hz; syn-form: 4.0 Hz) [ 9]. Pou detèmine konfigirasyon absoli a, yo te trete konpoze 1 separeman ak (R)- ak (S)- -metoksi- -(trifluorometil)-fenil asetil klori [(R)- ak (S)-MTPA- Cl] nan prezans piridin-d5 pou jwenn (S)- ak (R)-MTPA ester (1a ak 1b), respektivman. Ester MTPA yo te pwodwi avèk siksè nan C-3 ak C-20/C{-30/C{-40 , jan yo elisid nan 1H RMN ak 1H-1H COSY. spectre (1a, H-3, δ 5.82, m; H-20, δ 5.70, t, J=9.5 Hz; H{-30, δ 4.39, t, J=9.5 Hz; H{-40, δ 5.76, t, J=9.5 Hz; 1b, H{-3, δ 5.81, m; H{{64 }}, δ 5.56, t, J=9.5 Hz; H{-30, δ 4.12, t, J=9.5 Hz; H{-40, δ 5.66, t, J=9.5 Hz). Diferans ki genyen ant chanjman chimik 1H NMR pou 1a ak 1b (valè ∆ yo montre nan Figi 3) te mennen nan plasman S- ak R-konfigirasyon nan C-3 ak C-2, respektivman. An konsekans, konpoze 1 te elisid kòm butyl 4- -D-glucopyranose-(S)-3-hydroxy-(R){-2-methyl butanoate e yo te rele bò tulip H.

Konpoze 2, bò tulip I, te bay fòmil molekilè, C15H28O8, etabli pa HRESIMS (m/z 359.1686 [M plis Na] plis , kalkile pou 359.1682). Spectre 1D NMR nan 2 yo te sanble tou ak sa yo ki nan 1, eksepte lefèt ke chanjman chimik yo nan siyal la methylene δH 1.65 (sèks, J=7.0 Hz) ak 1.96 (sèks, J).=7.0 Hz)/δC 34.6 yo te idantifye olye pou yo yon sèl metin nan C-3 nan 1 (Tablo 1). Dapre done COSY ak HMBC yo (Figi 2), yo te postule konpoze 2 a ki konpoze de yon isoprenoid, yon sèl glikoz, ak gwoup n-butil yo tou. HMBC 3 J korelasyon H2-1" (δ 4.04, 2H, t, J=7.5 Hz/δC 65.4) ak C{-1 (δ 178.5) ak H-10 (δ 4.19, d, J=8.0 Hz/δC 104.4) ak C{-4 (δ 68.4) sijere ke gwoup n-butil la ak yon sèl -glikoz Moyety [8] yo te konekte nan C-1 ak C{-4, respektivman (Figi 2). Kle korelasyon HMBC ak COSY yo montre nan Figi 2. Konfigirasyon R nan H3-5 nan C-2 nan 2 te detèmine pa idroliz asid nan 2 pou ofri konpoze tulipalin korespondan an, 3-methyldihydrofuran{-2 (3H)-yon sèl (Figi S28) [8] ak yon wotasyon optik pozitif. valè ([ ] 23 D plis 18.7, CH2Cl2) (R: [ ] 25 D plis 14.7, CHCl3) [10]. Yo te idantifye estrikti konpoze 2 a kòm butyl 4- -D-glucopyranose-(R){{ 81}}methyl butanoate.

Fòmil molekilè 3 a te dedwi kòm C11H20O8 akòz aparans yon [M plis Na] plis ion nan m/z 303.1049 (kalki pou 303.1050) nan HRESIMS la. Onz siyal kabòn, ki gen ladan yon sèl methyl (δ 17.6), twa methylene (δ 34.7, 62.8, ak 68.6), sis metin (δ 37.6, 71.6, 75.1, 77.9, 78.0, ak 104.4), ak yon kwatènèr kabòn (6). , yo te obsève nan spectre 1D NMR nan 3 (Tablo 1). Kabòn kwatènè a te idantifye kòm yon kabònil ki baze sou chanjman chimik kabòn nan δ 180.6. Anplis de sa, konpoze 3 te montre done espektroskopik ki sanble ak sa yo ki nan 2, eksepte pou siyal n-butil yo. Nan spectre HMBC (Figi S15), pwoton anomerik nan δ 4.23 (d, J=8.0 Hz) te montre 3 J entèraksyon ak C-4 (δ 68.6) ki mennen nan -glikoz ki sitiye nan C-4. Koneksyon kle HMBC ak COSY yo montre nan Figi 2. Konpoze 3 pa te izole nan yon kantite ase pou detèmine konfigirasyon absoli nan C-2. Finalman, tilip bò ​​J (3), 4- -D-glucopyranose-(R){-2-methyl butanoic asid, te idantifye akòz elisid estriktirèl yo mansyone anwo a nan 1 ak 2 nan etid sa a.

