3-Reseptè adrenèjik sou lenfosit ki enfiltre timè yo soutni ekspresyon PD-L1 ki depann de IFN- -epi li afekte iminite anti-timè nan neroblastom.

Neuroblastoma (NB) se yon timè eterojèn ekstrakranyen ki fèt nan anfans. Yon karakteristik diferan nan timè NB se kapasite neroendokrin yo sekrete katekolamin, ki an vire, atravè ligasyon reseptè adrenèjik, ka afekte diferan chemen siyal nan mikroanvironman timè (TME). Li te deja demontre ke antagonism espesifik nan 3-reseptè adrenèjik (3- AR) sou selil timè NB yo afekte kwasans ak pwogresyon timè yo. Isit la, nan yon modèl sinjenik murin nan NB, nou vize envestige si 3-AR modulasyon an enfliyanse repons sistèm iminitè lame a kont timè. Rezilta yo montre ke 3-antagonism AR mennen nan yon reaktivasyon repons iminitè, ki depann pasyèlman sou patisipasyon aks siyal PD-1/PD-L1. Vreman vre, 3- AR blokaj sou lenfosit ki enfiltre timè yo (TIL) diminye kapasite yo pou sekrete IFN-, ki an vire redwi ekspresyon PD-L1, ki te koze pa enfiltrasyon TIL yo, sou selil timè NB yo. Plis envestigasyon, atravè yon analiz jenomik sou pasyan NB, te montre ke ekspresyon jèn ADRB3 segondè korelasyon ak rezilta klinik pi mal konpare ak gwoup ekspresyon ki ba a e ke ekspresyon jèn ADRB3 afekte diferan chemen ki gen rapò ak iminitè. An jeneral, rezilta yo endike ke 3-AR nan NB TME kapab modil entèraksyon ant timè a ak sistèm iminitè lame a e ke antagonis li yo frape plizyè chemen siyal pro-timoral.

Grafik Abstract

ENTWODIKSYON

Neuroblastoma (NB) se yon maladi konplèks ak etewojèn, ak kalite kansè ki pi komen yo dyagnostike nan premye ane lavi a. NB se yon timè neroendokrin ki soti nan selil precurseur komèt nan krèt neral la pandan devlopman sistèm nève senpatik (SNS). Orijin diferan sa a detèmine lokalizasyon timè, ki anjeneral rive nan glann adrenal la ak / oswa gangli senpatik [1]. Konpòtman klinik NB varye anpil, soti nan timè ki tounen yon fason espontane, rive nan lòt ki vin refractè ak tout terapi ki disponib tankou chimyoterapi entansif, operasyon, radyoterapi, transplantasyon selil souch otològ, ak administrasyon retinoid (13-cis-retinoyik). asid) [2]. Se poutèt sa, yo nesesè sib altènatif ki ka geri pou timè ki pa reponn. Imunoterapi ki baze sou inibitè pòs iminitè (ICIs) reprezante estrateji ki pi pwomèt pou plizyè timè solid [3]. Pami lòt moun, aks siyal ligand lanmò pwograme-1/lanmò pwograme-1 (PD-L1/PD-1) afekte iminite selil T efektè yo epi amelyore tolerans iminitè selil timè yo, jwe yon wòl enpòtan. wòl nan diminye repons anti-timè nan tou de sourit ak kansè imen [4, 5]. Sepandan, pandan ke anpil etid te deja envestige mekanis ki kache siyal PD-1/PD-L1 nan kansè granmoun, yo konnen ti kras nan timè pedyatrik yo. Yon diskisyon konplèks ant SNS ak sistèm iminitè a, atravè lage katekolamin ak aktivasyon siyal reseptè adrenèjik yo, kapab detèmine sò pwogresyon timè nan anpil timè [6]. Sa a ta ka patikilyèman vre nan pasyan NB kote, tout bon, nivo elve nan katekolamin reflete gravite a nan malfezans [7]. Yo fèk idantifye subtip 3-reseptè adrenèjik (3-AR) kòm yon regilatè enpòtan kansè [8–10]. An patikilye, ekspresyon li yo ak aktivasyon, tou de sou timè ak selil stromal nan mikroanvironman timè a (TME), pwovoke chemen siyal pro-timoral ki responsab pou pwogresyon timè nan diferan modèl pre-klinik [11-14]. Isit la, nan yon modèl sinjenik murin nan NB, nou te demontre ke 3-AR sou lenfosit ki enfiltre timè (TILs) soutni yon IFN- - depandan PD-L1 regilasyon sou selil timè yo, ki an vire mennen nan yon TME iminitè-suppressive ki responsab pou chape timè. Anplis de sa, 3-antagonis AR te kapab ogmante kantite CD iminitè-reyaktif8+, asasen natirèl (NK), ak selil dendritik (DCs), epi diminye kantite regilasyon iminitè-suppressive. Selil T (Treg) ak selil suppressor ki sòti nan myeloid (MDSC) nan TME. Anplis de sa, yon analiz Kaplan-Meier te montre ke gwo ekspresyon jèn ADRB3 te asosye ak siviv pòv nan pasyan NB, ak analiz de diferan done piblik ki disponib nan ekspresyon NB revele yon korelasyon enpòtan ant nivo ekspresyon jèn ADRB3 ak jèn ki enplike nan siyal chemen ki gen rapò ak entèraksyon sistèm iminitè/timè.

Benefis cistanche tubulosa-Antitumor

METÒD

Kilti selilè

Neuro-2A murin selil kansè NB yo te jwenn nan ATCC (CCL-131) epi yo te grandi nan DMEM sipleman ak 10% nan FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U·ml-1 penisilin ak 100 ug·ml-1 streptomycin nan 37 degre nan dlo-satire, 5% CO2 atmosfè. Selil nero-2a yo te teste regilyèman pou kontaminasyon mikoplasm yo.

Modèl timè sinjenik murin

Sourit fi NCI A/JCr ki gen 4 semèn yo te achte nan men Charles River Laboratories (Frederick). Selil neuro-2a (N2A) yo te enplante anba lar nan sourit resevwa A/J lè yo enjekte 1 × 106 selil nan 100 ul PBS nan bò dwat la. Lè selil N2A yo te fòme yon timè palpab (apeprè 8 jou), tretman yo te kòmanse. Tretman yo te administre de fwa pa jou pou SR59230A (Tocris Bioscience) ak machin (solisyon fizyolojik), ak nan jou 8 ak jou 12 pou antikò PD-L1 (InVivoMAb anti-sourit PD-L1 (B7-xhH1) #BE0101). , Bio X Cell) ak kontwòl izotip (InVivoMAb rat IgG2b izotip kontwòl # BE0090, Bio X Cell). Administrasyon kontwòl izotip IgG2b pwodui menm rezilta machin yo, kidonk sèlman kondisyon machin yo montre nan figi yo. SR59230A te delivre nan 10 mg / kg nan solisyon fizyolojik atravè intraperitoneal (ip); 250 µg PD-L1 te delivre ip nan 100 µl InVivoPure™ pH 6.5 Dilution Buffer (#IP0065); 250 µg sourit kontwòl izotip IgG2b te delivre ip nan 100 µl InVivoPure™ pH 7.0 Dilution Buffer (#IP0070). Tretman ak FTY720 (#6176, Tocris Biotechne) te administre nan 2 mg/kg pa os (po) depi jou 6. Yo te evalye to kwasans timè a pa mezire mas timè ak yon kalib, epi volim mas timè yo te kalkile kòm volim {{ 41}} [(longè × lajè)2 /2]. Sourit yo te sakrifye apre 8 jou tretman.

Analiz Western blot

Selil yo te kolekte epi lysed nan tanpon RIPA ki gen bwason inibitè proteaz. Apre kantite, yo te itilize 20 ug nan pwoteyin total pou fè yon analiz SDS-PAGE ak WB. Manbràn PVDF yo te enkube lannwit lan ak antikò prensipal anti-PD-L1 (ab238697, Abcam), fosfo-CREB (ab32096, Abcam), CREB (ab32515, Abcam), p-PKA / / (sc- 32968, Santa Cruz Biotechnology), -aktin (sc-1615, Santa Cruz Biotechnology), 3-AR (ab94506, Abcam) nan 4 degre ak Lè sa a, ak antikò segondè espesifik pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Yo te detekte lyezon antikò yo ak pwoteyin espesifik yo lè l sèvi avèk Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad) ak imaj yo te akeri atravè Chemidoc Imaging System (Biorad®). Lojisyèl ImageJ yo te itilize pou fè analiz quantitative, epi entansite siyal gwoup yo te eksprime kòm yon ogmantasyon pli parapò ak valè kontwòl yo.

