Yon Vaksen Viris Grip Atenue Bivalan Pwoteje Kont Izolasyon Klinik H1N2 ak H3N2 ki derive nan kochon Pati 1

Résumé:

Viris grip A (IAV) ka lakòz yon maladi respiratwa ki trè kontajye pou anpil espès mamifè. Nan kochon, IAV yo lakòz gwo morbidite ak maladi mòtalite ki ba nan popilasyon sansib ki ka gen gwo enpak finansye ak pwodiksyon. Yo kapab tou prezante opòtinite pou mitasyon ak reasòtiman jèn, ki pwodui tansyon grip ak potansyèl pandemi.

Grip A se yon maladi respiratwa trè kontajye ki reprezante yon menas grav pou sante piblik mondyal la. Etid ki gen rapò ak iminite yo montre ke yon sistèm iminitè fò ka fè moun yo pi byen konbat viris la lè yo enfekte ak viris grip la, kidonk diminye ensidans la ak severite maladi a.

Iminite se kapasite sistèm iminitè nou an pou konbat maladi. Sistèm iminitè imen an konsiste de de pati: iminite natirèl ak iminite akeri. Sistèm iminitè natirèl la se sa nou fèt ak tout kò a abilite pou defann kont maladi. Sistèm iminitè akeri a se iminite nou piti piti genyen nan lavi nou, sitou ki gen ladan iminite umoral ki konpoze de selil iminitè ak antikò, ak iminite selilè ki konpoze de selil T ak selil iminitè.

Etid yo montre ke lè w kenbe yon vi an sante ak rejim alimantè, fè egzèsis, ak jwenn ase vitamin ak lòt eleman nitritif, ou ka amelyore sistèm iminitè ou. Anplis de sa, vaksen an kapab tou amelyore iminite kò a kont viris grip la epi redwi ensidans maladi a.

Viris grip A yo pataje pa moun ak bèt, kidonk yo souvan mitasyon. Espesyalman nan otòn ak sezon fredi, iminite moun yo ba, ak viris grip A ka fasil atake lè yo pwofite opòtinite sa a. Men, si nou ensiste sou devlope yon vi ki an sante, ranfòse egzèsis, ak aktivman vaksinen, nou ka amelyore iminite nou yo ak pi byen fè fas ak envazyon an nan viris grip A. Anplis de sa, si ou jwenn ke ou gen sentòm grip, ou ta dwe chèche tretman medikal epi resevwa tretman alè, pou kò ou ka byen vit refè.

Nan ti bout tan, gen yon enfliyans mityèl ant viris grip A ak iminite. Ranfòse iminite yon moun, kenbe yon vi ak rejim alimantè ki an sante, epi sitou aksepte vaksen an se tout mezi efikas pou anpeche ak goumen kont viris grip A. Se pou nou pozitif epi avanse pou yon vi ki pi ansante an tèm de prevansyon viris grip A! Li ka wè ke nou bezwen amelyore iminite. Cistanche ka siyifikativman amelyore iminite, paske sann vyann gen yon varyete de engredyan biyolojik aktif, tankou polisakarid, de dyondyon, Huang Li, elatriye engredyan sa yo ka ankouraje divès kalite sistèm iminitè. selil ki sanble ak selil yo, ogmante aktivite iminitè yo.

Klike sou benefis cistanche tubulosa

Se poutèt sa, li trè enpòtan pou anpeche ak kontwole enfeksyon grip nan kochon, e prensipal fason pou fè sa se atravè vaksinasyon. Soutip IAV ki pi komen nan kochon atravè mond lan se H1N1, H1N2, ak H3N2; sepandan, divèsite jenetik viris sa yo ka varye anpil pa rejyon an. Nou te deja devlope yon vaksen viris bivalan ki depann de elastaz lè l sèvi avèk de izole viris grip pòsin Kanadyen A (swIAV), A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] ak A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2). ) [SD69], ki te pwoteje kont tansyon homologue.

Nan etid sa a, nou demontre ke vaksen sa a pwolonje pwoteksyon nan kochon nan plis aktyèl, derive ki pa omologu H1N2 ak H3N2 tansyon, A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] ak A/Swine/AB/SD0435/ 2019 (H3N2) [SD435].

