Yon Novel, Ataksik Modèl sourit Ataksya Telangiectasia ki te koze pa yon mitasyon san sans ki enpòtan nan klinik (Pati 2)

Pou aprann plis enfòmasyon tanpri kontaktedavid.wan@wecistanche.com

3.0 Diskisyon

Lè nou ogmante estrès jenotoksik atravè ajoute yon frape segondè nan chemen DDR a, nou te jenere yon modèl sourit roman ki montre seri sentòm AT ki pi konplè nan nenpòt modèl jiska prezan. Sa a gen ladan ataksya grav ak pwogresif ki asosye ak atrofi serebeleux ak perturbasyon nan pwopriyete PN ansanm ak yon gwo ensidans kansè ak domaj nan devlopman selil iminitè. Ansanm, komorbidite sa yo enkli twa kòz prensipal lanmò twò bonè nanAT—chak kontribyea apeprè yon tyè nan lanmò. Nan sa yo, efè enkapasite nan ataksya se pi penetrasyon an epi pasyan yo ak moun k ap bay swen yo rapòte ke yo gen pi gwo enpak sou kalite lavi yo. Pou rezon sa a, prezans ataksya ak atrofi serebeleux nan nouvo modèl sourit sa a se yon gwo siyifikasyon, paske li bay pou premye fwa yon resous pou non sèlman elicide mekanis malfonksyònman newolojik, men tou, yon modèl nan vivo ki nesesè anpil. tès ki nesesè anpil AT therapeutics, tankou konpoze lekti nou dekri la a. Nou te jwenn plizyè resanblans ant pwogresyon an jeneral nan ataksya nan Atm3535 la; Aptx sourit akAT pasyan yo. Nan klinik AT, defisi motè yo obsève nan apeprè 2 zan, lè paran yo ak doktè yo detekte yon kapasite bese pou tranzisyon soti nan timoun piti nan yon pòtay lis, reflèks kowòdone - malerezman, yo konnen ti kras sou defo motè nan etap pi bonè akòz maladi yo. ba prévalence ak aktyèl mank de tès dyagnostik bonè (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Anjeneral, pasyan yo aprann mache san asistans epi sentòm newolojik yo gen tandans rete estab pandan 4 a 5 premye ane lavi yo (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Nou te jwenn yon pwogresyon byen bonè ki sanble nan defisi motè nan Atm735 × R3x; Sourit Aptx^' yo, detekte byen bonè defisi motè modere nan P8 (righting reflex defisi) ki te swiv pa yon peryòd de estabilite relatif, anvan aparisyon nan ataksya pwogresif ak grav devlope apre p210 ki enkli chanjman nan demach, reflèks sezisman, tranbleman, ak lokomotè. aktivite. Plizyè kesyon enpòtan soti nan konklizyon sa yo, tankou si ATM ak/oswa APTX gen yon wòl neurodevlopman nan

serebelo. Etid nan lavni konsantre sou faz nan bonè nan maladi a pral kritik nan konpreyansyon si serebeleu a devlope nòmalman anvan malfonksyònman oswa si domaj nan devlopman yo se yon kòz premye. Nou menm tou nou te jwenn, menm jan ak pasyan AT, ke gravite ataksya ki te devlope an reta a te varyab, ak kèk sourit ki t ap anbilans ak yon pòtay dèyè maladwa, ki gen gwo etap (Videyo 3) ak lòt moun k ap deplase prèske antyèman atravè kontorsyon nan kòf la dèyè ( Fig.1E ak Videyo 4) (Rothblum-Oviatt et al.2016; Levy and Lang 2018; Boder and Sedgwick 1958). An jeneral, nou te jwenn ke Atm?35×xR35×; Sourit Aptx yo devlope yon pèt pwogresif vizyèlman pwofon ak mezirab nan kowòdinasyon motè menm jan ak sa yo obsève nan pasyan AT, ki te sove pa ekspresyon nan omwen yon kopi Atm oswa Aptx jwenn li. Pèt kowòdinasyon motè nan AT yo te atribiye nan koripsyon serebeleu akòz neropatoloji relativman selektif li yo atravè sèvo a ak wòl kozatif li nan plizyè fòm diferan nan ataksya (Hoche et al.2012). Ki konsistan avèkAT pasyansyans neuroimaging (Wallis et al.2007; Sahama et al.2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al.2013), nou jwenn ke gwosè serebeleux nan Atm735 × R3 × ; Sourit Aptx 'yo okòmansman nòmal, men pwogresivman atrofi ansanm ak chanjman nan fonksyon newolojik. Pandan ke yo te konsidere pèt la nan tisi serebeleu yo kòm yon kòz prensipal nan ataksya nan imen, li pa klè nan done klinik si gravite ataksya se yon bon prediksyon nan limit dejenerasyon serebeleux yo te jwenn apre mortem (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006). : Dineen et al.2020). Nan ATM a?35×R35×; Aptx^ sourit, nou jwenn klè atrofi ki asosye ak eklèsi nan kouch nan dendrite newòn Purkinje ki anvan an reta, defisi konpòtman grav. Obsèvasyon istolojik nou yo nan Atm?35xR35×; Aptx'mice sijere ke chanjman nan fonksyon serebeleux tèt li, olye ke pèt pwofon nan selil serebeleux, yo ase yo lakòz fenotip ataksik la, ki konsistan avèk obsèvasyon an nan domaj konpòtman anvan pèt PN enpòtan nan plizyè SCAs (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti et al 2000; Clark et al. 1997; Jayabal et al.2016). Rezon ki fè ATM ak APTX deficiency oblije jenere ataksya nan sourit lè pèt nan swa se ase lakòz ataksya nan imen rete klè. Yon posibilite se ke sèvo wonjè a ka itilize plis fleksibilite chemen konpansatwa oswa pwoteyin redondants pandan y ap reponn a 10-20k blesi ADN ki afekte selil yo chak jou (Lindahl and Barnes 2000). Gen plizyè fòm reparasyon ADN ki kapab rankontre defi sa a, ki gen ladan reparasyon pou eksizyon baz (BER), reparasyon ekscision nukleotid (NER),

