Yon Distribisyon Distenktif nan Faktè Ipoksi-induzibl -1 nan Kiltive Renal Tubular Cells ak Hypoperfusion Simulation pa Plasman Coverslip

Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Résumé

Ipoksi kwonik nan tubulointerstitium nan ren jwe yon wòl kle nan pwogresyon nan kwonikrenmaladi(CKD). Se poutèt sa li enpòtan pou mennen ankèt sou ipoksi tubulaires ak aktivite faktè ipoksi-induzibl (HIF) -1 an repons a ipoksi. Rarefaksyon nan kapilè peritubular la lakòz ipopèfizyon nan CKD; sepandan, efè hypoperfusion sou HIF yo raman te envestige. Nou pwovoke ipopèfizyon ki te koze pa plasman kouvèti kouvèti nan imenren-2 selil ak obsève yon gradyan oksijèn anba kouvèti a. Iminositochimi HIF-1 te montre yon fòmasyon ki gen fòm beye sou kwen yon zòn pimonidazol pozitif, ke nou te rele "HIF-bag". Tansyon oksijèn bag HIF a te estime ant apeprè 4 mmHg ak 20 mmHg. Rezilta sa a pa t konpatib ak rechèch sot pase yo ki montre akimilasyon HIF-1 nan seri anoksik ak tansyon oksijèn omojèn. Nou te plis obsève prezans yon gradyan pH anba yon kouvèti, osi byen ke yon chanjman nan bag la HIF akòz chanjman nan pH la nan mwayen kilti a, sijere ke bag la HIF te fòme pa represyon nan HIF-1 ki gen rapò. ba pH. Rechèch sa a te demontre ke HIF-1 aktivasyon imite eta fizyolojik nan selil kiltive ak ipoperfusion.

MO KLEipopèfizyon, ipoksi, faktè ipoksi-induzibl, gradyan oksijèn, pH

Cistanche herbaanpeche maladi ren, klike la a pou jwenn echantiyon an

1|ENTWODIKSYON

Ensidans la nan kwonikrenmaladi(CKD) ap ogmante atravè mond lan kòm sosyete a laj (Tonelli & Riella, 2014). Pwogresyon CKD a irevokabl yon fwa domaj ren rive nan yon sèten degre epi finalman lakòz maladi ren nan etap final (ESRD), kèlkeswa maladi ki kache a. Rezilta sa a endike egzistans yon "chemen final komen." Dapre analiz patolojik sot pase yo, n bès nan fonksyon ren yo gen plis rapò ak domaj tubulointerstitis pase ak domaj glomerulèr. Te gen plizyè rapò ki demontre ke fibwoz ren pwovoke ipoksi kwonik nan tubulointerstitium la, ak ipoksi tubulointerstitial sa a agrave CKD ak mennen nan ESRD. Prèv sa a endike ke ipoksi tubulointerstitial jwe yon pati nan chemen final komen nan CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Larense trè sansib a ipoksi paske nan gwo demann li pou oksijèn, ak egzistans lan nan yon shunt oksijèn ant atè intrarenal yo ak venn (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Se poutèt sa, nou konsidere ke li esansyèl pou mennen ankèt sou ipoksi ak repons a ipoksi nan tubulointerstitium nan ren.

Repons byolojik prensipal la nan ipoksi nan òganis vivan yo rive atravè chemen faktè ipoksi-induzibl (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF konsiste de - ak - sou-inite. Malgre ke -subunit la konstititifman aktif, -subunit la degrade nan prezans oksijèn. Nan kondisyon normoxic, HIF- hydroxylated pa domèn nan prolyl hydroxylase (Ph.D.), ki fè li rekonèt pa von Hippel-Lindau timè suppressor (VHL). Rekonesans sa a rezilta nan ubiquitination ak degradasyon nan HIF-hydroxylated nan proteasome la. Anba kondisyon ipoksik, HIF- akimile nan sitosol la, paske HIF ki pa hydroxylated- chape anba degradasyon. Akimile HIF- transloke soti nan sitosol la nan nwayo a, kote li dimerize ak HIF-, epi li aji kòm yon faktè transcriptional, ankouraje ekspresyon jèn en. Nan twa izofòm ki idantifye HIF-sousinite yo—HIF-1, HIF-2, ak HIF{-3 —selil epitelyal tubulaires ren yo konnen yo eksprime HIF-1 (Tanaka et al. ., 2016). Etid anvan yo te montre akimilasyon pasajè oswa rejyonal nan HIF nan larenak CKD (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), ak HIF sa a aktive nan tansyon an oksijèn redwi nan milye a CKD. Maladapsyon nan ipoksi nan CKD ta ka koze pa prezans nan faktè ki siprime chemen HIF (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Efè pwoteksyon nan aktivasyon HIF yo te rapòte nan plizyè modèl bèt, ki gen ladan streptozotocin-induit rat dyabetik ak 5/6th nephrectomy rat (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). Ph.D. inibitè dènyèman te atire atansyon kòm nouvo apwòch terapetik nan anemi ren nan pasyan ki gen CKD (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al., 2011). ., 2016; Provenzano et al., 2016). Sepandan, detay yo sou pwogresyon nan ipoksi ren yo, ak fason ki akimilasyon HIF rive nanrenak CKD, rete fènwa. Hydroxylation HIF-depandan oksijèn rive nan sitosol la, e se poutèt sa li enpòtan pou mezire tansyon oksijèn intraselilè ak ekstraselilè. Gen plizyè metòd yo itilize pou mezire tansyon oksijèn, tankou itilizasyon mikwo-elektwòd oswa D 'sonans mayetik ki depann de nivo oksijèn nan san (BOLD-MRI). Nou te itilize mikwoskospi fosforesans pou tout lavi (PLIM) pou mezi quantitative estati oksijèn entraselilè (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 se yon koloran fosforesan ki baze sou BTP konplèks iridyòm (III), (bp)2Ir(acc) (bp=benzoat-piridin, aac=asetilasetòn) ak yon gwoup dimethylamino kationik, ki se pasif. distribye nan lizozòm intraselilè. Li te sentèz kòm yon fosfo-resan sond pou mezire presyon oksijèn intraselilè (Yoshihara et al., 2015). PLIM ak BTPDM1 pèmèt akizisyon de imaj-wo rezolisyon nan presyon an pasyèl nan oksijèn nan selil tubulaires ren sou sifas ren nan sourit nòmal, bay done ki endike prezans nan yon gradyan oksijèn, menm nan ren nòmal (Hirakawa et al., 2018). ).

Gen gradyan oksijèn nan ògàn vivan, ki gen ladanren, menm nan kondisyon nòmal (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), ak gradyan sa yo ka Se poutèt sa tou espere nan CKD. Ipopèfizyon ki te koze pa rarefaction nan microvasculature nan CKD, nan ki blesi glomerular pwogresif rezilta nan yon diminisyon nan sikilasyon san kapilè peritubular, agrave fibwoz entèrstisyèl. Fibwoz entèrstisyal afekte difizyon ak rezèv oksijèn nan selil yo tubulaires, epi li mennen nan rarifikasyon nan mikwovaskulasyon an, plis agrave ipoksi tubulointerstitial (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Efè byolojik ipopèfizyon, sepandan, rete fènwa, paske pifò etid yo te mennen ankèt sou efè ipoksi ak HIF-1 sou selil kiltive yo nan kondisyon perfusion omojèn ak tansyon oksijèn (Rexius-Hall et al., 2017). Etid anvan yo te demontre ke selil kiltive monokouch ki kouvri ak yon kouvèti bay yon bon modèl ipoperfusion pwovoke pa yon baryè nan difizyon nan mwayen kilti a. Ipoperfusion modle a asosye ak yon gradyan oksijèn paske yon kouvèti anpeche difizyon oksijèn soti nan tèt mwayen an nan selil yo (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). Nan yon monokouch nan selil kiltive ki kouvri ak yon kouvèti, tansyon oksijèn intraselilè desann ak distans soti nan kwen an nan kouvèti a akòz difizyon oksijèn limite nan selil kiltive yo. Kòm yon rezilta, yon gradyan oksijèn fòme soti nan kwen an nan sant la nan kouvèti a, ak tansyon an oksijèn entraselilè ka tonbe nan yon seri anoksik nan sant la nan kouvèti a (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . Nan etid aktyèl la, nou konsantre sou aktivasyon HIF ak envestige si gen yon chanjman oksijèn endepandan nan ekspresyon HIF- nan prezans ipoperfusion ak yon gradyan oksijèn. Depi ipoperfusion ak yon gradyan oksijèn egziste nan tubul ren in vivo, obsèvasyon efè endepandan oksijèn sou ekspresyon HIF- nan modèl la kouvèti ka bay apèsi sou mekanis ki kache nan ensifizans HIF- akimilasyon nan CKD.

