Yon nouvo mitasyon omozigòt KLHL3 kòm yon kòz Pseudohypoaldosteronism Resessiv Tip II dyagnostike an reta nan lavi
Nov 02, 2023
Abstract Entwodiksyon:
Pseudohypoaldosteronism tip II (PHA II) se yon maladi Mendelian, ki gen asidoz ipèkalemik ak ba nivo renin plasma, anjeneral ki asosye ak tansyon wo. Mitasyon nan WNK1, WNK4, CUL3, ak KLHL3 lakòz PHA II, ak mitasyon dominan nan WNK1, WNK4, ak CUL3 ak swa mitasyon dominan oswa resesif nan KLHL3. Yo rapòte katòz fanmi ki gen mitasyon KLHL3 resesif, ak dyagnostik a laj de 3 mwa a 56 ane, tipikman nan moun ki gen fonksyon ren nòmal.
Metòd: Nou te fè envestigasyon klinik ak jenetik nan yon pasyan ki gen tansyon wo ipèkalemik epi nou itilize simulation dinamik molekilè, ekspresyon eterològ nan selil COS7, ak Western blotting pou mennen ankèt sou efè yon mitasyon maladi kandida KLHL3 sou ekspresyon pwoteyin WNK4.
KLIKE LA POU JWENN FORMULASYON ÈRBAL CISTANCHE POU REN
Rezilta: Pasyan an, yon fi 58-zan ki soti nan yon fanmi fanmi ki gen syans, te montre tansyon wo, asidoz hyperkalemic ki pèsistan ki asosye ak gwo doulè nan misk, nefrolitiaz, maladi ren kwonik (CKD), ak maladi kè kardyovaskulèr. Terapi ak hydrochlorothiazide korije hyperkalemia, tansyon wo, ak doulè nan misk. Analiz jenetik revele yon mitasyon homozygous p.Arg431Trp nan yon pozisyon KLHL3 trè konsève. Simulation sijere redwi estabilite nan pwoteyin mutan an, ki te konfime pa Western blot. Konpare ak kalite sovaj KLHL3, kotransfèksyon p.Arg- 431Trp KLHL3 te mennen nan ogmante nivo pwoteyin WNK4, ki lakòz ogmante reabsòpsyon NaCl atravè konpayi asirans lan thiazide-sansib ak PHA II.
Konklizyon: Menm nan pasyan ki prezante byen ta nan lavi a ak nan prezans CKD, PHA II ta dwe sispèk si nivo renin yo ba ak asidoz ipèkalemik ak tansyon wo pa apwopriye pou etap CKD a, patikilyèman nan prezans yon istwa fanmi sispèk.
Entwodiksyon
Tansyon wo sistemik atè afekte plis pase 1.1 milya adilt atravè lemond [1] epi li konsidere kòm faktè risk ki pi enpòtan pou modifye pou tout kòz morbidite ak mòtalite atravè lemond [2]. Apeprè 90% nan pasyan adilt yo gen sa yo rele tansyon wo prensipal oswa esansyèl ak etyoloji miltifaktoryèl jèn-anviwònman [2], tandiske yon kòz kache nan tansyon wo ka idantifye nan rès la. Kòz komen nan tansyon wo segondè yo se aldosteronism prensipal, apne dòmi obstriktif, maladi ren parenchymal, ak stenoz atè ren [3]. Nan ka ki ra, tansyon wo eritye kòm yon karakteristik mono-jenik. Pasyan ki afekte yo anjeneral prezante ak nivo renin plasma ki ba, tandiske nivo aldosteron ak elektwolit varye selon etyoloji ki kache [4]. Fòm Mendelian tansyon wo souvan manifeste nan anfans oswa jèn. Adilt yo raman envestige pou tansyon wo mono-jenik; konsa, prévalence li nan popilasyon jeneral la rete enkoni. Nan yon gwoup chwazi (kritè enklizyon omwen youn nan: laj nan kòmansman mwens pase oswa egal a 35 ane, tansyon wo rezistan, tansyon wo ak anomali elektwolit, anomali ormon, rezilta imaj nòmal, oswa siy klinik sigjesyon), 37 jèn kandida yo te teste, ak patojèn oswa ki gen anpil chans varyant patojèn yo te idantifye nan 33 nan 1,179 ka (2.8%) [5].