Klike la a pou aprann plis sou Cistanche

osi byen ke omològ ak ki pa omologe rantre nan fen (HEJ ak NHEJ, respektivman), tout moun ki ATM ak APTX yo te enplike nan (Chou et al.2015; Caglayan et al.2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee and Walker 2017) Altènativman, li ka la. ka ke deficiency nan ATM oswa APTX pou kont li pa ase enpak sou sante selil pandan lavi relativman kout sourit la, epi konsa elimine tou de pwoteyin ki nesesè yo reyalize ase akimilasyon nan domaj ADN manifeste sou peryòd tan sa a. Se posiblite sa a ranfòse pa lefèt ke ATM ak APTX gen pwopriyete byochimik distenk ak wòl fonksyonèl nan repons domaj ADN, ak Se poutèt sa ta dwe prevwa yon defisi nan tou de lakòz yon frape pi laj nan estabilite genomic (sa vle di, ogmante estrès jenotoksik). Konklizyon nou an ke de pwoteyin chemen estabilite genòm yo oblije pwovoke domaj newolojik nan sourit yo sijere ke li se pèt Oriole ATM nan reparasyon ADN, olye ke fonksyon potansyèl nan siyal estrès oksidatif, mitofaji, oswa fonksyon mitokondriyo ki lakòz domaj serebeleux yo. Shiloh 2020). Altènativ yo, sepandan, pa ka konplètman eskli, kòm APTX, tankou ATM, yo te obsève nan mitokondri yo nan selil nan sèvo, kote li te panse yo sipòte pwosesis la nan ADN mitokondriyo (Meagher and Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). Nouvo modèl sourit sa a bay yon nouvo zouti pou eksplore posiblite sa yo epi pou defini mekanikman kijan pèt ATM ak APTX finalman lakòz malfonksyònman serebeleux. Perturbasyon byofizik yo obsève nan PN yo anrejistre nan AtmR35XR35X la; Sourit Aptx yo jwenn menm jan an nan plizyè lòt modèl sourit ataksya. Sa a gen ladann chanjman nou obsève nan rezistans opinyon PN, kapasite manbràn, ak papòt AP ak lajè, ki te tou dekri nan modèl sourit nan SCA tankou 1, 3, ak 7 (Stoyas et al.2020; Shakkottai et al.2011; Dell 'Orco et al.2015). Anplis, rediksyon pwogresif nan PN aksyon potansyèl tire frekans nou rapòte pozitivman korelasyon ak devlopman nan ataksya nan AtrnR35XR35X la; Aptx'mice yo rapòte nan yon gwo kantite modèl sourit ataksik, ki gen ladan SCAs 1, 2, 3,5, 6, ak 13 osi byen ke kèk fòm epizod (gade revizyon (Cook, Fields, and Watt 2021)). Etandone sipèpoze siyifikatif nan perturbations PN yo obsève atravè anpil ataksi diferan ki te koze pa domaj selilè diferan, restorasyon frekans tire PN AP yo te konsidere kòm yon apwòch ki ka geri ki baze sou laj. Sepandan, li rete klè si redwi PN tire se yon faktè kozatif nan ataksya. Anplis, prèv eksperimantal sijere chanjman nan aktivite PN ka an reyalite se yon repons jeneralize pou kenbe omeyostazi pandan maladi kontinyèl ki gen rapò ak maladi nan fizyoloji PN (Dell'Orco et al.2015). Kidonk, yo bezwen efò kontinye atravè tout ataksi serebeleux yo pou lye dezòd jenetik, molekilè ak selilè ki te koze pa maladi a ak chanjman espesifik nan siyal neral serebeleux ki finalman jenere ataksya a. Siyifikativman enpòtan nan efò sa a pral detèmine si defo serebeleux ki lakòz maladi souvan oswa diferansye lakòz ataksya atravè yon pèt nan fonksyon serebeleux (egzanp, pèt siyal kowòdinasyon pandan mouvman), oswa nan yon efè dominan-negatif (egzanp, deranje neral en. sikwi ak modèl pwodiksyon neral nòmal). Alafen, pandan yon estrateji terapetik komen pou adrese ataks serebeleux ta gen pi gwo enpak, yon apwòch dirije ki adrese kòz distenk jenetik ak molekilè malfonksyònman selilè ka finalman nesesè pou devlope avèk siksè yon terapetik efikas. Lyen mekanik ant yon defisi nan ADN pwoteyin estabilite tankou ATM ak APTX ak PN malfonksyònman se byen lwen klè. Rezilta nou yo sijere efè pèt ATM ak APTX sou PN yo se intrinsèques, paske nou pa jwenn chanjman nan pwopriyete presinaptik selil granules oswa prèv pèt selilè yo (pa gen okenn chanjman nan epesè GCL). Anplis, pandan ke nou te obsève diferans nan plastisit kout tèm nan entrées oliv enferyè nan ATM- ak APTX-defisi PNs ak sovaj, rezilta sa yo gen anpil chans montre nan yon dezòd nan omeyostazi Ca2 * potansyèlman atravè rediksyon nan Inositol 1,4, 5- trifosfat reseptè 1 (ltpr1) ekspresyon, menm jan ak sa yo obsève nan SCAs 1,2, ak 3 modèl sourit kòm byen ke ATM-defisi sourit (Kim et al.2020; Chen et al.2008; Demirci et al.2009; Shakkottai et al. al.2011). Pandan ke sa a bay yon avni pwomèt pou egzamen ak konparezon nan lavni, li poko klè, menm pou SCA yo, si chanjman nan omeyostazi Ca²*, se faktè kozatif la oswa jis yon lòt sentòm oswa menm repons konpansatwa nan PN ki malad oswa detounen (Dell 'Orco et al.2015). Nan sistèm iminitè a, ATM enplike nan reparasyon ADN kase ki fèt natirèlman pandan reranje jèn nan jèn reseptè antijèn nan précurseurs selil B ak T, yon fenomèn kritik pou divèsite reseptè antijèn (LG ak TCR) nan selil sa yo. jwenn saT-selilpwopòsyon nan san an yo siyifikativman redwi se ki konsistan avèk etid anvan nan imen ak AT sourit knockout(Schubert, Reichenbach, and Zielen 2002; Hathcock et al.2013; Chao, Yang, and Xu 2000; Barlow et al.1996). Sa a rediksyon nan selil T nan periferik la gen anpil chans korelasyon ak yon defo nan iminite tou de selilè ak umoral. Sa ki enpòtan, nou te jwenn ke ekspresyon de yon kopi jèn ATM ase pou retabli CD4 plis defisi nan san an ki endike ke terapi ki kapab retabli ekspresyon pasyèl ATM ta gen efikasite terapetik. Malgre ke nou pa te evalye devlopman selil B nan papye sa a, li posib ke konklizyon menm jan an ta aplike nan pwosesis sa a akòz resanblans mekanik yo (Marshall et al. 2018). Kòm espere, rediksyon nan selil T nan san periferik se korelasyon ak devlopman defo thymocyte. Nan tim la, nou te jwenn de defo prensipal yo. Youn, pwovoke prensipalman pa defisi APTX, manifeste kòm yon defo nan tranzisyon DN3 a DN4 ki koinside ak reyajman byen bonè nan lokal TCR la. Lòt defo a, prensipalman ki te koze pa ATM deficiency, korelasyon ak diminye pwogresyon nan CD4-pozitif doub * CD8 nan selil sèl-pozitif, prensipalman CD4 'timosit. Pandan ke APTX konklizyon an te etone, kòm deficiency li yo (AOA 1) pa asosye ak defisi iminitè, se APTX li te ye pou kominike avèk pwoteyin jèn TCR, ki gen ladan XRCC4 (Clements et al. 2004). Etid nan lavni ki vize a defini wòl APTX nan mekanis fen-joining pandan reyajman jèn TCR yo pral

