Sekans Genome antye pou dyagnostik twoub ekspansyon repete newolojik nan UK a: yon presizyon dyagnostik retrospektiv ak etid Validasyon klinik pwospektiv

Pou plis enfòmasyon:ali.ma@wecistanche.com

Rezime

Background

Twoub ekspansyon repete afekte apeprè 1 nan 3000 moun epi yo se maladi klinik etewojèn ki te koze pa ekspansyon repetisyon kout ADN tandem. Tès jenetik yo souvan espesifik, sa ki lakòz anba dyagnostik moun ki gen prezantasyon klinik atipik, espesyalman nan pasyan pedyatrik ki pa gen yon istwa fanmi pozitif anvan. Sekans antye genòm yo de pli zan pli itilize kòm yon tès premye liy pou lòt maladi jenetik ki ra, epi nou vize evalye pèfòmans li nan dyagnostik pasyan ki gen maladi.newolojikrepete maladi ekspansyon.

Metòd

Nou te evalye retrospektiv presizyon dyagnostik sekans antye-genom pou detekte loci ekspansyon repete ki pi komen ki asosye aknewolojikrezilta yo (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT, ak TBP) lè l sèvi avèk echantiyon yo te jwenn nan Sèvis Sante Nasyonal nan Angletè nan men pasyan yo te sispèknewolojikmaladi; rezilta tès PCR anvan yo te itilize kòm estanda referans. Yo te egzamine presizyon klinik sekans tout-genom pou detekte agrandisman repete nan pasyan ki te deja teste e ki pa dyagnostike yo te rekrite nan 2013–17 nan 100 000 Pwojè Genòm nan UK a, yo te sispèk yo gen yon jenetik.newolojikmaladi (fòm familyal oswa ki kòmanse byen bonè nan ataksya, neropati, parapleji spastik, demans, maladi newòn motè,pakinsonyenmouvmanmaladi, andikap entelektyèl, oswa maladi neromiskilè). Si yo te fè yon apèl ekspansyon repete lè l sèvi avèk sekans antye-genom, yo te itilize PCR pou konfime rezilta a.

Konklizyon yo

Presizyon dyagnostik sekans tout-genom pou detekte agrandisman repete yo te evalye kont 793 tès PCR yo te fè deja nan NHS nan 404 pasyan yo. Sekans antye-genom klase kòrèkteman 215 nan 221 alèl elaji ak 1316 nan 1321 alèl ki pa elaji, ki montre 97·3 pousan sansiblite (95 pousan CI 94·2–99·0) ak 99·6 pousan espesifik (99·1-99). ·9) atravè 13 loci ki asosye ak maladi lè yo konpare ak rezilta tès PCR yo. Nan echantiyon ki soti nan 11 631 pasyan ki nan pwojè 100 000 Genomes, sekans antye genòm yo te idantifye 81 agrandisman repete, ki te teste tou pa PCR: 68 yo te konfime kòm ekspansyon repete nan seri patojèn konplè a, 11 yo pa t. -patojèn ekspansyon entèmedyè oswa pèmitasyon, ak de yo te repete ki pa elaji (16 pousan pousantaj dekouvèt fo).

Entèpretasyon

Nan etid nou an, sekans tout-genom pou deteksyon ekspansyon repete yo te montre gwo sansiblite ak espesifik, epi li te mennen nan idantifikasyonnewolojikrepete maladi ekspansyon nan pasyan ki pa dyagnostike deja. Konklizyon sa yo sipòte aplikasyon an nan sekans antye-genom nan laboratwa klinik pou dyagnostik la nan pasyan ki gen yonnewolojikprezantasyon ki konsistan avèk yon twoub ekspansyon repete.

Finansman

Konsèy Rechèch Medikal, Depatman Sante ak Swen Sosyal, Sèvis Sante Nasyonal Angletè, Enstiti Nasyonal pou Rechèch Sante, ak Illumina.

Entwodiksyon

Malgre dènye pwogrè nan konpreyansyon nou sou baz jenetik ranewolojikmaladi, jiska 70 pousan nan pasyan ki gen maladi sa yo rete jenetikman pa dyagnostike.1–3 An pati, sa a se akòz defi teknik tès yo pou varyant jenetik konplèks ak repetitif, ki gen ladan agrandisman repete; yo estime ekspansyon sa yo afekte apeprè 1 moun sou 3000 (anèks p 1) epi yo se kòz prensipal plis pase 40 maladi nerojenetik,4 ki gen ladan maladi Huntington ak sendwòm X frajil. Twoub ekspansyon repete yo klinikman ak jenetikman eterojèn, epi ekspansyon repete ka asosye ak divès maladi. Pou egzanp, ekspansyon nan C9orf72 ka prezante swa kòm esklewoz lateral amyotwofik oswa demans frontotemporal.5 Repete ekspansyon nan diferan loci kapab tou bay karakteristik fenotipik menm jan an, ki fè yo difisil pou distenge klinik: repete ekspansyon nan omwen dis jèn ataksi spinocerebellar souvan prezan kòm adilt. -aparisyon ataksya,6 ak moun ki nan C9orf72 ak AR ka tou de lakòz maladi newòn motè.7,8