Konpoze 1–3 yo se kote tulip, yon kalite pwodwi espesyalize ki gen 4-idwoksi2-asid metilèn butanoik (HMBA) ak/oswa (3S)-3,4-dihydroxy -2-Gwoup asid metilèn butanoik (DHMBA) acylate nan pozisyon C-1 ak/oswa C-6 nan yon -D-glikoz (Glc) sitou yo jwenn nan genus Tulipa [8,11] . Jiskaprezan, analogue bò tulip, ki gen ladan 1-tilip bò ​​A, 6-tilip bò ​​A, 1-tilip bò ​​B, 6-tilip bò ​​B, ak tulip bò ​​D–G , yo te izole nan Tulipa [8,11]. Sepandan, estrikti nan bò tulip C pa te rapòte epi yo ta ka manke nan literati anvan yo [11]. Tulipalin, tankou tulipalin A ak (-)-tulipalin B, se pòsyon aglycone nan kote tulip, ki espontaneman laktòn apre yo fin lage gwoup HMBA ak / oswa DHMBA pa anzim konvèti bò Tulip [8,11]. Nan etid sa a, konpoze 1–3 yo te rele kote tulip H–J fè pati kote tulip, men lyezon doub yo nan C-2 te redwi epi gwoup -D-glikoz yo te tache ak C-4 (oksimetilèn). ), olye de C-1 (fonksyonalite O-acyl) nan HMBA oswa DHMBA (Figi 1). Anplis de sa, konpoze 10 (2S,3S) se tulipalin men li pa t 'kapab metabolize soti nan 1 (2R,3S) akòz konfigirasyon diferan nan C-2. Byosentèz posib nan kote tulip 1-3 yo montre nan Figi S29 [8,11].

Anplis de sa, 11 konpoze li te ye ki gen ladan twa analogu asid piroglutamik (4-6), twa dérivés asid asid (7-9), de furanone (10-11), yon furan (12), ak de estewoyid (13-14) yo te. izole de A. edulis pou premye fwa. Konpoze 1-9 ak 10-14 yo te jwenn nan fraksyon brut TEB ak TEE, respektivman. Yo te idantifye kòm (plis)-piroglutamik asid (4) [12], (plis)-methyl 5-oxo pyrrolidine-2-carboxylate (5) [12], (plis )-butyl {{23 }}oxo pyrrolidine-2-carboxylate (6) [12], 1-butil sitrat (7) [13], 1,10 -dibutil 5-methyl sitrat (8) [ 13], sitrat tributyl (9) [13], (–)-3-idwoksi-2-methyl butyrolaktone (10) [14-16], (–)-methyl 3-idwoksi{{ 44}}oxo tetrahydrofuran-3-carboxylate (11) [17], 5-(hydroxymethyl)furfural (12) [18], sitosterol (13) [19], ak sitosterol -3- -D -glikoz (14) [20] soti nan done yo espektroskopik ak konpare ak literati a.

2.2. Konpozan chimik elisid nan TEW

Spectre 1H ak 13C NMR nan TEW, yon fraksyon brit idrosolubl nan ekstrè TEM, te montre anpil menm jan ak sa yo ki nan idrat kabòn (Figi S16 ak S17). Yo rapòte ke polisakarid ki prepare nan espès sa a posede ramnoz, ksiloz, arabinoz, galaktoz, mannoz, glikoz, ak fruktoz apre analiz monosakarid [3,8]. Done espektroskopik NMR yo ak faktè retansyon TLC (kwomatografi kouch mens) TEW konpare ak estanda sik yo (Figi S18-S23) sijere D-glikoz ak D-fruktoz yo te eleman prensipal yo nan ekstrè TEW.

2.3. Efè ekstrè ak izole sou Melanogenesis

Ekstrè MeOH (TEM) nan espès sa a te separe an TEE, TEB, ak TEW fraksyon brit, epi yo te evalye kat ekstrè yo susmansyone pou efè sitotoksisite ak melanogenesis nan selil melanom B16 nan konsantrasyon ki soti nan 12.5 a 200 µg / mL (Figi S24) . TEE te montre sitotoksisite evidan nan direksyon B16 nan 200 µg/mL ak TEB osi byen ke TEW te gen aktivite sitotoksik nan konsantrasyon soti nan 12.5 a 200 µg/mL (Figi S24A-1, B-1, C{{13} }, D-1). Nan bioassay la, yo te itilize òmòn -melanocyte-stimulating (-MSH) pou aktive selil B16 pou fè sentèz plis melanin, ak TEM te kapab estimile melanogenesis (Figi S24A-2).

Pifò nan tout izolat (Figi 1), eksepte 13 ak 14, yo te plis teste pou règleman an nan efè melanogenesis nan konsantrasyon soti nan 10 a 40 µM, ak arbutin itilize kòm yon kontwòl pozitif (Figi 4). Jan yo montre nan Figi 4, konpoze 9 evidamman ak dòz-depandan inibit pwodiksyon melanin ki te soti nan sitotoksisite nan direksyon selil B16 ak yon valè IC50 (mwatye maksimòm konsantrasyon inhibitory) nan 81.9 µM (Figi S25). Izolasyon 4, 6, 10, ak 12 ogmante kontni melanin depann de dòz la jiska pousantaj maksimòm 11.9 pousan, 29.8 pousan, 27.2 pousan, ak 17.6 pousan, respektivman, nan 40 µM san toksisite selilè. Tyrosinase jwe yon wòl kle nan de premye etap yo nan melanogenesis [6]; Se poutèt sa, efè konpoze 4, 6, 10, ak 12 sou tirozinaz entraselilè yo te evalye plis. -MSH ogmante aktivite tirozinaz la jiska 254.3-305.5 pousan lè yo konpare ak gwoup kontwòl la (100 pousan) (Figi 5 ak Tablo S1).