extrait cistanchepou ren

2|MATERYÈL AK METÒD

2.1|Kilti selilè

Selil kiltive yo te enkube nan yon enkibatè imidite ak 5 pousan CO2. Yo te fè enkubasyon ipoksik nan yon enkibatè pèsonèl CO2/multi-gaz APM-30D (Astec). Yo te pwovoke anoksi ak yon sak anoksi, AnaeroPack, ak ansanm kiltivasyon anaerobik #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

Selil HK-2 (Homo sapiens, mounren, gason, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), yon liy selil epitelyal tubul proximal imòtalize ki soti nan ren moun nòmal adilt, yo te kiltive nan melanj mwayen/nitritif Dulbecco modifye Eagle F{{2} } Kam (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) ki gen 10 pousan serom fetal bovine (FBS) (F7524, Sigma Aldrich), ak solisyon penisilin-streptomycin (15070063, Thermo Fisher Scientific) nan yon plat kilti 10 cm. Pou pasaj, selil HK-2 yo te disosye ak trypsin (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ak santrifuje nan 300 g pou 5 min.

Selil kansè nan matris HeLa ak anbriyon imenrenselil 293 (HEK293) yo te kiltive nan DMEM ak ba (1000 mg / L) glikoz (D6046, Sigma Aldrich) ki gen 5 pousan FBS nan yon plat kilti 10 cm. Selil sa yo te pase kòm selil HK-2.

Selil epitelyal tubul proximal ren yo (RPTECs) (CC - 2553, Cambrex) yo te konsève lè l sèvi avèk twous RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Pou pasaj, RPTEC yo te dissociated lè l sèvi avèk trypsin, netralize ak Trypsin Neutralizing Solution (CC -5002, Lonza Ltd.), ak santrifuje nan 200 g pou 5 min.

2.2|Etablisman yon modèl hypoperfusion pa yon plasman lam kouvèti

Kouvèti ki gen fòm wonn ki gen 15 mm dyamèt (C015001, Matsunami) yo te netwaye lè l sèvi avèk ultrason epi estoke nan etanòl 99.5 pousan anvan yo itilize. Yo te itilize de metòd, ki baze sou obsèvasyon selil deyò kouvèti kouvèti a.

Selil kiltive monokouch yo te mete sandwitch ant yon kouvèti ak anba a nan yon plat (Figi S1a, b), oswa yon metòd altènatif (Figi S1c), jan sa dekri anba a. Swa metòd tradisyonèl la oswa metòd altènatif te chwazi pou etabli modèl kouvèti nou an pou imaj vivan, si D 'oksijèn oswa D' PH. Pou iminositochimi (ICC), yo te chwazi metòd altènatif la, paske lè w ap itilize metòd tradisyonèl la, majorite selil yo souvan detache anba plat la pandan retire kouvèti a pou fikse selil (Figi S2a).

2.2.1|Metòd tradisyonèl

Nan Jou 1, selil yo te mete sou anba a nan yon plat ki baze sou vè 27 mm (3910-035, Iwaki) nan yon konfluyans nan 100 pousan * (apeprè 5.0 × 105 / plat). Yo te kiltive nan DMEM/F12 ki gen 10 pousan FBS san solisyon antibyotik lannwit lan. Nan Jou 2, yo te mete yon kouvèti sou selil kiltive yo pou peryòd ki endike a (Figi S1b).

2.2.2|Metòd altènatif

Selil yo te simen sou yon kouvèti nan yon plat kilti 35 mm nan 100 pousan konfluans (apeprè 5.0 × 105/plat) nan Jou.

1. Yo te kiltive nan DMEM/F12 ki gen 10 pousan FBS san solisyon antibyotik lannwit lan. Nan jou 2, kouvèti-glise a te ranvèse, tache sifas selil li yo nan pati anba a nan yon nouvo plat ki baze sou vè 27 mm pou yon peryòd espesifye (Figi S1c).

Nou menm tou nou te kreye yon modèl coverslip lè l sèvi avèk coverslips ki gen fòm wonn ak yon dyamèt 10 mm (CS01005, Matsunami) (Figi S2b).

2.3|D 'oksijèn vivan ak BTPDM1

Selil kiltive yo te prepare nan Jou 1, jan sa dekri pi wo a. Nan jou 2, selil yo te rense de fwa ak solisyon Hanks' Balanced Salt (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) epi yo te enkube ak 500 nM BTPDM1, yon lank lipofil kationik ki baze sou iridyòm yo itilize kòm yon pwofonde fosforesan entraselilè (Yoshihara et al., 2015), nan DMEM/F12 san wouj fenol (21041-025, Thermo Fisher Scientific) pou 30 min. Apre selil yo te lave de fwa ak HBSS, yo te sandwich ant yon kouvèti ak anba a nan yon plat, jan sa dekri pi wo a. Yo te obsève entansite fosforesans nan BTPDM1 nan selil kiltive ki kouvri ak yon kouvèti ak yon filtè eksitasyon ak emisyon, epi yo te detekte fosforesans BTPDM1 (Hirakawa et al., 2015) lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan, BZ-X710 (Keyence Corporation). Imaj yo jwenn nan mikwoskòp fliyoresan envèse yo te ajiste pou klète ak kontras lè l sèvi avèk lojisyèl analiz BZ-X la.

2.4|Iminositochimi

Selil ki sou yon kouvèti yo te kiltive ak 200 µM pimonidazole HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) nan DMEM/F12 san fenol wouj pou 1 èdtan, apre sa yo te vire kouvèti a epi yo tache nan yon plat vè kouvèti, kòm dekri deja. Lè sa a, selil yo te kiltive nan DMEM / F12 san fenol wouj pou yon peryòd espesifye. Lè pimonidazòl counterstaining pa te itilize, pretreatment ak pimonidazole te omisyon.

Apre yo te fini peryòd kilti a, yo te kolekte chak kouvèti, epi selil yo te imedyatman fikse ak metanol / asetòn (1:1) sou glas, kote yo te rete pou 30 min. Apre lave de fwa ak Dulbecco a fosfat-tanpon saline (PBS) (D5652, Sigma Aldrich), manbràn selilè a te pèmeabilize pou 30 minit, enkube ak 5 pousan albumin serik bovin (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) pou 30 minit, epi apre sa. ak blòk pwoteyin san serom (X0909, DAKO) pou 10 min. Selil yo te tache ak yon premye antikò epi answit ak yon dezyèm, antikò fliyoresan. Lis premye antikò yo bay nan Tablo S1. FITC-kochon poliklonal anti-lapen imunoglobulin (F0205, 1:20 dilution, DAKO) te itilize kòm premye antikò si lame a te yon lapen. Antikò fliyoresan Alexa Fluor 594 streptavidin (S11227, 1:500 dilution, Thermo Fisher Scientific) te itilize kòm premye antikò si lame a te yon sourit, ki te swiv pa biotinylate anti-sourit IgG (H plis L) (BA{{23} }, 1:1000 dilution, Vector Laboratories), kòm dezyèm antikò. Yo te fè tach nikleyè lè l sèvi avèk bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (B2261, Sigma Aldrich) pou chak echantiyon.