Twoub ekspansyon repete yo te koze pa yon ogmantasyon nan kantite repetisyon kout sekans ADN tandem, ak papòt yo patojèn pou chak maladi yo espesifik. Gwosè ekspansyon an varye ant mwens pase 30 repete (pa egzanp, nan CACNA1A) a plizyè milye inite repete (pa egzanp, nan FMR1, DMPK, C9orf72, ak FXN, ki ka pwolonje jiska 5 kb nan gwosè). Ekspansyon repete montre enstabilite molekilè, ki ka mennen nan chanjman nan gwosè a repete (jeneralman ogmante nan longè) atravè jenerasyon ak tisi.4 Nan kondisyon sa yo, yon ogmantasyon nan kantite repete souvan mennen nan yon kòmansman pi bonè ak maladi pi grav nan siksesif. jenerasyon.4 Pedyat aparisyon twoub repetisyon ekspansyon yo ka prezante kòm sendwòm miltisistèm san siyati fenotip espesifik,9 epi timoun ki gen maladi sa yo gen plis chans pou yo pa dyagnostike lè yon istwa familyal nan twoub ekspansyon repete absan pase lè li prezan.10– 12

Evalyasyon laboratwa pou ekspansyon repete anjeneral limite nan evalyasyon molekilè vize a nan yon sit endividyèl gide pa dyagnostik klinik la sispèk lè l sèvi avèk PCR ki baze sou oswa metòd Southern blot,13 ki ka koute chè epi pran tan. Anplis de sa, akòz karakteristik fenotip varye ak sipèpoze maladi sa yo, loci ekspansyon repete ki asosye ak maladi a ka rete san tèste.14

Sekans antye-genom ap parèt kòm yon zouti dyagnostik premye liy nan pasyan ki gen maladi ra15, men, jiska dènyèman, yo te panse yo te gen kapasite limite pou evalye loci ki gen agrandisman repete. -ki lakòz ekspansyon repete soti nan done sekans pwochen jenerasyon an.17–22 Isit la, nou rapòte sou evalyasyon an dyagnostik nan yon apwòch sekans tout-genom pou detekte agrandisman repete lè l sèvi avèk done PCR retrospektiv, ak validasyon klinik li nan pasyan nan Pwojè 100000 Genomes ki te gen yon maladi newolojik sispèk, ki pa dyagnostike ak tès jenetik anvan yo.

Metòd

Etidye konsepsyon ak patisipan yo

Evalyasyon sa a nan sekans antye-genom pou deteksyon an nan ekspansyon repete enkli tou de presizyon dyagnostik ak evalyasyon presizyon klinik. Presizyon dyagnostik yo te evalye lè l sèvi avèk done pasyan ki te deja teste pa PCR pou ekspansyon repete yo te konnen ki lakòz maladi newolojik.4 Yo te idantifye pasyan yo nan de sous: Pwojè 100 000 Genomes ak Laboratwa Genomic ki baze nan Lopital Inivèsite Cambridge yo. Cambridge, UK). Pou tou de seri pasyan yo, laboratwa nan Sèvis Sante Nasyonal (NHS) te fè tès PCR sou echantiyon pasyan yo kòm yon pati nan evalyasyon klinik woutin: pou echantiyon nan Pwojè 100000 Genomes, tès PCR yo te fè anvan rekritman nan pwojè a. University College London Lopital Nerogenetics Laboratwa (London, UK); echantiyon ki gen PCR-konfime ekspansyon repete yo te jwenn nan pasyan teste pa laboratwa a Genomic ki baze nan Cambridge. Pasyan ki gen rezilta tès PCR-pozitif ak PCR-negatif pou twoub ekspansyon repete yo te idantifye pou enklizyon nan etid nou an atravè sistèm dosye laboratwa; tout pasyan yo te bay konsantman enfòme alekri pou itilize echantiyon yo pou asirans kalite ak rechèch ak fòmasyon, kòm yon pati nan optimize sèvis klinik ak validation.

Sekans tout genòm chak echantiyon yo te fè nan youn nan de laboratwa: Genomics England (Hinxton, UK) pou echantiyon 100000 Genomes Project (n=254) ak Laboratwa sèvis klinik Illumina (ICSL; San Diego, CA,). USA) pou echantiyon yo jwenn nan laboratwa jenomik ki baze nan Cambridge (n=150). An jeneral, yo te itilize done sa a pou pati presizyon dyagnostik etid la, e li te genyen PCR ak done sekans tout-genom ki soti nan 404 pasyan, ki kouvri 13 loci ki reprezante twoub ekspansyon repetitif newolojik ki pi komen yo: 11 loci ki asosye ak ataksya ak an reta. aparisyon maladi neurodegenerative (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72, ak FXN), yon sèl kote ki asosye ak andikap entelektyèl (FMR1), ak yon sèl ki asosye ak distwofi myotonic (DMPK). Pou chak locus, done tès PCR yo te disponib pou omwen yon alèl elaji (anèks p 24).