Ko-kilti pou PD-L1 cytofluorimetric test

Selil timè yo te simen sou MW24 (45,000 selil / byen) epi apre 24 èdtan yo te ko-kilti ak lenfosit, yo te jwenn nan TDLN nan sourit pre-trete pou 2 jou ak Veyikil oswa SR59230A (T2), nan yon rapò simen nan 1:10 (timè / lenfosit). Nan fen peryòd enkubasyon total la (48 h), lenfosit yo te retire ansanm ak mwayen ko-kilti a pa pipette dou, ak Lè sa a, selil timè detache pa tripsinizasyon ak make ak antikò anti-PD-L1 la (CD274 Antibody { {17}}, eBioscience™) pou quantification cytofluorimetric. Selil tache yo te akeri sou yon MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer (Miltenyi Biotec, Gladbach, Almay), ak done yo te trete lè l sèvi avèk lojisyèl Flowlogic (Miltenyi Biotec, Gladbach, Almay).

Ko-kilti pou PD-L1 imunofluorescence ak IFN- quantification

Selil timè yo te simen sou glisad mikwoskòp (20,000 selil/byen) nan glisad chanm Nunc Lab-Tek 4, epi apre 24 èdtan yo te ko-kilti ak lenfosit, yo te jwenn nan TDLN nan sourit trete pou 2 jou ak Veyikil. oswa SR59230A (T2), nan yon rapò simen 1:10 (timè/lenfosit). Apre 48 èdtan, lenfosit nan mwayen kilti a te kolekte pa pipette dou, ak Lè sa a, jete nan santrifujasyon; sipènatant te itilize pou quantifier IFN- atravè Luminex xMAP teknoloji selon enstriksyon manifakti a. Yon ti tan, yo te fè quantification IFN nan mwayen ko-kilti a lè l sèvi avèk Bio-Plex Pro Mouse Cytokine IFN-Set (#171G5017M, Bio-Rad) ak done yo te akeri sou MAGPIX System (Luminex, Texas, USA). Yo te fè analiz lè l sèvi avèk lojisyèl Bio-Plex Manager™ (BIO-RAD, Kalifòni, USA). Selil timè sou glisad mikwoskòp yo te itilize olye pou fè tès iminofluoresan PDL1 la jan sa a. Pou analiz imunofluoresans selil yo te fiks nan 3% paraformaldehyde nan PBS pou 20 min. Yo te jwenn pèmeabilizasyon lè w ajoute yon solisyon ki gen Tween-20 0.5% nan PBS pou 30 min nan tanperati chanm. Lè sa a, selil yo te bloke nan 3% BSA pou 1 èdtan ak enkubasyon ak antikò prensipal anti-PD-L1 (ab238697, Abcam) pou 2 èdtan. Imedyatman, apre yo fin lave nan PBS, glisad yo te enkube ak Alexa-fluor 488 segondè antikò pou 1 èdtan. Imaj yo te jwenn lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan (DMi8 - mikwosistèm Leica).

Chinwa zèb cistanche plant-Antitumor

Elektwoporasyon siRNA nan lenfosit pou 1- 2- ak 3-AR silans

Lenfosit yo te jwenn nan TDLN yo te transfekte ak siRNAs pou selektif 1- (SASI_Mm{01_00090154, sekans: GUGAUCGUGGCCAUCGCCCA, Merck), 2- (SASI_Mm{ {5}}, sekans: CCAAGUUCGAGCGACUACA, Merck) ak 3-AR (SASI_Mm{01_00145466, sekans: CAGUGGACGUGCUCUGUGU, Merck) silans. Yon ti tan, lenfosit yo te electroporated ak siRNAs (100 nM) lè l sèvi avèk 4D-Nucleofector X Unit (Lonza) ak P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Twous (V4XP-3024, Lonza). Yo te fè pwogram DN-100, espesifik pou elektwoporasyon selil T murin yo. Apre elektwoporasyon, lenfosit yo te kiltive nan TexMACS Medium (130-097-196, Miltenyi Biotec) pou 24 èdtan ak Lè sa a, ko-kilti ak selil timè N2A pou 48 èdtan, jan sa dekri deja, pou PD-L1 quantification. -ARs silansman efikasite nan lenfosit te evalye atravè PCR gout dijital jan sa a.

PCR dijital ti gout pou -ARs mRNA quantification

RNA te ranvèse transkri lè l sèvi avèk iScript Advanced cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). ddPCR te fèt lè l sèvi avèk ddPCR Supermix pou Sond (Pa gen dUTP) (Bio-Rad), dapre enstriksyon fabrikasyon, sou yon sistèm QX200 (Bio-Rad) ak yon C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad). Egzamen yo te itilize yo se: Adrb3-FAM (dMmuCPE5088688), Adrb2-FAM (dMmuCPE5089938), Adrb1-FAM (dMmuCPE5100184), Rps{18-HEX (dMmuCPE519647}47196). Done ddPCR yo te analize lè l sèvi avèk lojisyèl QuantaSoft™ (vèsyon 1.7.4, Bio-Rad).

RNA-sekans

Timè eksised yo te mete nan tanpon RLT (Qiagen) ak mekanikman homogenized ak gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec, Glad bach, Almay) lè l sèvi avèk gentleMACS M Tib (Miltenyi Biotec, Gladbach, Almay). Yo te fè ekstraksyon total RNA ak twous RNeasy Plus Mini (Qiagen), swiv enstriksyon manifakti a. Kantifikasyon RNA te fèt lè l sèvi avèk tou de NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers (ThermoFisher) ak Qubit RNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher). Yo te evalye entegrite RNA lè l sèvi avèk Agilent RNA 6000 Pico Kit sou yon Bioanalyzer Agilent ak tout echantiyon ki gen yon nimewo entegrite RNA (RIN) ki pi ba pase 6.00 yo te eskli. Yo te fè preparasyon bibliyotèk lè l sèvi avèk TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold Kit (Illumina) dapre enstriksyon manifakti a, ak yon premye opinyon 500 ng RNA total. Kalite bibliyotèk la te evalye lè l sèvi avèk yon twous Agilent DNA 7500 sou yon Agilent Bioanalyzer, ki te swiv pa kantite bibliyotèk lè l sèvi avèk 1X dsDNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher). Bibliyotèk yo te sekans sou yon Sistèm Sekans NextSeq 550 (Illumina) lè l sèvi avèk NextSeq 500/550 v2.5 (150 sik) Twous Reyaktif High Output (Illumina). Kouri yo te fèt ak yon konfigirasyon 2 × 76 bp.

Quantification mRNA ak analiz transcriptomics

Salmon (v. 1.5.1) nan mòd ki baze sou kat yo te itilize pou fè quantification nan transkripsyon yo, ak transcriptome referans mus musculus la GRCm38.98. Fichye qf ki te lakòz yo te analize pa langaj estatistik R la. Yo te itilize pake tximport pou enpòte done yo nan R, epi pakè AnnotationDbi ak baz done org.Mm.eg.db te tonbe sou jèn yo. Finalman, nou te fè analiz estatistik yo ak DESeq2. Nou te fè yon analiz sou anrichisman anplis (ORA) lè nou itilize pake ClusterProfiler pou nou fè rechèch sou baz done GO: BP, ak analiz estatistik ki te lakòz yo, pou detekte chemen selilè ki chanje yo. Pou nou ka chwazi jèn yo pou analiz anrichisman an nou mete papòt log2FC a 0.5 (| log2FC|⋝ 0.5) ak p-valè ajiste a 0.{ {17}}5. Apre filtraj rezilta yo pa yon valè p de 0.05 nou rekipere 45 pwosesis estatistik deregleman nan mitan 15158 yo teste kont baz done a GO: BP.

Luminex cytokines quantification

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity

【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Sourit yo te sakrifye apre 2 jou nan tretman (T2) ak Veyikil, SR59230A, PD-L1, ak SR59230A + PD-L1, ak mas timè yo te elimine ak sizo ak omojènize lè l sèvi avèk Bio-Plex Cell lysis kit (BIO-RAD, Kalifòni). , USA) ak gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec, Almay). Lè sa a, lisat Tumoral yo te teste pou konsantrasyon cytokin yo pa Bio-Plex Pro™ tès (BIO-RAD, Kalifòni, USA) ki baze sou Luminex xMAP teknoloji. IFN-, TNF-, IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IL-1, ak IL-1 nivo (pg/ml ) yo te mezire selon enstriksyon manifakti a. Done yo te akeri sou Sistèm MAGPIX (Luminex, Texas, USA) epi yo te fè analiz lè l sèvi avèk lojisyèl Bio-Plex Manager™ (BIO-RAD, Kalifòni, USA).

