Unambiguous NMR Detèminasyon estriktirèl nan (plis)-catechin-Laccase pwodwi reyaksyon dimerik kòm makè potansyèl nan oksidasyon rezen ak diven

Pou plis detay, kontakte:tina.xiang@wecistanche.com

Résumé:( plis )-Catechin—laccaseoksidasyonestanda dimerik yo te Hemi-sentèz lè l sèvi avèk lakaz soti nan Trametes Versicolor se yon solisyon dlo-etanòl nan pH 3.6. Yo te detekte uit fraksyon ki koresponn ak uit potansyèl pwodwi dimerik oksidasyon. Pwofil fraksyon yo te konpare ak pwofil yo te jwenn ak de lòt oksidoreductases:polifenol oksidazekstrè nan rezen ak lakaz soti nan Botrytis cinerea. Des yo te sanble anpil, byenke kèk diferans minè sijere diferans posib nan reyaksyon anzim sa yo. Lè sa a, senk fraksyon yo te izole ak analize pa espektroskopi 1D ak 2D NMR. Anplis de sa nan tras nan nitrat Kadmyòm nan echantiyon yo solubilize nan asetòn te mennen nan siyal NMR konplètman rezoud nan pwoton fenolik, ki pèmèt detèminasyon an klè estriktirèl nan sis pwodwi reyaksyon, youn nan fraksyon yo ki gen de enantiomère. Pwodwi sa yo ka itilize plis kòm makè oksidasyon pou mennen ankèt sou prezans yo ak evolisyon nan diven pandan vinifikasyon ak aje diven.

Mo kle: makè oksidasyon;( plis )-katechin; siyal RMN fenolik; lakaz; nitrat kadmyòm; polifenol oksidaz

Klike pou w jwenn plis enfòmasyon

1. Entwodiksyon

Polifenolse yon fanmi konpoze chimik lajman prezan nan lanati. Yo jwenn yon kantite enpòtan nan te [1], kakawo [2,3], blueberries [4], rezen [5l, ak pwodwi fèrmante tankou diven [6]. Lè yo vize oksidasyon prensipal J7,8], estrikti chimik polifenol yo toujou evolye. Chanjman sa yo afekte pwopriyete organolèptik anpil kalite manje; yo responsab fenomèn tankou manje mawon [9] ak modifikasyon nan karakteristik sansoryèl diven an [10,11. Nan enoloji, fenomèn oksidasyon sa a pran plas nan rezen oswa ven. Konsènan oksidasyon anzimatik, anzim prensipal ki responsab pou mawon yo se oksidoreductases, pi jisteman,polifenol oksidazprezan nan rezen ak lakaz ki pwodui pa Botrytis cinerea [12].

Anzimatikoksidasyonsitou fèt nan mout rezen, men plis mawon diven ka akòz reyaksyon oksidasyon chimik |7,13]oswa Botrytis cinerea laccase ki ka trè estab pandan aje diven14. De aktivite anzimatik oksidasyon ka rive sou substrats fenolik: aktivite monofenol oksidaz karakterize pa idroksidasyon yon gwoup idroksil ki egziste deja pozisyon adjasan ak aktivite diphenol oksidaz ki koresponn ak oksidasyon ortho-dihydroxybenzenes ortho-benzoquinones.

Dapre Komite Nomenklati Inyon Entènasyonal Biochimi ak Biyoloji Molekilè (NC-IUBMB), aktivite anzimatik sa yo katalize pa anzim klas EC1-ki koresponn ak oksidoreductases. Pami yo, twa klas prensipal oksidoreductases ki katalize oksidasyon polifenol yo se EC1.14.18.1 (monophenol monooxygenase), EC1.11.1 (peroksidaz/POD), ak EC1.10.3 (oksidoreductases aji sou diphenols).

Dènye klas sa a divize an diferan subklas, e de nan yo te parèt patikilyèman enteresan pou etid sa a: EC1.10.3.1 (polyphenol oxidase/PPO) ak EC1.10.3.2 (laccase) (Gade Materyèl Siplemantè Figi S1).

PPO, laccase, ak peroksidaz yo se oksidoreductases prensipalman responsab pou mawon pandan pwosesis rezen [13]. Browning ki te koze pa POD se neglijab nan fwi men li ka ogmante degradasyon fenol lè yo konbine avèk PPO [15]. PPO se natirèlman prezan nan rezen epi li kapab katalize oksidasyon monofenol nan katekòl ak nan katekòl nan pigman mawon [8,13,16]. Lakaz, ki fèt nan rezen ki enfekte ak Botrytis, gen yon spectre aksyon pi laj|17|kòm yo ka katalize oksidasyon anpil substrats diferan. Objektif oksidasyon lakaz prensipal yo rete 1-2 ak 1-4 dihydroxybenzene.