Presizyon klinik yo te evalye pa egzamine konkordans agrandisman repete, jan yo detekte ak sekans tout-genom, ak sispèk dyagnostik klinik apre konfimasyon PCR nan pasyan ki gen sispèk maladi jenetik newolojik (fòm familyal oswa bonè-aparisyon nan ataksya, neropati, parapleji spastic, demans). , maladi newòn motè,pakinsonyenmaladi mouvman, andikap entelektyèl, oswa maladi neromiskilè) yo te rekrite nan Pwojè 100000 Genomes nan ane 2013–17. Pwojè 100000 Genomes se yon pwogram UK pou evalye valè sekans antye genòm nan pasyan ki gen bezwen dyagnostik ki pa satisfè nan maladi ra ak kansè. Apre apwobasyon etik pou Pwojè 100000 Genomes pa East of England Cambridge South Research Ethics Committee (referans 14/EE/1112), ki gen ladan pou analiz done ak retounen nan rezilta dyagnostik yo bay pasyan yo, pasyan sa yo te rekrite pa pwofesyonèl swen sante ak chèchè soti nan. 13 Sant Medsin Jenomik nan Angletè epi yo te enskri nan pwojè a si yo oswa gadyen yo bay konsantman alekri pou echantiyon yo ak done yo dwe itilize nan rechèch, ki gen ladan etid sa a. Pwobab yo ak, si sa posib, lòt manm fanmi yo, yo te enskri selon kritè kalifikasyon yo te fikse pou kondisyon espesifik maladi ra (anèks pp 5–11). Yo te rekrite pasyan yo nan Pwojè 100000 Genomes apre tès jenetik estanda swen nan NHS, jan sa endike nan kritè kalifikasyon yo. Done klinik debaz estandadize yo te anrejistre lè l sèvi avèk Human Phenotyping Ontology (HPO)23 kont modèl done espesifik maladi yo.24 Yo te kolekte estati maladi manm fanmi yo, parapò ak endikasyon klinik proband la pou fè tès la tou.

Pou idantifye ekspansyon repete kozatif nan pasyan ki gen maladi jenetikman pa dyagnostike, nou teste pasyan ki gen sispèk maladi jenetik ki konsistan avèk yon maladi ekspansyon repete. Pasyan yo te chwazi sou baz konkordans maladi yo ak tèm HPO ak repete maladi ekspansyon ki asosye. Done sekans tout-genom pasyan yo te entèwoje pou chèche ekspansyon nan seri patikilye nan repete lè l sèvi avèk kat diferan panno ekspansyon repete selon karakteristik klinik yo (anèks p 5). Ekspansyon repete yo chwazi pou enklizyon sou panno sa yo se kote ki pi komen pou ekspansyon repete maladi newolojik ki lakòz. Yo te teste pasyan ki gen karakteristik klinik ki kapab konpatib ak plis pase yon twoub ekspansyon repete sou plizyè panno. Si yo te fè yon apèl ekspansyon repete lè l sèvi avèk sekans antye-genom, yo te fè tès konfimasyon pa PCR.

Pou chak pasyan ki gen yon ekspansyon repete konfime, yo te enfòme klinisyen lokal la sou rezilta potansyèl dyagnostik la, epi yo te evalye kontribisyon ekspansyon repete nan karakteristik klinik pasyan an. Pou ekspansyon repete ki konplètman oswa pasyèlman eksplike karakteristik klinik pasyan an, yo te pibliye yon rapò dyagnostik dapre pwosedi estanda lokal yo.

Pwosedi yo

Pou echantiyon istorik NHS yo itilize nan pati presizyon dyagnostik etid nou an, yo te deja teste ekspansyon repete lè l sèvi avèk anplifikasyon PCR ak analiz fragman. Southern blotting te fèt pou gwo ekspansyon C9orf72. Nan pati presizyon klinik etid nou an, PCR te teste agrandisman repete pa sekans tout-genom ki te detekte nan pasyan ki soti nan 100 000 Pwojè jenom nan echantiyon ki estoke nan laboratwa jenetik NHS yo. Yo bay plis detay, tankou sekans primè, nan apendis la (pp 2–3, 25–26).

ADN te prepare pou sekans genòm antye lè l sèvi avèk preparasyon bibliyotèk TruSeq DNA PCR-Free, epi yo te fè sekans fen pè 150 bp oswa 125 bp sou platfòm swa HiSeq 2000 oswa HiSeq X nan etablisman jenom ki gen gwo debi pou Genomics England, ak nan ICSL. . Genòm yo te sekans nan yon pwofondè mwayèn nan 35 × (31 × a 37 ×; apendis p 27). Genotip kout-tandem-repete yo te fè lè l sèvi avèk pakè lojisyèl ExpansionHunter vèsyon 3.1.2.25,26 An brèf, ExpansionHunter realign lekti sekans atravè yon seri predefini repetisyon kout tandem pou estime gwosè tou de alèl ki soti nan yon moun (anèks p 3).

Pwodiksyon ExpansionHunter gen ladann yon estimasyon kantite eleman repete, gwosè jeneral, ak limit konfyans pou chak lokal yo evalye. Gid ki soti nan Asosyasyon pou Patoloji Medikal ak Kolèj Patolojis Ameriken yo rekòmande enspeksyon vizyèl nan apèl varyan pandan evalyasyon woutin nan varyant sekans segondè-debi.27

Sepandan, varyasyon kout tandem repete pa kapab byen vizyalize pa zouti vizyalizasyon komen tankou Integrative Genomics Viewer.28 Pou egzamine tout done sekans jenom ki kache anba chak apèl jenotip, yo te itilize yon zouti vizyalizasyon graf, ki pèmèt vizyalizasyon dirèk nan haplotypes ak pileup lekti ki koresponn lan. nan jenotip ExpansionHunter (apendis pp 3, 15). Yo te fè enspeksyon vizyèl nan graf la pileup sou tout sekans tout-genom kout tandem repete apèl yo konfime ke prediksyon an ExpansionHunter pou alèl yo te antyèman genyen nan chak lekti (sa vle di, sekans nan repete te pi piti pase longè lekti sekans lan); konfime prezans nan yon ekspansyon monoallelic oswa biallelic; pou detekte apèl fo pozitif; ak detekte alèl fo-negatif nan ekspansyon repete biallelic, tankou FXN (anèks pp 4, 16).