Analiz sitometrik koule

Analiz sikometri koule te fèt sou selil timè yo ak subpopulations selil iminitè nan mikroanvironman timè a jan sa a. Yon ti tan, timè yo te omojeneize ak sourit twous disosyasyon timè (#130-096-730, Miltenyi Biotec) ak lenfosit ki enfiltre timè yo te izole nan sispansyon total selil yo lè l sèvi avèk sourit MicroBeads CD45 (TIL) (#130-110- 618, Miltenyi Biotec) oswa CD8 (TIL) MicroBeads sourit (#130-116-478, Miltenyi Biotec) atravè otomatik Pro Separator (Miltenyi Biotec) selon enstriksyon manifakti a. Lè sa a, selil yo te enkube ak tache ak divès kalite konbinezon ki apwopriye dilye nan diferan antikò fluorochrome-konjige (Tablo siplemantè 1). Selil tache yo te analize lè l sèvi avèk yon MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer (Miltenyi Biotec®), epi yo te trete done yo lè l sèvi avèk lojisyèl Flowlogic (Miltenyi Biotec®).

Imunofluoresans nan selil ak tisi yo

Yo te fè analiz imunofluoresan mas timè murin jan sa a. Echantiyon yo te retire rapidman, yo te fikse nan fòmaldeyid 4% tanpon pou 24 èdtan, epi yo te mete parafine. Seksyon istolojik, 5 μm epè, yo te koupe nan echantiyon yo, yo te deparafinize ak bouyi pou 1 0 min nan tanpon sitrat sodyòm (10 mM, pH 6.0; Bio-Optica) pou rekipere antijèn ak imunostained lannwit lan nan 4 degre ak prensipal. antikò (anti-PD-L1, ab238697, Abcam; anti- 3-AR, ab94506, Abcam; anti-CD4, 14-9766-82, eBioscience; anti-CD8, 14-0808-82, eBioscience; DBH, ab209487, Abcam). Reyaksyon iminitè te revele seksyon enkubasyon ak antikò segondè Alexa Fluor 488- IgG konjige oswa Alexa Fluor 594- IgG konjige (1:350; Jackson Laboratory). Apre kontre ak 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), imaj reprezantan yo te akeri pa yon mikwoskòp Olympus BX63 makonnen ak CellSens Dimension Imaging Software vèsyon 1.6 (Olympus). Tach imunofluoresans la te evalye atravè lojisyèl ImageJ (NIH, USA) kòm entansite fliyoresan pwoteyin enterè a te nòmalize nan valè DAPI.

Benefis cistanche tubulosa-Antitumor

Kaplan-Meier ak analiz korelasyon jèn nan pasyan ki gen NB

Korelasyon jèn ADRB3 ak jèn pwen kontwòl iminitè CD80, CTLA4, CD276, CD226, CD40LG, 4-1BBL, ak korelasyon ant pwobabilite jeneral (OS) ak siviv san evènman (EFS) pasyan ki gen NB ak nivo ARDB3. Ekspresyon mRNA yo te pote soti lè l sèvi avèk pwofil ekspresyon jèn nan 649 espesimèn NB ki te pwodwi lè l sèvi avèk 44 K oligonukleotid mikro. Pwofil ak done klinik yo te rekipere nan R2: analiz jenomik ak platfòm vizyalizasyon (http://r2.amc.nl), (Kocak, ag44kcwolf koutim, n=649 ka). Dènye katil distribisyon an te itilize kòm valè koupe ekspresyon pou ekspresyon jèn ADRB3 segondè parapò ak ba nan analiz Kaplan-Meier.

Estatistik

Analiz estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA) pa yon sèl-fason oswa de-fason analiz de divèjans (ANOVA), ki te swiv pa Bonferroni pòs-hoc tès la oswa tès elèv ki pa pè. Pou eksperyans yo an vivo, dapre etid anvan yo sou menm modèl bèt la [12], omwen 6 sourit pou chak gwoup yo te nesesè pou garanti yon pouvwa 80%. Valè yo prezante kòm mwayen ± SEM. Siyifikasyon te konsidere lè P te<0.05 and described in each figure legend. Allocation concealment was performed using a randomization procedure (http:// www.randomizer.org/).

REZILTA

3-Antagonis AR diminye ekspresyon PD-L1 nan selil timè sourit A/J ki gen NB.

Etid resan yo te montre ke siyal PD-1/PD-L1 nan NB reprezante yon mekanis enpòtan pou limite siveyans iminitè e ke ekspresyon PD-L1 korelasyon ak nivo segondè nan makè timè [15, 16]. Lè nou konsidere done sa yo ak done anvan nou yo ki montre kapasite 3-AR blokaj pou pwovoke yon TME iminitè-konpetan nan sourit ki gen melanom [13], nou te mande si, nan timè NB, 3-AR a. antagonism ta ka mennen nan deklanchman repons iminitè depann sou patisipasyon siyal PD-L1. Administrasyon 3-AR antagonist la, SR59230A, nan yon modèl sinjenik murin nan NB, redwi kwasans timè nan yon pi gwo mezi pase yon anti-PD-L1 antikò mAb (PD-L1) tretman, men pa gen okenn efè sinèrjik obsève. lè sourit yo te trete ak tou de dwòg (Fig. 1A, B). Pou mennen ankèt sou si efè anti-timoral te pote pa administrasyon SR59230A te konte an pati sou modulasyon ekspresyon PD-L1, nou te teste nivo ekspresyon PD-L1 nan TME sourit ki bay NB. Enteresan, imunofluoresans (Fig. 1C) ak analiz Western blot (Fig. 1D) sou mas timè murin te montre ke ekspresyon PD-L1 te diminye nan TME nan sourit trete ak 3-AR antagonist la konpare ak kondisyon machin. Kòm done literati anpil te montre ke nan TME, anplis selil kansè yo, selil stromal tankou selil ki prezante antijèn (APCs) MDSC, DCs, ak macrophages, se sous prensipal PD-L1 [17-20], nou pi lwen. te envestige kote nan TME a, nivo ekspresyon PD-L1 te afekte apre 3-AR blokaj. Egzamen Cytofluorometric te revele ke 3- AR antagonism diminye ekspresyon PD-L1 nan selil timè yo (Fig. 1E) pandan y ap ogmante nivo ekspresyon li nan DCs ak macrophages (Fig. 1F, G). Pa gen okenn chanjman yo te obsève nan popilasyon an MDSC (Fig. 1H). Premye rezilta sa yo montre ke 3-AR blokaj te egzèse yon siyifikatif aktivite anti-timoral nan yon modèl syngeneic sourit ki gen NB e ke administrasyon an koncomitan nan antikò PDL1 pa t 'pwovoke yon efè sinèrji anti-timoral. Enteresan, 3-AR antagonism famasi te modile nivo ekspresyon PDL1 nan TME, sa ki sijere patisipasyon siyal PD-L1 nan aksyon anti-timoral yo te pote pa blokaj la 3-AR.

Fig. 1 Efè tretman SR59230A ak PD-L1 sou kwasans timè ak ekspresyon PD-L1 nan sourit NB ki gen timè.

3-Antagonis AR ak administrasyon PD-L1 ankouraje yon TME iminitè-reyaktif nan NB

Yo nan lòd yo mennen ankèt sou si espresyon PD-L1 diminye, obsève nan selil timè NB apre 3-AR antagonis, te mennen nan yon reyaktivasyon iminitè nan TME, nou te premye evalye kantite perforin pa PD-1+CD{ {4}} selil nan mas timè sourit SR59230A-, PD-L1- oswa SR59203A + PD-L1-trete yo konpare ak machin (Fig. 4A, B). Anplis de sa, yon tès tach Ki67 te montre yon tandans ki endike yon pwopagasyon ogmante nan selil CD8+ T nan timè NB sourit yo trete ak 3-AR antagonist oswa antikò PD-L1, menm si li echwe pou rive nan yon gwo kantite. diferans (figi 4C). Finalman, mezi sitokin yo te montre, nan mas timè sourit PDL1-trete yo, yon nivo ogmante nan sitokin li te ye pou egzèse aksyon anti-timoral tankou TNF-, IFN-, ak IL-6, ak yon koncomitan. diminisyon nan sitokin iminitè-suppression IL-10. Etonan, nan sourit ki gen NB ki te trete ak antagonis 3-AR a, nou te obsève yon ogmantasyon nan TNF- ak IL-6, ak yon diminisyon nan IL-10 nivo, dapre iminitè-a. estati reyaktif sijere pa karakteristik selil T, men yon nivo diminye nan IFN- (Fig. 4D). Yo pa jwenn okenn diferans enpòtan nan lòt sitokin yo teste (GMCSF, IL-2, IL-1, ak IL-1). Ansanm done sa yo demontre ke 3-AR antagonis deklanche repons iminitè lame a nan TME sourit ki gen NB, retrace menm efè yo obsève apre administrasyon antikò PD-L1. An patikilye, CD8+ fonksyon sitotoksik yo te ranfòse pa tou de SR59230A ak PD-L1. Pa gen okenn efè sinèrjik yo te obsève lè 3-antagonis AR a te koadministre ak antikò PD-L1 la, ki konfime ke reactivasyon iminitè a te pote nan 3-blok AR a depann, omwen an pati, sou siyal PD-L1 la. patisipasyon chemen an.