enpòtan, ak posiblite pou mekanis altènatif fen-joining, tankou itilizasyon mikrohomoloji, kont pou mank de yon defisi iminitè nan absans li bezwen plis envestigasyon (Bogue et al. 1997). Sivivabilite nan Atm?35×/R35×; Aptx'mice se konsiderableman pi long pase modèl AT sourit anvan yo. An konparezon, premye aAT KOmodèl sourit rapòte pa Barlow et al. te mouri ak timòm anjeneral nan 2-4 mwa apre nesans (Barlow et al. 1996). Diminye sivivabilite kansè nan sa a ak anpil lòt modèl sourit knockout AT gen anpil chans jenetik, paske yo te montre souch background ki gen mitasyon an gen yon efè enpòtan sou prévalence kansè ak sivivabilite, ak A/J ak C57BL/6.

orijin ki gen siyifikativman ogmante sivivabilite sou tansyon yo BALBC ak 129S (Genik et al. 2014). Lefèt ke sourit ATM nou yo te kreye sou yon background C57BL/6 gen anpil chans anba; ke sourit Aptx * t yo pa devlope ataksya, li se lavi konparativman long yo. Etandone ke Atm35xR35× la; Li pa fasil pou lanmò bonè nan sourit AT KO anpeche obsèvasyon yon fenotip ataksik ki ta devlope nan sourit sa yo. Sepandan, li se enkoni si background nan C57BL / 6 bay rezistans nan devlope ataksya, menm jan li fè pou kansè. Defini faktè jenetik oswa pètèt epigenetik ki enfliyanse gravite maladi a ta ka bay avni pou devlopman terapetik nan lavni. Etandone nati mondyal la nan ATM ak APTX nil mitasyon nan modèl sourit nou an, nou pa ka totalman ekskli ke domaj siplemantè-serebeleu yo ka kontribiye tou nan fenotip ataksik grav la, epi konsa egzamen nan lavni deyò serebeleu a nan sèvo a, tij sèvo, mwal epinyè. , e menm misk ap bezwen fèt. Nan serebeleu a, pandan ke nou te jwenn kèk diferans anatomik nan pwopriyete yo tire PN nan diferan rejyon nan serebeleu a, nou pa t 'detekte diferans rejyonal nan lajè ML oswa dansite PN. Sepandan, gen defi nan itilize anatomi rejyonal kòm yon faktè gwoupman nan serebeleu a, kòm pli fizik yo nan tisi a pa nesesèman korelasyon ak limit fonksyonèl, ekspresyon molekilè, oswa domèn pwopriyete fizyolojik ki te dekri (Apps and Hawkes 2009). ; Tsutsumi et al.2015; Gao, van Beugen, and De Zeeuw 2012; Zhou et al.2014). Eksperyans ki konsantre sou egzamine limit domaj serebeleux nan domèn sa yo pral enpòtan nan etid nan lavni epi konpare ak rapò anekdotik sou diferans anatomik nan pasyan AT (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, ak Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Pandan ke nou detekte de etap potansyèl nan pwogresyon nan ataksya nan Atm735wR35x la; Sourit Aptx, etap nan pita nan ataksya grav devlope nan laj granmoun nan sourit, kòm konpare ak anfans-aparisyon nan imen. Sa a ka limite itilizasyon li nan kèk etid neurodevlopmantal. Epitou, entèpretasyon eksperyans nan lavni dwe ak anpil atansyon faktè nan lefèt ke nouvo modèl sa a eksprime mitasyon nil nan de jèn estabilite genomic an menm tan, yon sitiyasyon ki pa te detekte nan pasyan imen ak swa AT oswa AOA1. Finalman, detèmine ki kote, ki lè, ak ki jan deficiency ATM lakòz patoloji serebeleux ak ataksya te yon defi, kòm sourit anvan ATM-defisi jeneralman manke karakteristik yo ki nesesè yo kozatif lyen defisi selilè ak molekilè ak fenotip ataksik la. Plizyè avni pwomèt envestigasyon yo te defini, ki gen ladan sa ki konsantre nan nivo newòn, kote ATM enplike nan siyal estrès oksidatif (Chen et al.2003) ak fonksyon sinaptik (Li et al.2009; Vail et al.2016), kòm byen ke fonksyon glial, kote prèv resan sijere patoloji glial ka yon faktè dirijan nan patoloji serebeleux (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al.2016; Petersen, Rimkus, and Wassarman 2012; Weyemi et al.2015). Modèl bèt roman sa a bay yon nouvo zouti pou teste ipotèz mekanis yo konsènan fason deficiency ATM lakòz patoloji serebeleux ak ataksya. Anplis de sa, modèl sa a ka sèvi pi enpòtan kòm yon zouti preklinik kritik pou teste kandida terapetik yo te pwopoze deja (Browne et al.2004; Chen et al.2003) ak pwòp konpoze SMRT nou yo (Du et al. 2013). Limit yo grav nan pa gen yon modèl preklinik apwopriye pou tès ki ka geri, espesyalman pou yon maladi ra tankou AT ak AOA1, pa ka egzajere.