Siyal fliyoresan yo te obsève lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan Envèse, BZ-X710 (Keyence Corporation) ak filtè sa yo: Texas Wouj ak yon longèdonn eksitasyon (eg) nan 560/40 nm, longèdonn emisyon (Em) nan 630/75 nm, GFP ( Egz: 470/40 nm, Em: 525/50 nm), ak DAPI (Egz: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Imaj yo te ajiste pou klète ak kontras lè l sèvi avèk lojisyèl analiz BZ-X.

2.5|ICC nan HIF nan selil HK-2 trete ak klori cobalt

Metòd altènatif la te modifye pou pwodui yon modèl lam kouvèti selil HK-2 trete ak klori cobalt. Selil HK-2 yo te simen nan dansite mwatye konfluyan (2.5 × 105/plat) sou yon kouvèti nan Jou 1 ak trete ak 300 µM klori cobalt hexahydrate (C 8661, Sigma Aldrich) pou 16 èdtan sou. Jou 2. Nan jou 3, kouvèti a te ranvèse pou tache sifas selil yo nan pati anba a nan yon nouvo plat vè 27 mm pou 3 èdtan, epi yo te fè ICC nan HIF.

2.6|Western blotting

Pou envestige akimilasyon HIF{{0}} anba diferan tansyon oksijèn ak nan diferan nivo pH, 1.0 × 1{06 selil HK-2 pou chak plat kilti 10 cm. yo te enkube anba swa normoxia, 2 pousan oksijèn, 1 pousan oksijèn, oswa anoksi, pou 5 èdtan, oswa nan DMEM/F12 nan pH 7.4, pH 6.0, oswa pH 5.0 pou 5 èdtan.

Selil sa yo te lysed nan tanpon RIPA ki gen 50 mM Tris-tanpon (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 w/v pousan sodyòm deoxycholate, 0.1 w/v pousan SDS, ak 1.0 w/v pousan NP40.

Pou Western blotting, SDS echantiyon tanpon ki gen {{{0}}.35 M Tris-HCl (pH 6.8), 10 pousan SDS, 36 pousan gliserin, 0.012 pousan bromofenol ble, ak 0.1 M dithiothreitol. (DTT) te ajoute nan pwoteyin yo. Pwoteyin ki gen tanpon echantiyon SDS yo te eliye pa bouyi nan 95 degre pou 5 min.

Pwoteyin yo te separe pa elektwoforèz sou 10 pousan jèl poliakrilamid SDS. Lè sa a, pwoteyin yo te transfere sou yon manbràn PVDF AmershamTM HybondTM (10600023, GE Healthcare) nan tanpon transfè (48 mM Tris-baz tanpon, 39 mM glisin, 0.04 pousan SDS, ak 20 v/v pousan metanol) lè l sèvi avèk yon Trans-Blot®. TurboTM Transfè Sistèm (Bio-Rad). Manbràn yo te enkube nan tanperati chanm ak antikò prensipal, anti-HIF1 anti-kò (NB100-134, 1:500 dilution, Novus Biologicals, RRID: AB{_350071), ak anti-aktin antikò (A2066). , 1:2000 dilution, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), epi answit nan antikò segondè a, polyclonal kabrit anti-lapen imunoglobulin/HRP (P0448, 1:10000 dilution, DAKO, RRID: AB{26). }}). PierceTM ECL Plus Western Blotting Substrate (32132, ThermoFisher Scientific) te itilize pou deteksyon. Yo te obsève chemiluminescence lè l sèvi avèk yon analizeur Luminoimage ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Yo te konfime reproductibilite pa fè omwen twa eksperyans endepandan. Entansite gwoup yo te mezire lè l sèvi avèk Enstiti Nasyonal Sante ImageJ lojisyèl (Schneider et al., 2012).

2.7|Lisiferase repòtè tès

Yo te fè yon tès repòtè luciferase pou mezire akimilasyon HIF1 nan enkubasyon kilti ipoksik omojèn. Nou te deja konstwi yon jèn luciferase tagged kondwi pa yon eleman ipoksi-reponn (HRE) epi devlope Hypoxia-Responsive Reporter Vector (Konstriksyon Transgene). Sa a te konstwi apati kopi tandem HRE ki soti nan jèn faktè kwasans endothelial vaskilè rat la ki te sub-klone nan rejyon 5' nan inite transcription am CMV-promoter-luciferase (pre-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al., 2011). al., 2004).

Selil HK{{0}} nan yon konsantrasyon 1.0 × 105 pou chak pi yo te prepare nan 12-plak kilti byen (150628, Thermo Fisher Scientific). Selil yo te ko-transfekte ak 500 ng vektè pGL3-Basic HRE-luciferase ak 30 ng pRL-SV40 Renilla vektè kontwòl luciferase (Promega), lè l sèvi avèk 2 µl FuGENE® HD Transfection Reagent (E2311, Promega) pou chak. byen. Selil HK-2 ko-transfekte ak 500 ng ofpGL3-vektè debaz koukouy lisiferaz ak 30 ng ofpRL-SV40 vektè kontwòl lisiferaz Renilla (Promega) yo te itilize kòm yon kontwòl negatif.

Selil transfekte yo te enkube anba normoxia, 2 pousan ipoksi, 1 pousan ipoksi, oswa yon sak anoksi, pou 5 èdtan. Lè sa a, selil yo te rekòlte lè l sèvi avèk 100 µl nan tanpon liz pwoteyin pasif, pou tès la doub luciferase. Yo te itilize yon luminomèt LB9507 (EG ak Berthold) pou mezi yo. Pou korije efikasite transfèksyon, valè relatif nan inite limyè luciferase koukouy la te divize pa sa nan luciferase Renilla.

cistanche pou ed

2.8|Analiz de apoptoz

Selil kiltive yo te kouvri ak yon kouvèti pou 0 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, ak 24 h, epi apre sa yo kolekte lè l sèvi avèk tripsin. Selil trete ak 3 pousan oksijene idwojèn (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pou 30 minit yo te prepare kòm yon kontwòl apoptotik. Yo te fè analiz quantitative apoptoz lè l sèvi avèk Muse Annexin V ak Twous Selil Mouri (MCH100105, Millipore) nan yon Analyzer selil Muse™ (Millipore), dapre enstriksyon manifakti a.

2.9|Quantitative PCR an tan reyèl (qRT-PCR)

Yo te fè ekstraksyon total RNA ak sentèz cDNA dapre enstriksyon manifakti a pou RNAiso Plus (9109, Takara) ak PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara) respektivman. Yo te fè PCR an tan reyèl lè l sèvi avèk THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) nan CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Nivo transkripsyon yo te nòmalize nan nivo ekspresyon mRNA -actin. qRT-PCR te fèt an triple lè l sèvi avèk premye jèn espesifik. HIF-1 te anplifye lè l sèvi avèk pi devan, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ ak ranvèse, 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′ primè. -aktin te anplifye lè l sèvi avèk pi devan, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′, ak ranvèse 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′ primè.

2.10|Transfèksyon ak siRNA

Pou envestige RNAi-induit HIF-1 knockdown nan selil HK-2, 5.0 × 104 HK-2 selil pou chak pui yo te prepare nan plak sis-puit. De kalite RNAi—HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] ak siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) — yo te itilize ak Lipofectamine RNAiMAX. Reyaktif transfèksyon (Thermo Fisher Scientific). Kòm yon kontwòl negatif, yo te itilize Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); Yo te melanje 1.5 µl chak siRNA ak 5 µl RNAiMAX. Selil transfekte siRNA yo te enkube nan kondisyon normoxic oswa ipoksik (1 pousan O2) pou 48 èdtan epi yo te ekstrè RNA. Yo te egzamine efikasite knockdown-HIF-1 lè l sèvi avèk qRT-PCR.