Nan diven, benzoquinone ki pwodui pa oksidasyon (PPO oswa lakaz) ka fasil sibi plis reyaksyon depann sou pwopriyete redox yo ak afinite elektwonik [15]. Yo ka swa aji kòm elektwofil epi reyaji ak dérivés amine [18] oswa aji kòm oksidan epi reyaji, pami lòt moun, ak substrats fenolik. Tou depan de konfòmasyon chimik yo (quinone oswa semi-quinone), benzoquinone ka mennen nan diferan pwodwi reyaksyon oksidasyon. Nan yon pH net, (plis)-catechin pral soksid nan kinone sou pozisyon A-bag C5 oswa C7 epi mennen nan fòmasyon nan sis izomè dimerik posib ki vle di yon lyen ant pozisyon B-bag C2', C5', oswa. C6' nan inite catechin anwo a ak pozisyon A-bag C6 oswa C8 nan inite ki pi ba a [19,20]. Dehydrodicatechin se yon pwodwi byen koni nan kouple sa a [21]. Pozisyon etikèt estrikti yo parèt nan Figi 1. Anba kondisyon asid, fòm semi-quinone ka prezan tou sou bag B (pozisyon OH3'oswa OH4') epi mennen nan kat izomè dimerik posib [20,22] ak inite catechin anwo a ak bag A nan inite ki pi ba a (pozisyon C6 oswa C8). Oksidasyon anzimatik Catechin te envestige nan etid anvan [22,23], ak pwodwi oksidasyon ki asosye yo te karakterize pa HPLC [24], menm si pi raman izole epi pa janm konplètman karakterize pa NMR.

Objektif travay sa a te premye konpare pa UHPLC-MS pwofil pwodwi oksidasyon dimerik (plis)-catechin yo nan prezans twa ekstrè oksidoreductase, sa vle di, PPO ekstrè soti nan rezen, lakaz soti nan chanpiyon Botrytis cinerea prezan nan ven dous botrytized. [14], ak lakaz soti nan Trametes Versicolor.

Dezyèm objektif la se te emisynthesize ak karakterize estrikti yo nan kèk pwodwi oksidasyon dimerik pa espektroskopi NMR jwenn ak lakaz nan Trametes Versicolor.

2. Rezilta ak Diskisyon

2.1. Konparezon pwofil pwodwi reyaksyon dimerik ak twa diferan oxydoreductases ak (plis)-catechin

(plis)-Catechin te premye soksid nan prezans laccase soti nan Trametes Versicolor nan pH3.6 nan solisyon an diven modèl. Apre separasyon fraksyon dimerik la soti nan rezidyèl (plis)-katechin ak lòt fraksyon polymère, UHPLC-UV-MS te kolekte uit fraksyon pi gwo epi analize, ki te note soti nan N1 rive nan N8 nan ogmante lòd tan retansyon (Tablo 1). Spectre mas electrospray yo nan mòd pozitif te montre pik ion yo [M plis H] plis nan m/z 579 pou N1 rive N6, ipotetik ki koresponn ak yon dimè ki te fòme pa yon lyezon sèl ant de inite katechin, ak [M plis H] plis nan m/577 pou N7 ak N8, ipotetik sigjere fòmasyon yon lyezon adisyonèl.

Sa yo uitoksidasyonfraksyon yo te potansyèlman obsève apre depolymerization chimik nan yon fraksyon tanen nan travay anvan yo [25,26] epi yo ta ka pètèt menm jan ak sa yo deja dekri pa Guyot et al. [20], menm si kondisyon eksperimantal yo te yon ti kras diferan. Vreman vre, nan etid anvan sa a, yo te itilize yon ekstrè PPO bit nan pH3 ak 6 pou jwenn uit fraksyon. Nan etid la prezan, twa anzim diferan yo te konpare nan pH3.6 nan solisyon an diven modèl. LC-MS analiz konparatif nan fraksyon oksidasyon pi gwo yo jwenn ak twa anzim yo diferan (laccase soti nan Trametes Versicolor, lac-case soti nan Botrytis cinerea, ak polifenol oksidaz ekstrè nan rezen) yo prezante nan Tablo 2. Pou chak nan uit fraksyon yo, tan yo retansyon yo te prèske ki idantik ak anzim yo diferan, ak menm jan m / z yo te detèmine ak analiz la MS. Rezilta sa yo sipòte ipotèz ke yo te jwenn menm fraksyon yo pou chak anzim, ki gen pwodwi ak estrikti ki sanble ak sa yo te sipoze pa Guyot et al. [20]. Lopez-Serrano ak Ros Barcel6 [27] te fè tou yon etid konparatif sou (plis)-katechin pwodwi oksidasyon yo ak de anzim diferan: peroksidaz ak polifenol oksidaz, tou de ekstrè nan frèz. Yo konkli ke pwodwi yo jwenn ak de anzim yo te kalitatif menm bagay la. Yon lòt konpoze ki rele N4' ak m/z=578 Th ak Rt=15.66 min te obsève nan eksperyans ak lakaz soti nan Botrytis cinerea ak ekstrè PPO men se pa ak lakaz soti nan Trametes Versicolor, ki sijere diferans posib. nan reyaksyon pou anzim sa yo.

2.2. Etid ak Optimizasyon paramèt fizikochimik sou siyal 1H-NMR fenolik ak alifatik OH

Karakterizasyon estriktirèl procyanidins dimè yo ka jwenn pa analiz NMR. An patikilye, pozisyon egzak lyen ant inite yo ka detèmine lè l sèvi avèk HMBC ak / oswa ROESY korelasyon spectre [28,29] (Figi S2 ak S3). Nan ka yon kosyon etè-type (COC), atribisyon nan pwoton siyal hydroxyl nesesè. Li ka enpòtan tou nan ka lyen CC si kèk pwoton alifatik oswa aromat sipèpoze oswa si kèk korelasyon kle yo manke. Sepandan, menm nan yon sòlvan aprotik, pwoton idroksil polifenol yo souvan parèt kòm siyal laj ki pa ka jwenn enfòmasyon estriktirèl [30]. Pwoblèm sa a te pwovizwaman adrese pa adisyon a nan tras nan

Cd(NO3)2 nan echantiyon solisyon yo. Vreman vre, 'H gwo siyal nan gwoup OH yo akòz echanj la entèmolekilè ant pwoton OH sa yo ak lòt pwoton nan sòlvan an oswa solute. Lè yo diminye lyezon entèmolekilè, prezans nitrat Kadmyòm nan echantiyon yo ka diminye echanj sa yo, kidonk amelyore précision siyal pwoton OH.