4.0 Materyèl ak Metòd

4.1 Deklarasyon Etik

Etid sa a te fèt an akò sevè ak rekòmandasyon yo nan Gid la pou swen ak itilizasyon bèt laboratwa nan Enstiti Nasyonal Sante yo. Tout bèt yo te okipe dapre pwotokòl Komite Swen ak Itilizasyon Enstitisyonèl Animal (IACUC) apwouve nan Enstiti Lundquist (31374-03,31773-02) ak UCLA(ARC-2007-082, ARC{{3}). }). Pwotokòl la te apwouve pa Komite sou Etik Eksperyans Animal nan Enstiti Lundquist (Nimewo Asirans: D16-00213). Yo te fè tout efò pou minimize doulè ak soufrans lè yo bay sipò lè sa nesesè epi chwazi pwen final etik.

4.2 Sourit

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>Mitasyon T yo te jwenn nan yon gwo popilasyon Afrik di NòATpasyan yo using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), repwodui AT PTC imen an). Apre sa, alèl jenomik yo te klonaj nan yon vèsyon modifye vektè vize mamifè NorCOMM lè l sèvi avèk yon 3-fason Gateway Reaction (Bradley et al. 2012). Vektè yo vize ki kapab lakòz yo te elektwoporasyon nan selil C2 ES (C57BI / 6N, ki sòti nan laboratwa A. Nagy, Toronto, Kanada) ak klon vize avèk siksè yo te idantifye pa seleksyon ak G418 (Gertsenstein et al.2010). Southern blot te konfime entegrasyon kasèt vize mitasyon an nan zòn jèn Atm, ak sekans pwodwi PCR pou konfime prezans mitasyon PTC Atm, vize san erè nan sit Atm, ak eleman fonksyonèl san erè nan.

vektè (done yo pa montre). Klon ES pozitif yo te itilize pou piki blastocyst pou jwenn liy transjenik yo. Alèl transjenik la te genyen yon pwomotè-delta imen beta-aktin floxedTK1-Neo cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(Fig.1A). Genotyping de liy Atm yo te fè lè l sèvi avèk primè sa yo nan Tm 62 degre degre: Atm gene forward (F) primer:5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; ak Atm jèn ranvèse(R) premye: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', kreye yon pwodwi alèl sovaj-kalite nan 151bp oswa pwodwi alèl vize nan 241bp (figi. 1A, 1B).Atmn35 ~ ak Atm035 × v yo te back-crossed ak sourit C57Bl/6J pou 9 jenerasyon (99.2 pousan izojenik) anvan kriyokonservasyon ak rederivasyon ki vin apre lè l sèvi avèk manman ranplasan C57BI/6J. Atm735× ak Atm?35xand Atm 35×/Q35× se te éleveurs ki te jwenn nan F1 frè ak sè Atm35 ak Atm835X plis sourit. AtmR35×k35×: yo te jwenn tou de yo fètil. Aptx knockout (Aptx) sourit yo te kreye epi yo te bay Dr Mathews kòm anbriyon soti nan Dr McKinnon (Ahel et al.2006), epi answit redérivé via C57Bl/6J manman ranplasan. Sourit Aptx yo sou yon background melanje C57Bl/6 ak 129. Atm35k35; Sourit Aptx nan divès kalite sovaj, eterozigòt, ak konbinezon omozigòt yo te kreye nan Atm35X; Elve aptxt yo te pwodwi pa kwaze sourit Atm?35×R35 ak Aptx^. Yon kòwòt doub mutan ak sourit kontwòl korespondan yo te itilize nan etid konpòtman longitudinal pou analiz demach ak tès SHERPA (Figs.2,3). Plizyè kowòt adisyonèl nan laj-matche doub mutan ak kontwòl sourit yo te itilize pou elektwofizyolojik, imunohistolojik, ak eksperyans tès poto vètikal (Figs.4, 7). Eksperyans ekspresyon iminolojik ak pwoteyin yo te pote soti lè l sèvi avèk sourit elve nan orijinal AtmR35 × ak Atm35 × sourit rederive (Figs.5, 6, ak 8). Genotype te fè nan echantiyon tisi zòrèy sourit P8-11. Yo te itilize metòd PCR an tan reyèl pa Transnetyx Inc. pou detèmine jenotip chak bèt. Yo te fè bèt yo idantifye atravè tatoo zòtèy yo bay an menm tan ak byopsi zòrèy. Jadendanfan inik pou Atm35× ak Atm35× yo te quantifye epi yo te itilize pou idantifye sourit sovaj, etewozigòt ak omozigòt (ki nan lis pi wo a). Yo te itilize primè Aptx'and Aptx*" pou evalye jenotip yo.

4.3 Sante bèt

Bèt yo te peze atravè yon echèl dijital nan P8, 45, 120,210,400. Yo te anrejistre lanmò bèt la kòm jou yo te jwenn lanmò a, oswa jou lè bèt yo te rive nan yon pwen imanitè (bèt ki pa t kapab redrese tèt li nan ane 60 yo, tapi cheve enpòtan ki endike mank de pwòp tèt ou oswa detrès twòp jan veterinè a te note sa. anplwaye). Kadav bèt yo te imedyatman jele lè yo mouri, epi yo te fè necropsis apre lanmò an pakèt. Yo te detèmine kòz pwobab lanmò a pi byen nan kapasite nou an kolaborasyon ak veterinè anplwaye a (Dr. Catalina Guerra) pa enspeksyon vizyèl nan ògàn entèn yo. Gen kèk sourit yo te kanibalize oswa aksidantèlman jete pa anplwaye vivarium epi yo te

Se poutèt sa te make kòm "manke." Sourit ki pa gen okenn kòz vizyèl lanmò yo te make "endetèminab." Sourit ki te jwenn ak mas thoracic toupre kote timis la ta nòmalman ye nan sourit jèn yo te nan lis kòm gen "kansè timik." kòz pwobab lanmò (egzanp, fwa elaji, blokaj urin) yo te make "lòt."