Vaksen an te pwovoke yon repons iminitè solid nan serom ak nan poumon ak redwi replikasyon viral ak patoloji nan poumon ki asosye ak tansyon sa yo. Se poutèt sa, vaksen bivalan sa a rete yon kandida solid ki ta benefisye mache vaksen kont grip pòsin nan Amerik di Nò.

Mo kle:

Grip; vaksen; kochon.

1. Entwodiksyon

Viris grip A (IAV) se yon patojèn enpòtan pou anpil espès, tankou kochon. Enfeksyon ka lakòz maladi respiratwa trè kontajye nan kochon [1]. Enfeksyon grip nan kochon mennen nan maladi grav ak mòtalite ki ba anpil, men pousantaj morbidite nan yon bann bèt ka rive nan 100 pousan [2]. Sa a lakòz pèt ekonomik pou kiltivatè yo akòz diminye pran pwa nan kochon ki enfekte diminye pèfòmans pwodiksyon, ak echèk repwodiktif nan simen [3,4].

Ko-enfeksyon nan grip ak lòt patojèn respiratwa kochon kapab tou mennen nan devlopman nan konplèks maladi respiratwa porsin, ak nan konsekans, ogmante mòtalite ak pèt ekonomik [5].
Anplis de sa, kochon yo sansib a enfeksyon ak IAV avyè ak imen ak IAV kochon (swIAV) akòz prezans tou de lyen galaktoz asid sialik avyè ak mamifè nan aparèy respiratwa yo [6]. Sa fè li posib pou reasòtiman rive lè ko-enfekte ak tansyon miltip, ki ta ka mennen nan pwodiksyon an nan nouvo tansyon ak potansyèl pandemi [4,7].

Kòm imen gen menm distribisyon lyezon galaktoz asid sialik nan tout aparèy respiratwa a, evènman debòde bi-direksyon posib ant imen ak kochon. Premye ensidan li te ye nan sa a se te pandan pandemi grip 1918 lè yo te prezante IAV nan kochon nan men moun [8]. Liyaj sa a te rete estab nan popilasyon porsin yo jiska ane 1990 yo, lè souch H3N2 imen ak avyè yo te reyasòti ak liy H1N1 k ap sikile a pou pwodui souch doub ak trip H1N1, H1N2, ak H3N2 [8,9].

Kasèt triple reassortant gene (TRIG) ki fèk devlope te mennen nan yon peryòd divèsifikasyon rapid IAV nan kochon Nò Ameriken [10]. Kasèt TRIG sa a trè estab epi li fasilite ranplasman diferan konbinezon HA ak NA [5]. Depi 2005, anpil tansyon ak kasèt TRIG entèn sa a ki asosye ak jèn HA ak NA imen gaye nan twoupo kochon nan Etazini [9].

Pwochen evènman remakab la te fèt an 2009, lè yon souch H1N1 orijin kochon (H1N1pdm2009) gaye sou moun, ki te mennen nan pandemi grip 2009 la [11]. Transmisyon moun-a-kochon (zoonoz ranvèse) nan pandemi imen H1N1 IAV (H1pdm) te anrejistre plizyè fwa nan kochon Nò Ameriken, ki te mennen nan etablisman an nan yon nouvo liy ak nouvo swIAVs reassortant [8,10,12].

An total, sèt klad H1 distenk antijenik ak kat klad distenk viris H3 yo te anrejistre nan kochon Nò Ameriken [5]. Dènyèman, yon pwogram siveyans swIAV nan pwovens Lazi te idantifye yon viris genotip 4 (G4) reassortant Eurasian ki sanble ak avyè (EA), ak H1pdm ak jèn entèn trip reassortant.

Viris G4 sa a te mezire nan 10.4 pousan nan travayè kochon yo teste, epi li prezante makè potansyèl pandemi, ak kapasite pou transmèt bay moun ak diferan antijenisite nan viris imen ki sikile kounye a [7]. Se poutèt sa, li trè enpòtan pou anpeche ak kontwole enfeksyon grip nan kochon nan tou de yon endistri kochon ak pèspektiv sante piblik, e prensipal fason pou fè sa se atravè vaksinasyon [4].