Kontinwe, 4 (14.1-21.9 pousan), 6 (15.8-21.9 pousan), 10 (8.5-13.1 pousan), ak 12 (7.5-11.8 pousan) modere ogmante aktivite a nan anzim nan, tirozinaz, nan yon fason ki depann de dòz. nan konsantrasyon nan 10 a 40 µM, pandan y ap konpare ak gwoup la -MSH (Figi 5 ak Tablo S1). Nan Figi S26 yo montre yon graf korelasyon ant kontni melanin selilè a ak efè konpoze 4, 6, 10, ak 12 sou tirozinaz la. Anplis de sa, konfime efè melanogenesis-inducing nan 4, 6, 10, ak 12, yo te ajoute chak konpoze nan selil B16 san yo pa ko-trete -MSH ki te itilize kòm yon kontwòl pozitif nan tès sa a (Figi S27). Kontinwe, moun 4, 6, 10, ak 12 pa t ogmante pwodiksyon melanin pou kont li (Figi S27) menm jan ak sa yo montre nan Figi 4. Li te sijere kat konpoze ki anwo yo te kapab senpleman amelyore efè melanogenesis -MSH. An konsekans, chemen siyal adisyonèl nan melanogenesis, tankou pwoteyin ki gen rapò ak tirozinaz-1 (TRP{-1), TRP{-2, faktè transkripsyon ki asosye ak mikroftalmi, melanokortin 1 reseptè, adenosin monofosfat siklik, pwoteyin. kinase A, cAMPresponse eleman-obligatwa pwoteyin, c-Jun N-terminal kinases, ekstraselilè kinaz siyal reglemante, p38, ak fosfoinositide 3-kinaz/pwoteyin kinaz B [7,21], yo ta dwe plis teste ak konfime pou eleman aktif sa yo.

3. Materyèl ak Metòd

3.1. Pwosedi Jeneral Eksperimantal

Yo te mezire spectre NMR sou yon enstriman Bruker Avance Ill 500 MHz (BrukerBillerica, Amerik) pou 1H ak 125 MHz pou 13C-NMR. Valè chanjman chimik (0) yo te an ppm, ak konstan kouple () yo te an Hz ak CD; OD, CDCl, ak/oswa D, O yo te itilize kòm solvang. Wotasyon optik yo te jwenn sou yon polarimèt JASCO-P-2000 (JASCO, TokyoJapan) (longè selil 10 mm). Spectre IR yo te anrejistre sou yon espektromèt PerkinElmer Spectrum TwoFT-IR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Yo te mezire ESIMSelectrospray iyonizasyon mas espektwomèt ba ak segondè rezolisyon sou yon espektromèt mas pèlen Bruker Daltonics EsquireHCT ultra-wo kapasite ak yon espektromèt mas Orbitrap (LIOOrbitrap XL, Thermo Fisher Scientific), respektivman. TLC te fèt sou Kieselgel60 F254 (0.25 mm; Merck) ak / oswa RP-18 F254S (0.25 mm; Merck), plak kouvwi ak Lè sa a, tache pa flite ak 5 pousan (o/u) silfirik. asid nan yon solisyon MeOH ak chofaj sou yon plak cho. Jèl silica (Silicycle: 70 230 ak 230 400 may), RP-18 (LiChroprepe 4063 um: Merck. Sephadexn C20 CE Episode 0 pe louvri w Bre aplike foSupelcoTM, Bellefonte), ak MCI CHP20P (SupelcoTcolumn chromatography. Yon ponp Shimadzu LC-20AT ak yon Shimadzu RID-10Yon detektè endèks refraktif (Shimadzu Inc, Kyoto, Japon), ansanm ak yon Cosmosil 5C18-MS-II ( 250 x10 mm id, 5 um) kolòn nan yon pousantaj koule nan 2.0 mL / min, yo te itilize pou HPLC.Reyaktif sik ki gen ladan D-glikoz (MP Biomedicals, LLC, Illkirch, Frans) ak D-fruktoz (TCI, Tokyoapan) yo te itilize pou analiz fraksyon brut (TEW) idrosolubl nan dlo.

3.2. Materyèl Plant

Anpoul sèk nan A. edulis (ansyen T. edulis) yo te achte nan yon famasi medikaman tradisyonèl Chinwa nan Taichung, Taiwan, nan mwa septanm nan 2018 ak idantifye pa otè a Professeur Chang. Yon echantiyon bon (TE201809) te depoze nan Chinese Medicine Research and Development Center, CMUH Taiwan.

3.3. Ekstraksyon ak Izolasyon

Anpoul A. edulis (5.0 kg) yo te ekstrè uit fwa ak MeOH (8.0 L chak) nan tanperati chanm pou jwenn yon ekstrè brit. Ekstrè MeOH (TEM, 525.0 g) te divize twa fwa ant acetate etil (EtOAc) ak H2O (1500:1500, v/v) pou bay yon EtOAc. -idrosolubl fraksyon (TEE, 45.0 g) ak yon faz akeuz, ki te plis patisyone ak n-BuOH / H2O (1500:1500, v / v × 3), ak Lè sa a, separe an n-BuOH-idrosolubl (TEB, 53.6 g). ) ak H2O-idrosolubl (TEW, 410.0 g) fraksyon.

