Yon RNA ki pa kode lontan konsève, GAPLNC, modil repons iminitè a pandan chòk andotoksik.

Pou aprann plis enfòmasyon tanpri kontaktedavid.wan@wecistanche.com

Siyifikasyon

Enflamasyon te lajman etidye nan yon kontèks jèn pwoteyin-kode. Etid resan yo te dekouvri IncRNA yo kòm regilatè enpòtan nan iminite. Karakterizasyon fonksyonèl jèn sa yo rete yon domèn aktif nan rechèch. Nan etid sa a, nou idantifye GAPLNC kòm yon fonksyonman konsèveIncRNAant moun ak sourit. Rediksyon GAPLINC rezilta nan ekspresyon amelyore nan jèn repons iminitè ki dirèk.NF-kBsib. Etonanman, nou obsève ke sourit knockout Gaplinc montre rezistans nan chòk andotoksik LPS-induit epi yo jwenn ke ekspresyon fondamantal nan jèn enflamatwa anpeche fòmasyon pwen pwoteje kont echèk miltiògàn ak lanmò. Konklizyon sa yo gen enplikasyon nan tretman sepsis, kote nouvo terapi ki vize IncRNA yo ka kontribye enfòmasyon ki gen anpil valè nan konpreyansyon enflamasyon ak amelyore rezilta pasyan yo.

Klike la a pou aprann plis sou Cistanche

FG 1. idantifikasyon ak karakterizasyon nan macrophage-espesifikIncRNA GAPLINC. (A) A schematic for macrophage differentiation in vitro using primary human celeb or immortalized THP-1 cells, Isolated monocytes from human P8MCs are differentiated into macrophages using recombinant magnon stimulating factor. PHP-1 cells are differentiated into macrophages by treatment with PMA (100 nM). (8)RNA-Seg analysis on macrophages differentiated from monocytes isolated from human PBMCs (n = 4 donors). Results are represented in a volcano plot. GAPUNC (shown in red) is the most up-regulated and RNA (>1,000-fok). (C) RNA-Seq analiz deGAPLNCekspresyon pandan diferansyasyon monosit ak makrofaj pou pwen tan ki endike yo. Ekspresyon GAPLINC reprezante kòm kopi pou chak selil (FPKM. (D) Kat chalè reprezante ekspresyon jèn ki soti nan yon panèl koutim Nanostring, ki montre 10 InciNA ki eksprime diferans nan tèt konpare monosit ak makrofaj nan selil imen prensipal yo ak selil THP-1. Done ki soti nan Nanotring yo te fè nan kopi byolojik. (E) Yon chema pou selil granulosit-monosit ki bay de (2) popilasyon diferan; 1)MDDCs ak 2) MDMs. Tras navigatè genòm UCSC montre lekti RNA-Seq ki soti nan monosit, makrofaj, ak selil dendritik nanGAPLNCkote. () qPCR analiz de RNAs pirifye nan nikleyè (blan) ak cytoplasmic (gri) fraksyon nan MDMs (G qPCR analiz de Russ izole nan fraksyon polysome diferan nan sistèm MDM (10 a 50 pousan sikwoz gradyan, SW41, 40 K rpm, pou ~) 1.5 h).

Etid resan yo te idantifye dè milye de RNAs ki pa kodaj (ncRNAs) nan jenom mamifè ki kontwole ekspresyon jèn nan diferan pwosesis byolojik. Malgre ke IncRNA yo te idantifye nan yon varyete selil iminitè ak enplike nan repons iminitè, fonksyon an byolojik ak mekanis nan majorite a rete enkonu, espesyalman nan sepsis. Isit la, nou idantifye yon wòl pou yon hdRNA-gastric adenocarcinoma prediksyon long intergenic noncoding RNA (GAPLINC) - deja karakterize pou wòl li nan kansè, kounye a nan yon kontèks iminite natirèl, macrophages, ak chòk endotoksik LPS-induit. Analiz transcriptome makwofaj ki soti nan imen ak sourit revele ke GAPLNIC se yon IndRNA kon-sèvi ki trè eksprime apre diferansyasyon makrofaj yo. Lè deklanchman enflamatwa, GAPLNC se rapidman desann-reglemante. Makwofaj ki diminye nan GAPLNC montre ekspresyon de jèn enflamatwa améliorée nan debaz, pandan y ap ekspresyon twòp nan GAPLNC siprime repons sa a. Konfòm ak selil GAPLNC apovri yo, sourit knockout Gaplinc montre nivo debaz yo amelyore nan jèn enflamatwa epi yo montre rezistans nanLPS-pwovokechòk andotoksik. Mekanistikman, siviv lye ak nivo ogmante nan nikleyè NF-xB nan sourit knockout Gaplinc ki kondwi ekspresyon fondamantal nan jèn sib tipikman sèlman aktive apre eksitasyon enflamatwa. Nou montre ke aktivasyon sa a nan jèn repons iminitè anvan defi LPS mennen nan de-zone fòmasyon boul nan san, ki pwoteje sourit knockout Gaplinc kont echèk milti-òganis ak lanmò, Ansanm, rezilta nou yo idantifye yon fonksyon deja enkoni pou GAPLNC kòm yon regilatè negatif nan enflamasyon. epi dekouvri yon wòl kle pou lncRNA sa a nan modil chòk andotoksik.