ExpansionHunter estime gwosè repete soti nan done sekans antye-genom lè li analize lekti sekans ki gen totalman oswa pasyèlman yon repete tandem kout. Si yon alèl kout tandem repete pi kout pase longè li a, ExpansionHunter predi gwosè egzak la; si yon alèl kout tandem repete pi long pase longè li, ExpansionHunter estime gwosè repete nan yon CI, tou depann de konpozisyon sekans locus, pwofondè sekans lan, ak kalite sekans lan.

Analiz estatistik

Nou klase repete kòm elaji pa sekans genomic antye si gwosè a te prevwa pa ExpansionHunter te pi wo pase limit la premutasyon, oswa ki pa elaji si gwosè a prevwa te pi ba pase koupe a (anèks p 28).

Yo te kalkile sansibilite ak CIs pou deteksyon ekspansyon repete sekans antye-genom kòm pwopòsyon de alèl ak repete elaji nan mitan alèl ki te deja konfime PCR ak repete elaji. Espesifik la te estime kòm pwopòsyon alèl ki pa elaji nan mitan repetisyon ki pa elaji ki te deja teste pa PCR. Yo bay yon deskripsyon konplè fòmil estatistik yo nan apendis la (p 1).

Pou konpare gwosè repete pa PCR ak estimasyon repete gwosè pa sekans antye genòm, yo te konpare alèl PCR-quantifye ak gwosè repete ExpansionHunter prevwa pou alèl ki pi kout pase longè li nan tout 13 kout tandem repete loki. Konkòdans te kalkile pa pousantaj nan gwosè repete ExpansionHunter prevwa ki te an akò ak gwosè PCR-quantifye, pran an kont erè a PCR nan plis oswa mwens yon repete. Analiz estatistik te fèt lè l sèvi avèk R lojisyèl estatistik vèsyon 3.6.3.

Wòl sous finansman an

Anplwaye Genomics England ak chèchè akademik yo te dirije konsepsyon etid la, enskripsyon pasyan yo, koleksyon done ak sekans yo. Anplwaye Illumina fè sekans echantiyon pasyan 150 kòm yon eleman planifye nan etid jistès dyagnostik sekans genomic antye epi devlope ExpansionHunter. Anplwaye Genomics England, chèchè akademik, ak kootè RTH, ED, ak MAE te fè analiz ak entèpretasyon agrandisman repete nan pasyan yo te rekrite nan Pwojè 100 000 Genomes. Sous finansman yo pa te gen okenn wòl nan entèpretasyon done oswa ekri rapò a.

Rezilta yo

Presizyon dyagnostik sekans tout-genom pou detekte agrandisman repete yo te evalye kont 793 tès PCR yo te fè deja nan NHS nan 404 pasyan (64 pasyan yo te teste pou plis pase yon repete; figi 1). Nan tès sa yo, 183 yo te klase kòm gen yon repete elaji ak 610 kòm pa gen yon ekspansyon repete pa PCR, ki bay yon total de 221 elaji ak 1321 alèl endividyèl ki pa elaji atravè 13 loci maladi (anèks pp 24, 28). Sekans antye-genom klase kòrèkteman 215 nan 221 alèl elaji ak 1316 nan 1321 alèl ki pa elaji konpare ak rezilta tès PCR (anèks pp 27, 29), ki montre yon sansiblite inisyal 97·3 pousan (95 pousan CI 94·2-99). ·0) ak espesifik 99·6 pousan (99·1–99·9; tablo 1). Apre koreksyon vizyèl tout apèl ki baze sou kalite lekti yo, sansiblite ogmante a 99·1 pousan (96·8–99·9) ak espesifik a 100 pousan (99·7–100; figi 2A, tablo 1). Vizyalizasyon alèl yo elaji pèmèt deteksyon rezilta fo-pozitif ak reklasifikasyon tout alèl fo-negatif nan FXN, nan ki se sèlman yon sèl alèl te kòrèkteman klase kòm elaji nan echantiyon ak ekspansyon biallelic (anèks pp 17, 18).

Longè repete yo te quantifye pa PCR nan 509 tès PCR ki entèwoje 945 alèl atravè 13 loci ekspansyon repete. Korelasyon ant ExpansionHunter ak PCR pou gwosè repete ki pi kout ak pi gwo pase longè lekti sekans lan (sa vle di, 150 bp) yo montre nan apendis la (anèks p 19). Yo te obsève gwo konkordans pou repete ki pi kout pase longè li a, ak 92·7 pousan (836 nan 902) akò ant PCR ak ExpansionHunter. Yo te obsève varyasyon Locus, ak gwo konkordans ant ExpansionHunter ak PCR pou ATXN2, ATXN7, CACNA1A, ak HTT, ak konkordans ki ba pou DMPK oswa TBP (anèks p 30). Longè alèl ki pi gwo pase longè li yo te souzèstime pa ExpansionHunter, ki te afekte presizyon nan apèl nan DMPK, FMR1, ak FXN (figi 2B, apendis pp 19, 31).