TEE te sibi chromatografi kolòn louvri sou yon jèl silica ({{0}}.063–0.20{0 mm, kolòn: 7 × 26 cm, dyamèt × longè), lè l sèvi avèk gradyan hexane–EtOAc–MeOH (3{{20}}:1:0; 1:1:0; { {67}}:0:1, v/v/v) epi li bay 14 soufraksyon (TEE1–TEE14). Precipitate 14 (249.0 mg; pwodiksyon izolasyon: 0.{{1{0}}0498 pousan) te jwenn nan subfraksyon TEE12 (2.2 g) te filtre ak lave ak MeOH. TEE9 (3.6 g) te fraksyon nan sèt soufraksyon (TEE9-1 rive 9-7) pa jèl silica (kolòn: 5 × 24 cm; CH2Cl2–MeOH, 7:1; 1:1; 0:1). , v/v), ak subfraksyon TEE9-4 (1.1 g), ak Lè sa a, sibi Sephadex LH-20 kolòn kwomatografi (kolòn: 5 × 54 cm; CH2Cl2–MeOH, 1:1 a 0: 1, v/v), pou bay sèt soufraksyon (TEE9-4-1 rive 9-4-7). TEE9- 4-5 ak TEE{9-4-6 te konbine (total 551.7 mg) ak repete pirifye pa RP-HPLC (MeOH–H2O, 45:55; 20:80, v/v) pou bay 12 (21.0 mg). tR=13 min; pwodiksyon izolasyon: 0.00042 pousan) ak yon likè manman (131.2 mg), ki te sibi plis RP-HPLC (MeOH–H2O; 10:90, v/v) pou bay konpoze 10 ( 35.5 mg; tR=13 min; pwodiksyon izolasyon: 0.00071 pousan) ak 11 (1.2 mg; tR=15 min; sede izolasyon: 0.000024 pousan). Sephadex LH-20 te izole fraksyon TEE6 (2.7 g) (kolòn: 2.5 × 45 cm; CH2Cl2–MeOH, 1:1; 0:1, v/v) pou jwenn 13 (6.8 mg; pwodiksyon izolasyon:): 0.000136 pousan).

TEB te chromatographed sou yon kolòn Diaion HP{{0}} (6 × 60 cm; H2O–MeOH– asetòn, 100:{{15} }:0; 25:75:0; 50:5{{20}}:0; 75:25:{{41 }}; 0:10{{70}}:{{90}}; {{1{{105} }0}}:0:100, v/v/v) pou bay sis soufraksyon (TEB1–TEB6). Soufraksyon TEB5 (502.{0 mg) te pirifye pa RP-HPLC (MeOH–H2O, 85:15, v/v) pou jwenn konpoze 8 (9.3 mg; tR {{34}). } min; pwodiksyon izolasyon: 0.00{0186 pousan ) ak 9 (144.2 mg; tR {{4{{2{{2{{218} }9}}3}}}} min; pwodiksyon izolasyon: 0.002884 pousan). Fraksyon TEB3 (5.5 g) te sibi RP-18 kromatografi (kolòn: 7 × 25 cm; MeOH–H2O, 1:1; 1:0, v/v), ak soufraksyon TEB3-6 ( 1.0 g) te izole plis pa Sephadex LH -20 (kolòn: 5 × 54 cm; MeOH) pou jwenn sèt soufraksyon (TEB3-6-1 a 3-6-7). TEB3-6-4 (377.1 mg) te separe pa kwomatografi jèl MCI (kolòn: 2.5 × 23 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 40:60; 20:80; 0: 100, v/v) pou bay sèt soufraksyon (TEB3-6-4-1 pou 3-6-4-7). TEB3-6-4-4 (38.1 mg) te pirifye pa RP-HPLC (MeOH–H2O, 45:55 nan 0.1 pousan asid fòmik, v/v) pou bay pirifye 1 (12.2 mg; tR=17 min; sede izolasyon: 0.000244 pousan). Anplis de sa, TEB3-6-4-6 (31.0 mg) te fèt ak RP-HPLC (MeOH–H2O, 40:60 nan 0.1 pousan asid fòmik, v/v) pou bay 6 (7.1 mg; tR=28 min). ; sede izolasyon: 0.000142 pousan). TEB3-6-5 (410.7 mg) te izole pa kwomatografi jèl MCI (kolòn: 2.5 × 23 cm; H2O-MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30: 70; 20:80; 0:100, v/v) pou bay uit soufraksyon (TEB3-6-5-1 rive 3-6-5-8). TEB 3-6-5-3 (75.1 mg) te pirifye pa kwomatografi jèl MCI (kolòn: 1 × 20 cm; H2O-MeOH, 80:20; 70:30; 0:100, v/v) pou peye konpoze 4 (59.3). mg; pwodiksyon izolasyon: 0.001186 pousan) ak 5 (10.2 mg; sede izolasyon: 0.000204 pousan). Soufraksyon TEB3-6-5-4 (97.0 mg) te pirifye pa RP-HPLC (MeOH-H2O, 40:60 nan 0.1 pousan asid fòmik, v / v) pou jwenn 7 (46.4 mg; tR=18 min; sede izolasyon: 0.000928 pousan). TEB3-10 (925.4 mg) te chromatographed sou yon kwomatografi jèl MCI (kolòn: 2.5 × 28 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30). :70; 10:90; 0:100, v/v) pou bay uit soufraksyon (TEB3-10-1 rive 3-10-8) ak pi 2 (393.4 mg; pwodiksyon izolasyon: 0.007868 pousan). Konpoze 3 (6.3 mg; tR=8 min; pwodiksyon izolasyon: 0.000126 pousan) te jwenn nan TEB3-10-2 (20.9 mg) pa pirifikasyon RP-HPLC (MeOH-H2O, 30:70 nan 0.1 pousan fòmik). asid, v/v).