Fig.2. GAPLNC se yon regilatè negatif nan enflamasyon ak depann sou siyal Nf-sB. Monosit izole nan PBMC imen ak diferansye nan makrofaj yo te transfekte ak kontwòl oswa GAPLNC siRNA. (A)RNA-Seqanalysissou GAPLNC kd oswa kontwòl siRNA MDMs. RNA-Seq te fèt nan kopi byolojik. Rezilta yo reprezante nan yon trase vòlkan. Siyifikativman jener regilasyon ak chanjman pli ki pi gran pase oswa egal a 2 yo nan bwat wouj. (6) Analiz GO-Tèm sou jèn ki kontwole anpil. (C) Kat chalè reprezante ekspresyon jèn nan pi gwo jèn ki gen rapò ak iminitè ki kontwole sou GAPLNC kd. Done ki soti nan RNA-Seq yo te fèt nan kopi byolojik. (D) izoform GAPLLINC nan MDM yo te detèmine pa sekans R2C2 ki baze sou Nanopore. Done ki soti nan sekans Nanopore yo te fèt nan kopi byolojik (done anvan tout koreksyon yo disponib nan SRAunder Bloproject PRINA639136). (E)Yon tablo ki reprezante konte lekti ak pousantaj chak izofòm GAPLNC. (F) Vektè bidireksyon ki eksprime GFP-Zetocin sou yon bò ak GAPLNC sou lòt bò a. (G ak H) analiz qPCR nan ekspresyon GAPLNC nan selil THP-1 ki eksprime ektopik GAPLNC oswa kontwòl vektè vid. Nivo IL6 yo te mezire apre eksitasyon ak LPS (200 nal mL) pou 6 h; done yo te rasanble nan twa eksperyans endepandan.*P<0.05. ()="" rna-seq="" analysis="" of="" mdms="" stimulated="" with="" lps(200="" ng/ml)="" for="" the="" indicated="" time="" points.="" data="" from="" rna-seq="" was="" performed="" in="" biological="" duplicates.="" galplinc="" expression="" is="" represented="" as="" copies="" per="" cell="">FPKM), U qPCR analiz de GAPLINC nan MDMs （n=3）pretrete ak DMSO oswa BAY-7082（10μM）, ki te swiv pa eksitasyon LPS （200 ngmL） pou 6 ht done yo te pisin nan twa eksperyans endepandan. *P<0.05. (k)atacseq="" analysis="" of="" monocytes="" and="" macrophages,="" untreated="" and="" treated="" with="" lps="" (200="" ng/ml)="" for="" 1,6,="" and="" 18h.ucsc="" browser="" track="" displays="" atac-seq="" reads="" at="" the="" gaplinc="">

sepsis se yon maladi ki menase lavi ki te koze pa yon reyaksyon twòp nan kò a nan prezans nan enfeksyon, ki ka rapidman mennen nan echèk milti-òganik ak lanmò. Sistèm iminitè a esansyèl nan bay pwoteksyon kont enfeksyon; sepandan, aktivasyon san kontwòl ka gen konsekans grav pou lame a. Dapre Sant pou Kontwòl ak Prevansyon Maladi, youn sou twa pasyan ki mouri nan yon lopital gen sepsis(1). e ankò nou toujou pa konprann mekanis molekilè ki kache ki mennen nan fatalite. Opsyon klinik pou tretman sepsis yo limite a akouchman likid, antibyotik, ak swen sipò epi yo rete lajman san chanjman pandan plizyè dizèn ane. Menmsi dyagnostik bonè ak tretman rapid te amelyore rezilta sepsis(2), gen yon bezwen kritik pou devlope nouvo terapi. Malgre ke etid ekspresyon jèn yo te fèt pou egzamine potansyèl sib ki ka geri pou sepsis, objektif sa yo rete lajman pa karakterize (3). Nou te idantifye yon long noncoding RNA (lncRNA) ak wòl nan kontwole repons iminitè a ak chòk andotoksik ki bay avni pou devlopman nouvo dwòg pou vize sepsis.