Fig. 2 SR59230A ak PD-L1 ankouraje yon TME iminitè-reyaktif nan NB

Fig. 3 Ekspresyon pòs iminitè yo sou lenfosit nan TME ak TDLN apre 3-AR antagonis ak administrasyon PD-L1

Fig. 4 3-AR blokaj deklanche fonksyon CD8 epi kontwole sekresyon cytokin iminitè nan TME.

3-AR sou lenfosit ki enfiltre timè yo modile sekresyon IFN epi li afekte ekspresyon PD-L1 sou selil timè NB yo.

Ekspresyon PD-L1 sou selil timè yo ka pwovoke pa plizyè faktè, men pami lòt moun, TNF- ak IFN- reprezante prensipal cytokines ki kapab ogmante nivo PD-L1 nan diferan timè [23]. Pou plis elicide siyal ki kache 3-AR/PD-L1 diskisyon an nan modèl timè nou an nan NB, nou premye teste ekspresyon PD-L1 sou selil timè N2A yo apre tretman TNF- ak IFN-. Rezilta yo te montre ke ekspresyon PD-L1 te ogmante nan selil NB trete pou 48 èdtan ak IFN- men se pa ak TNF-. Anplis, pre-tretman nan selil timè N2A ak 3-AR antagonist SR59230A a pa t 'kapab anile ekspresyon PDL1 ogmante pa tretman IFN- (Fig. 5A). Lè nou konsidere ke done literati yo rekonèt TIL yo kòm sous prensipal selilè IFN- pandan repons iminitè adaptatif [24] e ke rezilta nou yo te revele ke 3-modulasyon AR sou selil timè N2A yo pa t afekte PD ki depandan IFN- -. -L1 ekspresyon, nou te mande si yon 3-modulasyon AR sou TIL yo te responsab pou yon chanjman sekresyon IFN-, ki an vire afekte ekspresyon PD-L1 sou selil timè yo. Pou pwouve ipotèz nou an, yo te izole lenfosit yo te jwenn nan TDLN sourit ki bay NB ki te trete ak machin oswa SR59230A epi yo te kiltive ansanm nan vitro ak selil timè yo. Imunofluoresans ak analiz sikometri koule konfime ke lenfosit kolekte nan sourit NB ki te trete ak antagonist AR 3- redwi kapasite yo pou deklanche ekspresyon PD-L1 sou selil N2A konpare ak lenfosit ki pa trete (Fig. 5B, D). Anplis de sa, mezi nivo IFN nan medya ko-kilti konfime ke lenfosit kolekte nan sourit SR50230A-trete, pasyèlman pèdi kapasite yo nan sekrete IFN- lè ko-kilti ak selil timè NB (Fig. 5C). Li deja montre ke 3-AR ka makonnen ak pwoteyin Gs nan plizyè tisi, ak aktivasyon li mennen nan aktivasyon nan chemen siyal cAMP/PKA [25]. An menm tan an, etid yo te pwouve wòl enpòtan nan cyclic AMP responsive element binding (CREB) kòm yon regilatè transkripsyon pozitif nan IFN- nan selil T [25-27]. Apati obsèvasyon sa yo, nou te teste si chemen siyal cAMP/PKA/CREB te enplike nan 3-sekresyon IFN-depandan AR nan TIL yo. Rezilta yo te montre ke 3-antagonis AR nan CD{8+ TIL yo diminye fosforilasyon PKA/PKA sou-inite yo ak CREB, ki mennen nan yon rediksyon nan ekspresyon IFN- nan CD8+ TILs (figi siplemantè 1A). , B). Rezilta sa yo konfime ke 3-AR kapab kenbe transkripsyon IFN-nan TIL nan NB lè li deklanche chemen siyal cAMP/PKA/CREB. Nan lòt men an, cytokin imunosuppressive IL-10 te diminye nan Treg nan sourit trete ak SR59230A konpare ak machin (Siplemantè Fig. 1C), ki konfime reyaksyon iminitè a nan NB TME a apre 3-AR antagonis tretman. nan sourit NB-pote. Pou konfime efè selektif antagonis SR59230A a sou subtip 3-AR a, nou te fè yon tès ko-kilti ak lenfosit fèmen bouch ak siRNA pou 1-, 2- ak 3-AR. subtip. Rezilta yo te montre ke lenfosit silans pou 3-AR, pami subtip -AR yo, pasyèlman pèdi kapasite yo pou pwovoke ekspresyon PD-L1 sou selil timè N2A yo konpare ak kondisyon kontwòl (figi 5E ak Figi siplemantè 1D). Anplis, ekspresyon pwoteyin nan 3-AR sou lenfosit murin nan sourit ki gen NB yo te konfime pa analiz Western blot nan lenfosit yo te jwenn nan TDLNs (Siplemantè Fig. 2A) ak imunofluoresans nan CD4+ ak CD{{ 90}} Selil T tache pou 3-AR sou seksyon mas timè yo (figi siplemantè 2B). Nou te deja demontre ke antagonism espesifik 3- AR sou selil timè N2A pa SR59230A, te anpeche kwasans NB ak pwogresyon timè, lè nou te chanje soti nan tij nan karakteristik diferansyasyon nan selil timè [12]. Isit la, rezilta nou yo te fè konnen efè anti-timoral administrasyon antagonis AR a te konte tou sou modulasyon siyal AR a sou TIL yo, ki an vire te mennen nan re-dinamize repons iminitè kont timè yo. Se poutèt sa, pou konfime tèz nou an nan vivo, nou te administre FTY720 pou kenbe selil T nan TDLN yo epi redwi enfiltrasyon yo nan mas timè yo. FTY720 se yon analòg sphingozin 1-fosfat (S1P), ak administrasyon li pwovoke entènalizasyon ak degradasyon reseptè S1P a, konsa anpeche lenfosit soti nan nœuds lenfatik yo [28]. Jan yo te sipoze, pre-tretman FTY720 te tonbe efè anti-timoral te pote pa 3-AR administrasyon antagonis (figi 5F-H). Pou valide efikasite FTY720 pou kenbe selil T nan TDLN yo, nou mezire nimewo selil T nan TDLN apre uit jou (T8) nan tretman an. Rezilta yo te montre ke tou de CD4+ ak CD{8+ selil yo te ogmante nan TDLN nan sourit pre-trete ak FTY720 konpare ak sourit ki pa trete (machin) (figi siplemantè 2C). Dapre rezilta nou yo ak lòt rezilta anvan yo demontre ke siyal S1P enpòtan anpil pou siviv selil timè NB [12, 29], tretman ak FTY720 pou kont li te kapab tou diminye siyifikativman kwasans timè (Fig. 5F-H). Analiz sekans RNA sou mas timè NB izole nan machin ak SR59230A-trete sourit idantifye 5607 jèn nan mitan ki 267 yo te eksprime diferan jèn (DEGs), 127 yo te upregulated ak 140 yo te downregulated nan timè SR59230A-trete (Fig. 6A). An patikilye, plizyè jèn ki te eksprime diferans estatistik ki te fè pati chemen ki gen rapò ak iminitè dapre GO: BP baz done (Fig. 6B). Anplis, downregulation nan mRNA PD-L1 (jèn CD274) nan timè SR59230A-trete konpare ak kondisyon machin ak regilasyon diferan lòt jèn ki enplike nan pwosesis ki gen rapò ak iminitè (figi 6C) korelasyon korelasyon ki genyen ant 3- AR ak iminitè-checkpoint PD-L1 obsève nan nivo pwoteyin. Finalman, analiz diferan ekspresyon jèn sou yon seri done piblik (GSE14880 soti nan achiv GEO) ki gen ladan 34 pasyan ki afekte nan NBs, konfime ke mas timè NB ak yon ekspresyon ki ba nan ADRB3 te montre yon règleman pozitif nan repons iminitè, deklanchman selil T, ak efè iminitè. chemen konpare ak mas timè ak nivo segondè nan ADRB3 (Fig. 6D). Pou sonje, pandan ke yo nan diferan kansè, katekolamin yo lage nan newòn ki asosye ak kansè oswa tou senpleman rive nan timè a atravè sikilasyon san, nan NB nivo twòp nan katekolamin ak metabolit yo (HVA, VMA, dopamine), yon karakteristik inik nan malignite sa a, soti. soti nan yon sous diferan. Vreman vre, akòz orijin spesifik nan selil NB (ki soti nan selil ki defektye senpatik diferansyasyon newòn nan krèt newòn), timè sa yo anjeneral kapab sekrete katekolamin poukont yo. Vreman vre, nan modèl NB murine nou an, imunofluoresans sou mas timè yo te montre ke selil timè NB yo te pozitif pou Dopamine-Hydroxylase (DBH) (Siplemantè Fig. 3A), yon anzim ki responsab sentèz norepinephrine, kèlkeswa 3- Ekspresyon AR sou timè oswa antagonis li yo. Ansanm, done sa yo mete aksan sou wòl enpòtan nan siyal adrenèjik la jwe nan reglemante diferan pwosesis byolojik ki enplike nan entèraksyon ki genyen ant sistèm iminitè lame a ak mikroanvironman timè nan timè NB. Efè anti timè yo obsève apre administrasyon 3-AR antagonis nan modèl sinjenik murin nou an, depann, omwen an pati, sou modulasyon 3-AR ki eksprime sou lenfosit ki enfiltre mas timè a. An patikilye, nou te demontre ke blokaj selektif 3-AR sou TIL yo te redwi sekresyon IFN-, ki an vire diminye ekspresyon PD-L1 sou selil timè NB yo ankouraje yon TME iminitè-reyaktif.