2.2.1.Efè adisyon Kadmyòm

Apre friz-seche, senk fraksyon N2, N3, N4, N6, ak N8 yo te solubilize nan asetòn-dg. Lè sa a, spectre 1D proton RMN yo te akeri nan 25 degre anvan (Figi 2A) ak apre adisyon a nan ti kantite Kadmyòm (Figi 2B). Nan pi bon kalite asetòn-d., pwoton fenolik OH nan tout fraksyon parèt kòm gwo pik. Apre adisyon nan Kadmyòm, pwoton sa yo te montre siyal trè rezoud nan ka fraksyon N6 ak N8, tandiske pou fraksyon N2, N3, ak N4 siyal yo te sèlman yon ti kras pi file. Li ta dwe tou mansyone ke ogmante kontni an Cd pa te gen okenn efè sou rezolisyon siyal OH, kòm pa gen okenn netteté oswa lajè nan liy pik yo te obsève lè siksesif ti kantite Cd yo te ajoute nan echantiyon yo (done yo pa montre).

Siyal OH fenolik trè rezoud soti nan pwodwi N2, N3, ak N4 yo te reyalize gras a siye adisyonèl ak rezolubilizasyon (Figi 2C, D).

Diferans nan konpòtman sou adisyon Cd ant fraksyon yo ka eksplike pa fòs nan entèraksyon molekilè: pi fò nan ka a nan N2, N3, ak N4 konpare ak N6 ak N8, yon etap plis nesesè yo kraze lyezon sa yo.

Etap adisyonèl sa a ka etap kle lè w ap itilize Cd pou jwenn siyal OH fenolik trè rezoud nan nenpòt sitiyasyon, kèlkeswa orijin echantiyon yo, reyaksyon sentèz la oswa pwodwi natirèl polifenolik yo.

Yon travay anvan fè fas ak karakterizasyon estriktirèl la klè nanpolifenoldimers itilize trè rezoud siyal OH fenolik RMN gras a adisyon nitrat Kadmyòm te pibliye an 1996 [30]. Dapre nou konnen, pa gen okenn lòt papye rechèch ki sèvi ak metodoloji sa a ki te pibliye depi lè sa a. Apre sa, lòt envestigasyon te antreprann pou atenn objektif sa a, swa pa adisyon dòz asid pikrik [31] oswa lè l sèvi avèk yon tanperati akizisyon ki ba [32]. Sa a ka eksplike pa etap ki pi lwen ki nesesè yo ka resevwa yon efè desizif sou précision pik OH ak adisyon Cd, jan sa dekri pi wo a. Sepandan, Kadmyòm sanble gen gwo valè, depi siyal trè rezoud yo ka jwenn san yo pa bezwen ajoute kantite egzak, nan kontra ak asid picric oswa akizisyon spectre NMR nan tanperati ki ba.

2.2.2. Efè Tanperati a

Yon diminisyon nan tanperati a soti nan 25 degre C a 15 degre pa te gen okenn enpak sou précision nan fenolik OH oswa alifatik siyal OH. Men, chanjman anba nan pik pwoton ki ka chanje yo te pèmèt nou separe kèk siyal fenolik ak alifatik OH ki sipèpoze, sa ki fè idantifikasyon yo pi evidan (Figi 3). Lè yo diminye tanperati a, pousantaj echanj pwoton yo te redwi, epi yon moun ta ka espere pi byen file OH alifatik [31]. Tanperati a nan 15 degre se evidamman pa ba ase yo jwenn byen rezoud siyal alifatik OH. Sepandan, li te pèmèt nou idantifye klèman sonorite de pwoton OH alifatik nan echantiyon N3 ak N6 ak youn nan echantiyon N8. Spectre echantiyon N2 te montre tou de siyal pwoton OH alifatik, ki te plis distenge nan 25 degre C pase nan 15 degre (Figi 2E).Nan ka echantiyon N4 la, siyal ki soti nan OH alifatik yo te sèlman an pati vizib nan la spectre, si tanperati a te fikse nan 25 degre oswa nan 15 degre C, akòz sipèpoze ki pèsistan (Figi 2E).

2.3. Karakterizasyon estriktirèl Estanda Dimerik yo - Analiz Spectrum NMR

Spectre NMR nan fraksyon N2, N3, N4, N6, ak N8 te montre ke pwodwi oksidasyon yo te pite segondè depi entansite siyal yo nan lòt konpoze detekte yo te mwens pase 10 pousan konpare ak sa yo ki nan pwodwi sa yo.