Malgre ke ExpansionHunter te kapab idantifye kòrèkteman gwo alèl elaji nan FMR1, DMPK, C9orf72, ak FXN (anèks p 29), estimasyon gwosè yo prevwa yo te gen tandans pi ba pase sa yo te jwenn pa PCR kòm gwosè repete ogmante nan seri a patojèn, ki te afekte a. kapasite pou fè distenksyon ant gwo ak ti ekspansyon nan DMPK, C9orf72, ak FXN, oswa ant ekspansyon konplè ak pèmitasyon nan FMR1 (anèks p 31). Pou egzanp, loci ki gen yon longè repete PCR-evalye ki pi gwo pase 200 repete nan FMR1 ak klase kòm yon mitasyon konplè te gen yon gwosè repete vle di ke ExpansionHunter estime 92·6 (SD 17·8; apendis p 31).

Pou teste kapasite deteksyon repete ekspansyon pa sekans genòm antye pou rezoud dyagnostik pasyan yo te teste anvan ak pasyan ki pa dyagnostike jenetikman, nou teste 11 631 pasyan ki gen yon maladi newolojik jenetik sispèk ki te rekrite nan Pwojè 100000 Genomes (figi 1). Done sekans antye-genom yo te evalye lè l sèvi avèk kat diferan panno ekspansyon repete selon karakteristik klinik pasyan an. Kantite pasyan yo teste ak chak nan kat panno yo montre nan tablo 2.

An jeneral, nou te detekte ak vizyèlman konfime agrandisman repete nan echantiyon ki soti nan 105 pasyan (tablo 2, apendis pp 20, 33). Nan sa yo, 81 echantiyon yo te disponib pou tès konfimasyon pa PCR, epi 68 yo te konfime ke yo te gen yon ekspansyon repete (0·6 pousan sede): 45 (1·2 pousan) nan 3692 nan panèl A, uit ({{ {18}}·3 pousan ) nan 2743 nan panèl B, senk (0·6 pousan ) nan 860 nan panèl C, ak dis (0·1 pousan ) nan 6731 nan panèl D. Trèz nan 81 apèl ekspansyon pa te konfime kòm ekspansyon repete patojèn (16 pousan pousantaj dekouvèt fo). Nan sa yo, de yo te alèl ki pa elaji nan ATXN1 ak ATXN2, kat te FMR1 apèl gwosè entèmedyè (apendis p 21), ak sèt yo te FMR1 pèmitasyon.

Detay klinik sou 68 pasyan yo ki gen repetisyon ekspansyon konfime pa PCR, ki gen ladan prezantasyon klinik yo, ekspansyon repete idantifye, ak kontribisyon nan ekspansyon repete nan karakteristik klinik pasyan an bay nan tablo 3; tèm HPO yo, gwosè repete ke ExpansionHunter estime, epi si yo te pibliye yon rapò dyagnostik nan apendis la (p 33).

Ekspansyon yo te obsève nan pasyan ki prezante ak yon gran varyete prezantasyon klinik sipèpoze teste ak panèl A (tablo 3, apendis p 22), ki gen ladan yon ekspansyon repete ATXN2 nan yon pasyan ki gen levodopa ki reponn byen bonè nan maladi Parkinson la ak yon istwa nan ataksya serebeleux pwogresif. , ak AR ekspansyon nan kat pasyan klinikman dyagnostike ak maladi Charcot-Marie-Tooth, ki gen ladan youn ak yon neropati demyelinating jenetikman konfime (sa vle di, maladi Charcot-Marie-Tooth kalite 1, pasyan 42; apendis p 33). Yon pakèt dyagnostik klinik anvan yo te obsève nan pasyan ki gen ekspansyon repete patojèn.

Pou egzanp, nan sèt pasyan ki gen esklewoz lateral amyotwofik oswa lòt maladi newòn motè, yo te idantifye ekspansyon nan AR (n=4) ak C9orf72 (n=3). Nan pasyan ki gen sispèk ataksya éréditèr, nou te idantifye ekspansyon nan loci ki pa te evalye kòm yon pati nan travay dyagnostik woutin nan NHS la nan moman rekritman an, ki gen ladan ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP, ak HTT ( tablo 3). Nou te detekte tou agrandisman repete nan pasyan ki gen karakteristik klinik ki konsistan avèk twoub ekspansyon repete altènatif, ki gen ladan yon ekspansyon C9orf72 nan kòmansman bonè ak maladi Parkinson nan fanmi an (pasyan 24, Tablo 3) ak agrandisman repete nan seri a pénétration redwi nan HTT (38 repete) an de sè ki gen yon twoub mouvman, demans, depresyon, ak difikilte pou lapawòl (pasyan 44 ak 45), ki souliye defi dyagnostik la prezante pa twoub ekspansyon repete sa yo.