2.11|Live D 'nan efè yon gradyan PH

Nou vizyalize gradyan pH intraselilè selil k ap viv anba yon kouvèti. Selil yo te trete ak pHrodo Green AM Endikatè pH Entraselilè (p35373, ThermoFisher Scientific) daprè enstriksyon manifakti a, anvan yo aplike modèl lam kouvèti a. Yo te itilize yon mikwoskòp fluoresans inverse, BZ-X710 (Keyence Corporation) ak yon filtè GFP pou obsève tranzisyon tan an nan gradyan entansite fluoresans la anba yon kouvèti.

2.12|Kantite analiz de bag la HIF

2.12.1|Sit bag HIF la

Nou mezire distans bag HIF yo ak zòn pimonidazol pozitif nan kwen kouvèti kouvèti yo lè l sèvi avèk ImageJ, jan sa a. Yo te detèmine zòn sèk ekstèn ak enteryè bag HIF ak sèk pozitif pimonidazol, epi yo kalkile reyon chak sèk. Chak valè yo te soustraksyon nan 7.5 mm, ki se reyon an nan yon kouvèti 15 mm, pou kalkile distans li soti nan kwen yon kouvèti. Twa eksperyans endepandan nan ICC nan HIF nan chak kondisyon yo te fèt.

2.12.2|Definisyon bag HIF

Nou te itilize imaj fliyoresan yo te jwenn nan yon modèl lam kouvri anba normoxia ak pH net. Nou te defini sit bag HIF la ak deyò ak andedan li yo kòm echèl 2.5–3.0 (0.22–0.45 mm), 0.5 –1.0 echèl (1.12– 1.35 mm), ak 5.0–5.5 echèl (2.24–2.47 mm) nan kwen yon kouvèti, respektivman, lè l sèvi avèk ImageJ. Nou mezire senk sit siyal HIF-1 pou chak echantiyon epi nou kalkile mwayèn. Twa eksperyans endepandan nan ICC nan HIF yo te fèt.

cistanche ekstrè poud

2.13|Mezi presyon oksijèn pa imaj PLIM

2.13.1|Konstriksyon yon liy kalibrasyon pou mezire presyon oksijèn

Yo te fè yon koub kalibrasyon selil HK-2, ki baze sou metòd ki dekri nan rapò anvan nou an (Yoshihara et al., 2015). Selil HK-2 ki chaje ak 500 nM BTPDM1 pou 30 minit yo te kiltive nan yon enkibatè oksijèn-konsantrasyon-chanjan plizyè gaz ekipe ak yon mikwoskòp fliyoresan Envèse ki te konekte ak sistèm mezi pou tout lavi a. Yo te konstwi yon liy kalibrasyon ki baze sou analiz Stern-Volmer lè l sèvi avèk tout lavi fosforesans (PL) selil HK-2 anba plizyè tansyon oksijèn diferan lè l sèvi avèk

Ekwasyon (1)

kote τp reprezante PL nan pO2, τ0 reprezante PL nan deoxygenation, kq reprezante konstan vitès trempe, epi pO2 reprezante presyon pasyèl oksijèn. Sèvi ak liy kalibrasyon sa a, presyon oksijèn an ka kalkile nan PL la.

2.13.2|Imaj PLIM yon modèl lam kouvèti

Selil HK-2 chaje ak 500 nM BTPDM1 pou 30 min yo te prepare. Yo te konstwi yon modèl kouvèti ak kiltive nan yon enkibatè milti-gaz konsantrasyon-chanjan O2 ekipe ak yon mikwoskòp fliyoresan Envèse, ki konekte ak sistèm mezi pou tout lavi a.

Yo te anrejistre imaj mikwoskòp fosforesans pou tout lavi (PLIM) lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan Envèse ekipe ak yon sistèm optik konfokal (Hirakawa et al., 2018). Imaj PLIM yo te jwenn apre 30 min enkubasyon nan 21 pousan O2 oswa 4 pousan O2. Yo te pran kat imaj PLIM pou chak echantiyon, ki soti nan rejyon anwo, anba, gòch ak dwa toupre kwen kouvèti kouvèti a, pou detèmine PL an mwayèn, pran an kont varyasyon nan PL nan yon kouvèti.

2.13.3|Idantifikasyon bag HIF nan yon imaj PLIM

Pimonidazol te pozitif anba a 10 mmHg nan presyon oksijèn. Ekivalan PL a 10 mmHg nan presyon oksijèn te 4034.6 ns, dapre liy kalibrasyon an, kidonk liy ekstèn nan sèk la pimonidazol nan imaj la PLIM ta ka idantifye. Answit, yo ka jwenn sit bag HIF ekstèn ak enteryè nan imaj PLIM la lè w itilize analiz quantitative distans. Nou mezire seri PL mwayèn ki ekivalan a bag HIF nan 21 pousan O2 ak 4 pousan O2.

2.13.4|Mezi presyon oksijèn bag HIF la

Nou kalkile seri presyon oksijèn bag HIF ki soti nan PL yo, lè l sèvi avèk liy kalibrasyon an. Imaj PLIM yo te analize lè l sèvi avèk SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|Analiz estatistik

Yo te itilize tès Dunnett pou konpare gwoup eksperimantal ak kontwòl, ak valè <.05 yo="" te="" konsidere="" pou="" endike="" diferans="" estatistik="" enpòtan.="" yo="" te="" itilize="" tès="" t="" elèv="" yo="" pou="" konpare="" twa="" oswa="" plis="" gwoup,="" epi="" yo="" te="" aplike="" valè="" p="" ajiste="" bonferroni.="" tout="" analiz="" estatistik="" yo="" te="" fèt="" lè="" l="" sèvi="" avèk="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" valè="" yo="" te="" sipoze="" sòti="" nan="" yon="" popilasyon="" nòmalman="" distribye,="" epi="" yo="" montre="" kòm="" mwayen="" ±="" devyasyon="" estanda="">

ki sa ki yon cistanche

3|REZILTA

3.1|Fòmasyon gradyan oksijèn nan modèl hypoperfusion

Nou konfime egzistans la nan yon gradyan oksijèn nan modèl la hypoperfusion pwovoke pa plasman kouvèti pa dirèkteman evalye tansyon oksijèn, lè l sèvi avèk fosforesans. Mezi entansite fosforesans ka predi yon tandans apwoksimatif nan presyon oksijèn (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Nou te obsève entansite fosforesans nan yon modèl kouvèti nan selil HK-2 trete ak BTPDM1. Imaj entansite fosforesans la te montre ipoksi nan pi fò nan zòn ki andedan kouvèti a, men pa gen ipoksi toupre kwen an, yon obsèvasyon ki sijere egzistans yon gradyan oksijèn alantou kwen an nan kouvèti a nan selil HK-2 ki kouvri ak yon kouvèti (Figi 1a). Piske entansite fosforesans depann sou konsantrasyon ankèt la, ak tan eksitasyon an, yon mezi fosforesans pou tout lavi (PL) itil pou analiz quantitative presyon oksijèn (Yoshihara et al., 2015). Kidonk, pou mezi quantitative tansyon oksijèn selil kiltive yo ozalantou kwen yon kouvèti, nou jwenn imaj PLIM nan selil HK-2 ki kouvri ak yon kouvèti pou 30 minit (Figi 1b). PL pwolonje kòm distans ki soti nan kwen an kouvri an ogmante. Nou konfime ke tansyon an oksijèn, kalkile lè l sèvi avèk yon liy kalibrasyon (Figi S3), diminye kòm distans ki soti nan kwen an kouvèti a ogmante, bay prèv pou egzistans la nan yon gradyan oksijèn alantou kwen an nan kouvèti a (Figi 1c). Egzamen pwofil tanporèl entansite fosforesans la te endike ke gradyan oksijèn an te kòmanse fòme 10 minit apre plasman kouvèti kouvèti a.

(Figi 1d).