Nan tout espèk, yo ka distenge kat rejyon chanjman chimik lH tipik nan inite katechin (Figi 2C): siyal pwoton alifatik bag piran yo (bag C) yo jwenn nan rejyon an soti nan 2.3 a 5. 0 ppm, ak sa yo ki nan pwoton yo siyal aromat nan bag resorcinol (A bag) ak nan bag catechol (Pote) soti nan 5.5 a 6.3 ppm ak 6.3 a 7.1 ppm, respektivman. Siyal fenol OH nan tou de bag A ak B yo te parèt soti nan 7.1 a 10 ppm. Spectre NMR nan tou de fraksyon yo te montre prezans nan seri siyal diferan nan inite catechin nan yon rapò entansite konstan: de seri siyal yo te obsève nan espèk yo nan fraksyon N2, N3, N6, ak N8 an akò ak prezans nan dimer, ak kat ansanm nan spectre N4 yo, ki ka koresponn ak yon sèl tetramer, de dimèr, oswa yon melanj de oligomè diferan, se sa ki, yon sèl trimer plis yon monomè. Yo nan lòd yo detèmine degre nan oligomerization nan pwodwi yo prezan nan fraksyon N4, yo te fè yon eksperyans 'H DOSY lè l sèvi avèk yon melanj ki gen aliquot nan tou de fraksyon N4 ak N2. Koefisyan difizyon tout siyal yo montre valè menm jan an (Figi 4), ki endike prezans de dimè katechin nan fraksyon N4.

Mèsi a siyal fenol OH konplètman rezoud ki bay rezilta quantitative serye, kalite lyen ant inite yo katechin ka dirèkteman dedwi nan entegrasyon zòn sifas pik. Kidonk, pou tou de fraksyon, N3 ak N6, mank de yon sèl OHphenol (ki fè pati swa nan resorcinol oswa nan yon bag katechol) ak mank de yon sèl pwoton aromat resorcinol endike yon lyezon interflavanic (IFL) nan kalite etè ki vle di yon opozisyon nan yon A. oswa B bag ak yon pozisyon C6 oswa C8 nan yon bag A. Nan ka echantiyon N2, de pwoton aromat te manke, youn nan yon bag B ak youn nan yon bag A, ki vle di yon CA-CB IFL. Spectre 1D 'H nan fraksyon N4 te montre ke de pwoton nan bag B la te manke, osi byen ke de pwoton nan bag A a. Lyezon ki genyen ant inite dimè fraksyon N4 yo se konsa tou de kalite CC yo. Spectre fraksyon N8 yo te byen diferan de kat lòt yo. Gen kèk siyal ki te tipik nan inite catechin, kote twa fenol OH, yon bag aromat A, ak yon pwoton bag B te manke, osi byen ke yon sèl OH alifatik. Nan lòt men an, kèk lòt siyal NMR yo atipik nan yon inite katechin: metilèn ak chanjman chimik 13C deblinded (~40 ppm) ak yon gwoup ketonn (~192 ppm).

Sistèm spin proton nan bag C, A, ak B yo te detèmine lè l sèvi avèk tou de 'H 1D ak 1H 2D TOCSY spectre (pa montre). De sistèm spin ABMX C-bag (tipik nan catechin) yo te obsève nan spectre yo nan fraksyon N2, N3, N6, ak N8, ak kat pou fraksyon N4. Nan spectre fraksyon N2, N3, N6, ak N8, de doubt meta-kouple (J ~ 2Hz) ak yon sèl nan rejyon aromat A bag yo te asiyen, respektivman, nan pwoton bag A nan inite katechin ki pa lye. ak pwoton rezidyèl bag A nan inite katechin ki lye C6-oswa C8-. Nan spectre N4, akòz prezans de dim, yo te detekte kat doubt meta-makonnen ak de singlets jan sa dekri pi wo a. Sistèm pwoton bag B yo te tou fasil detèmine nan spectre sa yo epi yo te pèmèt nou idantifye de sistèm vire pwoton ABM pou dimè fraksyon N3 ak N6, alòske yo te detekte yon sèl ABM ak yon sistèm spin pwoton AB pou dimer N2, ak yon sèl ABM ak yon sèl AM sistèm spin proton pou dimer N4. Dimer N8 a te montre yon sèl sistèm vire ABM B-bag tipik nan yon monomère catechin.

2.3.1.Detèminasyon Pozisyon A Ring IFL Dimè fraksyon N2, N3, N4, ak N6.

Etablisman pon an ki sitiye sou bag A nan dimè (sa vle di, C6A-oswa C8A-pozisyon) mande pou atribisyon nan pwoton HA rezidyèl nan inite katechin ki lye CA a. Mèsi a siyal OH fenolik ki trè rezoud, yon pwen depa fasil se idantifikasyon de pwoton OHphenol nan inite A bag-lye yo, sa vle di, bag A ki

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm） ki te fasil atribiye a C7A ak C8A, respektivman. Yon fwa ke C6A ak C8A yo asiyen, rezidyèl HA pwoton yo ka dirèkteman atribiye nan espèk HSQC yo. Se konsa, li te jwenn ke rezidyèl HA pwoton sa a te H6A pou tout fraksyon N2, N3, N4, N6. IFL ki genyen ant inite katechin yo te enplike yon pozisyon C8A pou tout dimè yo.