Ozetazini, kalite vaksen ki pi komen an se viris inaktive antye (WIV), men yon vaksen vektè RNA ki eksprime HA ak yon vaksen NS1-twonke viris grip la atenue (LAIV) te apwouve tou [4] . Soutip IAV ki pi komen nan kochon atravè mond lan, enkli Amerik di Nò, se H1N1, H1N2, ak H3N2 [13].

Divèsite jenetik viris sa yo ka varye anpil pa rejyon an, sepandan, e gen diferans nan evolisyon jenetik swIAV nan Kanada ak USA, patikilyèman nan viris subtip H1 [12]. Siveyans nan Kanada ant 2009 ak 2016 te endike ke klad jenetik H1 ki te dominan nan USA a, H1g (1A.3.3.3) ak H1d-1 (1B.2.2), pa te detekte nan Kanada, ak Viris H1 nan Kanada te trè diferan de sa yo ki nan USA a [12].

Yo te idantifye yon nouvo klad H1 (H1a-3) nan Kanada ki te kòmanse nan Manitoba e ki te sibi kwasans rapid anvan yo te gaye nan tout peyi a ak nan Etazini. Konsènan viris H3, yo te dokimante sis liy H3 nan kochon Ameriken (IV-A rive IV-F), e nan sa yo, yo te jwenn twa nan kochon Kanadyen (IV-B, IV-C, ak IV-E) [12 ].

Sa a mete aksan sou enpòtans siveyans rejyonal yo ak konsyantizasyon sou sikilasyon tansyon yo enfòme pwogram vaksen efikas epi li endike ke vaksen ki fèt baze sou IAV sikile nan kochon Ameriken yo ka pa pwoteje kochon Kanadyen [12].

Anvan sa, yo te kreye yon vaksen bivalan lè l sèvi avèk de izole swIAV Kanadyen, A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] ak A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2), ki se reprezantan H{{ 9}} gwoup antijenik ak yon nouvo gwoup antijenik H3 ki soti nan Lwès Kanada (gwoup kochon IV-E), respektivman [14]. Nouvo vaksen sa a se yon vaksen viris ki atenue vivan ki fèt ak fòm SD191 ak SD69, SD191−R342V ak SD69-K345V ki depann de elastaz. Etid yo te montre ke li te pwoteksyon kont tou de SD191 ak SD69, osi byen ke yon souch eterològ H1N2 A/Swine/Saskatchewan/SD0142/2015 (H1N2) ki te izole tou nan Lwès Kanada [14].

Depi lè sa a, tansyon swIAV k ap sikile yo kontinye ap flote. Izolasyon klinik ki pi resan nan kochon nan Lwès Kanada yo te kolekte epi izole nan echantiyon jaden nan Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Kanada. A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] se yon manm gwoup antijenik H -3 men li gen senk sibstitisyon asid amine sou 54 sit antijenik H1 kle yo konpare ak SD191 [10,15, 16].

A/Swine/AB/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] se yon manm gwoup IV-E a men li gen ladan l de sibstitisyon asid amine nan sis sit antijenik H3 kle yo [17].

Nan etid sa a, nou te evalye si LAIV ki depandan de elastaz bivalan ta kenbe tèt ak nouvo izole klinik yo, epi yo ka rapòte ke li pwoteje kochon lè yo te defye ak tansyon swIAV SD467 (H1N2) ak SD435 (H3N2) k ap sikile kounye a.

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Selil ak viris

Madin-Darby canine kidney (MDCK) (ATCC, #CRL-2936) selil yo te konsève nan Minimal Essential Medium (MEM) (Sigma-Aldrich, M4655, St. Louis, MO, USA) ki gen 10 pousan serom fetal bovine. (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada 16000-044), epi yo te kenbe nan yon enkibatè imidite 5 pousan CO2 nan 37 ◦C. A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] ak A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV yo te izole nan echantiyon jaden nan Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatoon, Saskatoon, Saskatoon. , SK, Kanada.