3.3.1. Tuliposid H (1)

[ ] 23 D −23.1 (c 0.12, MeOH); IR (pwòp) νmax 3376 (OH), 2960, 2934, 2875 (CH), 1725 (C=O), 1640, 1589, 1459, 1382, 1259, 1167, 1075, C–104 C), 926, 900, 632, 521 cm−1; Done espektroskopik 1H ak 13C NMR, gade Tablo 1; HRESIMS m/z 351,1652 [M - H] - (kalki pou C15H27O9, 351,1655).

3.3.2. Tuliposid I (2)

[ ] 23 D −25.8 (c 0.2, MeOH); IR (pwòp) νmax 3404 (OH), 2961, 2934, 2876 (CH), 1729 (C=O), 1638, 1461, 1378, 1277, 1185, 1165, 1077, C–1036 C), 897, 736, 625, 517 cm−1; Done espektroskopik 1H ak 13C NMR, gade Tablo 1; HRESIMS m/z 359,1686 [M plis Na] plis (kalki pou C15H28O8Na, 359,1682).

3.3.3. Tuliposid J (3)

[ ] 23 D plis 9.0 (c 0.1, MeOH); IR (pwòp) νmax 3424 (OH), 2953, 2924, 2853 (CH), 1740 (C=O), 1632, 1441, 1401 (C–O–C), 1284, 1205, 1182, 120 , 1078, 1039, 893, 768, 721 cm−1; Done espektroskopik 1H ak 13C NMR, gade Tablo 1; HRESIMS m/z 303,1049 [M plis Na] plis (kalki pou C11H20O8Na, 303,1050).

3.4. (R)- ak (S)-MTPA Dérivés de 1

Preparasyon an nan (S)-MTPA ester dérivés nan 1 te pote soti nan yon pratik Mosher ester pwosedi [22,23]. Konpoze 1 (3.4 mg, 0.01 mmol) te transfere nan yon tib NMR pwòp epi answit seche nèt anba vakyòm anvan yo te plen nitwojèn. Anplis de sa, C5D5N ({{20}}.5 mL) ak (R)-(-)- -metoksi- -(trifluorometil)-fenil-asetil klori (klori MTPA, 12,2 mg, 0.05 mmol) yo te ajoute imedyatman nan tib NMR sele a ki te plis souke ak anpil atansyon melanje echantiyon an ak klori MTPA. 1H RMN ak 1H-1H COSY spectre melanj lan apre yo fin reyaji pou 24 èdtan nan tanperati chanm lan. Ester (R)-MTPA 1 te prepare menm jan an tou pa pwosesis ki endike anwo a. Konpoze 1: 1H RMN (C5D5N, 500 MHz) δ 0.78 (H-400, t), 1.26 (H-300, sext), 1.28 (H{3-5, d), 1.52 ( H-200, kint), 3.08 (H{-2, kint), 3.95 (H{-50, m), 4.03 (H{-4a, dd), 4.05 (H{-4 -20, sipèpoze), 4.15 (H{-100, t), 4.23 (H{-30, sipèpoze), 4.23 (H{-40, sipèpoze), 4.36 (H{{{ 68}}a, dd), 4.39 (H-3, sipèpoze), 4.43 (H-4b, dd), 4.53 (H{-60b, d), ak 4.95 (H{-60 -10, d).

3.4.1. (S)-MTPA Ester nan 1 (1a)

1H RMN (C5D5N, 500 MHz) δ 0.77 (H-400, t), 1.17 (H-300, sext), 1.21 (H{3-5, d) , 1.37 (H-200, kint), 3.18 (H{-2, kint), 3.92 (H-100, t), 3.97 (H{-4a, dd), 4.33 (H-50, m), 4.39 (H-30, t), 4.49 (H-4b, brd), 4.64 (H{-60a, dd), 4.96 (H-10, d), 5.05 (H{-60b, d), 5.70 (H{-20, t), 5.76 (H{-40, t), ak 5.82 (H-3, m).

3.4.2. (R)-MTPA Ester nan 1 (1b)

1H RMN (C5D5N, 500 MHz) δ 0.79 (H-400, t), 1.26 (H-300, sext), 1.30 (H{3-5, d) , 1.50 (H-200, kint), 3.33 (H{-2, kint), 3.60 (H-50, m), 3.94 (H{-4a, dd), 4.11 (H-100, t), 4.12 (H-30, t), 4.13 (H-60a, dd), 4.50 (H{-4b, brd), 4.70 (H-10, d), 4.85 (H{-60b, d), 5.56 (H{-20, t), 5.66 (H{-40, t), ak 5.81 (H-3, m).