2.3.2. Detèminasyon Pozisyon B Ring IFL la

Dimè fraksyon N2 ak N4. Spectre fraksyon N2 te montre de diferan kalite sistèm spin proton B bag: yon sèl AMX ki koresponn ak bag B nan inite ki pa lye a, ak yon sèl AM ak yon konstan kouple apeprè 8 Hz, karakteristik H6'B ak H5'. B nan yon inite C2'B-lye. Lyen ki genyen ant inite N2 dimè a se konsa C2'B-C8A. Spectre NMR nan fraksyon N4 te montre tou diferan sistèm vire B: de AMX, ki koresponn ak bag B ki pa lye, ak de sistèm AXspin, tou de montre konstan kouple apeprè 2 Hz, ki se karakteristik H2'B ak H6'. B pwoton nan inite C5'B ki lye. Prezans alontèm 'H/13C korelasyon ant H6'Band C8A, ki te obsève nan spectre HMBC de dimè yo, yo an akò ak yon lyen C5 / 'B-C8A (Figi 5).

Dimè fraksyon N3 ak N6. Spectre fraksyon N3 ak N6 te montre prezans de sistèm pwoton AMX B-bag ak mank de yon siyal fenol OH. Depi tout pwoton fenolik OHA nan inite dimer yo te idantifye (jan sa dekri pi wo a), siyal fenolik OH ki manke a ka swa OH3'B oswa OH4'B.

Pozisyon OH (3'B oswa 4'B) ka fasil pou detèmine atravè korelasyon ROE ak H2'Bor H5'B, respektivman, oswa lè l sèvi avèk korelasyon HMBC alontèk jan yo montre nan Figi 5.

Atribisyon OH rezidyèl bag B yo te fasilman fèt lè l sèvi avèk korelasyon HMBC oswa ROESY alontèm, jan sa montre nan Figi 5. Nan ka dimère N3, yo te obsève yon korelasyon ROE ant H5'B ak OH rezidyèl la. 'B nan inite katechin la lye nan bag B li yo. Se konsa, OH sa a te idantifye kòm OH4'B. Nan ka a nan fraksyon N6, OH'B rezidyèl la te asiyen nan OH3'B, paske yo te obsève yon korelasyon ROE ant OH sa a ak H2'B. Korelasyon alontèm HMBC yo an akò ak atribisyon sa yo. Lè sa a, yo te detèmine pozisyon lyen de dimè sa yo jan sa a: CO3'B-C8A ak CO4'B-C8A pou N3 ak N6. respektivman.

Fraksyon N8.Analiz spectre nan dimè N8 a te montre ke yon inite nan dimè sa a se katechin la ak de pozisyon lyen youn nan bag A, youn nan C8A a, ak lòt la nan pozisyon C-O7A, depi pwoton yo H8A ak OH7A yo. manke. Lòt inite nan dimer sa a te montre karakteristik espèk sengilye, ki endike pèt aromatisite B bag la ak prezans plizyè pozisyon lyen sou tou de bag B ak C.

Siyal 'H NMR ki soti nan bag B la te de doublet nan 2.49 ak 2.71 ppm, ki montre yon kouple geminal nan ~ 15 Hz (12.03 ppm) tipik nan yon gwoup metilèn ak yon singlet nan 6.38 ppm ki soti nan yon pwoton etilenik. Piske pwoton metilèn ak etilèn sa yo pa te makonnen, yo gen anpil chans pou yo nan pozisyon 2'B ak 5'B. Spectre HIMBC a te montre tout korelasyon, ki te pèmèt atribisyon egzat nan kabòn bag B sa yo, jan sa montre nan Figi 5. H2C nan inite sa a te bay twa korelasyon ak kabòn bag B: youn se kabòn nan metilèn nan ~ 45 ppm, ki te konsa atribiye a. C2'B, ak de ki rete yo, ak kabòn sonan nan ~ 90 ppm ak ~ 162 ppm, ki ka asiyen nan C1'B ak C6'B.H5'B te bay sèlman fò korelasyon 3J ak de kabòn kwatènè nan bag sa a B. : youn se kabòn ki te deja asiyen nan C3'B (~ 95 ppm), ak lòt la, ki rezone nan ~ 90 ppm, ta ka konsa dwe atribiye a C1'B. Lè sa a, kabòn nan ~ 162 ppm te dedwi yo dwe C6'B.

Prezans yon OH alifatik (~5.8 ppm) nan pozisyon C3'B (~95 ppm) te detèmine atravè korelasyon ROE li yo ak tou de pwoton H2'B. Anplis de sa, OH3/B te bay HMBC korelasyon ak yon kabòn kwatènè nan ~ 192.5 ppm, karakteristik yon gwoup ketonn nan pozisyon C4'B la.

Pwoteksyon C1'B sa a nan apeprè 40 ppm se an akò ak yon pèt nan aromatisite nan bag B. Anplis de sa, mank de OH nan pozisyon C7A nan lòt inite a se akò ak yon lyen etè C1'BO-C7A.

Done NMR yo te montre ke bag C nan inite sa a pa gen okenn OH3C. Prezans nan yon lyezon C3C-O-C3'B se an akò ak pwoteksyon C3C nan apeprè 1.5ppm ak chanjman chimik nan C3'B ki se tipik nan kabòn hemiketal (95 ppm).

Ansanm, done espèk NMR yo pèmèt nou konkli ke dimè sa a koresponn ak dehydrocatechin A ki dekri pi bonè pa Winges et al.[33] epi apre sa Guyot et al.[20].