Fig. 5 3-AR sou TIL yo soutni ekspresyon PD-L1 ki depann de IFN- -nan selil timè NB yo. A

Ekspresyon jèn ADRB3 korelasyon ak move pronostik nan pasyan NB

Gen kèk etid sigjere ke {{0}}AR mRNA ak/oswa pwoteyin yo twòp eksprime epi nan kèk ka korelasyon ak pwopagasyon neoplastik ak transfòmasyon nan diferan kansè imen [10, 30-32]. An konsekans, rezilta preklinik nou yo te jwenn nan yon modèl sinjenik murin nan NB, te demontre ke 3-siyal AR ka soutni diferan pwosesis pro-timoral ki favorize kwasans timè. Se poutèt sa, pou teste si ekspresyon jèn ADRB3 korelasyon ak siviv pasyan NB, nou te fè yon analiz Kaplan-Meier atravè R2: Genomics Analysis and Visualization Platform (http://r2.amc.nl), lè l sèvi avèk baz done Kocak ki gen ladann. enfòmasyon konplè sou done klinik 649 pasyan NB yo. Rezilta yo te montre ke ekspresyon jèn ADRB3 te asosye ak rezilta pòv nan pasyan ki gen NB. Ekspresyon segondè nan jèn ADRB3 la te, tout bon, siyifikativman asosye ak redwi evènman-gratis (p=3.2e-05) (Fig. 7A) ak siviv an jeneral (p=8.4e-0.5) ( Fig. 7B) nan pasyan NB. Anplis de sa, yon analiz korelasyon jèn nan kèk kowòt te montre yon korelasyon pozitif ant ADRB3 a ak jèn pou pòs iminitè inhibitory, tankou CD80, CTLA4, ak CD276, ak yon korelasyon negatif ak jèn pou pòs iminitè aktive sistèm iminitè a, tankou CD266, CD40 ligand (CD40LG) ak 4-1 BB ligand (4-1 BBL) (Fig. 7C). An jeneral, done yo jwenn yo mete aksan sou korelasyon negatif ekspresyon jèn ADRB3 la ak rezilta pasyan NB yo epi yo konfime ak ranfòse wòl 3-AR a kòm yon jwè molekilè ki kapab diminye repons iminitè anti-timè lè yo afekte plizyè pòs iminitè. chemen siyal yo.

DISKISYON

Depi orijin neurogenic spesifik li yo, nivo segondè nan metabolit katekolamin karakterize kondisyon timè NB [7, 33]. Nan travay anvan yo, nou te espekile ke lage katekolamin nan TME ta ka vize selil kansè yo atravè aktivasyon -ARs, deklanche yon bouk feedforward nan kwasans ak maliyans nan kansè NB. Vreman vre, done eksperimantal yo te demontre ke 3-AR eksprime sou diferan liy selil timè NB ak byopsi pasyan yo e ke modulasyon li yo te afekte kwasans timè anpil nan yon modèl sinjenik murin nan NB [12]. Anplis ekspresyon -ARs sou selil timè yo, li se lajman konnen ke -AR yo sitiye sou sifas pifò selil nan TME, ki gen ladan selil iminitè yo, e ke, ligasyon catecholamines nan -AR nan selil iminitè kontwole tou de iminite natirèl ak adaptasyon. [34]. Pou remake, pandan y ap nan kondisyon fizyolojik, modulasyon nan sistèm iminitè a pa siyal adrenèjik ankouraje repons iminitè nòmal, nan pwosesis ki chanje, eksitasyon SNS/catecholamines/-ARs-pwolonje ka gen efè danjere sou diferan selil iminitè ki gen ladan lenfosit [35, 36]. ]. Nan kondisyon sa yo chanje, yon eksitasyon soutni nan siyal adrenèjik la ankouraje pwosesis patolojik, ak pami lòt moun, pwogresyon kansè [37]. Apati de obsèvasyon yo mansyone pi wo a, etid nou an gen entansyon envestige si efè anti-timoral yo te pote pa 3-AR antagonism nan timè NB yo, ta ka an pati konte sou re-dinamize iminite anti-timè a epi si sa ta ka enplike. modulasyon nan pòs iminitè siyal chemen yo. Etid preklinik sijere ke ekspresyon PD-L1 nan metastaz NB reprezante yon mekanis enpòtan pou limite siveyans iminitè [15], epi ki konbine imunoterapi ak anti-PD-L1/PD-1 ak anti-CD4 antikò geri singeneic difize NB [ 38]. Dènyèman, ekspresyon PD-L1 te evalye nan plizyè timè pedyatrik, e pi wo a tout, tach PD-L1 te asosye ak siviv enferyè nan mitan pasyan ki gen NB [16, 39]. Anplis, yo te montre ke timè PD-L1-pozitif yo te lokalize nan glann adrenal la pi souvan pase timè PD-L{1-negatif e ke metabolit katekolamin (NSE, VMA, ak HVA) te gen tandans yo dwe pi wo nan gwoup PD-L1-pozitif la pase nan gwoup PD-L{1-negatif [16].