Yo te jwenn uit timoun ki te teste ak panèl B yo gen gwo ekspansyon CAG repete (figi 3), sèt ladan yo ki te eksplike konplètman karakteristik klinik pasyan an. Sis pasyan pa t gen yon istwa familyal enfòmatif epi yo pa t ofri yo repete tès ekspansyon kòm yon pati nan evalyasyon klinik yo nan moman rekritman an (pasyan 48-53; tablo 3, apendis p 33). De nan timoun sa yo te pote gwo ekspansyon HTT (90-100 repete CAG). Nòt, yon timoun te eritye repete a nan men yon paran ki pa afekte ki pa gen okenn istwa fanmi maladi Huntington la. Tès fanmi an ap kontinye, men yo te idantifye yon alèl pénétration redwi nan fanmi pwolonje a, ki endike ke repete a te elaji pa plis pase 60 inite repete nan yon sèl jenerasyon (pasyan 52). Nan moman sa a, pèsonn nan fanmi an pa te montre okenn siy maladi Huntington, epi konsèy jenetik ak tès yo ap kontinye pou paran yo. De timoun ki poko gen 5 ane te pote gwo ekspansyon repete nan ATXN7 epi prezante ak maladi konplèks milti-sistèm. Pou youn nan timoun sa yo (pasyan 50), paran yo te montre pwoblèm demach 2 zan apre enskripsyon nan Pwojè 100000 Genomes. Menm jan an tou, yo te jwenn yon ti fi ki gen laj 10 ane ki gen andikap entelektyèl ki te gen yon 99-agrandisman repete nan ATXN2, malgre lefèt ke tou de paran yo te deziyen kòm pa afekte, epi yo te jwenn yon ti fi ki gen laj 18 an ki gen demans ki gen yon { {19}}repete ekspansyon nan ATN1 (anèks p 33).

Senk ekspansyon nan DMPK (panèl C) yo te detekte, ki gen ladan nan yon timoun ak yon manman ki gen yon dyagnostik klinik distwofi miskilè, nan de frè ak sè ak sispèk myopati distal, ak nan yon adolesan ki gen myopati konjenital (pasyan 54-58). Ekspansyon FMR1 (panèl D) yo te detekte nan nèf ti gason ak yon ti fi, ak yon dyagnostik sendwòm X Frajil eksplike konplètman oswa pasyèlman karakteristik klinik yo prezante (pasyan 59-68).

Diskisyon

Dyagnostik la nan maladi ekspansyon repete se defi nan swen sante akòz karakteristik klinik etewojèn ak sipèpoze ak rezilta klinik ki pa espesifik, ki ka ogmante nan severite ak laj ak nan chak jenerasyon ki vin apre. Twoub ekspansyon repete yo se pami kòz ki pi komen nan maladi newolojik eritye yo.4 Sepandan, pasyan yo ka pa dyagnostike, swa paske yo te fè ase tès jenetik oswa paske varyant jenetik ki lakòz yo poko dekouvri. Aktyèlman apwòch tès yo fragmenté, epi pasyan yo ta ka fè tès la ki pa kòrèk repete ekspansyon29 oswa yo ka resevwa yon tès molekilè pou yon diferan klas variant akòz sipèpoze karakteristik klinik yo ak lòt maladi jenetik newolojik.30

Sekans antye genòm yo te itilize nan plizyè anviwònman kòm yon tès dyagnostik premye liy pou maladi newolojik ki ra, men yo te deja panse ke yo gen yon kapasite ki ba pou detekte agrandisman repete. sekans nan anviwònman rechèch la,31 men pa youn nan apwòch sa yo te aplike nan done sekans antye-genom kolekte nan yon gwo kantite pasyan nan sèvis swen sante sèl. Nou prezante prèv ke yon algorithm ki fèt pou detekte ekspansyon repete nan sekans antye-genom ka evalye seryezman agrandisman repete maladi ki pi komen ki lakòz epi rezoud ka deja jenetikman pa dyagnostike nan yon gwo kòwòt nan pasyan ki gen maladi newolojik. Rezilta nou yo endike ke sekans antye-genom ka distenge ant alèl ki pa elaji ak elaji ak sansiblite segondè ak espesifik atravè 13 loci ekspansyon repete (ki ka amelyore plis pa enspeksyon vizyèl), ka byen kalkile gwosè a nan alèl ki pi piti pase longè a li. , epi li ta ka souzèstime gwosè gwo ekspansyon nan FMR1, DMPK, FXN, ak C9orf72.

Lè yo te evalye deteksyon repete ekspansyon pa sekans genomic antye kont rezilta pozitif ak negatif deja jwenn nan laboratwa jenomik dyagnostik klinik lè l sèvi avèk metòd lò-estanda, nou te jwenn yon minimòm de 97·3 pousan sansiblite ak 99.6 pousan espesifik. Anplis de sa, nou te montre ke tou de espesifik la ak sansiblite ka amelyore pa manyèl curation nan pileup la lekti, sa ki pèmèt deteksyon nan rezilta fo-pozitif ak reklasifikasyon nan alèl fo-negatif nan echantiyon ak ekspansyon biallelic. Nan 6731 pasyan yo te teste pou FMR1 (panèl D), 124 apèl yo te prevwa yo dwe elaji. Nou te kapab eskli 97 atravè enspeksyon vizyèl kòm posib fo pozitif. Sa a endike ke 1 nan 54 tès sekans genòm antye ta gen yon apèl FMR1 ki ta bezwen yo dwe enspekte vizyèlman jete yon potansyèl apèl fo-pozitif. Travay ap kontinye pou amelyore metòd jenotip ExpansionHunter pou redwi kantite apèl fo pozitif pou FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 repete) lakòz maladi pi grav, ak ataksya spinocerebellar tip 36 (NOP56), pou ki ekspansyon ki pi gwo pase 650 repete yo konsidere kòm patojèn ak gwosè repete nan 15-650 yo konsidere kòm entèmedyè ak varyant nan siyifikasyon ensèten.