3.5. Idwoliz asid nan Tuliposide I (2)

Izole 2 (78.6 mg) te idrolize nan 1 M HCl (1.5 mL) nan 100 ◦C pou 2 h [8]. Apre refwadisman, yo te ekstrè melanj reyaksyon an ak CH2Cl2 (2.0 mL × 3) pou ofri analòg tulipalin, 3-methyldihydrofuran-2 (3H)-yon (11.1 mg). [ ] 23 D plis 18.7 (c 1.1, CH2Cl2); 1H RMN (CDCl3, 400 MHz) δ 1.30 (3H, d, J=7.0 Hz), 1.94 (m), 2.45 (m), 2.61 (m), 4.20 (ddd, J {{43} }.8, 6.8, 6.4 Hz), 4.33 (ddd, J=8.8, 8.8, 2.8 Hz). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 15.2, 30.7, 34.1, 66.2, 180.1 (Figi S28); ESIMS m/z 101.06 [M plis H] plis .

3.6. Kilti Selil

Selil melanom B16 murin yo te kiltive nan Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; GIBCO Invitrogen Corporation, New York, NY, USA) ak 10 pousan serom fetis bovin, 100 U/mL penisilin, ak 100 µg/mL streptomycin nan 37. ◦C nan yon enkibatè 5 pousan CO2.

3.7. Mezi B16 selil viabilite

Sitotoksisite selil B16 pou konpoze tès yo te mezire pa MTT ak yon pwotokòl ki dekri deja ak modifikasyon ti tay [6]. Selil yo te simen nan 96-plak byen (1 × 103 selil/po) epi yo te kiltive pou 24 èdtan anvan yo te trete ak konpoze pou yon lòt 72 èdtan. Apre sa, yo te retire mwayen an, 100 µL reyaktif MTT (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) (nan konsantrasyon final la nan 0.5 mg/mL) te ajoute nan chak pi epi answit enkube nan 37 ◦C pou 1 èdtan. Yo te fonn kristal formazan an nan 100 µL DMSO, epi yo te mezire dansite optik lè l sèvi avèk yon lektè microplate (SPECTORstar® Nano, BMG LABTECH, Ortenberg, Almay) nan 570 nm.

3.8. Mezi kontni Melanin nan selil B16

Kontni melanin nan selil B16 yo te teste dapre yon metòd ki dekri deja ak modifikasyon ti tay [6]. Selil yo te simen nan yon dansite 5 × 103 selil/po nan plak 24-pou pou 24 èdtan. Mwayen an te ranplase pa yon mwayen kilti fre 500 µL ki gen 0.5 µM -MSH avèk oswa san konpoze pou 72 èdtan. Arbutin (1 mM) te itilize kòm kontwòl pozitif la. Apre sa, yo te retire mwayen an epi lave ak PBS (pH 6.8) de fwa. Selil yo te rekòlte pa NaOH (200 µL, 2 N) ak Lè sa a, chofe nan 85 ◦C pou 30 min. Apre refwadisman nan tanperati chanm epi yo te santrifuje, yo te mezire absorbans nan 405 nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate.

3.9. Aktivite Tirozinaz Entraselilè

Yo te fè tès aktivite tirozinaz intraselilè pa yon metòd yon ti kras modifye, ki te rapòte deja [6]. Selil yo te simen nan 24-plak byen nan yon dansite 5 × 103 selil/pi pou 24 èdtan. Selil yo te trete nan DMEM ki gen 0.5 µM -MSH avèk oswa san konpoze pou 72 èdtan. Apre yo fin retire mwayen an, selil yo te lave ak PBS frèt (pH 6.8) de fwa. Selil yo te lysed ak 100 µL lysis tanpon (1 pousan triton X-100 nan PBS) ak jele nan -80 ◦C pou 15 min.

Lè sa a, lisat selil yo te santrifuje nan 13,200 × g nan 4 ◦C pou 30 minit pou jwenn supernatant la. Kontni total pwoteyin nan supernatant la te quantifye pa tès pwoteyin BCA. Apre sa, yo te melanje chak lysate quantifiée (30 µg/90 µL) ak 10 µL L-DOPA (15 mM) nan yon plak 96-byen epi yo te enkube a 37 ◦C pou 1 èdtan, epi yo te mezire absorpsyon an. nan 405 nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate.

4. Konklizyon

An jeneral, 14 konpoze pi, ki gen ladan twa nouvo glikozid isoprenoid, ak kote tulip H–J (1–3), yo te izole nan A. edulis. Asid citrique dérivés 9, tributyl citrate, te gen siyifikativman anti-melanogenesis aktivite men te montre cytotoxicity vers B16 mélanome cellules ki te kapab plis rechèch pou dwòg anti-melanoma. Pandan ke analogue asid pyroglutamic 4 ak 6, furanone 10, ak furan 12 te gen dòz-depandans ogmante kontni melanin ak aktive tyrosinase ki ta ka plis etidye pou maladi po vitiligo oswa ajan anti-blanchiman ak anti-ipopigmantasyon pou cheve. Sepandan, mekanis in vitro ak/oswa etid in vivo yo bezwen envestige an plis detay pou verifye efikasite konpozan aktif yo.