3.2|Distribisyon inik HIF-1 nan modèl ipoperfizyon an, "bag HIF"

Nou te egzamine distribisyon HIF-1 nan modèl ipopèfizyon ak yon gradyan oksijèn. ICC HIF-1 nan selil HK-2 yo te montre yon amelyorasyon ki gen fòm beye sou kwen pimonidazole-pozitif zòn nan, ke nou te rele "bag HIF" (Figi 2a). Entansite siyal HIF-1 la te siyifikativman pi wo sou bag HIF la pase nan zòn anndan oswa deyò li yo (Figi 2b). Fenomèn sa a te konfime lè l sèvi avèk ICC ak yon lòt antikò HIF-1 (Figi S4a) oswa lòt liy selil tubulaires (Figi S4b, c). Nou te fè tou analiz ICC HIF-1 nan lòt kalite selil kiltive, tankou selil kansè nan matris HeLa. Malgre ke adezyon an fèb nan selil sa yo nan yon kouvèti te fè yon evalyasyon detaye distribisyon HIF-1 difisil, nou obsève yon amelyorasyon ki gen fòm beye nan HIF-1 nan selil HeLa (Figi S4d).

Bag HIF la ak zòn pimonidazol pozitif te kòmanse fòme plizyè èdtan apre plasman kouvèti kouvèti a, ak bag HIF la parèt estatik pa 3 h (Figi 2c). Knockdown HIF-1 te lakòz disparisyon siyal HIF-1, ki gen ladan bag HIF (Figi 2d, Figi S4e), ki endike bag HIF la te depann de HIF-1 .

Pou mennen ankèt sou posiblite pou fòmasyon bag HIF depann sou oksijèn, nou te envestige distribisyon HIF-1 nan modèl kouvèti kouvèti a anba enkubasyon ak diferan tansyon oksijèn. Nou mete yon plat nan chanm ipoksik ak diferan tansyon oksijèn imedyatman apre yo fin fè yon modèl kouvèti. Pandan enkubasyon ipoksik, nou te obsève ke tou de bag la HIF ak zòn nan pimonidazole-pozitif parèt yo elaji deyò (Figi 3a). Nou mezire distans chak bag HIF ak zòn pimonidazòl-pozitif soti nan yon kwen kouvri anba normoxia, 4 pousan O2, ak 1 pousan O2 enkubasyon. Tou de bag la HIF ak zòn nan pimonidazole-pozitif elaji deyò kòm tansyon an oksijèn ki antoure diminye (Figi 3b). Rezilta sa yo te endike bag HIF a te depann de HIF-1 ak tansyon oksijèn.

Yo nan lòd yo konfime ke akimilasyon beye ki gen fòm se yon fenomèn espesifik nan HIF, nou fè ICC ak jèn antretyen nan modèl la kouvèti. GAPDH ak siyal aktin yo te kenbe sou tout zòn nan yon kouvèti epi yo te konparab ant rejyon an nan bag la HIF ak lòt rejyon yo (Figi S5a, b).

3.3|Mezi nan seri a nan presyon oksijèn nan bag la HIF

Nou konfime amelyorasyon ki gen fòm bag nan akimilasyon HIF-1 nan selil kiltive ki kouvri ak yon kouvèti, yon fenomèn ki depann de tansyon oksijèn. Pou detèmine seri tansyon oksijèn ki enplike, nou analize presyon oksijèn bag HIF a lè l sèvi avèk yon teknik fosforesans pou tout lavi. Nou jwenn imaj PLIM nan modèl lam kouvèti a apre 30 min enkubasyon nan 21 pousan O2 oswa 4 pousan O2 (Figi 4a). Bag HIF la te fòme sou kwen sèk pimonidazol nan ICC HIF (Figi 3b). Nou te idantifye sit la nan imaj la PLIM ki te ekivalan a zòn nan pimonidazole-pozitif nan ICC la nan HIF epi imedyatman idantifye sit ki koresponn ak bag la HIF (Figi 4b), lè l sèvi avèk analiz quantitative nan done yo distans ki soti nan bag la HIF ak la. zòn pimonidazol-pozitif (Figi 3b). Nou menm tou nou mezire seri PL bag HIF a epi nou itilize yon liy kalibrasyon (Figi S3) pou kalkile presyon oksijèn bag HIF nan 21 pousan O2 (4.20 [3.46-4.97] ~ 35.9 [28.5-44.9] mmHg) , ak 4 pousan O2 (2.19 [0.21-4.32] ~ 20.4 [17.1-24.1] mmHg) (Figi 4c).

3.4|HIF-1 akimilasyon anba tansyon oksijèn omojèn

Pandan ke siyal fèb nan HIF-1 deyò bag la HIF nan yon modèl kouvèti ka atribiye a ensifizan ipoksi, sa ki andedan bag la, kote HIF-1 ta dwe aktive pi fò pa tansyon oksijèn ki pi ba a, yo dwe. dwe kontwole pa yon fenomèn oksijèn endepandan. Pou egzamine fenomèn ki lakòz mank de akimilasyon maksimòm HIF-1 nan zòn anoksik ki fèt sèlman nan modèl hypoperfusion, nou te egzamine si te gen yon relasyon envès ant tansyon oksijèn ak akimilasyon HIF-1 anba enkubasyon. ak tansyon oksijèn omojèn. Analiz Western blot nan lysate selil yo anba diferan tansyon oksijèn omojèn te montre yon ogmantasyon nan HIF -1 akimilasyon pandan enkubasyon anoksik (Figi 5a). Egzamen repòtè HRE-luciferase te endike tou ke akimilasyon HIF -1 te ogmante ak pi ba tansyon oksijèn nan kondisyon tansyon oksijèn omojèn (Figi 5b). Rezilta sa yo endike ke akimilasyon HIF-1 te depann de tansyon oksijèn, ak akimilasyon maksimòm obsève nan seri anoksik la. Karakteristik HIF-1 ta dwe varye ant yon modèl hypoperfusion ak yon modèl ki gen tansyon oksijèn omojèn. Nou te espekile ke fenomèn inik akimilasyon HIF-1 nan modèl hypoperfusion sa a ta ka detèmine pa yon faktè ki pa tansyon oksijèn.

3.5|Fòmasyon bag HIF te endepandan de PhD

Nou te egzamine si degradasyon HIF-1, yon mekanis posib pou fòmasyon bag HIF, te regilasyon anndan bag HIF la. Lide sa a te sanble yo pa valab, paske hydroxylation pa Ph.D., yon pwosesis limitasyon pousantaj nan degradasyon HIF, mande pou oksijèn kòm yon substra. Klori Cobalt lajman itilize kòm yon estabilize chimik HIF. Nou te konstwi yon modèl lamèl HK-2 ki te trete ak klori cobalt epi nou te fè analiz ICC HIF. Siyal HIF-1 la pa t ogmante andedan bag HIF la, ki te vin klè akoz siyal HIF-1 ki te ogmante deyò bag la (Figi 6c). ICC nan selil HK-2 ak knockdown nan PHD2, ki kwè yo dwe prensipal HIF prolyl hydroxylase nan eksperyans kilti selil (Strowitzki et al., 2019), pwodui rezilta menm jan an (Figi S6). Rezilta sa yo endike ke aks PHD-VHL degradasyon HIF pa t gen rapò ak fòmasyon bag HIF.

3.6|Enpak pH sou akimilasyon HIF-1

Yon rapò anvan te dekri itilizasyon yon modèl myosit kadyak kouvèti ki te gen yon gout nan pH andedan lam kouvèti a (Pitts & Toombs, 2004). Nou te envestige pH la anba yon kouvèti ak enpak li sou fòmasyon bag HIF. Nou trete selil HK-2 ak yon endikatè pH entraselilè, entansite fliyoresans ki pèmèt evalyasyon pH nan selil yo. D 'vivan te montre ke pH la diminye sou pi fò nan zòn anndan an, men se pa tou pre kwen an nan kouvèti a, sijere egzistans lan nan yon gradyan pH alantou kwen an nan modèl la kouvèti (Figi 6a). Kantite analiz de korelasyon ki genyen ant entansite fliyoresans ak distans ki soti nan yon kwen kouvèti te montre ke ansyen an te elve kòm distans la ogmante, yon obsèvasyon ki sipòte egzistans la nan pH ak gradyan oksijèn alantou kwen an kouvri (Figi 6b). Analiz Western blot nan lisat selil yo anba konsantrasyon oksijèn omojèn yo te jwenn ke enkubasyon ak pH 5.0 medyòm siprime HIF -1 akimilasyon nan kondisyon ipoksik (Figi S7a–d). Nou konfime tou ke HIF-1 akimilasyon anba ipoksi nan diferan kondisyon pH diminye anba pH 6.0 (Figi S8a–c).