4.4 Konpòtman

Anvan yo te fè nenpòt tès konpòtman, sourit yo te aklimate nan suite konpòtman an pou ~ 20 minit. Sourit yo te teste nan diferan moman nan jounen an, nan liy ak sik chak jou yo. Yo te fè yon batri tès konpòtman sou sourit nayif doub mutan nan jenotip endike yo nan plizyè pwen tan depann sou konpòtman an men nan menm kòwòt sourit la. Batri tès yo enkli evalyasyon Catwalk Gait (P45, 120,210, 400) ak yon pati nan tès SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College ak Royal-London-Hospital Phenotype Assessment(SHERPA) (P30 ak 400). UCLA Behavioral Core te fè tès sa yo. Doub mutan ak kontwòl sourit yo te anplis egzamine sou tès la poto vètikal. Tout aparèy konpòtman yo te siye ak etanòl (70 pousan) ant chak sijè tès yo.

Analiz demach

Nou itilize yon sistèm analiz Noldus Catwalk Gait ki fèt pou mezire semi-otomatikman ak analize demach sourit yo pandan anbilasyon nòmal. Yon ti tan, mouvman sourit yo atravè yon koridò ki anba vè se videyo anrejistre nan yon pozisyon santral. Anpwent paw yo make nan videyo a akòz limyè limyè atravè platfòm la mache vè. Chak etap sourit nan yon videyo imedyatman detekte lè l sèvi avèk Catwalk XT (Noldus) nan yon mòd semi-otomatik. Yon kouri pou chak sourit konsiste de 3 esè nan anbilans ki konsistan atravè platfòm kontwole a. Yo aksepte sèlman esè ki konsistan, epi sourit yo ka pran jiska 10 tantativ pou konplete 3 esè ki konfòme yo nan nenpòt direksyon atravè koridò a. Esè ki konfòme yo te defini kòm moun ki gen mouvman atravè platfòm la ki gen mwens pase 5 s-long epi ki pa gen plis pase 60 pousan varyasyon vitès. Yon fwa yo mete yo sou platfòm la, sourit yo jeneralman kouri retounen ak lide san okenn bezwen eksperimantè.

Pòl vètikal

Sourit yo mete sou tèt yon boulon 80 cm wotè ak nen yo fè fas a desann ak grif dèyè yo pi pre tèt la ke posib. Sourit yo imedyatman lage, ak tan kòmanse imedyatman apre plasman.

Tan yo sispann lè premye paw la manyen sifas ki anba poto a. Predileksyon natirèl yon sourit se imedyatman monte desann poto a, epi yo bay yo jiska 60s pou travèse poto a, otreman, yo ede yo koupe poto a. Yon jijman ki pa fini otomatikman bay yon tan nan 30s, kòm 95 pousan nan sourit ki pa desann nan 30s te toujou sou poto a nan mak 60s la. Tès Konpòtman SHIRPA te fèt pa University of California, Los Angeles Behavioral Core nan P30.

ak P400.Tout paramèt yo bay nòt pou bay yon evalyasyon quantitative. ki pèmèt konparezon rezilta tou de sou tan ak ant diferan laboratwa. Yo te teste chak sourit an sekans atravè tout konpòtman nan yon peryòd ~20-min anvan yo te ale nan pwochen sourit la. Eksperimantè a te avèg nan jenotip bèt. Ekran an te fèt jan sa dekri deja (Rogers et al. 1997).

Obsèvasyon konpòtman

Ekran prensipal la bay yon pwofil obsèvasyon konpòtman ak evalyasyon chak bèt kòmanse pa obsève konpòtman san deranje nan yon bokal gade (10 cm dyamèt) pou 5 minit. Anplis konpòtman ki bay nòt nan pozisyon kò a, aktivite espontane, to respirasyon, ak tranbleman, obsèvatè a anrejistre nenpòt ka konpòtman ra oswa estereyotip ak konvulsion, niche konpulsif, mòde oto-destriktif, ak retropulsion (mache bak) ak endikasyon espasyal. dezoryante.

Konpòtman Arena

Apre sa, sourit la transfere nan tèren an (30 cm x 50 cm) pou tès eksitasyon transfè ak obsèvasyon nan konpòtman nòmal. Tèren an make nan yon kadriyaj 10 x 10 cm² pou mezire aktivite lokomotè nan yon peryòd 30 s. Pandan ke sourit la aktif nan tèren an, mezi repons sezisman, demach, elevasyon basen, ak elevasyon ke yo anrejistre.

Konstriksyon sou dorsal

Bèt la kenbe nan yon pozisyon soupine pou anrejistre konpòtman otonòm. Pandan evalyasyon sa a, yo te evalye fòs priz, ton kò, reflèks pinna, reflèks korn, zongle zòtèy, manèv fil, ak batman kè.

Balans ak Oryantasyon

Finalman, plizyè mezi fonksyon sistèm vestibilè yo te fèt. Reflèks redresman an, reflèks redresman kontak, ak tès geotaxis negatif yo te fèt. Pandan tout pwosedi sa a, yo te anrejistre vocalizasyon, pipi, ak laperèz jeneral, chimerik, oswa agresyon.