Viris vaksen SD191−R342V ak SD69- K345V yo te sove jan yo te dekri anvan an [14]. Tout viris yo te grandi nan selil MDCK nan prezans 0.2 pousan albumin serik bovin (BSA) (Sigma-Aldrich, A7030) ak swa 1 µg/mL L-[(toluèn{). {11}}sulfonamid)-2-fenil] etil chloromethyl ketone (TPCK) - tripsin (viris WT) oswa 0.5 µg/mL elastaz neutrofil imen (viris ki depann de elastaz) (Sigma-Aldrich, E8140).
2.2. Animal Jijman Design

Yo te jwenn vennkat kochon swIAV-negatif ki gen kat semèn nan Prairie Swine Center Inc. (Saskatoon, SK, Kanada). Sa yo kochon yo te chwazi owaza epi divize an kat gwoup ak sèt kochon pou chak gwoup vaksen, ak senk kochon pou chak gwoup mock pran vaksen an.

Yo dekri devwa gwoup la nan Figi 1A. Gwoup sa yo te loje nan chanm separe dapre gwoup vaksinasyon yo (gwoup A plis B ak C plis D yo te loje ansanm) epi yo te pèmèt yo aklimatize pandan sèt jou anvan enfeksyon.

Nan senk semèn ki gen laj (jou 0) osi byen ke nan uit semèn ki gen laj (jou 21), kochon yo nan gwoup A ak B yo te pran vaksen intratracheally mock ak 4 mL MEM, pandan y ap gwoup C ak D yo te pran vaksen. ak yon vaksen bivalan ki genyen 1 × 106 PFU nan chak SD191−R342V ak SD69-K345V nan 4 mL MEM. Dis jou apre (jou 31), kochon yo te defye swa ak MEM (mock) oswa 1 × 106 PFU swa SD435-WT (H3N2) oswa SD467-WT (H1N2).

Yo te kontwole kochon yo pandan senk jou apre defi, ak tanperati rektal yo te pran chak jou ak ti prelèvman nan nen yo te pran nan tou de twou nen yo nan jou 1, 3, ak 5. Yo te ranmase serom apre premye (jou 20) ak dezyèm (jou 30) vaksen pou esè netralizasyon viris serik (SVN) ak tès imunosorban ki lye ak anzim (ELISA).

Nan jou 5 apre defi, tout kochon yo te imanite, epi poumon yo te ekstrè ak evalye pou prezans nan swIAV-karakteristik blesi brit. Yo te kolekte echantiyon tisi nan poumon tou pou izolasyon viris (Figi 1B).

2.3. Deklarasyon Etik

Tout pwosedi bèt yo te apwouve pa University Animal Care Committee (UACC) ak Animal Research Ethics Board (AREB) nan University of Saskatchewan. Pwotokòl sa a te apwouve 12 Novanm 2021 (Protokòl Itilizasyon Animal #20190064). Tout pwosedi yo te fèt dapre estanda Konsèy Kanadyen pou Swen Animal (CCAC) obligatwa nan Òganizasyon Vaksen ak Maladi Enfektye (VIDO), University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Kanada.

2.4. Pran echantiyon

Yo te mete ti prelèvman nen ki soti nan chak twou nen nan 1 mL MEM ki gen 1 × antibyotik antimikotik (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada, 15240-062) epi yo te jele nan -80 ◦C jiskaske qRT-PCR te fèt. Tout kochon yo te imanize pa administrasyon venn nan etanòl (240 mg / mL sodyòm pentobarbital; 2 mL pou chak 4.5 kg). Lè yo fin fè Etanazi, yo te retire poumon yo an total pou detèmine tou de pousantaj vyolèt-wouj, blesi fèm ak nemoni.

Pousantaj yo te detèmine dapre pwa lòb nan poumon ak volim nan poumon tout antye [18]. Yo te pran echantiyon nan poumon tou nan lòb dwat apical, kadyak ak dyafragmatik pou titrasyon viral. Echantiyon poumon sa yo te melanje nan volim egal nan 10 pousan w / v MEM ki gen 1 × antibyotik-antimycotic pou titration.