Etid sa a konsantre sou pseudohypoaldosteronism tip II (PHA II), yon fòm tansyon wo Mendelian ki prezante asidoz hyperkalemic ak nivo renin plasma ki ba [6]. PHA II yo konnen tou kòm tansyon wo familyal hyperkalemic. Li te premye dekri an 1964 pa Paver ak Pauline nan yon jèn gason ki gen tansyon wo grav ak ipèkalimi malgre otreman nòmal fonksyon ren [7] ki te plis karakterize pa Stokes ak kòlèg [8] ak Arnold ak Healy [9] epi yo montre yo gen ba. plasma renin. Swivan rapò yon ti fi 10-zan ki gen ti wo, tansyon wo, gwo ipèkasemi, ti asidemi, paralizi peryodik, ak siprime renin an 1970 pa Gordon et al. [10], sendwòm lan te tou detanzantan refere li kòm sendwòm Gordon a.
An 2001, yo te idantifye mitasyon nan jèn kinaz serin-treonin kinaz WNK1 ak WNK4 ki pa gen okenn lizin (WNK) kòm kòz PHA II [11], ak plis mitasyon nan KLHL3 (kodaj kelch-like 3) ak CUL3 (kodaj). cullin 3) jèn yo te dekri nan 2012 [12, 13]. Soufòm PHA II ki te koze pa mitasyon nan WNK1, WNK4, ak CUL3 yo se maladi otozomal-dominan, tandiske mitasyon KLHL3 yo ka eritye swa nan yon otozomal-dominan oswa nan yon mòd otozomal-resesif [12]. KLHL3 prezante yon domèn N-tèminal BTB, ki te swiv pa yon domèn BACK ak yon estrikti C-tèminal sis-lame -propeller ki fòme ak sa yo rele kelch-tankou repete (yo montre nan Fig. 1d, 2a). Mitasyon dominan KLHL3 gwoupe nan oswa ant lam elis, tandiske mitasyon resesif yo distribiye nan tout pwoteyin nan [12]. Ka resesif yo mwens komen pase ka dominan yo; an total, 21 pasyan ki soti nan 14 fanmi ki gen mitasyon KLHL3 resesif yo te pibliye [12-15] (Tablo 1).
Fizyoloji ki kache nan tansyon wo nan PHA II ogmante reabsòpsyon NaCl atravè transpòtè a thiazide-sansib (Na-Cl cotransporter, NCCT) nan tubul konvolutif distal nan ren an, ak terapi ak thiazides korije tou de tansyon wo ak anomali elektwolit nan pasyan ki gen PHA II. [16]. Nan ti bout tan, WNK1 ak WNK4 phosphorylate OSR1 (oksidatif estrès-reponn jèn 1) ak SPAK (Ste 20- ki gen rapò ak proline-alanine-rich kinase), ki Lè sa a, fosforilate ak aktive NCCT [17, 18]. KLHL3 se yon adaptè substra nan ubiquitin ligase CUL3; Konplèks KLHL3-CUL3 ubiquitinylate WNK kinaz e konsa ankouraje degradasyon yo [19]. Pèt nan fonksyon ubiquitin ligase oswa pwoblèm obligatwa nan WNK kinaz lakòz ogmante abondans WNK, ogmante fosforilasyon NCCT [18], ak ogmante absòpsyon NaCl nan tubul distal konvolute a. Nan segman pita nan nefwon an, reabsòpsyon NaCl atravè ENaC (kanal sodyòm epitelyal) ak sekresyon K + atravè ROMK (kanal potasyòm medulè ren) redwi [20, 21]. Sourit knockout KLHL3 yo montre ipoplasi nan tubul konvolutè distal la, nivo fòtman ogmante nan WNK1 ak WNK4, ak ogmante fosforilasyon OSR1, SPAK, ak NCC nan ren an. Pli lwen, yo montre hyperkalemia, hyperchloremia, ak asidoz metabolik [22]. Isit la, nou rapòte yon pasyan ki gen PHA II otozomal-resesif epi karakterize mitasyon jenetik ak fizyoloji ki kache.