Rezilta

Fig. 3. GAPLINC se konsève nan sourit epi kontwole repons a chòk andotoksik. (4) GAPLNC konsève nan sinteny. GAPLNC sitiye sou Chr18 nan moun ak sou Chr17 nan sourit, ant pwoteyin ki kode jèn Dlgap1 ak Gift. Dlgapil pa eksprime nanmakrofaj. (B) MCA montre distribisyon nivo Gaplinc nan divès kalite selil iminitè (BM). (C) analiz qPCR nan ekspresyon Gaplinc nan selil B ak BMDMs; done sa yo (vle di ± SD) se reprezantan twa eksperyans endepandan, (D) qPCR analiz de Gaping ekspresyon nan BMDMEstimulated withLPS (200 na / mL) pou 6h; done sa yo (vle di ± SD) se reprezantan twa eksperyans endepandan. (E) Chematik lakou Gaplinc anvan ak apre sipresyon medyatè CRISPRCas9. Liy tirè yo endike rejyon an apwoksimatif nan efase. Jèl reprezante anplifikasyon PCR nan done jenomik. Longè anplikon yo konpare pou sourit WT ak Gaping KO, (F) analiz qPCR nan ekspresyon Gaplinc nan WT ak Gaplinc-KO BMDMs lè l sèvi avèk yon konbinezon de primè yo detekte Exon1, Exon2, ak rejyon ekson-spanning nan transkripsyon Gaplinc; done sa yo (vle di ± SD) se reprezantan twa eksperyans endepandan. (G) RNA-Seq analiz nan BMDMs soti nan sourit WT ak Gaplinc KO (n =3). Rezilta yo reprezante nan yon trase vòlkan. Jèn siyifikativman kontwole ak yon chanjman pli ki pi gran pase oswa egal a 2 yo montre an wouj. (H) GO-Tèm analiz sou jèn siyifikativman kontwole. (I ak J) Done siviv sourit WT ak Gaplinc KO yo montre an repons a defi E. coli LPS (5 mg / kg / sourit) (n =6 a 10). Yo te konte tès estatistik diferans yo lè l sèvi avèk tès log-rank (Mantel-Cox). "...P< 0.001.="" changes="" in="" body="" temperature="" of="" wt="" and="" gapline="" ko="" mice="" were="" recorded="" at="" the="" indicated="" time="" points.="" (k)="" survival="" data="" of="" wt="" and="" gaplinc="" ko="" mice="" are="" shown="" in="" response="" to="" the="" e.="" coli="" lps="" challenge(20="" mg/kg/mice)(n="10)." the="" statistical="" test="" of="" differences="" was="" calculated="" using="" the=""><>

Kòm ekspresyon lncRNA ka kontwole repons iminitè a lè li afekte diferansyasyon selil iminitè yo ak fonksyon respektif yo (4-7), nou te vle mennen ankèt sou wòl ncRNA yo nan makrofaj yo. Makwofaj yo enpòtan selil iminitè natirèl ki ka sòti nan monosit epi yo enpòtan anpil pou rekonesans patojèn atravè itilizasyon reseptè Toll-like (TLRs) .Lè deklanchman. TLR yo kòmanse chemen siyal konplèks ki aktive faktè transcription kle tankou NF-kB. ki mennen nan transcription a nan dè santèn de jèn repons iminitè (8).

Pou idantifye IncRNA ki enplike nan diferansyasyon ak fonksyon makrofaj, nou te fè sekans RNA (RNA-Seq)nan tou de makwofaj prensipal moun ki sòti nan monosit (MDMs) ak liy selil monositik THP-1s (Fig. lA ak SI Apendis. Fig. S1). Nou idantifye gastric adenocarcinoma prediksyon long intergenic noncoding RNA (GAPLINC) kòm IncRNA ki pi kontwole pandan monosit ak macrophage diferansyasyon (Fig. 1B). Nivo GAPLNC yo te detekte pa jou 1 epi yo te ogmante a ~ 300 kopi pou chak selil (Fig 1C). Sèvi ak teknoloji RNA-profiling (nCounter, Nanostring), nou valide GAPLNIC kòm youn nan pi gwo 10 mRNA yo eksprime nan MDM prensipal diferansye ak THP-1 (Fig1D). Nou konfime tou ke GAPLINC trè eksprime nan MDMs men li pa eksprime nan selil ki gen rapò ak selil monosit ki sòti nan selil dendritik (MDDCs) (Fig. 1E), sijere ke ekspresyon de GAPLINCis selil-kalite espesifik. Lè nou fè yon eksperyans fraksyon selilè ak mezire nivo GAPLNIC nan konpatiman sitoplasmik ak nikleyè makwofaj yo lè l sèvi avèk qPCR, nou te jwenn GAPLNIC se sitou lokalize nan sitosol la lè konpare ak CD14, yon mRNA sitoplasmik, ak NEAT1, yon IncRNA nikleyè (Fig. 1F). Sa a konsistan avèk rezilta nan selil kansè yo, kote GAPLNIC se sitou lokalize nan sitoplasm la (9). Pou asire GAPLNC pa kodaj, nou te fè polysome pro-filing, yon metòd yo itilize pou analize si yon jèn aktivman tradui nan pwoteyin. Kontrèman ak CD14, yo pa jwenn ni NEATI ni GAPLNC nan fraksyon ki gen anpil polysome, sa ki sijere ke GAPLNC pa tradui (figi 1G),