Materyèl siplemantè:

Sa ki annapre yo disponib sou entènèt, Figi S1–S5: Done espektral NMR nan konpoze 1, Figi S6–S10: Done espektral NMR nan konpoze 2, Figi S11–S15: Done espektral NMR nan konpoze 3, Figi S16–S22: Done espektral NMR nan konpoze 3 nan TEW, Figi S23: analiz TLC nan TEW, Figi S24: Sitotoksisite ak règleman an nan efè melanogenesis nan TEM, TEE, TEB, ak TEW, Figi S25: Done sitotoksisite nan konpoze 1-12, Figi S26: Yon graf korelasyon ant la kontni melanin selilè ak efè yo sou tirosinaz nan konpoze 4, 6, 10, ak 12, Figi S27: Efè Melanogenesis nan konpoze 4, 6, 10, ak 12 poukont yo san yo pa -MSH, Figi S28: Done espektral RMN ak wotasyon optik nan pwodwi yo jwenn nan idroliz asid nan konpoze 2, Figi S29: Byosentèz posib nan konpoze 1-3, Tablo S1: Efè aktivite Tirozinaz nan konpoze 4, 6, 10, ak 12.

Kontribisyon otè:

Konsepyalizasyon, C.-LL; idantifikasyon materyèl plant, Y.-SC; konduit izolasyon ak pirifikasyon, C.-LL ak Z.-AG; konduit byoessai yo, Y.-LJ; tout analiz espèk ak detèminasyon estrikti, C.-LL ak C.-JC; ekri nan preparasyon bouyon orijinal la, C.-LL Tout otè yo te li epi dakò ak vèsyon ki pibliye maniskri a.

Finansman:

Rechèch sa a te finanse pa Ministè Syans ak Teknoloji (MOST 108-2320-B{039-035-) ak Lachin Medical University (CMU108-MF-84), Taiwan. APC a te finanse pa "Chinese Medicine Research Center, China Medical University" ki soti nan Pwogram Sant Rechèch Zòn yo prezante nan kad Pwojè Edikasyon siperyè Sprout pa Ministè Edikasyon (MOE) nan Taiwan (CMRC-CHM{{5} }).

Deklarasyon Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl:

Pa aplikab.

Deklarasyon Konsantman Enfòme:

Pa aplikab.

Deklarasyon Disponibilite Done:

Pa aplikab.

Rekonesans:

Travay sa a te finansyèman sipòte pa Ministè Syans ak Teknoloji (MOST 108-2320-B{-039-035-) ak Lachin Medical University (CMU108-MF{-84), Taiwan, osi byen ke "Chinese Medicine Research Center, China Medical University" ki soti nan Pwogram Sant Rechèch nan Zòn yo prezante nan kad Pwojè Edikasyon siperyè Sprout pa Ministè Edikasyon (MOE) nan Taiwan (CMRC-CHM-1) bay C. .-LL

Konfli enterè:

Otè yo pa deklare okenn konfli enterè.

Egzanp Disponibilite:

Echantiyon konpoze 1–14 yo disponib nan men otè yo.

Referans

1. Lin, R.; Li, Z.; Lin, J.; Wi, J.; Cai, Q.; Chen, L.; Peng, J. Ekstrè etanolik nan Tulipa edulis Bak pwovoke apoptoz nan selil SGC-7901 gastric imen yo atravè chemen siyal mitokondriyo a. Oncol. Lett. 2015, 10, 2371–2377. [CrossRef] [PubMed]

2. Fan, Y.; Hou, X.; Guo, P.; Lv, X.; Zhao, L.; Wang, H.; Zhou, L.; Feng, Y. Ekstraksyon nan Amana edulis pwovoke apoptoz kansè nan fwa. Evid.-Baze Konpleman. altènatif. Med. 2018, 2018, 3927075. [CrossRef] [PubMed]

3. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ Physicochemical ak potansyèl antioksidan nan polisakarid sekans ekstrè soti nan Amana edulis. Ent. J. Biol. Macromol. 2019, 131, 453–460. [CrossRef]

4. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ Pwopriyete reolojik ak konpòtman emulsifyan nan polisakarid sekans ekstrè soti nan Amana edulis. Ent. J. Biol. Macromol. 2019, 137, 160–168. [CrossRef]

5. Cao, YY; Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Hu, F.; Zhang, JG; Wei, ZJ Efè silfate, fosforilate ak carboxymethylated modifikasyon sou aktivite antioksidan in-vitro nan polisakarid sekans ekstrè soti nan Amana edulis. Ent. J. Biol. Macromol. 2020, 146, 887–896. [CrossRef]

6. Lai, KY; Hu, HC; Chiang, HM; Liu, YJ; Yang, JC; Lin, YA; Chen, CJ; Chang, YS; Lee, CL Nouvo diterpenes leojaponins G−L soti nan Leonurus japonicus. Fitoterapia 2018, 130, 125−133. [CrossRef]

7. Ullah, S.; Chung, YC; Hyun, CG Endiksyon melanogenesis pa fosfomycin nan selil B16F10 atravè upregulating P-JNK ak P-p38 siyal chemen yo. Antibyotik 2020, 9, 172. [CrossRef] [PubMed]

8. Christensen, LP; Kristiansen, K. Izolasyon ak quantification nan kote tulip ak tulipalin nan tulip (Tulipa) pa segondè-pèfòmans likid kromatografi. Kontakte Dermat. 1999, 40, 300−309. [CrossRef]