Yon rapò te mete aksan sou enpòtans kondisyon ki pa twò asid, nan pH anviwon 6.0. Dapre etid sa a, reoxygenation apre ipoksi asidifye medya yo, ki te lakòz sekstrasyon nukleolè nan VHL. Nan vire, degradasyon HIF yo te anpeche nan myotubes C2C12, newòn PC12, ak selil kansè nan ren 786-0 (Mekhail et al., 2004). Nan etid nou an, pa te gen okenn chanjman nan distribisyon VHL nan selil tubulaires ant rejyon yo ak akimilasyon HIF-1 ak sa yo kote li te siprime, nan yon modèl kouvèti ak valè pH soti nan 5.0 a 7.4. (Figi S9a–c). Selil Echafodaj yo ekspoze a yon pakèt kondisyon pH (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), kidonk nou te envestige varyasyon bag HIF la nan medya ki gen diferan pH. valè ant 5.0 ak 8.5. Bag HIF la te obsève klèman nan medya ak pH 8.5 ak 7.4 (Figi 6c). Bag HIF la te egziste tou nan pH 6.5 men li te kache (Figi 6c). Siyal HIF-1 te atténué nan tout zòn nan yon lam kouvèti a pH 5.0. (Figi 6c). Nou te fè plis analiz quantitative nan relasyon pozisyon ki genyen ant bag HIF la ak kwen nan zòn nan pimonidazole-pozitif (Figi 7a) epi dekouvri ke pozisyon nan bag la varye depann sou pH la. Sèk enteryè a te gen tandans elaji deyò nan pH 6.5, konpare ak pH 7.4, pandan y ap sèk deyò a siyifikativman retresi anndan nan pH 8.5, ki baze sou kwen nan zòn nan pimonidazole-pozitif (Figi 7b, c). Nou te konfime tou ke aktivite yo nan jèn antretyen yo te kenbe nan yon modèl kouvri anba enkubasyon asid (Figi S10). Se poutèt sa, pH parèt yo jwe yon wòl enpòtan nan mekanis ki kache fòmasyon bag HIF.

4|DISKISYON

Nan etid sa a, nou te idantifye yon distribisyon inik nan HIF-1 nan selil tubulaires ren yo, lè l sèvi avèk yon modèl ipopèfizyon pwovoke pa plasman kouvèti kouvèti. Nou te jwenn ke fòmasyon an ak antretyen nan bag la HIF yo te reglemante pa presyon oksijèn ak pH, tou de nan yo ki te egziste nan yon gradyan nan kwen an coverslip nan yon modèl coverslip. Baze sou rezilta sa yo, nou pwopoze yon mekanis posib pou fòmasyon bag HIF, ki enplike HIF-1 akimile ak diminye tansyon oksijèn, ak akimilasyon an siprime akòz pH ki ba nan yon sèten distans soti nan kwen yon kouvèti kouvèti (Figi 8). ).

Ipopèfizyon pwovoke pa rarefaksyon nan mikwo-vaskulasyon nan CKD (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). Nan travay anvan nou an, nou te itilize imaj in vivo pou demontre prezans yon gradyan oksijèn nan selil tubulaires ren nan ren sourit nòmal (Hirakawa et al., 2018). Tansyon oksijèn tou espere yo dwe heterogeneous nan selil tubulaires nan CKD. Sepandan, li rete klè si egzistans ipoperfusion ak yon gradyan oksijèn afekte sistèm defans kont ipoksi, HIF. Nan etid sa a, nou te envestige distribisyon HIF nan kiltive selil tubul proximal anba yon modèl ipoperfusion epi dekouvri ke gradyan oksijèn nan kiltive selil tubulaires ren yo te avèk siksè modle lè l sèvi avèk yon kouvèti glas wonn. Prèv ki soti nan eksperyans lè l sèvi avèk tansyon oksijèn omojèn endike ke HIF-1, ki gen idroksidasyon ak degradasyon ki vin apre yo sitou depann de oksijèn, akimile. Sa se kantite HIF-1 ogmante pandan tansyon oksijèn an diminye. Nan modèl kouvèti nou an, sepandan, HIF-1 te siprime nan zòn anoksik la epi li te gen akimilasyon ki pi wo a nan yon sèten distans soti nan kwen yon kouvèti kouvèti. Sa a akimilasyon HIF ki gen fòm beye pa janm te montre anvan. Nou te montre ke mouvman bag HIF ta ka obsève kèlkeswa tansyon oksijèn atmosfè enkubasyon an, men kote li te depann de tansyon oksijèn an. Ranje tansyon oksijèn sou bag HIF a te mezire apeprè 4-20 mmHg lè l sèvi avèk PLIM ak BTPDM1. Pifò etid anvan yo, ki te konsantre sou selil kiltive nan yon atmosfè ki gen yon tansyon oksijèn omojèn, te jwenn ke kantite pwoteyin HIF-1 ogmante nan seri ipoksik oswa anoksik (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Kidonk, nan modèl nou an, fòmasyon bag HIF dwe afekte pa yon faktè ki pa tansyon oksijèn; li te endepandan de Ph.D., yon pwosesis ki limite pousantaj nan degradasyon HIF. Yon dekouvèt nan elisidasyon nan mekanis fòmasyon bag HIF se te dekouvèt nou an nan wòl nan gradyan pH la, osi byen ke gradyan oksijèn nan, nan modèl la kouvri-lèv, ki limite flo a nan medya yo menm jan ak yon ipoperfusion in vivo. modèl. Nan modèl hypoperfusion sa a, pH entraselilè a diminye kòm distans ki soti nan kwen kouvèti-glise a te ogmante, epi yo te obsève yon gradyan pH alantou kwen an kouvri. Nou te montre ke akimilasyon HIF-1 te siprime nan pH ba, alantou pH 5.0, konpare ak enkubasyon nan alantou pH net anba tansyon oksijèn omojèn. Kwen ekstèn bag HIF a elaji deyò nan pH 6.5, ak kwen enteryè bag HIF a retresi anndan nan pH 8.5, ki baze sou kwen nan zòn nan pimonidazole-pozitif. Bag HIF la te bouche anba kondisyon asid, epi siyal HIF-1 te disparèt nan pH 5.0. Kidonk, nou elisid enpòtans pH pou fòmasyon bag HIF nan yon modèl coverslip. Nou te demontre posiblite pou bag HIF a te fòme pa represyon akimilasyon HIF-1 pa pH ki ba andedan bag la.