Fig.4. Gaplnc KO kontwole IRG yo epi li montre yon nivo ogmante nan p65 nan toutouni nan debaz. (A) Nivo sitokin nan serik sourit WT ak Gaplinc KO nan basal.n=4 rive 7,*P<0.05.(b and="" c)rna-seg="" analysis="" in="" bmdms="" from="" wtand="" gaplinx="" ko="" mice="" stimulated="" with="" lps="" (200naiml)for6h="" (n="3)." the23aenes="" up-regulated="" in="" gap/inc="" ko-only="" condition="" are="" compared="" to="" wt="" and="" gapfinc-ko="" bmdms="" stimulated="" with="" lps.="" the="" resulting="" fold="" change="" upon="" lps="" stimulation="" is="" shown="" for="" wt="" and="" gapinc-ko="" bmdms.genes="" are="" ranked="" according="" to="" their="" fold="" change="" in="" wt.="" (d)="" coagulation="" parameters="" assessed="" for="" wt="" and="" gapinc="" ko="" mice="" challenged="" ip.with="" e.="" coils(5mg/kg/mice)(n="4" to="" 5).plasma="" was="" collected="" 18h="" post-lpsiniection.="" aptt="" was="" measured.="" (e)genes="" upregulated="" non="" sirna="" kd="" of="" human="" gaplnc="" in="" mdms="" are="" compared="" to="" genes="" up-regulated="" upon="" crsprcas9="" knockout="" of="" mouse="" gaplincin="" bmdms="" (fold="" change="" ≥1.5).="" up-regulated="" genes="" overlapping="" in="" both="" humans="" and="" mice="" are="" shown="" in="" the="" middle.="" (f)="" western="" blot="" of="" kb-gin="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" at="" the="" indicated="" time="" points="" following="" stimulation="" with="" lps="" (200="" ngml);="" these="" data="" are="" representative="" of="" three="" independent="" experiments,(g)="" western="" blot="" of="" p65="" in="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="3)" at=""><0.01. (h="" western="" blot="" of="" p65="" in="" the="" nuclear="" fraction="" of="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="">

Apre sa, nou te envestige efè silans GAPLNC sou diferansye makrofaj yo. Kòm nivo GAPLNC te ogmante pandan diferansyasyon, nou te sipoze ke knock-down (KD) GAPLNC ta gen enpak sou jèn ki enplike nan diferansyasyon. Sèvi ak pisin ti RNA entèferans (siRNA), nou reyalize ~ 55 a 65 pousan kd nan GAPLNIC nan MDMs prensipal (SIAppendix, Fig. S2). Nou te fè RNA-Seq epi idantifye yon kantite jèn ki te dysregulated sou GAPLNC kd (Fig. 24). Nou te konfime gwo frape yo lè l sèvi avèk Nanostring (SI Apendis, Fig. S3). Gene Ontology (GO) analiz anrichisman te montre ke jèn repons iminitè yo te siyifikativman siyifikativman surreprezante nan jèn yo-reglemante sou GAPLNIC kd epi yo pa jèn ki enplike nan diferansyasyon makrofaj, kontrèman ak ipotèz orijinal nou an. (Fig. 2B). Miyò, jèn ki eksprime diferan nan selil GAPLNIC-KD yo gen ladan sitokin pro-enflamatwa ak chemokin (IL6, CXCL10, ak TNFSF10), jèn ki ankouraje IFN (ISGs) (IFIT2 ak RSAD2), ak pwoteyin ki gen guanyl (GBPs) (GBP3 ak GBP5). (Fig. 2C ak SI Apendis. Fig. S4). Pou verifye ke diferansyasyon macrophage pa te afekte pa GAPLNC kd. nivo CD11B.CD16 ak CD14 yo te mezire nan makrofaj kontwòl ak siyal trete epi yo te jwenn yo sanble (SI Apendis. Fig S5). Apre sa, nou te itilize yon lòt apwòch kd itilizeCRISPRanpèchman (CRISPRi) pou vize sit la kòmanse transkripsyon an pa GAPLIN Lè l sèvi avèk twa RNA gid diferan (gRNAs) nan selil THP-1 ankouraje ak phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Nou reyalize plis pase 80 pousan kd nan GAPLINCand ankò obsève ekspresyon ogmante nan proinflammatory cytokine IL6 a lè GAPLIN se frape desann nan debaz (SI Apendis. Fig. S6 A ak B). Enteresan, apre lipopolysaccharide (LPS) aktivasyon, nivo IL6 yo te sanble nan kontwòl kont selil GAPLNIC kd THP -1 (SIAppendix, Fig. S6C). Piske nivo debaz yo diferan, endiksyon an jeneral pliye IL6 redwi lè yo retire GAPLNC. (S7 Apendis, Fig. S6D).