Figi 1. Gwoup kochon ak konsepsyon esè pou evalye efikasite pwoteksyon LAIV bivalan kont nouvo izole klinik yo. Kochon (n=5 pou gwoup MEM/MEM ak n=7 pou gwoup bivalan/bivalan) yo te pran vaksen entratracheal ak 4 mL MEM oswa vaksen bivalan ki konpoze de 1 × 106 PFU. nan chak SD191−R342V ak SD69-K345V nan jou 0 ak 21. Nan jou 31, kochon yo te entratracheally defye ak MEM oswa 1 × 106 PFU nan swa SD435 (H3N2) oswa SD467 (H1N2). (A)

Orè vaksen an, defi, ak pran echantiyon pou esè bèt sa a. Vennkat kochon swIAV-negatif ki gen kat semèn te pèmèt yo aklimate pandan sèt jou anvan enfeksyon. Nan senk semèn ki gen laj (jou 0) osi byen ke nan uit semèn ki gen laj (jou 21), kochon yo nan gwoup A ak B yo te pran vaksen intratracheally mock ak 4 mL MEM, pandan y ap gwoup C ak D yo te pran vaksen. ak yon vaksen bivalan ki genyen 1 × 106 PFU nan chak SD191−R342V ak SD69-K345V nan 4 mL MEM.

Dis jou apre (jou 31), yo te defye kochon yo ak swa MEM (mock) oswa 1 × 106 PFU swa SD435-WT (H3N2) oswa SD467-WT (H1N2). Yo te kontwole kochon yo pandan senk jou apre defi, ak tanperati rektal yo te pran chak jou ak ti prelèvman nan nen yo te pran nan tou de twou nen yo nan jou 1, 3, ak 5. Yo te kolekte serom apre premye (jou 20) ak dezyèm (jou 30) vaksen an. Nan jou 5 apre defi (jou 36) tout kochon yo te imanitè, epi yo te ekstrè poumon yo pou evalyasyon. (B) Kreye ak BioRender.com.

2.5. Egzamen iminosorban ki lye ak anzim (ELISA)

Pou fè antijèn kouch, SD435 ak SD467 yo te pwopaje nan selil MDCK ak pirifye lè l sèvi avèk ultracentrifugation gradyan sikwoz. Inaktivasyon viris yo te fèt lè yo ajoute 97 pousan -propiolactone nan viris la nan yon konsantrasyon 1:1000 (v/v) (Thermo Fisher Scientific, AAB2319703). Yo te balanse melanj sa a nan 4 ◦C lannwit lan, enkube a 37 ◦C pou de zè de tan pou fasilite idroliz -propiolactone, Lè sa a, estoke nan -80 ◦C jiskaske yo itilize.

Pou mezire nivo swIAV-espesifik IgG pwovoke pa vaksinasyon ak defi, yo te pran serom kochon apre premye (jou 20) ak dezyèm (jou 30) vaksen an, epi anvan necropsy (jou 36).

Pirifye -propiolactone-inaktive viris SD435 (1 µg/mL), ak SD467 (2 µg/mL), dilye nan tanpon kouch kabonat/bikabonat, (pH 9.6) yo te aplike nan plak Immulon-2 96-byen nan 1{{ 12}}0 µL/pi (Thermo Labsystems, Ottawa, ON, Kanada, 3655) ak enkubasyon lannwit lan nan 4 ◦C. Apre enkubasyon lannwit lan, plak kouvwi yo te lave kat fwa ak TBST (0.1 M Tris, 0.17 M NaCl, ak 0.05 pousan Tween 20), kote yo te ajoute dilusyon seri kat fwa nan serom oswa BALF. plak la an kopi, ki te swiv pa yon enkubasyon de èdtan nan tanperati chanm. Sewòm te ajoute nan yon dilution kòmanse nan 1:10, ak BALF te ajoute san dilution.

Echantiyon seri kontwòl pozitif defini deja ak kontwòl negatif apwopriye, serom, ak BALF ki soti nan kochon san vaksen nan yon etid anvan yo te kouri sou chak plak [14]. Plak yo te lave kat fwa ak TBST, apre sa kabrit anti-kochon IgG (H plis L) fosfataz ki make affinité pirifye antikò (1:5000) (Sigma Aldrich, SAB3700435) oswa sourit anti-kochon IgA (Serotec, MCA658) ( 1:300) dilye nan TBST te ajoute epi kite enkubasyon nan tanperati chanm pou yon èdtan.

ELISA IgA yo te devlope pa adisyon nan antikò IgG (H plis L) kabrit biotinylated anti-sourit (CALTAG, Burlingame, CA, USA, M30015) ak solisyon streptavidin fosfataz alkalin (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) tou de pou yon èdtan nan tanperati chanm. Apre enkubasyon, tou de plak IgG ak IgA yo te lave kat fwa ak TBST, kote p-nitrophenyl phosphate substrate (PNPP) [10 mg/mL p-nitrophenyl phosphate di(tris) sèl cristalline (Sigma-Aldrich), 1 pousan diethanolamine ( Sigma-Aldrich), 0.5 mg/mL MgCl2, ak pH 9.8] (1 mg/mL) te ajoute ak enkubasyon nan tanperati chanm pou de zè de tan.