Estrikti sis konpoze dimerik yo detèmine pa analiz NMR sa yo montre nan Figi 6, N2, N3, N6, ak N8 yo se pwodwi pi, ak N4 se yon melanj de de izomè.

3. Materyèl ak Metòd

3.1.pwodwi chimik yo

(plis)-Catechin idrat Pi gran pase oswa egal a 98 pousan; laccase soti nan Trametes Versicolor (0.94 U·mg-1); sodium phosphate dibasic dihydrate Pi gran pase oswa egal a 98 pousan; asid asid (ACS reyaktif, nitrat Cadmium tetrahydrate 99.997 pousan; asid fòmik ak Amberlite XAD7HP yo te jwenn nan Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, USA). Acetone-dgwas te achte nan men Euriso-top (Saarbrüicken, Almay), ak trifluoroacetic. asid (TFA) soti nan Roth Labo(Karlsruhe, Almay).Dlo LC-MS, acetonitrile LC-MS(ACN), ak metanol LC-MS (MeOH) yo te tout soti nan VWR (Radnor, PA, USA).

3.2. Preparasyon nan solisyon an diven modèl

Solisyon diven modèl la se te yon solisyon etanòl/dlo (12/88;o/o) ak 0.033 M asid tartrik, ajiste a pH 3.6 ak NaOH 1 M [34].

3.3. Ekstrè PPO rezen brit

Ekstrè PPO a te prepare jan Singleton et al te dekri deja.[35]. Rezen nan frizè yo te premye melanje nan yon tanpon acetate (1.5 M, pH5; 10 gL-I asid ascorbic). Lè sa a, melanj lan te filtre ak santrifuje (3000 g; 10 min). Te rezidi a finalman lave ak asetòn (80 pousan) ak lè-cheche.

3.4.Laccase soti nan Botrytis Cinerea

Laccase soti nan Botrytis cinerea te jwenn jan sa dekri pa Quijada-Morin et al.[36]. Li te pwodwi apati souch VA612 (kolekte nan 2005 nan yon jaden rezen nan Hautvillers, Champagne, Lafrans, nan kiltirèl Pinot Noir). Yon ti tan, kilti sou mwayen ledven malte solid yo te kite pou yon semèn nan 24 degre anba limyè ble. Apre sa, yo te grate espò yo epi yo te vaksinen nan yon flacon Erlenmeyer 5{0{0 mL ki te genyen 125 mL mwayen kilti (4{{30}} gL-1glikoz, 7 gL{{1{0}}gliserin, 0.5 g·L-1L-histidine,0.1 g:L-1 CuSO,1.8gL-1 NaNO3,0.5g:L -1 KCl,0.5gL-1 CaCl2·H2O,0.05g:L-1 FeSO4.7H2O,1.0g L{-1KH2PO4, ak 0.7 gL{-1 MgSO 4-7H2O).Apre 3 jou enkubasyon ak 2 jou kwasans nan menm mwayen anvan an, yo te ajoute asid galik (2 gL-1) nan pre-kilti yo. Apre 5 jou, yo te filtre mwayen likid la, epi yo te soumèt supernatant nan filtraj tanjansyèl nan yon sistèm filtraj Quixstand (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Angletè) ekipe ak yon pwa 30 kDa-molekilè koupe manbràn la. Te konsantre nan finalman sibi yon dyafiltrasyon kont dlo distile, epi sèlman fraksyon yo ki te prezante aktivite oksidan kont ABTS yo te kenbe (-80 degre).

3.5.Oksidasyon Pwosedi

Yon solisyon lakaz (1 gL-1) nan tanpon fosfat-sitrat te deja prepare epi ajoute nan yon solisyon 6g.L-1(plis)-catechin (diven modèl) pou jwenn yon konsantrasyon final lakaz nan { {6}}.3 gL-1. Lè sa a, solisyon an jwenn yo te dousman brase (180 rpm) nan tanperati chanm pou 2 èdtan. Konsantrasyon yo te deja optimize, epi eksperimantasyon an te fèt an triple.

3.6. Reyaksyon kanpe sou résine Amberlite XAD7HP

Yon kolòn Amber Lite te kondisyone ak etanòl (absoli) epi rense ak de volim kolòn nan milli-O dlo. Mwayen reyaksyon lakaz/(plis)-catechin anvan an te jete sou kolòn nan epi premye elite ak de volim kolòn milli-Qwater [37]. Lè sa a, kolòn nan eluye ak etanòl jiskaske fraksyon nan kolekte pa gen koulè. Se sèlman fraksyon etanòl yo te kenbe, evapore, ak lyofilize. Poud lan te estoke nan -80 degre jiskaske yo itilize.

3.7.Purifikasyon Pwosedi Fraksyon Dimerik la Sèvi ak Flash Chromatography

Poud liyofilize a te premye pirifye lè l sèvi avèk yon sistèm kwomatografi flash puriflash430 ekipe ak yon detektè UV mete nan 280 nm ak yon kolòn Puriflash dyol 50 um f0025. Faz mobil binè a fèt ak asetonitrile (sòlvan A) ak metanol (sòlvan B), tou de asidifye ak 0.1 pousan TFA. Yo te fè yon seri piki nan yon vitès konstan koule 20 mL·min-1, lè l sèvi avèk gradyan sa a: 100 pousan A pou 4.4 min; 0-10 pousan B nan 10 min;10 pousan B pou 5 min; 10-90 pousan B nan 5 min;90 pousan B pou 3 min;90-10 pousan B nan 2 min;10 pousan B pou 10 min. Volim piki a te 1mL (300 mg lyofilize poud ki fonn nan 1 mL sòlvan A). Twa fraksyon diferan yo te kolekte chak fwa. Premye a te koresponn ak rezidyèl (plis)-catechin, ak twazyèm lan se te yon melanj de polifenol ki gen anpil pwa molekilè. Dezyèm fraksyon elite a, ki gen yon melanj de pwodwi oksidasyon dimerik, te evapore ak lyofilize anvan dezyèm etap pirifikasyon an.