Kòm GAPLINC kd te lakòz yon regilasyon ogmantasyon nan jèn repons iminitè a, nou te jenere yon liy selil THP-1 ki twòp eksprime GAPLNIC pou detèmine si li medyatè efè opoze a. Sèvi ak done sekans ki long li. nou idantifye izoform dominan yo nan GAPLIN eksprime nan MDMs (Fig. 2D). Isoform ki pi abondan, ki matche ak sekans referans (RefSeq) annotasyon jèn, te enkòpore nan konstwi nou an (Fig. 2E). Nou itilize yon vektè lentiviral ki gen yon pwomotè bidireksyon pou kondwi vèt fliyoresan pwoteyin (GFP)/Zeocin ak GAPLNC an paralèl (Fig. 2F). Nou konfime lè l sèvi avèk qPCR ke GAPLNC te eksprime estab nan THP -1 konpare ak kontwòl (Fig. 2G). Ekspresyon twòp nan GAPLNC redwi IL6 nan nivo RNA konpare ak kontwòl apre eksitasyon ak LPS, yon eleman nan bakteri gram-negatif (Fig. 2H). Obsèvasyon sa yo sijere ke GAPLNC aji kòm yon regilatè negatif nan repons enflamatwa a.

Apre sa, nou egzamine nivo GAPLNIC nan MDM prensipal an repons a enflamasyon. Sou eksitasyon LPS, nou te jwenn ke GAPLNC te rapidman desann-reglemante (Fig. 2I). Anplis de sa, lè l sèvi avèk qPCR nou montre ke GAPLNC se tou desann-regleman apre deklanchman ak yon varyete deTLRligands(SI Apendis, Fig. S7A). Endiksyon nan kontwòl pozitif enflamatwa jèn TNF-a, IL6, ak CCL5 te konfime (SI Apendis, Fig. S7B). Done sa yo sijere ke ekspresyon GAPLNC dwe redwi apre eksitasyon yo nan lòd pou pi bon endiksyon jèn enflamatwa rive. Pou evalye wòl NF-kB nan kontwole ekspresyon GAPLNIC, MDM yo te pretrete ak dimethyl sulfoxide (DMSO) oswa BAY11-7082, yon inibitè NF-B,

ki te swiv pa eksitasyon ak LPS pou 6 h.Nan BAY11-7082-trete MDMs.the down-regulation of GAPLNC te andikape parapò ak kontwòl (Fig. 2/). ki sijere règleman GAPLNC depann sou siyal NF-KB. Endiksyon kontwòl pozitif enflamatwa jèn TNF- ak IL6 sou eksitasyon LPS te konfime (SIAppendix, Fig, S7C). Pou konprann ki jan GAPLNIC yo ap reglemante, nou itilize Assay for Transposase-Accessible Chromatin lè l sèvi avèk sekans (ATAC-seq) nan MDM yo. evalye aksesiblite chromatin nan locus GAPLNC la. Nou te jwenn ke GAPLNC se aktivman transkri nan repoze makro-faj men byen fèmen apre eksitasyon LPS (Fig. 2K), sijere ke GAPLNIC se reglemante nan nivo nan transcription.