Ekipman yo itilize

1.Clear Plexiglas tèren (apeprè dimansyon entèn 55x33 x18 cm). Sou planche tèren an gen yon fèy plèksiglas ki make ak 15 kare (11 cm). Yon fil orizontal rijid (3 mm dyamèt) sekirize nan kwen dèyè dwa pou bèt yo pa ka manyen kote yo pandan manevwe fil la. Yon kadriyaj (40x 2{0 cm) ak 12 mm may (apwoksimatif) sekirize atravè lajè bwat la pou mezire sispansyon ke ak konpòtman fòs grip. 2. Yon silenn Plexiglas klè (15 x ll cm) te itilize kòm yon bokal gade. 3. Yon etaj kadriyaj (40x 2{0 cm) ak may 12mm sou ki pot gade yo kanpe.4. Kat sipò silendrik asye pur (3 cm longè x 2.5 cm dyamèt) pou monte griye sou ban an. 5. Yon plak kare (13 cm) asye pur pou transfè bèt yo nan tèren an. 6. Koupe longè 3/0 Mersilk ki te kenbe nan forceps yo pou tès reflèks korn ak pinna 7. Yo te file yon baton plastik pou yon pwent kreyon pou teste salivasyon ak mòde.8. Yon pè forceps ekipman diseksyon, koube ak pwen byen (125 mm forceps, Philip Harris Scientific, Cat. No. D46-174), pou zongle zòtèy la. 9.Yon kronometre.10. Yo itilize yon bwat Klike IHR pou teste repons sezisman yo. Klike bwat la jenere yon ton kout 20 kHz nan 90dB SPL lè yo kenbe 30cm anlè sourit la. Kontakte Prof. KP Steel, MRC Institute of Hearing Research, University Park, Nottingham NG7 2RD. 11.Yon règ.12.Yon tib plèksiglas klè 30 cm ak yon dyamèt entèn 2.5 cm pou reflèks redresman kontak la.4.5 Elektwofizyoloji Preparasyon pou tranch serebeleyaj egi yo te prepare tranch parasagittal bèl ki gen 300 μm epesè nan serebele sourit eksperimantal ak kontwòl littermate. pa swiv metòd pibliye (Hansen et al., 2013). An brèf, serebella yo te byen vit retire epi plonje nan yon solisyon ekstraselilè frèt ak konpozisyon (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 glikoz, 2.5 KCl, 2.5 CaCla, 1.3 MgCla, ak 1 NaHzPOa, pH 7.4 lè gaze ak 5 pousan CO-/95 pousan O2. Serebella yo te seksyon parasagittally lè l sèvi avèk yon vibratome (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Almay) ak okòmansman enkubasyon nan 35 degre pou {-30 minit, ak Lè sa a, ekilibre ak estoke nan tanperati chanm jiskaske yo itilize. Ekstraselilè Elektwofizyoloji Anrejistreman ekstraselilè ak entraselilè yo te jwenn nan newòn Purkinje (PNs) nan tranch ki toujou ap perfuze ak yon solisyon ekstraselilè ki bouyi ak kabojèn epi yo kenbe nan swa 37 degre C (eksterelilè) oswa 32 degre (entraselilè) ± 1 degre (gade pi wo a). Selil yo te vizyalize ak optik DIC ak yon objektif dlo-immersion 40 × (NA 0.75) lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Zeiss Examiner. Pipèt vè ki gen ~ 3 MQ rezistans (Modèl P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) yo te ranpli ak solisyon ekstraselilè epi yo te pozisyone tou pre PN axon ti mòn yo nan lòd yo mezire aksyon potansyèl-asosye transient aktyèl kapasitif nan mòd vòltaj-klanp. ak potansyèl la pipèt ki te kenbe nan 0 mV. Pou anrejistreman patch-clamp tout selil yo, pipèt yo te ranpli ak yon solisyon entraselilè (mM): 140 mwa (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0.2 CaClz, 10 HEPES, 14 Phosphocreatine (sèl tris), 1 EGTA, 4 Mg. -ATP,0.4 Na-GTP.100 μM Picrotoxin (Sigma) te ajoute pou bloke entrées sinaptik inhibitory GABAegeric. Done yo te akeri lè l sèvi avèk

yon anplifikatè MultiClamp 700B nan 20 oswa 100 kHz nan mòd vòltaj oswa aktyèl-klanp, Digidata 1440 ak pClamp10(Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ak filtre nan 2 a 4 kHz. Rezistans seri a te anjeneral ant 10 ak 15 MQ. Rezistans seri yo te konpanse nan 80 pousan pou eksperyans plastik kout tèm sèlman. Pou anrejistreman ekstraselilè, yo te anrejistre yon total de 20 a 45 PN pou chak bèt atravè tout jenotip, sèks, ak gwoup laj. Anrejistreman yo te distribye atravè aks medyal-lateral ak rostrocaud serebellum la. Se sèlman selil ki gen yon aparans "sante" (kontrè ki ba nan fwontyè selilè) ak regilye, san enteripsyon pousantaj tire yo te egzamine. Pandan analiz, yo te jwenn kèk selil ki gen twou vid ki genyen nan tire a ki pi gran pase 2 segonn, epi selil sa yo te elimine nan analiz la, paske se kalite sa a tire ki asosye ak yo te "malsen." Doub tisi mutan pa t 'ka diferan nan aparans anba mikwoskospi DIC anvan anrejistreman, ni kantite selil "malsen" pa t pi gran pase lòt jenotip (7 pousan kont 4 a 11 pousan nan tout selil atravè jenotip kontwòl nan P400). Konparezon espasyal nan aktivite neral yo te jwenn nan anrejistreman nan seksyon seri nan flocculus, lateral (2 "d oswa 3'), entèmedyè (6" oswa 7yèm), ak medyal (11" oswa 12t) tranch. Yo te itilize tranch nimewo ki pi ba yo nan gwoup laj ki pi piti yo (P45 ak 110) pou apeprè matche ak pozisyon relatif anrejistreman yo atravè gwoup laj yo. 0-3 Anrejistreman yo te fè nan chak lobule ki nan chak tranch depann sou kalite tisi ak sante. Chak anrejistreman te dire pou {{29} Yo te itilize 3 a 5 sourit pou chak gwoup laj, epi eksperimantè a te avèg pou jenotip, laj, ak sèks.

Anrejistreman intraselilè yo te jwenn nan PN yo nan swa lobule IIl oswa VIl nan serebelo medyal la (sa vle di, vermis); pa gen okenn diferans estatistik nan pwopriyete yo te obsève ant lobule yo.