Yo te idantifye plis pase 40 loki ekspansyon repete; anpil nan loci sa yo te sèlman idantifye dènyèman epi kounye a yo asosye ak kondisyon ki pa t eksplike deja, ki gen ladan ataksya serebeleux ak neropati ak sendwòm areflexia vestibular (RFC1) 32 ak epilepsi myoklonik (SAMD12). chwazi pou etid nou an baze sou disponiblite echantiyon kontwòl pozitif ak negatif.

Konklizyon yo prezante isit la sijere ke ExpansionHunter ta dwe kapab klasifye alèl ki pa elaji ak elaji avèk presizyon nan nenpòt kote ekspansyon repete si alèl ki pa elaji yo pi piti pase longè li (sa vle di, 150 bp). Malgre ke pifò loci ekspansyon repete gen alèl ki pi piti pase 150 bp lè yo pa elaji, kèk loci pou ki gwosè alèl ki pa elaji a se tou pre 150 bp (egzanp, NOTCH2NLC)34 ta ka pi difisil pou jenotip lè l sèvi avèk apwòch sa a. Pou loci kote repete agrandi siyifikativman pi gwo pase longè li, sekans antye-genom ka detekte ekspansyon patojèn (eg NOP56,35 RFC120,32). Teknoloji sekans ki ap li lontan k ap parèt yo ta ka ofri apwòch konplemantè lè genotip gwo agrandisman.36

Evalyasyon ekspansyon repete lè l sèvi avèk sekans antye-genom nan 11 631 pasyan ki pa dyagnostike yo te rekrite nan 100 000 Pwojè Genòm yo te bay 68 pasyan ak rezilta eksplikasyon. Yo te rekrite pasyan yo nan pwojè 100 000 Genomes apre tès jenetik estanda swen yo; Se poutèt sa, pwopòsyon de ekspansyon repete idantifye nan kòwòt sa a reprezante yon ogmantasyon nan rannman dyagnostik la nan tès estanda NHS, ki gen ladan tès lokal espesifik pou twoub ekspansyon repete tankou FXN oswa DMPK. Nòt, kèk dyagnostik yo pa te sispèk ki baze sou karakteristik klinik pasyan an, ki gen ladan sis pasyan pedyatrik ki pa te gen okenn istwa fanmi li te ye nan yon twoub ekspansyon repete. Gwosè ekspansyon repete an mwayèn ki prevwa pa sekans genòm antye nan pasyan pedyatrik ki dekri nan etid sa a se sibstansyèlman pi gwo pase mwayèn nan adilt, ki konsistan avèk atant ke pi gwo ekspansyon yo asosye ak kòmansman pi bonè ak pi grav, menm nan timoun yo. Gen plis travay ki nesesè, men konklizyon sa a sijere ke yon evalyasyon patojèn ki depann de laj ak repete gwosè a ta ka sipòte yon dyagnostik pedyatrik lè li diminye danje potansyèl pou idantifye alèl risk pou granmoun, ki mennen ale nan tès prediksyon pa mande pou timoun yo.

Konklizyon nou yo pèmèt etablisman an nan yon workflow dyagnostik klinik pou sekans genomic antye (anèks p 23). Nou pwopoze ke yo fè enspeksyon vizyèl pou tout apèl ki klase kòm elaji pou detekte fo pozitif, ak pou ekspansyon biallelic pou yo te detekte sèlman yon sèl alèl elaji (egzanp, FXN). Nou rekòmande pou laboratwa yo sèvi ak ExpansionHunter pou evalye prezans yon ekspansyon san yo pa respekte gwosè estimasyon epi fè tès PCR konfimasyon kòm yon eleman estanda nan workflow tès la.

Maladi ki ra eritye yo gen ladan yon pakèt karakteristik klinik, ki fè tès jenomik espesifik lokal yo pa efikas, difisil, ak chè. Nou prezante prèv ki montre sekans genòm antye nan klas klinik ak potansyèl pou fè dyagnostik yon seri de maladi newolojik ki ra tipikman prezante ak yon sèl baz, indel, oswa varyant nimewo kopi kapab kounye a pwolonje pou repete ekspansyon. Paske sekans tout-genom bay yon sèl tès ki ka idantifye ekspansyon repete ki pi komen yo, ansanm ak pèmèt tès mitasyon pwen ak varyant nimewo kopi nan jèn ki asosye ak kondisyon sa yo ansanm, li ofri opòtinite pou idantifye pifò pasyan ki gen maladi etewojèn sa yo. ki pa te dyagnostike lè l sèvi avèk tès lokal espesifik. Nan epòk terapi émergentes pou maladi sa yo, deteksyon bonè ta ka vin enpòtan.37 Rezilta sa yo sipòte aplikasyon sekans tout-genom pou deteksyon agrandisman repete nan laboratwa dyagnostik klinik yo, yon apwòch ki deja enkli nan NHS England National Genomic. Anyè tès,38 pou envestigasyon maladi newolojik ra ki pa dyagnostike.