Pou eksplore konsèvasyon GAPLNC ant moun ak sourit. nou t'ap chache idantifye loci syntenic, kote jèn yo konsève pozisyon ant de menm jèn ki kode pwoteyin yo. ki te swiv pa yon evalyasyon pou konsèvasyon fonksyonèl. Isit la, nou montre ke Gaplinc se pozisyon konsève, lokalize yon transkripsyon ant jèn Dlgap1 ak TgifI (Fig.3A). Pou konfime espesifik kalite selil, nou itilize Mouse Cell Atlas (MCA)

(10) pou evalye nivo transkripsyon atravè selil iminitè yo nan mwèl zo a (BM) epi li jwenn li pi wo eksprime nan makrofaj, ak pi ba nivo ekspresyon nan progenitors netrofil (Fig. 3B). Apre sa, pou detèmine si modèl ekspresyon yo te konsève pandan diferansyasyon makrofaj nan tou de imen ak sourit, nou te fè RNA-Seq konpare selil BM ak makrofaj mwèl zo yo (BMDMs), ranpli asanble transkripsyon de novo, epi yo te jwenn nivo Gaplinc sourit ogmante apre diferansyasyon. (SI Apendis, Fig. S8A). Nou valide sa a pa qPCR, konpare nivo Gaplinc nan selil BM ak BMDMs (Fig. 3C). Konparab ak GAPLNIC moun. sourit Gaplinc se rapidman desann-reglemante nan LPS-estimile BMDMs (Fig.3D). Kòm yon kontwòl, nou konfime endiksyon an nan jèn enflamatwa The-a ak I6 (SI Apendis. Fig. S8B). Sourit Gaplinc se tou rapidman desann-regleman apre deklanchman ak plizyè ligand TLR. Endiksyon nan jèn kontwòl pozitif ll6 ak Ccl5 yo te konfime tou (SI Apendis, Fig. S8C).

Sèvi ak CRISPR, nou te pwodwi yon sourit knockout Gaplinc (KO) kote yo te retire Exon I ak majorite premye entron an (Fig. 3E). Sourit Chaplin KO elve nòmalman epi yo pa montre okenn domaj devlopman evidan. Sipresyon Gapline te konfime pa anplifikasyon PCR nan ADN jenomik nan sourit sovaj (WT) ak Gaplinc KO, ak gwosè anplikon ~ 1,300 bp pou WT ak ~ 500 bp pou sourit Gaplinc KO (Fig.3E), Estrateji jenotip konplè. pou konfime WT ak Gaplinc KOs make nan SI Apendis, Fig. S9. Nou te konfime tou deficiency Gaplinc nan BMDMs lè l sèvi avèk qPCR (Fig. 3F). Pou evalye si deficiency Gaplinc afekte diferansyasyon, nou tache WT ak Gaplinc-KO BMDMs pou CD11B ak F4/80; modèl tach yo te menm jan an, sijere diferansyasyon nòmal makrofaj (SI Apendis, Fig. S104). Pou evalye si Gaplinc KO deranje fonksyon makrofaj, nou konpare aktivite fagositoz nan WT ak Gaplinc-KO BMDMs epi nou pa jwenn okenn diferans (SI Apendis, Fig.S10B).

Pou evalye enpak mondyal defisi Gaplinc nan makrofaj, nou te fè RNA-Seq sou WT ak Gaplinc-KO BMDMs; tou de yo pa trete ak LPS ankouraje pou 6 èdtan. Nan Gaplinc-KO BMDMs, ekspresyon de 23 jèn (yo montre an wouj. Fig.3G) te siyifikativman moute-reglemante nan debaz. Jèn sa yo gen ladan sitokin pro-enflamatwa ak chemokin (Il6.l1-a. I{1-8, ak Cxd10), ISGs (Ifitlbl1), manm fanmi GBP (Gbp5 ak Gbp0), ak selil-sifas makè espesifik pou aktive macrophages(Cd69).GO analiz konfime ke jèn ki enplike nan repons iminitè a gen twòp reprezantasyon nan Gaplinc-KO BMDMs nan debaz (Fig. 3H). Jèn sa yo anjeneral reglemante apre eksitasyon LPS (SI Apendis. Fig. S11). Menm jan ak done yo jwenn nan etid imen nou yo, done sa yo sijere saGAPLNCse fonksyonèl konsève atravè espès yo fondamantalman kontwole ekspresyon jèn repons enflamatwa (IRGs). Pa te gen okenn gwo diferans nan jèn yo ki te kontwole apre eksitasyon LPS ant WT ak Gaplinc-KO BMDMs (Dataset S1).