Reyaksyon an te sispann grasa adisyon 0.3 M asid ethylenediaminetetraacetic (EDTA), ak plak yo li nan yon espektwofotomètr nan 405 nm ak yon referans nan 490 nm. Titer echantiyon an te defini kòm dilution ki pi wo nan ki OD echantiyon an te pi wo pase limit la defini (OD an mwayèn nan yon echantiyon negatif li te ye plis de fwa devyasyon estanda a).

2.6. Viris netralizasyon (VN) essai

Selil MDCK (3.5 × 104) yo te plake nan plak 96-byen. Serom ak BALF te inaktive chalè a 56 ◦C pou 30 min. Yo te ajoute dilusyon de fwa nan serik la ak BALF nan plak la an kat kopi, epi yo te enkube 60 µL serom dilye oswa BALF ak yon volim egal SD435 oswa SD456 ki gen 100 TCID50 a 37 ◦C pou 1 èdtan.

Lè sa a, yo te ajoute 100 µL nan melanj lan nan selil MDCK yo, epi efè cytopathogenic (CPE) te dokimante nan 48 èdtan ak 72 èdtan apre enfeksyon (pi). Titre antikò netralizasyon an te dilution ki pi wo a nan chak echantiyon serik ki konplètman pwoteje selil yo kont CPE nan omwen 2 soti nan 4 pwi.

2.7. Detèminasyon viral

Lè yo fin kolekte, echantiyon poumon yo te imedyatman mete sou glas epi yo te jele nan -80 ◦C jiskaske yo te trete. Pou pwosesis, yo te peze chak tisi nan poumon epi yo te ajoute yon konsantrasyon 10 pousan (w/v) nan MEM ak 1 × antibyotik-antimikotik (Thermo Fisher Scientific, 15240-062). Tisi poumon yo te omojènize nan TissueLyser II a (Qiagen, Hilden, Almay) nan 30 Hz pou 5 min, ki te swiv pa santrifujasyon nan 5000 × g pou 10 min nan 4 ◦C. Sipènatant omojenize a te kolekte epi estoke nan -80 ◦C jiskaske plis analiz.

Yo te toubiyon nan nen yo pou 15 segonn ak santrifuje nan 1600 × g pou 25 min nan 4 ◦C. Supernatant yo te kolekte epi estoke nan -80 ◦C jiskaske plis analiz. Titer viral yo te detèmine pa tès TCID50 pou poumon ak RT-PCR quantitative pou prelèvman nan nen yo.

2.8. Ekstraksyon RNA ak RT-PCR Kantitatif (qRT-PCR)
Pou detèmine nivo RNA viral SD467 ak SD435 nan prelèvman nen yo apre defi, yo te fè qRT-PCR. Yo te fè yon koub estanda lè l sèvi avèk RNA ekstrè nan SD435 ak SD467 nan yon tit li te ye. Yon ti tan, yo te itilize RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Toronto, ON, Kanada, 74136) pou ekstrè vRNA soti nan 200 µL lave nen.

RNA te konvèti nan cDNA lè l sèvi avèk inivèsèl grip Uni12 ak SuperScript III Transcriptase (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) [19]. qPCR te fèt an triple sou yon sistèm PCR an tan reyèl StepOnePlusTM (Applied Biosystems, CA, USA) ak Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5 µL cDNA, ak 1 µL 10µM primè pou pi devan ak ranvèse. Reyaksyon PCR yo te kouri nan yon tanperati rkwir nan 58 ◦C pou 40 sik. Tout sekans premye qPCR yo disponib sou demann.

2.9. Analiz estatistik

Analiz estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism 8. Yo te itilize tès ki pa parametrik Mann-Whitney ak Kruskal-Wallis. Diferans enpòtan yo endike pa * (p < 0.05), ** (p < 0.01), *** (p < 0.001) , oswa **** (p <0.0001). ns=pa enpòtan.

For more information:1950477648nn@gmail.com