Plizyè etid anvan yo itilize metòd kouvèti kouvèti a te itilize selil kansè yo. Dapre yon rapò ki itilize liy selil epatoma imen Hep3B, ki eksprime redshift ki depann de oksijèn nan pwoteyin vèt fliyoresan (AcGFP1), imaj vivan nan selil ki kouvri ak yon kouvèti rektangilè te montre yon redshift kòm distans ki soti nan kwen yon kouvèti a ogmante (Takahashi & Sato, 2010). Spectre emisyon selil epatoma yo te deplase soti nan longèdonn fliyoresan pwoteyin vèt fliyoresan (GFP) pou rive nan wouj pandan tansyon oksijèn an diminye. Nan yon lòt etid, yo te mezire tansyon oksijèn selil SCC-7 ak yon lam kouvèti wonn 15-mm lè l sèvi avèk yon teknik fosforesans pou tout lavi. Tansyon oksijèn an te 6.9 mmHg ak 166 mmHg, kalkile nan PL, ki te 3.89 µs ak 893 µs, 0-2 mm andedan, ak 0-1 mm deyò nan kwen an kouvri, respektivman (Yoshihara et al., 2015). Metòd la kouvri tou te itilize ak myosit kadyak, yon sistèm ki te atire atansyon kòm yon modèl pwomèt nan vivo ischemi-reperfusion. Kelly et al te montre ke myosit ki kouvri ak yon kouvèti sibi chanjman mòfolojik ki make sou tan, akonpaye pa chanjman nan potansyèl manbràn mitokondriyo ak dinamik manbràn plasma, evantyèlman sa ki lakòz lanmò myosit. Yo te demontre tou ke pH intraselilè myosit ki kouvri ak yon kouvèti desann byen vit nan apeprè pH 4 nan sant yon kouvèti (Pitts & Toombs, 2004). Yon modèl kouvèti-glise, anpeche oksijèn oswa difizyon nitrisyonèl nan selil kiltive anba yon kouvèti, ka imite yon modèl in vivo nan ischemic, nòmal, ak zòn majinal nan sant la, deyò, ak kwen an nan yon kouvèti, respektivman. Plizyè etid yo te itilize modèl sa a kòm yon modèl ischemi-reperfusion nan myosit nan vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Dapre sa nou konnen, etid nou an se premye moun ki aplike yon metòd kouvèti pou selil tubulaires. Nan sistèm nou an, distans ki soti nan kwen yon kouvèti ak yon rejyon ekivalan a 10 mmHg nan tansyon oksijèn, kote pimonidazol ta dwe tounen pozitif, te 1.22 mm, ak tansyon oksijèn diminye a osi ba ke zewo nan yon distans 2 mm soti nan kwen an kouvri. . Rezilta sa a ka konpatib ak rapò anvan yo itilize alantou 15 mm kouvri, ki demontre egzistans lan nan yon gradyan oksijèn omwen nan 2 mm soti nan kwen an (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Nou te egzamine pousantaj apoptoz selil yo anba kouvèti (Figi S11) epi nou te dekouvri ke GAPDH ak aktin yo te kenbe menm andedan bag HIF la, ki endike ke bag HIF la pa te koze sèlman pa apoptoz selil oswa lanmò andedan bag HIF la.

Plizyè etid yo te mezire tansyon oksijèn nan ren yo lè l sèvi avèk diferan metòd. Kèk egzanp mezi tansyon oksijèn nan ren nòmal yo te jan sa a: 50 mmHg ak 30 mmHg nan cortical a ak medul la lè l sèvi avèk mikwo-elektwòd; ak 49 mmHg ak 41 mmHg nan segman S1 ak S2 nan selil tubulaires nan cortical a lè l sèvi avèk PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). Tansyon oksijèn nan ren malad ta pi ba. Dapre yon rapò anvan lè l sèvi avèk mikwo-elektwòd oksijèn, rat dyabetik te gen pi ba tansyon oksijèn ren parenchymal: 36 mmHg ak 11 mmHg nan cortical a ak medula respektivman (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Depi mikwo-elektwòd oksijèn mezire tansyon an mwayèn oksijèn parenchymal, yon seri pi laj espere nan ren malad. Tansyon oksijèn entraselilè a diminye a zewo mmHg nan yon modèl ren ischemik ki gen atè ren lateral ak venn yo te bloke (Hirakawa et al., 2015). Lè nou konsidere rezilta sa yo, seri tansyon oksijèn sou bag HIF a, apeprè 4-20 mmHg, te sanble yo te posib nan vivo.

Nou te dekouvri plis ke pH afekte fòmasyon bag HIF ak tansyon oksijèn. Depi selil epitelyal tubulaires nan ren an yo kontinyèlman ekspoze a likid urin, pH la nan selil tubulaires ta dwe afekte pa sa ki nan pipi. Lè nou konsidere gwo ranje pH nan pipi, nou deside etidye selil ki enkubate nan yon ranje pH 5.0–8.5. Te gen etid sou ranje pH nan ren nòmal. Yon etid te jwenn pH cortical a te 7.39 ± 0.{{10}}8, ak medula a te 7.20 ± {{2{{39} }}}.09, jan yo mezire lè l sèvi avèk mikwo-elektwòd (Burke et al., 1999). Yon lòt etid, lè l sèvi avèk D MRI ki baze sou pH, te montre valè pH nan 7.3 ± 0.13 ak 7.{0 ± 0.29 respektivman (Raghunand et al., 2003). Yo te rapòte ke pH ren diminye soti nan 6.5 a 6.32, ak osi ba ke 5.83 nan yon ka grav, nan yon modèl sourit nan CKD ak asidoz (Pavuluri et al., 2019). Obsèvasyon sa yo te bay prèv gout pH ak varyasyon nan CKD. Sepandan, enpak pH sou HIF-1 ki te pwovoke pa ipoksi kwonik nan CKD pa te ase byen egzamine. Nan etid la prezan, yo te obsève yon chanjman nan bag HIF a ant pH 6.5 ak pH 7.4, yon seri pH ki plauzib nan CKD. Rezilta sa a sipòte ipotèz ke yon diminisyon pa grav nan pH afekte akimilasyon HIF-1 nan CKD. Dapre prèv yon gout pH anba 6.0 nan ka grav nan CKD, li nesesè tou pou evalye eta fizyolojik HIF-1 nan pi ba pH. Malgre ke gen rapò ke yon anviwònman asid, menm nan normoxia, estabilize HIF-1, pi fò nan rapò sa yo envestige kondisyon nan asidite modere, sou pH 6.0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004) . Nan travay sa a, nou te montre repwesyon akimilasyon HIF-1 nan selil tubulaires nan pH 5.0, ak atenuasyon siyal HIF{-1 nan yon modèl lam kouvèti enkubasyon nan pH 5.0. Se poutèt sa, diminisyon pH ren nan CKD in vivo ta ka korelasyon ak aktivasyon HIF ensifizan, osi byen ke ak toksin uremik nan ren ipoksik la, ki agrave pwogresyon CKD (Tanaka et al., 2013).

Etid nou an gen plizyè limit. Premyèman, nan zòn nan nan ipoperfusion, medya kilti yo ta dwe ensufizant nan eleman nitritif, nan adisyon a prezans nan deficiency oksijèn ak diminye pH. Sepandan, li difisil pou delimiter efè pH, tansyon oksijèn, ak lòt faktè pwovoke pa ipoperfusion. Nan kò a, ischemi, ipoperfusion patolojik nan san an ki te koze pa yon konbinezon de oksijèn ki ba ak eleman nitritif ki ba, rive nan ògàn ak selil yo. Li enpòtan pou konprann diferans ki genyen ant deteksyon ipoksi ak deteksyon ischemi. Malgre difikilte pou elisid efè byolojik chak faktè, modèl hypoperfusion nou an fizyolojik plauzib, imite estati patolojik la nan vivo. Dezyèmman, fè yon modèl kouvèti mande pou konpetans ak pratik, depi majorite selil yo detanzantan te vin detache pandan retire yon kouvèti, espesyalman lè w ap itilize metòd tradisyonèl la (Figi S2a). Pwoblèm sa a depann sou liy selil yo itilize a. Pou egzanp, li te difisil pou nou aplike yon modèl kouvèti pou selil HEK 293 paske adezyon yo nan yon kouvèti te relativman fèb. Twazyèmman, li te dezirab pou misyon pou minimize domaj nan selil kiltive anba yon kouvèti. Kantite selil ki domaje yo te ogmante pandan peryòd kote yo te kouvri yo te ogmante, jan analiz apoptoz la montre. Nou te detèmine ke 3 h te apwopriye pou estime bag la HIF lè li te sanble yo dwe estatik, ak apeprè tankou 10 pousan nan selil yo te vin apoptotik (Figi S11). Katriyèm limit la se te difikilte pou yo tache selil kiltive yo nan yon kouvèti nan yon fason inifòm nan chak echantiyon (Figi S2b, c). Diferans nan atachman ant yon metòd tradisyonèl ak yon altènatif pou fè yon modèl kouvèti-lèv te kapab tou afekte etid la. Nou mezire seri tansyon oksijèn ki ekivalan a bag HIF pa yon teknik fosforesans pou tout lavi, nan ki nou te kreye yon modèl kouvèti ak yon metòd tradisyonèl. Depi bag la HIF pandan imunositochimi yo te vizyalize lè l sèvi avèk yon metòd altènatif, tansyon an oksijèn vre ta ka diferan. Nou minimize erè sa yo lè nou itilize prèv ki montre pimonidazol te pozitif nan 10 mmHg oswa mwens nan tansyon oksijèn an. Senkyèm limit la se ke pH intraselilè pa nesesèman menm ak pH mwayen kilti a. Plizyè rapò sot pase yo te montre ke pH intraselilè ki konsistan avèk pH mwayen nan yon sèten limit nan selil kiltive (Michl et al., 2019), nou ta ka evalye sèlman tandans nan pH intraselilè pa chanje pH mwayen an. Nan vivo, relasyon ki genyen ant pH nan rejyon entraselilè ak ekstraselilè, tankou pipi oswa likid kò, se pi konplike pase nan selil kiltive. Kidonk, plis etid sou fason chanjman pH kontwole akimilasyon pwoteyin HIF-1 nan vivo yo pral nesesè pou lavni.