Referans

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Yon plafon dyagnostik pou sekans exome nan ataksya serebeleux ak maladi newolojik ki gen rapò. Hum Mutat 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Parapleji éréditèr spastic nan Lagrès: karakterizasyon yon popilasyon ki pa eksplore deja lè l sèvi avèk sekans pwochen jenerasyon. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Rendeman dyagnostik yon panèl jèn sekans pwochen jenerasyon vize pou twoub mouvman timoun yo: yon etid kowòt 3-ane. Front Genet 2019; 10:1026.

4 Paulson H. Repete maladi ekspansyon. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 frontotemporal demans ak/oswa amyotrophic lateral sclerosis. Seattle, WA: Inivèsite Washington, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Ataksya spinoserebeleux. Nat Rev Dis Primers 2019; 5:24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Klinik neurogenetics: otosomal dominan spinocerebellar ataksya. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Atrofi nan kolòn vètebral ak anpoul miskilè. Nan: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Seattle, WA: Inivèsite Washington, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. Fòm letal nan ataksya spinocerebellar tip 7 ak kòmansman bonè nan anfans. Arch Pediatr 2018; 25:42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Ataxin -7 agrégation ak ubiquitination nan timoun SCA7 ak 180 CAG repete. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Spinocerebellar ataksya tip 2 prezante ak regresyon mantal nan anfans. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Ataksi spinocerebellar nan timoun ki kòmanse 3: distoni lang kòm yon manifestasyon bonè. Tranbleman Lòt Hyperkinetic Mov 2019; pibliye sou entènèt 13 septanm.

13 Zwazo TD. Myotonic dystrophy type 1. Nan: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Seattle, WA: Inivèsite Washington, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Frekans SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS ak C9orf72 repete ekspansyon nan pasyan SCA negatif pou subtip SCA ki pi komen yo. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Sekans antye-genom nan pasyan ki gen maladi ra nan yon sistèm sante nasyonal. Lanati 2020; 583: 96–102.

16 Ashley EA. Nan direksyon medikaman presizyon. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–522.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et al. Itilite dyagnostik ak klinik nan sekans antye-genom nan yon kòwòt fanmi Chinwa ki pa dyagnostike ak maladi ra. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profiling peyizaj lajè genomic agrandisman repete tandem. Asid Nukleik Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Detekte agrandisman repete tandem nan kowòt sekans ak done sekans lekti kout. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Idantifikasyon ki baze sou byoenfòmatik nan repete elaji: yon ekspansyon pentamè entwonik ki pa referans nan RFC1 lakòz CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Kopi-nimewo variants nan klinik genomic sekans: deplwaman ak entèpretasyon pou maladi ra ak ki pa dyagnostike. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Deteksyon nan tout genòm nan repete ADN tandem ki elaji nan otis. Lanati 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. Ontoloji fenotip imen an: yon zouti pou annote ak analize maladi ereditè imen. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomics Angletè. Maladi ra kondisyon done klinik modèl. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (aksede 4 Out 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Deteksyon nan ekspansyon repete long soti nan done sekans antye-genom PCR-gratis. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: yon zouti ki baze sou sekans graf pou analize varyasyon nan rejyon kout tandem repete. Bioenfòmatik 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Estanda ak direktiv pou validation pwochen jenerasyon tiyo byoenfòmatik sekans: yon rekòmandasyon ansanm Asosyasyon pou Patoloji Molekilè ak Kolèj Patolojis Ameriken yo. J Mol Diagn 2018; 20:4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Visualiseur entegratif jenomik. Nat Biotechnol 2011; 29:24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Omojeneite fenotipik nan prezantasyon ki sanble ak maladi Huntington nan yon fanmi SCA17. neroloji 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Maladi Bird T. Huntington, maladi Huntington a sanble, ak kore ereditè benign: kisa ki nouvo? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Dènye pwogrè nan deteksyon repete ekspansyon ak kout-lecture pwochen jenerasyon sekans. F1000Res 2018; 7:736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. Ekspansyon biallelic nan yon repete entwonik nan RFC1 se yon kòz komen nan ataksya an reta. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Ekspansyon TTTCA entwonik ak TTTTA repete nan epilepsi myoklonik familyal adilt benign. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. Noncoding CGG repete ekspansyon nan maladi enklizyon newòn entranikleyè, myopati oculopharyngodistal, ak yon maladi sipèpoze. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. Dyagnostik rapid nan ataksya spinocerebellar 36 nan yon fanmi twa jenerasyon lè l sèvi avèk done sekans sekans antye-genòm ki kout li. Mov Dezòd 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Long-read sequencing émergentes nan jenetik medikal. Front Genet 2019; 10:426.

37 Ellerby LM. Repete maladi ekspansyon: mekanis ak terapi. Neurotherapeutics 2019; 16: 924–27.

38 Sistèm Sante Nasyonal. National Genomic Test Directory: kritè tès pou maladi ra ak eritye. Oktòb 2021.