Anpil etid yo montre kapasite IncRNA yo pou kontwole transkripsyon jèn vwazen yo (11). Kòm sa yo, nou eksplore potansyèl cis-règilasyon wòl pou Gaplinc kòm jèn vwazen li yo, Tgif1, te deja enplike nan modulation aktivasyon makrofaj (12). Sèvi ak done RNA-Seq nou an, nou konfime ke nan GaplincKO BMDMs, ekspresyon Tgifl relatif a selil T pa te afekte (SIAppendir.Fig.S124). Nou plis konfime pa qPCR ke Tgifl pa te chanje nan Gaplinc-KO BMDMs (SI Apendis, Fig. S12B). Apre sa, nou te eksplore posibilite ke dezòd nan plas Gaplinc ta ka retire yon eleman regilasyon enpòtan, tankou yon enhancer. Nou itilize done ATAC-seq ki soti nan WT BMDMs pou evalye rejyon aktif nan transkripsyon nan Gaplinc (13). Nou pa t idantifye siyal ki nan rejyon an sipresyon Gaplinc, sèlman sa yo ki koresponn ak pwomotè Gaplinc (SI Apendis. Fig.S13). Ansanm, done sa yo sijere ke regilasyon IRG yo sou deficiency Gaplinc se pa akòz efè sou jèn vwazen oswa retire yon eleman regilasyon.

Kòm Gaplinc KO nan BMDM yo kontwole ekspresyon IRG yo nan kondisyon fondamantal, nou pwochen te vle defi bèt Gaplinc KO nan vivo yo obsève diferans ki genyen nan repons lame. Nou te anplwaye yon modèl "endotoksik chòk". kote Escherichia coli LPS te enjekte intraperitoneally (ip) nan sourit WT ak Gaplinc KO pou mezire diferans ki genyen nan siviv. Nan yon dòz 5 mg / kg / sourit. Sourit WT te montre 0 pousan siviv apre 2 d (Fig.30. Sepandan, 100 pousan nan sourit Gaplinc KO siviv, sg-ap resevwa ke sourit Gaplinc KO gen rezistans nan chòk endotoksik LPS-induit (Fig. 31). , diferans siyifikatif tanperati ant sourit WT ak Gaplinc-defisi yo obsève (Fig 3). Menm lè w ap itilize yon dòz pi wo nan LPS nan 20 mg / kg, sourit yo Gqplinc-defisi montre yon avantaj siviv enpòtan (Fig. 3K). , done sa yo montre ke Gaplinc jwe yon wòl enpòtan nan reglemante repons iminitè a nan vivo.

Apati etid imen nou yo, nou konnen ke GAPLNC ka regle jèn iminitè yo nan debaz. Pandan ke pa gen okenn diferans nan ekspresyon cytokine apre deklanchman enflamatwa, gen yon diferans nan grandè repons lan depi nivo debaz yo diferan, Se poutèt sa, pi byen konprann diferans sa yo siviv nan vivo, nou evalye pou chanjman nan ekspresyon cytokine nan debaz. Nou itilize yon seri cytokine multiplexed pou mezire an menm tan biomarkers ki asosye ak repons iminitè a, sepsis, ak kansè. Nan debaz, jèn iminitè kle ki gen ladan MDC. MIP-1a.IL-13. IL-5. ak M-CSF te siyifikativman elve nan serom nan sourit Gqplinc KO konpare ak WT (Fig.44). Sitokin sa yo enplike nan rekritman selil: sepandan, lè l sèvi avèk sikometri koule, nou konfime pousantaj netrofil, selil T, selil B, eozinofil, monosit, ak makrofaj yo te konparab ant WT ak Gaplinc KOmice nan debaz (SI Apendis, Fig. S14) . Enteresan, pousantaj sa yo te konparab tou ak defi apre-LPS nan pwen yo 6 h ak 18 h tan (SI Apendis, Fig. S15 ak S16). Anplis de sa, serom soti nan sourit WT ak Gaplinc KO teste pou karakteristik klinik nan sepsis, ki gen ladan laktat ak pwoteyin C-reyaktif (CRP) (S7 Apendis, Fig. S17), pa montre okenn diferans.

Kòm ogmante nivo MDC oswa IL-13(Fig.44) te deja karakterize yo jwe wòl pwoteksyon kont chòk ando-toksik atravè modulasyon nan sitokin proenflamatwa (14, 15), nou pwochen egzamine pou diferans ki genyen nan nivo sitokin proinflammatory. , ki gen ladan l6, Il1-, l1-, ak Cxcl10, apre deklanchman enflamatwa. Pandan ke nivo WT ak Gaplinc KO yo menm nan tou de transkripsyon an (Fig. 4B) ak nivo pwoteyin (SI Apendis, Fig.S18A-C), grandè chanjman an pi ba anpil (Fig. 4C), sijere ke sa a pliye redwi. chanjman ka jwe yon wòl nan anpeche emotivite sourit Gaplinc KO nan LPS. pwovoke chòk andotoksik.