Analiz

Yo te detekte ak analize entèval potansyèl aksyon espontane yo lè l sèvi avèk woutin estanda ak koutim nan ClampFit (Aparèy Molekilè), GoPro (Wavemetrics), ak Excel (Microsoft). Espesyalman, potansyèl aksyon yo te detekte papòt, ak estatistik spiking (sa vle di, frekans ak longè entèval) yo te detèmine ak adaptedlgorProroutines (TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/). Koefisyan varyasyon entèval entè-spike mwayèn (CV) ak entèval entè-spike medyàn (CV2=2 ISIn plis 1-ISInl/(ISIn plis 1 plis ISIn)) yo te kalkile nan Excel lè l sèvi avèk makro koutim. Pwopriyete manbràn estanda yo te analize lè l sèvi avèk lgorPro. Yo te detèmine RM lè w fè yon mwayèn 3 repons tras vòltaj nan yon batman -5 mV etap ki soti nan yon-80 mV kenbe potansyèl ak mezire defleksyon aktyèl la ki kapab lakòz ant 900 ak 1000 ms apre kòmansman an. Konstan tan manbràn lan te mezire pa mete yon sèl eksponansyèl nan faz dezentegrasyon inisyal la soti nan 90 pousan a 10 pousan nan pik la. Yo te kalkile CM nan divize konstan tan manbràn la pa RM.sEPSC evènman yo te anrejistre sou yon epòk 1-minit epi yo te detekte ak mezire lè l sèvi avèk Neuroexpress (v21.1.13). Axons paralèl ak k ap grenpe fib yo te ankouraje lè l sèvi avèk elektwòd theta-glass (WPI) ak yon izolatè estimilis TTL-kontwole (ISO-Flex, AMPI). Anplitid EPSC evoke ak konstan tan pouri (1 eksp. pou paralèl ak 2 eksp. pou fib k ap grenpe) yo te analize lè l sèvi avèk woutin koutim nan lgorPro. Potansyèl aksyon yo te egzamine kòm yon pati nan yon seri piki aktyèl 1 s ant -500 ak 2250 pA (250 pA etap) ak yon kouran kenbe ajiste pou kenbe yon potansyèl ~ 70 mV. Yo te mezire fòm ond potansyèl aksyon lè l sèvi avèk koutim

woutin nan lgorPro. Aksyon potansyèl papòt te defini kòm premye vòltaj manbràn nan ki premye dérivés depase 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6 Egzamen Atrofi serebeleux

Gwosè serebeleuz Imedyatman apre yo fin retire sèvo a nan zo bwa tèt la, yo te jwenn yon imaj dorsal, tout mòn. Lè sa a, imaj yo te trete lè l sèvi avèk Fidji (NIH). Gwosè serebeleux ak sèvo an te evalye lè yo dekri espas 2-dimansyon yo epi apre yo te kalkile zòn nan. Nou nòmalize pou diferans posib nan gwosè sèvo an jeneral lè nou divize rezilta serebelo a pa gwosè forèb pou pwodui yon rapò relatif serebelo-a-sèvo. Eksperyans yo te avèg nan jenotip bèt la. Imunoistochimi Nan pwen final etid yo (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0), sourit gason ak fi nan tout jenotip. reprezante nan etid sa a te anestezi ak isoflurane ak sibi perfusion transkad ak fosfat-tanpon saline ki te swiv pa 4 pousan (w/v) tanpon paraformaldehyde (PFA) ak Lè sa a, diseke ekstrè sèvo a. Imaj tout sèvo a te pran imedyatman apre yo fin retire sèvo a nan zo bwa tèt la epi sèvo yo te submerged nan 4 pousan PFA pou 24 èdtan, ak Lè sa a, cryoprotected nan Tris-tampon saline (TBS) ak 0.05 pousan azid ak 30 pousan sikwoz pou 72. èdtan epi estoke nan 4 degre jiskaske plis itilize. Serebelo a te separe de sèvo an ak seksyon parasagittal lè l sèvi avèk yon mikrotom glisman （Microm HM 430, Thermo Scientific） mete nan seksyon nan 40 μm epesè. Seksyon cerebellum yo te kolekte nan yon seri de sis epi estoke nan TBS-AF (TBS ak 30 pousan sikwoz, 0.05 pousan azid sodyòm, ak 30 pousan ethylene glycol) nan 4 degre oswa -20 degre jiskaske plis itilize. Pou vizyalizasyon imunofluoresan newòn Purkinje, seksyon serebellè tou de Atm*; Aptx*t ak Atm?35×R35×; Aptx ^ (n=5 pou chak jenotip) yo te lave pandan 5 minit nan TBS twa fwa epi yo te bloke nan 15 pousan serom kabrit nòmal nan tanperati chanm pou 30 minit ki te swiv pa enkubasyon k ap flote gratis nan lapen oswa sourit anti-kalbindin D. -28k (1:1000) pou 1 èdtan nan tanperati chanm sou yon shaker òbital. Lè sa a, seksyon yo te lave pou 5 minit ak TBS twa fwa, ki te swiv pa enkubasyon k ap flote gratis nan kabrit anti-lapen oswa sourit Alexa Fluor 488 (1:1000) pou 1 èdtan nan fè nwa a nan tanperati chanm sou yon shaker òbital. Apre enkubasyon segondè antikò, seksyon yo te lave pou 5 min nan TBS twa fwa, Lè sa a, monte ak kouvri-glise ak Fluoromount-G ak DAPI. Pou kèk seksyon, antikò Caspase -3(1:200) ak anti-CD68 (1:400) te anplis sonde an paralèl ak Calbindin lè l sèvi avèk yon Alexa Fluor 647 (1:500) antikò segondè. Yo te analize glisad yo lè l sèvi avèk Stereo Investigator (MBF Bioscience, ver.2020) sou yon mikwoskòp Zeiss ekipe ak yon ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) lè l sèvi avèk swa yon objektif 2.5, 10,20,40, oswa 63x, ak imaj. te kaptire ak yon kamera Hamamatsu CMOS (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plis). Pou mezire kantite selil kalbindin-reyaktif nan chak lobule nan imaj ki lakòz yo, nou te itilize Stereo Investigator pou trase owaza 2 liy ant 300 a 500 μm nan longè. chak lobule ak manyèlman konte kantite total PNs sou longè a nan 40 um epesè nan tisi a tranch anba 40x agrandisman. mwayèn pou plis konparezon ant lobule ak bèt. Calbindin pozitif PN lajè dendrite yo te mezire nan yon kote predefini nan lobule VI soti nan chak bèt nan 25 oswa 40 um seksyon tisi epè anba 20x agrandisman. Lajè dendritik branch prensipal ak segondè yo te mezire nan liy mitan ant kò selil PN yo ak kwen kouch molekilè a. Ant 7 ak 13 dendrite yo te mezire pou chak seksyon, yon seksyon pou chak bèt. Pou mezi somatik PN yo, yo te itilize Stereo Investigator pou chwazi PN yo owaza distribye nan tout seksyon medyal la anba agrandisman 20x. Lajè PN an mwayèn pou chak bèt te detèmine pa rezilta mwayèn atravè 3 seksyon seri (16 a 37 PNs pou chak seksyon). PN lajè yo te mezire pèpandikilè ak kouch PN a oswa nan dendrite a sòti si askew pa plis pase kèk degre. Kouch molekilè ak kouch selil granules (vizyalize ak tach Calbindin ak DAPI, respektivman) yo te evalye lajè nan Stereo Investigator lè yo fè yon mwayèn de mezi lajè nan kote predefini pou chak lobule, apeprè mwatye ansanm ak limit la long nan chak lobule anba agrandisman 2.5x. CD68 pozitivite nan seksyon serebeleux yo te mezire lè w mezire zòn pousantaj total CD68 plis tach pozitif atravè tout seksyon serebelelèr medyal la. 10x imaj koud yo te limite nan kontwòl negatif la ak quantifye lè l sèvi avèk ImageJ, yon seksyon pou chak bèt. Pou mezire pousantaj PN ki pozitif pou Calbindin ki te pozitif pou Caspase clivé-3 nou te konte PN nan tout serebelo a lè l sèvi avèk Stereo Investigator. Twa, 20x agrandisman imaj koud pou chak bèt yo te egzamine ak rezilta yo te mwayèn. Papòt la pou Caspase-3 pozitivite te etabli nan seksyon kontwòl tache ak sèlman antikò segondè yo. Pou analiz istolojik ki pa fliyoresan, 25-um-epè, seksyon tisi k ap flote gratis sou glisad ki chaje pozitivman ak lè seche lannwit lan. Tisi a te lave nan saline ki gen fosfat-tanpon (PBS) de fwa pou 5 minit, Lè sa a, tache sekans ak 0.1 pousan Hematoxylin nan 95 pousan etanòl pou ~ 25s ak 0.5 pousan Eosin nan 95 pousan etanòl pou ~ 3s epi lave nan dlo doub-distile apre. chak tach. Apre sa, tisi a te dezidrate pou 1 minit nan 95 pousan etanòl, 100 pousan etanòl, ak 100 pousan Xylene lave, Lè sa a, coverslipped ak Permount. Yo te imajine glisad yo lè l sèvi avèk yon kamera koulè (Q Imaging, MBF Biosciences) sou menm mikwoskòp Zeiss ak lojisyèl akizisyon MBF. Eksperyans yo te avèg sou jenotip sourit kote yo te egzamine seksyon yo, epi yo te entèle lòd egzamen an pou tout mezi istolojik.