Materyèl ak Metòd
Preparasyon ADN ak Sanger Sekans ADN te prepare apati yon echantiyon san venn periferik lè l sèvi avèk QIAamp DNA Blood Maxi Kit (Qiagen) dapre enstriksyon manifakti a. Yo te fè PCR estanda ak sekans dirèk Bidirectionnelle Sanger nan ADN jenomik lè l sèvi avèk primè pibliye pou KLHL3 [13], WNK1, ak WNK4 [11], ak CUL3_9F (5′-AGGAGACACTTTCTCAAAACCG-3′) ak CUL3_9R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3′) primè pou CUL3. Sekans Sanger te fèt nan Eurofins Genomics.
Sekans aliyman
Yo te idantifye sekans pwoteyin omològ lè l sèvi avèk NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ak baz done eggNOG (http://eggnogdb.embl.de). Sekans yo montre yo enkli KLHL3 imen ak ortholog li yo: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP{_001349344.2), Gallus gallus (XP{_015149442.1), Danio rerio. (XP_021328460.1), Ciona intestinalis (XP{_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP{_724095.1), ak Caenorhabditis elegans (NP{{_001254310.1) . Paralog imen yo te idantifye pa rechèch literati epi yo enkli KLHL1 a KLHL42 jan yo montre nan Tablo 1 siplemantè sou entènèt (pou tout materyèl sou entènèt suppl., gade www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. Sekans yo te aliyen lè l sèvi avèk Jalview vèsyon 2.10.5 [24]. Estrikti domèn te soti nan UniProt (Q9UH77, jwenn aksè nan 13 avril 2021) epi li te vizyalize lè l sèvi avèk DOG [25].
Plasmid ak mutagenèz ki dirije sou sit
Plasmid pTRE2hyg WNK4 ak pFN21A KLHL3 yo te kado kalite doktè Shinichi Uchida (Tokyo Medical and Dental University). Pou prezante mitasyon p.R431W la, yo te fèt primè lè l sèvi avèk Primer X (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACACCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10} }F) ak 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). Résidus mutan yo montre an fonse. Yo te fè mutagenezis ki dirije sou sit la lè l sèvi avèk Twous Mutajèn ki Dirije Sit QuikChange a ak yon ADN Polymerase PfuUltra High-Fidelity (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) dapre enstriksyon manifakti a. cDNA a te sekans Sanger nan Eurofins Genomics. Plasmid yo te prepare lè l sèvi avèk QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit la.
Kilti Tisi, Transfèksyon Transitwa, ak Western Blot
Selil COS7 yo te kiltive nan DMEM + L-glutamin, 10% FBS, ak 1% penisilin/streptomycin (tout Gibco, Thermo Fisher). Pou transfèksyon, selil yo te simen sou 6-plak byen nan yon dansite 1.9 × 105 selil/pi epi yo te grandi nan apeprè 90% dansite. Selil yo te transfekte ak 1 µg pTRE2hyg WNK4 ak 2 µg pFN21A (vektè vid oswa KLHL3 kalite sovaj [WT]) oswa KLHL3 R431W cDNA lè l sèvi avèk Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) dapre enstriksyon manifakti a. Yo te itilize de klon endepandan chak pou transfèksyon. Karant-uit èdtan apre transfeksyon, selil yo te lave nan PBS frèt ak lysed nan 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, ak 1% NP40 ki gen konplè Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Merck). Lisat la te santrifuje nan 20,000 g pou 30 min nan 4 degre, epi supernatant la te estoke nan -20 degre. Konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine nan kopi (estanda) oswa