Ansanm ak pwodiksyon rampant de cytokines. yon lòt aspè klinik nan chòk andotoksik ki ka mennen nan mòtalite se fòmasyon nan san boul nan veso ki pi piti yo, ki mennen nan yon echèk miltiògàn (16.17). Pou adrese sa a, nou analize serom sourit LPS ip trete pou evalye diferans ki genyen nan coagulation. Sèvi ak yon tès tronboplastin pasyèl aktive tan (a) ki mezire tan fòmasyon kayo, nou jwenn ke sourit WT montre yon tan siyifikativman pwolonje konpare ak sourit Gaplinc KO sou defi LPS (Fig. 4D). Tan aPTT pwolonje sijere sourit WT yo te deja sibi koagulasyon ak apovri faktè kle koagulasyon, konsa ke nan moman tès la, kòmanse kayo, ak mezire, tan nan fòmasyon kayo ogmante. Done yo sijere ke diferans ki genyen nan siviv sou defi LPS yo se akòz sourit WT sibi ogmante kayo, ki mennen nan evantyèlman echèk ògàn ak lanmò.

Apre sa, nou te eseye mekanikman konprann ki jan Gaplinc ap medyatè efè sa a. Premyèman, nou konfime lokalizasyon li yo ak analize nivo Gaplinc nan tou de konpatiman sitoplasmik ak nikleyè nan BMDMs pa qPCR. Menm jan ak GAPLNIC moun. sourit Gaplinc te majorite cytoplasmic (ST Apendis, Fig.S19). Apre sa, nou te fè yon modifye Comprehensive Idantifikasyon nan RNA-obligatwa proteins(ChIRP), makonnen ak espektrometri mas ak ti sekans RNA, kòm GAPLNC te deja montre yo kominike avèk mikwo RNAs (18). Nou pa t obsève entèraksyon ak sib deja idantifye (SIAppendix, Fig. S20).

Kòm nou pa t 'kapab idantifye yon patnè dirèk obligatwa, nou konsantre sou fonksyon an konsève ant imen ak sourit, espesyalman jèn yo konsève afekte nan etid imen GAPLINC kd ak sourit Gaplinc KO, majorite nan yo se regilatè NF-kB (Fig. 4E). ). Fòm ki pi abondan nan NF-KB aktive pa LPS se p65:p50 heterodimer, ak sèt soti nan nèf jèn yo konsève yo se p65 objektif dirèk (19). Nou te itilize natif natal RNA imunoprecipitation (RIP) epi te montre ke pa gen okenn entèraksyon dirèk ant Gaplinc ak p65 (S7 Apendis, Fig. S21). nan inhibitor I-kB- nan selil repo yo. Lè yo fin aktive, I-KB- degrade, sa ki pèmèt p65:p50 transloke nan nwayo a ak aktive jèn sib (20). Nan BMDM WT ak Gaplinc-KO, nou mezire degradasyon I-kB- lè l sèvi avèk Western blot epi nou pa jwenn okenn diferans (Fig.4F). Apre sa, nou konpare nivo total p65 nan BMDM yo. Nan done RNA-Seg nou yo, nivo transkripsyon p65(RelA) nan tou de kondisyon fondamantal ak LPSstimulatedconditions pou WT ak Gaplinc-KO BMDM yo konparab (SI Apendis, Fig. S22). Sepandan, lè nou te konpare nivo total pwoteyin p65 pa Western blot, nou te jwenn siyifikativman ogmante p65levels nan Gaplinc-KOcells konpare ak WT (Fig. 4G). Sa a sijere ke Gaplinc kontwole nivo total p65 nan nivo tradiksyon an. Anplis de sa, nou te evalye nivo p65 nan konpatiman sitoplasmik ak nikleyè yo epi nou te jwenn ke p65 nikleyè gen plis abondan nan selil Gaplinc-ensufizant konpare ak WT (Fig. 4H). Konbine, done sa yo sijere yon wòl mekanistik pou GAPLNC nan priming aktivasyon an nan IRG kritik yo.

Diskisyon

Isit la, nou te idantifye GAPLNIC kòm yon IncRNA ki eksprime cytosolically konsève nan imen ak sourit ki fonksyone kontwole ekspresyon jèn enflamatwa atravè règleman nan NF-xB. An konparezon ak IncRNAs sitosolik rapòte ki gen enpak sou efikasite tradiksyon lè yo modile ekspresyon pwoteyin oswa asanble ribozom (21-23), nou jwenn Gapline cytosolically kontribye nan kapasite tradiksyon p65; sepandan, mekanis nan entèraksyon, swa dirèk oswa endirèk, rete yo dwe detèmine. Konklizyon nou yo bay apèsi sou fason yon IncRNA fonksyonèl konsève kontwole repons iminitè a epi bay avni ankèt pou devlopman terapetik pou chòk andotoksik.