3.8. Pwosedi pou pirifye pwodwi oksidasyon ki soti nan fraksyon dimerik lè l sèvi avèk yon sistèm chromatografik semi-preparasyon.

Fraksyon ki gen pwodwi oksidasyon dimerik yo te pirifye lè l sèvi avèk yon semi-preparasyon Bio-Rad NGC 10 mwayen-presyon kwomatografi sistèm ekipe ak yon faz ranvèse Varian Dynamax C18 Microsorb kolòn (250 × 21.2 mm; 3 um). Faz mobil binè a konsiste de dlo milli-O (sòlvan A) ak 80 pousan acetonitrile, 20 pousan dlo Milli-Q (sòlvan B), tou de asidifye ak 0.05 pousan TFA. Yon seri piki (300 μL) poud liyofilize a (20 mg ki fonn nan 200 uL sòlvan A ak 100 uL ACN) yo te fè nan kondisyon elisyon sa yo: 100 pousan A pou 4 min; 0-35 pousan B nan 46 min;35-100 pousan B nan 2 min;100 pousan B pou 5 min. Uit fraksyon diferan yo te kolekte chak fwa, ki koresponn ak siyal UPLC pi bon kalite nan 280 nm. Chak fraksyon te evapore ak lyofilize anvan analiz NMR.

3.9.Preparasyon echantiyon pou analiz RMN

Apeprè 1 mg nan chak poud lyofilize filaplon nan tib Eppendorf te rezoud nan 500 μL nan asetòn-dg. Lè sa a, ~ 10 uL nan yon solisyon konsantre nan nitrat Kadmyòm nan asetòn-d, yo te ajoute nan echantiyon yo, epi solisyon yo ki kapab lakòz yo te transfere nan 5 mm tib NMR pou analiz NMR. Yo te fè yon etap adisyonèl pou kèk echantiyon: apre solubilizasyon poud yo lyofilize nan asetòn-dg nan prezans tras nan Kadmyòm, echantiyon yo te evapore nan sechrès ak Lè sa a, re-solubilize nan asetòn-d san plis adisyon nan Cd.

3.10.Espesifikasyon Enstriman

UPLC-MS analiz. Reyaksyon yo te kontwole lè l sèvi avèk de sistèm UPLC-MS. Premye a te itilize pou idantifye jisteman pwodwi retansyon fwa lè l sèvi avèk yon metòd gradyan long. sa vle di, Waters ranvèse-faz Ultra-High-Performance Liquid Chromatography makonnen ak Mass Spectrometry (UHPLC-MS). Sistèm chromatografi likid la se te yon Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, USA) ekipe ak yon detektè fotodyode etalaj. Nou itilize yon kolòn Acquity UPLC HSS T3 (1.8 um, 2.1 × 150 mm). Tanperati kolòn nan te 25 degre. Faz mobil binè a konsiste de 0.1 pousan asid fòmik nan dlo (sòlvan A) ak asetonitrile (sòlvan B). Separasyon an te fèt ak yon vitès konstan 0.25mL·min-1,sèvi ak gradyan sa a:8-11 pousan B nan 2 min;11 pousan B pou 8 min; 11-25 pousan B nan 15 min;25-55 pousan Bin 5 min;55-99 pousan Bin 1 min;99 pousan B pou 4 min;99-8 pousan Bin1 min;8 pousan B pou 4 min. Volim piki a te 5 μL. Espektromèt mas la se te yon Waters Acquity QDa electrospray ionization (ESI) senp quadrupol (Waters, Milford, MA, USA). Voltaj kapilè a te fikse nan 0.8 kV. Yo te akeri spectre mas yo sou yon seri mas de 200-900 Mens mòd ion pozitif la.

Dezyèm sistèm UHPLC-MS, ki te itilize pou verifikasyon rapid pandan etap pirifikasyon yo, te menm jan sa dekri anvan an, ak yon kolòn Acquity UHPLC HSS T3 （1.8 μm, 2.1×100 mm） chofe. nan 38 degre. Separasyon an te fèt nan yon vitès konstan koule 0.55 mL·min-1, lè l sèvi avèk gradyan rapid sa a: 0.1-40 pousan B nan 5 min; 40-99 pousan B nan 2 min; 99 pousan B pou 1 min; 99-0.1 pousan B nan 1 min. Volim piki a te 2 μL. Espektromèt mas la se te yon pèlen iyon Bruker Amazon X electrospray ionization (ESI) (Bruker Daltonics, Bremen, Almay). Voltaj kapilè a te fikse nan -5.5 kV. Yo te akeri spectre mas yo sou yon seri mas de 50-2000 Mens mòd ion pozitif la.

Tout analiz UPLC-MS yo te fèt an triple.