triple (echantiyon) pa tès BCA (Pierce, Thermo Fisher) dapre enstriksyon manifakti a. Apeprè 20 µg pwoteyin total te fractionné pa SDSPAGE epi transfere nan yon manbràn PVDF (1.5 h, 100 V). Manbràn yo te bloke nan 2% lèt sèk nan TBST. Western blot te fèt lè l sèvi avèk lapen poliklonal anti-HaloTag (Promega #G9281, 1:500, 4 degre lannwit lan), ki te swiv pa lave ak enkubasyon ak bourik IgG anti-lapen IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46 }}, dianova, 1:20,000, 1 h nan tanperati chanm), lave, ak deteksyon kimiluminesan amelyore (Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare). Yo te retire tach lè l sèvi avèk ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth), yo te bloke nan 2% lèt sèk nan TBST lannwit lan nan 4 degre, epi yo te enkube ak sourit monoklonal anti-FLAG M2 (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1, {{69} }, 1.5 èdtan nan tanperati chanm), ki te swiv pa bourik IgG anti-sourit IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 1 èdtan nan chanm tanperati), deteksyon ECL, nidite, ak bloke jan pi wo a. Lè sa a, tach yo te enkube ak monoklonal sourit anti- -aktin (Sigma-Aldrich # A2228, Merck, 1:5,000, 1 èdtan nan tanperati chanm) ak bourik IgG anti-sourit IgG, ankò ki te swiv pa deteksyon ECL. Gwoup yo te mezire lè l sèvi avèk Lojisyèl Laboratwa Imaj la sou yon ChemiDoc XRS + (Bio-Rad). Entansite bann detekte pa antikò anti-HaloTag ak antikò anti-FLAG M2, respektivman, te divize pa entansite korespondan nan bann detekte pa antikò aktin anti- -. Pou evalye nivo ekspresyon KLHL3, selil yo te transfekte jan sa endike anwo a, sepandan, lè l sèvi avèk 0 µg, 0.5 µg, 1 µg, 2 µg, 4 µg, ak 8 µg pFN21A KLHL3 WT oswa R431W. Elektwoforèz jèl ak blotting yo te fè tankou pi wo a. Pou tès cycloheximide chase, selil yo te simen tankou pi wo a epi transfekte kòm pi wo a sepandan ak 2 µg pFN21A KLHL3 WT oswa 4 µg KLHL3 R431W. Karant-uit èdtan apre transfeksyon, yo te ajoute 100 µM cycloheximide, epi selil yo te lysed apre pwen tan ki endike yo. Plis etap analiz yo te tankou pi wo a.
Fig. 2. Simulation MD nan domèn WT ak p.Arg431Trp (R431W) KLHL3 Kelch. yon gade anwo-desann nan domèn Kelch (PDBID: 4CH9), ki gen koulè pal pa -propeller lam (K1–K6). Sit mitasyon an endike pa yon etwal jòn, ak rejyon an nan enterè gen koulè gri (résid 425-465), ak peptide WNK4 la (ki pa enkli nan simulation yo) se transparan ak koulè gri. b Diferans nan MSF yo nan domèn Kelch ki trase sou zo rèl pwoteyin nan. Sit mitasyon an endike pa yon etwal jòn. Koulè wouj la endike pati ki pi dinamik (mwens ki estab) nan pwoteyin lan. c RMSD tout pwoteyin (anwo), résidus 425–465 (mitwayen), ak WNK4-poch obligatwa (anba) ki soti nan estrikti kristal la pou twa kopi simulation endepandan (liy fonse, mwayèn kouri). d Violon simityè hbonds (gòch) ak distans COM (midwayen) ant K3 (résidus 425–441) ak K4 (442–465) -lam elis ak elektwostatik obligatwa-pòch (adwat). e Superpozisyon estriktirèl nan koòdone K3–K4 a soti nan ankadreman final la (1.1 μs) nan chak kopi (WT, ble; R431W, gri) ak modèl yo eksperimantal/inisyal (nwa). Se zo rèl do pwoteyin ki parèt kòm yon desen, ak rezidi 431 parèt kòm baton. MSF la vle di fluctuation kare.