9. Tripathi, A.; Puddick, J.; Prinsep, MR; Lee, PPF; Tan, LT Hantupeptins B ak C, cyclodepsipeptides cytotoxik ki soti nan cyanobakteri maren Lyngbya majuscula. Phytochemistry 2010, 71, 307−311. [CrossRef]

10. Qabaja, G.; Willent, JE; Benavides, AR; Bullard, GE; Petersen, KS Senèz fasil nan ester idroksi enantioenriched-ranplase atravè yon rezolisyon sinetik ki katalize asid Brønsted. òg. Lett. 2013, 15, 1266−1269. [CrossRef]

11. Nomura, T.; Kato, Y. Idantifikasyon tuliposid G, yon roman glucoside ester-tip tuliposide, ak distribisyon li yo nan tulip. Z. Naturforsch. CJ Biosci. 2020, 75, 75−86. [CrossRef]

12. Gang, FL; Zhu, F.; Li, XT; Wei, JL; Wu, WJ; Zhang, JW Sentèz ak byoaktivite evalyasyon analòg asid L-pyroglutamic soti nan plon pwodwi natirèl. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 4644–4649. [CrossRef]

13. Vereshchagin, AL; Anikina, EV; Syrchina, AI; Lapin, MF; Azin, LA; Semenov, AA Ankèt chimik sou sibstans ki anmè nan fwi Lonicera caerulea. Chem. Nat. Konp. 1989, 25, 289−292. [CrossRef]

14. Jaime, C.; Ortuño, RM; Font, J. Di- ak trisubstituted -lactones. Yon etid konformasyon pa kalkil mekanik molekilè ak analiz konstan kouple. J. Org. Chem. 1986, 51, 3946−3951. [CrossRef]

15. Larchevêque, M.; Henrot, S. Enantiomerically pi, -epoxyesters soti nan -hydroxylactones: sentèz -hydroxyesters ak (-)-GABOB. Tetrahedron 1990, 46, 4277−4282. [CrossRef]

16. Jaime, C.; Segura, C.; Dinarés, I.; Font, J. Ranplase -lactones ak atòm idwojèn vicinal. Konfòmasyon etid pa kalkil MM2 ak kouple analiz konstan. J. Org. Chem. 1993, 58, 154−158. [CrossRef]

17. Mori, K.; Fukamatsu, K. Yon sentèz (1R,5S)-(plis)-frontalin soti nan (S)-(−)-2-hydroxyparaconic asid. Liebigs Ann. Chem. 1992, 11, 1191−1193.

18. Miyazawa, M.; Anzai, J.; Fujioka, J.; Ishikawa, Y. Konpoze ensektisid kont Drosophila melanogaster soti nan Cornus officinalis Sieb. et Zucc. Nat. Prod. Res. 2003, 17, 337−339. [CrossRef] [PubMed]

19. Lee, CL; Wang, CM; Hu, HC; Yen, HR; Chante, YC; Yu, SJ; Chen, CJ; Li, WC; Wu, YC Indol alkaloid indigo-doles A–C soti nan pati ayeryen nan cuisine Strobilanthes nan medikaman tradisyonèl Chinwa Qing Dai gen pwopriyete anti-IL-17. Phytochemistry 2019, 162, 39−46. [CrossRef] [PubMed]

20. Faizi, S.; Ali, M.; Saleem, R.; Irfanullah; Bibi, S. Ranpli devwa 1H- ak 13C-NMR nan stigma-5-en-3-O- -glikozid ak derive asetil li yo. Magn. Reson. Chem. 2001, 39, 399–405. [CrossRef]

21. Kuo, YH; Chen, CC; Wu, PY; Wu, CS; Sung, PJ; Lin, CY; Chiang, HM N-(4-methoxyphenyl) kafeamide-induit mekanis anpèchman melanogenesis. BMC Konpleman. altènatif. Med. 2017, 17, 71. [CrossRef] [PubMed]

22. Ohtani, mwen .; Kusumi, T.; Kashman, Y.; Kakisawa, H. High-field FT NMR aplikasyon metòd Mosher a. Konfigirasyon yo absoli nan terpenoid maren. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4092−4096. [CrossRef]

23. Lee, CL; Chang, FR; Hsieh, PW; Chiang, MWEN; Wu, CC; Huang, ZY; Lan, YH; Chen, M.; Lee, KH; Yen, HF; et al. Sitotoksik ent-abietane diterpenes soti nan Gelonium aequoreum. Phytochemistry 2008, 69, 276−287. [CrossRef] [PubMed]

1 Depatman Cosmeceutics, Lachin Medical University, Taichung 406040, Taiwan.

2 Chinese Medicine Research and Development Center, China Medical University Hospital, Taichung 40402, Taiwan.

3 Chinese Medicine Research Center, Lachin Medical University, Taichung 40402, Taiwan.

4 Depatman Syans famasetik Chinwa ak Resous Medsin Chinwa, Inivèsite Medikal Lachin, Taichung 40402, Taiwan.

5 Graduate Institute of Integrated Medicine, Lachin Medical University, Taichung 40402, Taiwan.

6 Proteomics Core Laboratory, Depatman Rechèch Medikal, Lachin Medical University Hospital, Taichung 40402, Taiwan.

For more information:1950477648nn@gmail.com