Enstrimantasyon RMN. Tout espèk RMN yo te anrejistre sou yon espektwomèt Agilent DD{{0}} MHz (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), ki fonksyone nan 500.05 ak 125.74 MHz pou nwayo pwoton ak kabòn-13, respektivman, lè l sèvi avèk yon pwofonde deteksyon endirèk 5 mm ekipe ak yon bobin gradyan.1D'H ak 13C, 2Dhomonuclear1H TOCSY ak ROESY, ak heteronuclear lH/13C HSQC ak HMBCexperiments yo te fèt lè l sèvi avèk sekans batman kè klasik ak analize lè l sèvi avèk tou de VNMRJ4.2 ak MestRe2Nova 144. .1 (Mestrelab Research, Espay) lojisyèl. Mezi DOSY yo te akeri ak trete jan yo te dekri deja 38]. Paramèt akizisyon yo nan sekans batman kè DgcsteSL yo te jan sa a: tan an reta difizyon ak lajè a batman kè gradyan yo te fikse nan 50 ms ak 2 ms, respektivman, fòs la gradyan (g) te ogmante nan 16 etap ak espas g2 egal soti nan 0.3 a. 32G·cm-mwen. Apre koreksyon faz, yo te konstwi espèk 2D DOSY apati mezi wotè pik la lè l sèvi avèk lojisyèl VNMRJ4.2.

Tout spectre yo te fè referans ak siyal sòlvan asetòn-dg yo ('H rezidyèl siyal nan 2.05 ppm ak siyal 13C nan 29.92 ppm).

4. Konklizyon

Aksyon twa diferan oxidoreductases (polifenol oksidaz extrait nan rezen, laccase soti nan Botrytis cinerea, ak laccase soti nan Trametes Versicolor) sou (plis) -catechin yo te envestige, ak pwofil yo LC-UV-MS ki kapab lakòz yo te sanble anpil, byenke kèk diferans minè. sijere diferans posib nan reyaksyon anzim sa yo.

Estrikti sis pwodwi oksidasyon catechin-laccase (itilize lakaz ki soti nan Trametes Versicolor) yo te jwenn sou baz siyati NMR espesifik (kat pwodwi pi, sa vle di, N2, N3, N6, ak N8, ak N4, ki koresponn ak yon melanj de). de izomè). Atribisyon konplè nan siyal fenolik OH te posib gras a adisyon nan nitrat Kadmyòm ak yon pwosedi preparasyon echantiyon ki te pèmèt atribisyon an klè nan lyen ki genyen ant inite yo catechin pou kèk nan konpoze yo nan enterè yo. Pwosedi sa a pral senplifye anpil analiz NMR nan melanj polifenol, swa sentèz oswa ekstrè soti nan pwodwi natirèl.

Estanda yo jwenn nan travay sa a ka itilize alavni kòm makè oksidasyon pou mennen ankèt sou prezans yo ak evolisyon yo pandan matrité rezen ak aje diven. Anplis catechin, lòt konpoze polifenol, ki gen ladan flavonoid ak ki pa flavonoid, ka itilize tou kòm substrate nan lakaz pou jwenn nouvo estanda adisyonèl.

Abreviyasyon yo

NMR: rezonans mayetik nikleyè,

CD: Kadmyòm,

TOCSY: Spèktroskopi korelasyon total,

ROESY: Wotasyon-ankadreman nikleyè Overhauser efè spèktroskopi,

HSQC: Eksperyans korelasyon eteronikleyè yon sèl-pwopòsyon,

HMBC: Koneksyon milti-band eteronikleyè,

DOSY: espektroskopi òdone difizyon.

Referans

1. Khan, N.; Mukhtar, H. Tea polifenol pou pwomosyon sante. Lavi Sci. 2007, 81, 519–533. [CrossRef]

2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Karakterizasyon New Flavan-3-Ol Derivatives nan fèrmante pwa kakawo. Manje Chem. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]

3. Rimbach, G.; Melchin, M.; Moehring, J.; Wagner, AE Polifenol ki soti nan kakawo ak sante vaskilè—Yon revizyon kritik. Ent. J. Mol. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]

4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, A.; Wickramasinghe, SR Konsantrasyon polifenol soti nan ekstrè Blueberry Pomace lè l sèvi avèk nanofiltrasyon. Manje Bioprod. Pwosesis. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]

5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Karakterizasyon polifenol ak evalyasyon kapasite antioksidan nan pòs rezen nan Cv la. Malbec. Manje Chem. 2015, 178, 172–178. [CrossRef]

6. Saucier, C. Ki jan polifenol diven evolye pandan aje diven? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]

7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, Mekanis oksidasyon AMS ki rive nan diven. Manje Res. Ent. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]

8. Singleton, VL oksijèn ak fenol ak reyaksyon ki gen rapò nan Musts, diven, ak sistèm modèl: Obsèvasyon ak enplikasyon pratik. Am. J. Enol. Vitic. 1987, 38, 69–77.

9. Mathew, AG; Parpia, HAB Browning Manje kòm yon reyaksyon polifenol. Nan pwogrè nan rechèch manje; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 1971; Volim 19, paj 75–145. [CrossRef]

10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Evolisyon nan konpoze fenolik ak astringence pandan aje diven wouj: Efè ekspoze oksijèn anvan ak apre boutèy. J. Agric. Manje Chem. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]