4.7 Mezi Sitometri Flux

Analiz sikometri koule nan san ak timis selil yo te fèt pa tach ak antikò espesifik anti-sourit∶CD4, CD8, CD3, CD44, ak CD25. Yon ti tan, echantiyon san antye (50 μ) yo te tache lè l sèvi avèk antikò ki gen etikèt fliyoresan, Lè sa a, globil wouj yo te lysed lè l sèvi avèk BD lysing solisyon pandan y ap globil blan vivan yo te tache lè l sèvi avèk yon tach viabilite. Thymi te mekanikman disosye. 1 a 2 milyon selil timis yo te tache menm jan an lè l sèvi avèk antikò espesifik pou CD4, CD8, CD44, ak CD25. Analiz de globil blan imuno-tache oswa echantiyon timus yo te fèt lè l sèvi avèk FACS ARIA l ak done yo te analize lè l sèvi avèk lojisyèl FlowJo jan yo te rapòte deja (Sanghez et al. 2017).

4.8 Western BIots

Ekstrè pwoteyin (selil/tisi) yo te omojènize nan tanpon lysis assay radioimmunoprecipitation (RIPA) (150 mM NaCl, 1 pousan Nonidet P-40 [NP-40],0 .5 pousan deoxycholate, 0.1 pousan SDS, 50 mM Tris, pH 8.0) ak inibitè proteaz (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml leupeptin, 5 ug/ml pepstatin, 5 ug/ml chimotripsin, 10ug/ml aprotinin). Ekstrè pwoteyin yo te sonike ak Lè sa a, granules pa santrifujasyon nan 13, 000 rpm pou 15 min nan 4C. Yo te itilize tès pwoteyin BCA pou quantifier konsantrasyon pwoteyin. Echantiyon ki gen kantite egal pwoteyin 50 a 100 ug pou chak liy yo te separe lè l sèvi avèk 4 a 12 pousan gradyan TGX prefabrike jèl BioRad Lè sa a, transfere pa TransBlot Semi-Dry BioRad sistèm lè l sèvi avèk Nitrocellulose transfè pake. Tach transfere yo te tache pa tach Ponceau S pou chaje pwoteyin egal, Lè sa a, lave ak bloke ak 5 pousan lèt sèk san grès nan TBST pou 60 min nan tanperati chanm. Antikò prensipal yo te enkube ak souke lannwit lan nan 4 degre. Yo te sonde blots pou antikò sa yo: ATM (D2E2) siyal selil mAb lapen, nan dilusyon 1:1000, -Actin (D6A8) siyal selil mAb lapen, GAPDH (D16H11) siyal selil mAb lapen ki te swiv pa apwopriye peroksidaz refor (conjuga). HRP) segondè Anti-lapen, Anti-sourit pou 2 èdtan nan tanperati chanm. Apre plizyè lave ak TBST, ekspresyon Pwoteyin te detekte pa substra chemiluminescence Radiance Plus lè l sèvi avèk Azure c400 ak sistèm D 'BioRad ChemiDoc yo. Analiz densitometrik ATM a te fèt lè l sèvi avèk ImageJ. Eksperyans yo te fèt ak 2 kopi teknik ak 2-3 byolojik jan sa endike a.

4.9 Evalyasyon Estatistik

Kantite bèt yo te chwazi pou chak gwoup te baze sou analiz pouvwa a priori lè l sèvi avèk GPower v3.1 ki baze sou yon gwosè 0.5, pouvwa 0.8, ak gwosè efè yo te estime apati done preliminè. oswa etid anvan yo. Nou te itilize tou de parametrik (1-ak 2-fason ANOVA) pou metòd estatistik nòmalman distribye ak non-parametrik (Kruskal Wallace) pou done entèval pou teste diferans ki genyen ant gwoup ki te swiv pa tès konparezon miltip pa par jan sa endike nan tèks la. Outliers pou done iminitè nan Fig. 6 ak 7 yo te eskli atravè metòd ROUT (Q=2 pousan). Analiz espesifik yo itilize pou chak seri done yo note nan chak lejand figi.Pou tout figi: ns pa enpòtan,*p Mwens oswa egal a 0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">