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Prèv sa a sigjere kapasite aks siyal PD-1/PD-L1 pou kontwole chape iminitè timè nan NB prensipal ak metastatik, sepandan, yo pa t egzamine mekanis egzak ki kache nan PD-1/PD-. Règleman siyal L1. Pou mennen ankèt sou si 3-AR modulasyon an ta ka afekte ekspresyon PD-L1 nan NB, ak reyaksyon iminitè ki konsekan nan TME a, nou te trete sourit A/J ki te resevwa vaksen ak selil N2A NB sinjenik yo, ak 3- AR antagonist SR59230A, yon antikò monoklonal PD-L1 (PD-L1), oswa konbinezon yo. Premyèman, nou te obsève ke 3-AR antagonism te kapab diminye kwasans timè NB epi ansanm diminye ekspresyon PD-L1 nan TME sourit ki gen NB. Sitometri koule revele ke kantite lajan an diminye nan PD-L1 obsève nan mas timè nan sourit SR59230A-trete sitou reflete ekspresyon an redwi nan selil timè. Nan kontras sevè, ekspresyon PD-L1 sou DC ak makrofaj yo te kontwole. Plizyè prèv syantifik asiyen nan PD-L1 ki sitiye sou tou de selil timè yo ak APCs kapasite nan dekouraje deklanchman selil T, pasyèlman anpeche yon reyaksyon iminitè efikas kont timè a [40]. Sepandan, etid resan yo te demontre ke pandan absorption antijèn ak kwa-prezantasyon antijèn timè nan selil T, yon etap enpòtan nan iminite adaptasyon an, DCs ak makrofaj yo kontwole PD-L1 konsa limite yon aktivasyon twòp nan selil T ak pwoteje yo kont aktivite sitotoksik nan. Selil T [41, 42]. Se poutèt sa, nou te ipotèz ke ekspresyon an diminye nan PD-L1 sou selil timè yo ak ogmantasyon koncomitan li yo sou APCs nan mas timè SR59230A-trete gen anpil chans reflete yon revigorasyon sistèm iminitè nan TME. Rezilta yo konfime ogmante kantite selil iminitè-reyaktif ki enfiltre timè yo (NK, DCs, ak CD8+), ak rediksyon nan selil iminitè ki enfiltre timè yo (Treg ak MDSC). Analiz ekspresyon nan pòs iminitè PD-1 sou TIL yo te montre yon kantite siyifikativman ogmante nan PD-1+CD{4+ ak PD{- 1+CD{8+ selil T nan TDLN nan yon etap bonè nan devlopman timè (T2), ak nan PD-1+CD{8+ nan timè a apre 8 jou yo (T8) nan SR59230A, PD-L1, oswa tretman konbinezon yo konpare ak kontwòl. Yo te note yon tandans ogmante tou nan kantite CD4+ T selil ki tache pou TIM3 oswa LAG3 nan timè nan tretman SR59230A, PD-L1, ak konbinezon yo, men yo pa rive jwenn siyifikasyon estatistik. Pou CD8+ selil T ki tache pou TIM3 oswa LAG3, olye nou te obsève yon gwo varyasyon. Pandan ke kèk done literati sijere ke PD-1, LAG{-3, ak TIM-3 eksprime selil T yo fin itilize ak disfonksyonèl [43-45], lòt moun te demontre ke pòs iminitè sa yo, an patikilye PD -1, yo ogmante tou apre deklanchman ak diferansyasyon selil T efektè [46-48], e se poutèt sa ekspresyon poukont li pa reflete yon estati fin itilize, olye makè sa yo idantifye repètwa otològ timè-reyaktif ki enfiltre diferan timè [46- 49]. An akò, envestigasyon pi fon nan modèl timè nou an te konfime ke 3-antagonis AR a, kòm tretman ak anti-PD-L1 mAb la, te deklanche fonksyon sitotoksik nan CD8+, jan yo montre nan kantite ogmantasyon nan PD. 1+Selil CD8+ ki tache pou perforin oswa granzym B, sa ki montre ke PD1+ TIL yo jwenn nan mas timè yo fonksyonèl aktif. Yo te montre gwo enfiltrasyon CD8+ selil T citotoksik nan timè yo korelasyon ak pronostik pozitif nan pasyan ki gen plizyè maladi malfezan tankou melanom, tèt ak kou, tete, kolorektal, ovè, pwostatik, ak lòt kansè [50]. Nan NB, yon etid resan te demontre ke timè anrichi nan timè-enfiltre selil T te gen yon pi bon rezilta klinik, endepandan de lòt endikatè aktyèl yo te adopte pou timè staging [51]. Anplis de sa, rezilta ki sot pase yo te demontre ke prezans selil DC ak NK nan mas timè gen yon relasyon pozitif ak tou de enfiltrasyon selil T ak rezilta klinik pozitif pasyan NB [52]. Tout prèv klinik sa yo dakò ak rezilta preklinik nou yo, kote yon TME anrichi nan selil NK, DC, ak CD8+ T, yo obsève apre 3- AR antagonism oswa administrasyon PD-L1, te fonksyonèl kapab. kontwole kwasans timè NB. Yon aspè fondamantal nan defi sistèm iminitè lame a kont timè se liberasyon diferan sitokin nan TME, ki ka kenbe oswa fennen aktivite anti-timoral. Mezi cytokines nan timè konfime, nan sourit trete SR59230A- ak PD-L1-, yon kondisyon deplase nan direksyon yon TME iminitè-reyaktif. Sepandan, pandan ke pami sitokin anti-timoral yo, nivo TNF- ak IL-6 yo te ogmante, nivo IFN te bese nan mas timè sourit 3-AR ki te trete antagonis yo. Apati obsèvasyon sa a, nou te sipoze ke modulasyon 3-AR siyal sou selil T ki enfiltre timè yo, an patikilye sou CD4+ ak CD{8+, ta ka responsab yon chanjman IFN- sekresyon, ki an vire afekte ekspresyon PD-L1 sou selil timè yo. Rezilta yo konfime ipotèz nou an. Antagonism selektif 3-AR sou TIL yo te rann, tout bon, selil sa yo pa efikas nan pwovoke ekspresyon PD-L1 sou selil timè NB akòz yon sekresyon ki chanje IFN-, epi anpeche defakto etablisman yon rezistans iminitè adaptatif. Nan TME, IFN- òkestre tou de repons iminitè pro-tumorigenic ak antitumoral, aji kòm yon sitokin sitotoksik ansanm ak granzyme B ak perforin frape selil timè yo, men tou, deklanche sentèz la nan pòs iminitè inhibitory konsa eksitan mekanis iminitè-suppression [53]. Wòl bimodal IFN- sa a nan lakòz efè opoze depann sou mekanis konplèks ki poko konprann konplètman, sepandan, kantite IFN- sekrete sanble ap desizif nan defini aksyon yo pote pa cytokine sa a [54]. An konsekans, nou ipotèz ke nan modèl nou an diminye kantite IFN- te pote pa 3- antagonis AR sou TIL yo te favorize repons iminitè yo konpare ak kondisyon kontwòl la, kote ekspoze kwonik nan IFN-fòs mekanis imunosuppressive plis. Pami subtip -AR yo, 2-AR sanble pi eksprime sou sifas yon varyete selil iminitè yo. Sepandan, ou ta dwe remake ke 3-AR, dènye manm idantifye nan -AR yo, te pi piti etidye jiska dat. Se poutèt sa, pou konfime ke administrasyon SR59230A te pote efè li yo bloke sitou 3-AR soustip la, nou te premye envestige ak konfime 3-AR ekspresyon pwoteyin sou lenfosit TDLN yo ak sou selil T ki enfiltre timè yo. Nou te demontre ekspresyon 3-pwoteyin AR a nan CD ki enfiltre timè4+ ak CD8+, epi answit nan selektif 1-, 2-, ak {{ 140}}ARs silans, nou konfime wòl enpòtan 3-AR ki chita sou lenfosit yo, nan kontwole ekspresyon PD-L1 ki depann de IFN- -sou selil timè NB yo. Pou remake, anpil done sou diferan tisi ak modèl selil yo te montre ke pandan ke 1- ak 2-AR yo tou de gen plis tandans fè fenomèn desensibilizasyon omològ apre ekspoze pwolonje a katekolamin andojèn, {{147} }Soustip AR yo te montre yo pa t ye, epi lè, sepandan, nan kèk selil, 3-ARs desensibilizasyon te fèt, li te mwens pwononse konpare ak sa ki nan 1- ak 2-ARs [ 55]. Lè sa a, nou espekile ke nan timè NB, yon kondisyon ki karakterize pa ekspoze kwonik nan katekolamin, 2-subtip AR sou TIL yo, ki pi eksprime fizyolojik la, ka sibi regilasyon apre desensibilizasyon, e kontrèman 3-AR a touche. wòl pivotal nan medyatè efè pro-timoral katekolamin pwovoke. Pou mennen ankèt sou moun ki gen tandans pro-timoral ekspresyon AR 3-, finalman nou te fè yon analiz jenetik sou 649 pasyan NB lè l sèvi avèk aksè louvri R2: Genomics Analysis and Visualization Platform. Segondè ekspresyon jèn ADRB3 ki gen rapò ak pi move rezilta klinik (siviv an jeneral ak evènman-gratis) pasyan NB yo konpare ak pi ba ekspresyon; nplis de sa, korelasyon pozitif nan jèn ADRB3 ak diferan pòs iminitè sipresyon tankou CD80, CTLA4, ak B7-H3 (CD276), ak korelasyon negatif la ak pòs iminitè aktive tankou CD266, CD40LG ak 4-1 BBL konfime wòl negatif 3-AR jwe nan règleman konplèks nan reyaksyon iminitè a nan NB. An patikilye, korelasyon pozitif nan ekspresyon jèn ADRB3 ak pòs iminitè-suppressive, tankou CD276, yon molekil ki asosye ak NB yo te jwenn nan variants NB ki pa reponn, ki egzèse yon wòl pwoteksyon nan yon liz selil NK medyatè [56, 57], oswa ak CTLA4, ki gen anpèchman yo te montre yo pa redondants nan amelyore touye selil T antitumoral nan NB [58], mete aksan sou kapasite 3-AR siyal la pou kenbe diferan mekanis ki favorize chape iminitè timè yo. Nou ka espekile ke korelasyon ki genyen ant ekspresyon jèn ADRB3 segondè ak ekspresyon ki ogmante nan diferan pòs iminitè ka konte sou 3-AR kapasite pou kenbe mekanis sa yo ki gen twòp aktivasyon ankouraje aparisyon rezistans timè, tankou ekspoze kwonik nan kèk pro. -sitokin enflamatwa. Syans bonè nan anpèchman pòs nan NB pa te toujou reyisi. An patikilye, tou de nan modèl etid preklinik ak nan imen, pi bon repons yo jwenn nan estrateji terapetik adopte plizyè ICI sijere ke vize diferan pòs iminitè reprezante yon apwòch efikas anti-timoral ki pa redondants nan NB [58, 59]. Lè sa a, vize diferan chemen imunosuppressive ta ka reprezante pi bon opsyon ki ka geri pou evite rezistans timè nan terapi sèl-sible. Sepandan, administrasyon an nan plizyè dwòg toujou pwoblèm, akòz gwo efè segondè ak toksisite, epi li pa te toujou mennen nan rezilta vle. Se poutèt sa, yon konesans pi fon nan mekanis molekilè ki enplike nan règleman an nan rezo konplèks la nan kontrepati iminitè a nan TME a nesesè pou devlopman nan nouvo apwòch iminitè-nkoloji. Nan kontèks sa a, rezilta prezante yo sijere ke vize 3-AR a nan NB TME ta ka reprezante yon apwòch posib pou frape plizyè chemen siyal pro-timoral ki pa redondants. An patikilye, lè yo afekte sistèm iminitè lame a, atravè retire baryè a ki te pwovoke pa koperasyon pòs iminitè yo, ak chemen pou siviv selil timè yo, 3-AR antagonism ka reprezante yon estrateji pwomèt ak, èspere ke, terapetik. potansyèl pou pasyan ki afekte nan maladi NB. Plis etid yo toujou bezwen apwofondi mekanis pi lwen ki kache entèraksyon an konplèks ant sistèm iminitè lame a ak kontrepati timè a nan NB. Sepandan, nan limyè de sa nou te obsève, etid la nan siyal -adrenergic nan TME a nan timè NB merite yo dwe pran an konsiderasyon.