Cistanche benefis: amelyore renfonksyon

Yon lòt limit se ke pH ta dwe gen yon efè sou makè ipoksi a, pimonidazol. Nou te konpare distans kwen pimonidazol-pozitif zòn ki soti nan sant yon kouvèti anba diferan kondisyon pH nan modèl kouvèti nou an. Kwen nan zòn nan pimonidazole-pozitif te konparab ant pH 6.5, 7.4, ak 8.5 (Figi S12a, b). Yon etid anvan te demontre tou antretyen nan pimonidazol obligatwa nan diferan valè pH (Kleiter et al., 2006). Dapre prèv sa a, nou konkli ke pimonidazol se yon makè ipoksi ki apwopriye pou eksperyans coverslip nou yo. Limit final la se ke yo bay yon seri tansyon oksijèn ant apeprè 4 mmHg ak 20 mmHg (0.52 pousan O2 a 2.6 pousan O2) nan bag la HIF, Pt(II)- ak Pd(II)-porphyrins, ki lajman itilize kòm byolojik. sond oksijèn, gen avantaj pou mezire konsantrasyon oksijèn ki ba anpil akòz lavi fosforesans siyifikativman pi long yo konpare ak sa yo ki itilize konplèks Ir(III) (Yoshihara et al., 2017). Sepandan, an jeneral, yon mezi oksijèn quantitative ki baze sou fosforesans, kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon Stern-Volmer, gen pi bon pèfòmans nan chenn O2 ki ba (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Plizyè etid anvan yo te demontre Ir (III) mezi konplèks ki baze sou tansyon oksijèn osi ba ke apeprè 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Se poutèt sa, nou kwè ke seri a nan tansyon oksijèn nan bag la HIF ta dwe yon rezilta egzak.

5|KONKLIZYON

An rezime, nou te jwenn ke konprann wòl tou de oksijèn ak pH esansyèl pou konprann eta fizyolojik HIF-1 nan CKD, epi yo ka jwenn nan envestige selil tubulaires ak ipoperfusion. Modèl kouvèti a, ak limit li yo nan flo a nan medya, se te yon bon modèl nan ipoperfusion nan vivo, espesyalman nan tubul yo nan CKD, depi rarifikasyon nan kapilè peritubular yo se yon mak prensipal nan CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Modèl hypoperfusion sa a kapab tou imite oksijèn ak pH gradyan nan vivo, tankou timè ak blesi ischemik. Modèl la bay yon apwòch pwomèt pou elisid mekanis byolojik sa yo.

KONFLI ENTERÈ

Tout otè pa gen okenn konfli enterè pou deklare.

KONTRIBYON OTÈ YO

Tout otè kontribye nan fòmasyon konsèp la an jeneral. TH te fè eksperyans yo an jeneral. TH ak YH analize rezilta yo epi fè figi yo. TH te ekri maniskri orijinal la. KM, TY, ak ST te fè eksperyans la lè l sèvi avèk yon teknik fosforesans pou tout lavi epi yo te modifye pati maniskri a. YH, TT, ak MN te edite maniskri an jeneral. Tout otè yo te li epi apwouve maniskri final la.

REFERANS

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir (iii) D 'oksijèn ki baze sou konplèks nan selil k ap viv ak fon okilè ak yon kamera ICCD fèmen. Photochemical and Photobiological Sciences, 17 (6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustat, konvèsyon ak terapi antretyen pou anemi nan pasyan emodyaliz: Yon esè faz 2b owaza, ki kontwole ak plasebo ki te swiv pa yon esè alontèm. Nefwon, 143(2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE, & Harris, AL (2002). Règleman nan yon eleman rat VL30 nan selil kansè nan tete imen nan ipoksi ak anoksi: Wòl HIF -1. Britanik jounal kansè, 87(10), 1173–1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe- Akanuma, M. (2016). Aktivasyon reseptè aryl idrokarbone medyatè repwesyon ekspresyon eritropoyetin ipoksi-induzibl faktè-depandan pa indoxyl sulfat. Ameriken Journal of Fizyoloji. Fizyoloji selilè, 310 (2), C142–C150.

Burke, TJ, Malhotra, D., & Shapiro, JI (1999). Faktè ki kenbe yon gradyan pH nan ren an: wòl achitekti vaskilè a. Kidney International, 56(5), 1826–1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ, & Macip, S. (2014). Wòl faktè transcription HIF-1alfa a nan ogmante divizyon selilè nan tansyon oksijèn fizyolojik. PLoS One, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019) ).

Roxadustat pou anemi nan pasyan ki gen maladi ren ki pa resevwa dyaliz. New England Journal of Medicine, 381(11), 1001–1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., Li, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). Faz 2 etid sou oral ipoksi-induzibl faktè prolyl hydroxylase inhibitor FG -4592 pou tretman anemi nan Lachin. Nefroloji, dyaliz, transplantasyon, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T., & Nangaku, M. (2011). Indoxyl sulfat, yon toksin uremik reprezantan, siprime pwodiksyon eritropoyetin nan yon fason ki depann de HIF. Envestigasyon Laboratwa, 91 (11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H., & Moon, IS(2015). Solisyon glikoz-ensilin-potasyòm pwoteje myosit vantrikul nan rat neonatal nan yon modèl ischemi/reperfusion in vitro coverslip. Korean Circulation Journal, 45 (3), 234–241.

Coyne, DW, Goldsmith, D., & Macdougall, IC (2017). Nouvo opsyon pou anemi maladi ren kwonik. Kidney International Supplement, 7 (3), 157–163. bo.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson, S. et al (2010). Pwoteksyon ren nan maladi ren kwonik: deklanchman faktè ipoksi-induzibl vs blokaj anjyotansin II. Ameriken Journal of Fizyoloji. Fizyoloji ren, 299 (6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016). Asidoz aji atravè HSP90 nan yon fason endepandan Ph.D./VHL pou ankouraje fonksyon HIF ak antretyen selil souch nan gliom. Rechèch kansè, 76(19), 5845–5856. KAPAB-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006). Ensifizans renal egi-sou-kwonik nan rat la: konpansasyon fonksyonèl ak tolerans ipoksi. Ameriken Journal of Nephrology, 26 (1), 22-33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S., & Khamaisi, M. (2013). Poukisa dyabèt melitus yon faktè risk pou nefropati kontras-induit? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018). Fosforesans intravital pou tout lavi D nan cortical ren yo mezire avèk presizyon ipoksi ren. Kidney International, 93(6), 1483–1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2017). Ipoksi ren nan CKD; Fizyopatoloji ak metòd detekte. Fwontyè nan fizyoloji, 8, 99.