Fig. 6 Analiz transcriptomik mas timè NB yo konfime wòl enpòtan 3-AR nan afekte pwosesis ki gen rapò ak iminitè a.

Fig. 7 Analiz siviv Kaplan-Meier ak korelasyon pòs iminitè ak ekspresyon jèn ADRB3 nan pasyan NB.

REFERANS

1. Cheung NK, Dyer MA. Neuroblastoma: byoloji devlopman, jenomik kansè, ak imunoterapi. Nat Rev Kansè. 2013;13:397–411.

2. Matthay KK, Maris JM, Gudrun S, Nakagawara A, Mackal CL, Diller L, et al. Neuroblastom. Nat Rev Dis Prim. 2016;2:16078.

3. Darvin P, Toor SM, Nair SN, Elkord E. Inibitè pòs iminitè: dènye pwogrè ak potansyèl biomarqueurs. Exp Mol Med. 2018;50:1–11.

4. Pardoll DM. Blokaj la nan pòs iminitè nan imunoterapi kansè. Nat Rev Kansè. 2012;12:252–64.

5. Zou W, Wolchok JD, Chen L. PD-L1 (B7-H1) ak PD-1 blokaj chemen pou terapi kansè: mekanis, biomake repons, ak konbinezon. Sci Transl Med. 2016;8:328rv4.

6. Cole SW, Sood AK. Wout molekilè: siyal beta-adrenèjik nan kansè. Clin Cancer Res. 2012;18:1201–6.

7. Strenger V, Kerlb R, Dornbusch HJ, Ladenstein R, Ambros PF, Ambros IM, et al. Enpak dyagnostik ak pronostik nan katekolamin urin nan pasyan neroblastom. Pedyatr Blood Cancer. 2007;48:504–9.

8. Huang XE, Hamajima N, Saito T, Matsuo K, Mizutani M, Iwata H, et al. Asosyasyon posib nan beta2- ak beta3-polimorfism jèn reseptè adrenèjik ak sansiblite nan kansè nan tete. Kansè nan tete Res. 2001;3:264–9.

9. Babol K, Przybylowska K, Lukaszek M, Pertynski T, Blasiak J. Yon asosyasyon ant polimorfism Trp64Arg nan jèn reseptè beta3-adrenèjik ak kansè andometri ak obezite. J Exp Clin Cancer Res. 2004;23:669–74.

10. Perrone MG, Notarnicola M, Caruso MG, Tutino V, Scilimati A. Upregulation beta3-mRNA reseptè adrenèjik nan kansè nan kolon imen: yon etid preliminè. Onkoloji. 2008;75:224–9.

11. Magnon C, Hall SJ, Lin J, Xue X, Gerber L, Freedland SJ, et al. Devlopman nè otonòm kontribye nan pwogresyon kansè pwostat. Syans. 2013;341:1236361.

12. Bruno G, Cencetti F, Pini A, Tondo A, Cuzzubbo D, Fontana F, et al. blokaj adrenoreseptè beta3- diminye kwasans timè ak ogmante diferansyasyon newòn nan neroblastom atravè modulasyon SK2/S1P2. Onkogene. 2020;39:368–84.

13. Calvani M, Bruno G, Dal Monte M, Nassini R, Fontana F, Casini A, et al. beta3 -Adrenoceptor kòm yon potansyèl ajan imino-sipresyon nan melanom. Br J Pharm. 2019;176:2509–24.

14. Dal Monte M, Casini G, Filippi L, Nicchia MG, Svelto M, Bagnoli P. Patisipasyon fonksyonèl nan reseptè beta3-adrenèjik nan kwasans melanom ak vaskularizasyon. J Mol Med. 2013;91:1407–19.

15. Dondero A, Pastorino F, Della Chiesa M, Corrias MV, Morandi F, Pistoia V, et al. Ekspresyon PDL1 nan neuroblastom metastatik kòm yon mekanis adisyonèl pou limite siveyans iminitè. Onkoimunoloji. 2016;5:e1064578.

16. Zuo S, Sho M, Sawai T, Kanehiro H, Maeda K, Yoshida M, et al. Wòl potansyèl ekspresyon PD-L1 ak lenfosit ki enfiltre timè sou neuroblastom. Pediatr Surg Int. 2020;36:137–43.

17. Keir ME, Butte MJ, Feeman GJ, Sharpe AH. PD-1 ak ligand li yo nan tolerans ak iminite. Annu Rev Immunol. 2008;26:677–704.

18. Curiel TJ, Wei S, Dong H, Alvarez X, Cheng P, Mottram P, et al. Blokaj B7-H1 amelyore iminite anti-tumeur myeloid dendritic. Nat Med. 2003;9:562–7.

19. Wu K, Kryczek I, Cheng L, Zou W, Welling TH. Sipresyon selil Kupffer nan selil CD8+ T nan kansòm epatoselilè imen se entèraksyon B7-H1/pwograme lanmò-1. Kansè Res. 2009;69:8067–75.

20. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C, et al. Monosit aktive nan stroma peritumoral nan karsinom epatoselilè ankouraje privilèj iminitè ak pwogresyon maladi nan PD-L1. J Exp Med. 2009;206:1327–37.

21. Rotte A, Jin JY, Lemaire V. Mekanistik apèsi sou pòs iminitè pou sipòte konsepsyon rasyonèl konbinezon yo nan imunoterapi kansè. Ann Oncol. 2018;29:71–83.

22. Dammeijer F, van Gulijk M, Mulder EE, Lukkes M, Klaase L, van den Bosch T, et al. Pwen kontwòl PD-1/PD-L1 anpeche iminite selil T nan gangliyon lenfatik ki drenaj timè yo. Selil kansè. 2020;38:685–700. e8.

23. Cha JH, Chan LC, Li CW, Hsu JL, Hung MC. Mekanis ki kontwole ekspresyon PD-L1 nan kansè. Mol selil. 2019;76:359–70.

24. Burke JD, Young HA. IFN-: yon cytokine nan bon moman, se nan bon kote. Semin Immunol. 2019;43:101280.

25. Schena G, Caplan MJ. Tout sa ou te toujou vle konnen sou 3-AR* (* men ou te pè mande). Selil. 2019;8:357.

26. Liu Y, Guo YL, Zhou SJ, Liu F, Du FJ, Zheng XJ, et al. CREB se yon regilatè transkripsyon pozitif nan gamma interferon nan enfeksyon tibèkiloz inaktif men pa aktif. Klin ak Vaksen Immunol. 2010;17:1377–80.

27. Samten B, Townsend JC, Weis SE, Bhoumik A, Klucar P, Shams H, et al. CREB, ATF, ak AP-1 faktè transkripsyon kontwole sekresyon IFN-gama pa selil T imen an repons a antijèn mikobakteri. J Immunol. 2008;181:2056–64.

28. Matloubian M, Lo CG, Cinamon G, Lesneski MJ, Xu Y, Brinkmann V, et al. Lenfosit sòti nan timis la ak ògàn lenfoyid periferik depann de reseptè S1P 1. Lanati. 2004;427:355–60.

29. Li MH, Hla T, Ferrer F. FTY720 inibit kwasans timè ak amelyore efè sipresyon timè topotecan nan neuroblastoma pa entèfere ak chemen siyal esfingolipid la. Pedyatr Blood Cancer. 2013;60:1418–23.

30. Chisholm KM, Chang KW, Truong MT, Kwok S, West RB, Heerema-McKenney AE. ekspresyon reseptè beta-adrenèjik nan timè vaskilè. Mod Pathol. 2012;25:1446–51.

31. Montoya A, Amaya CN, Belmont A, Diab N, Trevino R, Villanueva G, et al. Itilizasyon beta-blockers ki pa selektif yo asosye ak diminye endis proliferasyon timè nan kansè nan tete bonè. Oncotarget. 2017;8:6446–60.

32. Rains SL, Amaya CN, Bryan BA. Reseptè beta-adrenèjik yo eksprime atravè divès kalite kansè. Onkosyans. 2017;4:95–105.

33. Verly IR, van Kuilenburg ABP, Abeling NGGM, Goorden SMI, Fiocco M, Vaz FM, et al. Des Catecholamines nan dyagnostik: Ogmantasyon sansiblite dyagnostik ak korelasyon ak karakteristik byolojik ak klinik nan pasyan neroblastom. Eur J Kansè. 2017;72:235–43.

34. Eng JWL, Kokolus KM, Reed CB, Hylander BL, MA WW, Repasky, et al. Yon mikroanviwònman timè nève: enpak estrès adrenèjik sou selil kansè yo, imunosuppresyon, ak repons imunoterapi. Kansè Immunol Immunother. 2014;63:1115–28.

35. Dhabhar FS, McEwen BS. Estrès egi amelyore pandan y ap estrès kwonik siprime iminite selil-medyatè nan vivo: yon wòl potansyèl pou trafik leukocyte. Brain Behav Immun. 1997;11:286–306.

36. Dhabhar FS. Estrès-pwovoke ogmantasyon nan fonksyon iminitè-wòl nan òmòn estrès, trafik leukocyte, ak sitokin. Brain Behav Immun. 2002;16:785–98.

37. Qiao G, Chen M, Bucsek MJ, Repasky EA, Hylander BL. Siyal adrenèjik: yon pòs sib ki limite devlopman repons iminitè antitumoral la. Avant Immunol. 2018;9:164.

38. Rigo V, Emionite L, Daga A, Astigiano S, Corrias MV, Quintarelli C, et al. Konbine imunoterapi ak anti-PDL-1/PD{-1 ak anti-CD4 antikò geri syngeneic disemination neuroblastom. Sci Rep 2017;7:14049.

39. Majzner RG, Simon JS, Grosso JF, Martinez D, Pawel BR, Santi M, et al. Evalyasyon pwograme espresyon lanmò-ligand 1 ak selil iminitè ki asosye ak timè nan tisi kansè pedyatrik yo. Kansè. 2017;123:3807–15.

40. Gibbons Johnson RM, Dong H. Ekspresyon fonksyonèl nan ligand lanmò pwograme 1 (B7-H1) pa selil iminitè ak selil timè. Avant Immunol. 2017;8:961.

41. Peng Q, Qiu X, Zhang Z, Zhang S, Zhang Y, Liang Y, et al. PD-L1 sou selil dendritik diminye deklanchman selil T ak kontwole repons nan blokaj iminitè yo. Nat Commun. 2020;11:4835.

42. Singhal S, Stadanlick J, Annunziata MJ, Rao AS, Bhojnagarwala PS, O'Brien S, et al. Imèn timè ki asosye monosit / makrofaj ak règleman yo nan repons selil T nan kansè nan poumon bonè. Sci Transl Med. 2019;11:eaat1500.

43. Blackburn SD, Shin H, Haining WN, Zou T, Workman CJ, Polley A, et al. Korregulasyon nan fatig selil CD8+ T pa plizyè reseptè inhibiteur pandan enfeksyon viral kwonik. Nat Immunol. 2009;10:29–37.

44. Jin HT, Anderson AC, Tan WG, West EE, Ha SJ, Araki K, et al. Koperasyon Tim-3 ak PD-1 nan fatig selil T CD8 pandan enfeksyon viral kwonik. Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:14733–8.

45. Sakuishi K, Apetoh L, Sullivan JM, Blazar BR, Kuchroo VK, Anderson AC. Vize chemen Tim-3 ak PD-1 pou ranvèse fatig selil T ak retabli iminite anti-timè. J Exp Med. 2010;207:2187–94.

46. ​​Agata Y, Kawasaki A, Nishimura H, Ishida Y, Tsubata T, Yagita H, et al. Ekspresyon antijèn PD-1 sou sifas lenfosit T ak B sourit stimulé yo. Int Immunol. 1996;8:765–72.

47. Vibhakar R, Juan G, Traganos F, Darzynkiewicz Z, Dwèt LR. Ekspresyon aktivasyon pwovoke nan jèn moun lanmò pwograme -1 nan lenfosit T. Exp Cell Res. 1997;232:25–8.

48. Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, Bourque K, Chernova T, Nishimura H, et al. Angajman reseptè iminoinhibitè PD-1 pa yon manm fanmi B7 roman mennen nan règleman negatif nan aktivasyon lenfosit. J Exp Med. 2000;192:1027–34.

49. Gros A, Robbins PF, Yao X, Li YF, Turcotte S, Tran E, et al. PD-1 idantifye repètwa timè-reyaktif CD8(+) pasyan espesifik ki enfiltre timè imen yo. J Clin Invest. 2014;124:2246–59.

50. Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Kirilovsky A, Mlecnik B, Lagorce-Pagès C, et al. Kalite, dansite, ak kote selil iminitè yo nan timè kolorektal imen yo predi rezilta klinik yo. Syans. 2006;313:1960–4.

51. Mina M, Boldrini R, Citti A, Woumani P, D'Alicandro V, De Ioris M, et al. Lenfosit T ki enfiltre timè amelyore rezilta klinik neuroblastom ki reziste terapi. Onkoimunoloji. 2015;4:e1019981.

52. Melaiu O, Chierici M, Lucarini V, Jurman G, Conti LA, De Vito R, et al. Siyati selilè ak jèn selil dendritik ki enfiltre timè yo ak selil asasen natirèl yo predi pronostik neuroblastom. Nat Commun. 2020;11:5992.

53. Jorgovanovic D, Song M, Wang L, Zhang Y. Wòl IFN-gama nan pwogresyon timè ak regresyon: yon revizyon. Biomark Res. 2020;8:49.

54. Zhang J. Yin ak Yang entèraksyon nan IFN-gama nan enflamasyon ak maladi otoiminitè. J Clin Invest. 2007;117:871–3.

55. Okeke K, Angers S, Bouvier M, Michel MC. Desensibilizasyon beta3 -adrenoseptè agonis yo: ki kote, ki lè, ak ki jan? Br J Pharm. 2019;176:2539–58.

56. Castriconi R, Dondero A, Augugliaro R, Cantoni C, Carnemolla B, Sementa AR, et al. Idantifikasyon 4Ig-B7-H3 kòm yon molekil ki asosye ak neuroblastom ki egzèse yon wòl pwoteksyon nan yon liz selil NK medyatè. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:12640–5.