Simulation dinamik molekilè
Modèl WT la te baze sou estrikti kristal X-ray (PDBID: 4CH9) nan domèn Kelch imen an konplèks ak fragman peptide WNK4 [26]. Yo te ajoute atòm ki manke yo ak bouchon tèminal lè l sèvi avèk sèvis piblik psfgen nan vèsyon vizyèl dinamik molekilè 1.9.3 [27]. Modèl mutant (R431W) KLHL3 la te pwodwi lè l sèvi avèk Modeller vèsyon 9.18 [28]. Ranje rezidi final la pou chak sistèm te 300–585. N- ak C-tèmin nan modèl WT ak R431W yo te netralize pa asetilasyon ak N-methylamidation, respektivman. Eta protonasyon default yo te asiyen nan chak rezidi tittab dapre analiz ak PROPKA vèsyon 3.0 [29]. Peptid WNK4 te retire nan simulation pwodiksyon akòz disosyasyon nan KLHL3 apre premye simulation ekilib.
Tout simulation yo te fèt ak pakè lojisyèl GROMACS vèsyon 2021 [30]. CHARMM36m fòs-field paramèt yo te itilize pou atòm pwoteyin [31]. Iyon yo te dekri lè l sèvi avèk paramèt CHARMM default, epi yo te itilize modèl TIP3P pou dlo [32]. Yo te itilize yon etap tan entegrasyon 1 fs pou etap ekilib inisyal la, ak 2 fs yo te itilize pou tout simulation ki vin apre yo. Tout lyezon ki enplike idwojèn yo te contrainte lè l sèvi avèk LINCS [33]. Entèraksyon Van der Waals ki pa lye yo te kalkile lè l sèvi avèk potansyèl Lennard-Jones ak yon reyon koupe 1.2 nm; fòs yo te etenn san pwoblèm nan ranje 1.2-1.0 nm. Tout elektwostatik yo te kalkile lè l sèvi avèk metòd Ewald [34] lis patikil-may ak yon distans koupe espas reyèl nan 1.2 nm. Apre yon premye simulation nan ansanbl izokorik-izotèmal (NVT), tout simulation ki vin apre yo te fèt nan ansanbl izobarik-izotèmal (NPT) nan yon tanperati 310.15 K lè l sèvi avèk thermostat a vitès [35] ak yon konstan tan nan 0.5 ps. Yo te aplike tèmostat la separeman nan pwoteyin ak sòlvan (sa vle di, dlo ak iyon); menm gwoup yo te itilize pou retire mouvman sant-of-mass (COM). Yo te enpoze yon presyon 1 bar lè l sèvi avèk swa yon barostat Berendsen [36] oswa Parrinello-Rahman [37] nan yon fason izotwòp ak yon konstan tan 5 ps.
Modèl WT ak R431W yo te solvated nan yon bwat kib ak premye dimansyon 1.2 × 1.2 × 1.2 nm3. Chak sistèm te netralize ak 150 mM NaCl. Apre yon premye minimize enèji ki pi apik-desandan, yo te ekilibre chak sistèm nan ansanbl NVT pou 5 ns ak restriksyon pozisyon sou tout atòm pwoteyin. Yon etap ekilib ki vin apre yo te fèt nan ansanbl NPT la pou 5 ns ak restriksyon yo menm jan ak nan etap anvan an. Yo te retire kontrent pozisyon yo nan tout chenn bò pou simulation final 5-ns ekilib. Twa premye estrikti yo te pwodwi nan etap final la nan ekilibasyon pou simulation pwodiksyon endepandan nan sistèm WT ak R431W ak tout kontrent pozisyon yo retire. Chak replike pwodiksyon te simulation pou 1.1 µs; premye 0.1 µs yo te retire nan analiz.
Pou evalye estabilite estriktirèl la pandan simulasyon yo, yo te kalkile devyasyon kare mwayen rasin (RMSDs) ki soti nan estrikti kristal la pou atòm C nan pwoteyin tout antye, osi byen ke koòdone K3-K4 (résid 425-465) ak WNK4- pòch obligatwa (résid 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528, ak 577). Mwayèn kouri nan tras RMSD yo te kalkile ak kouvri ak done yo anvan tout koreksyon.
Efè mitasyon an sou estabilite estriktirèl yo te vizyalize nan kalkile diferans ki genyen nan fluctuations kare mwayèn nan atòm pwoteyin C yo, mwayèn sou ankadreman ak kopi ak kat nan estrikti nan pwoteyin WT. Tout vizyalizasyon pwoteyin yo te pwodwi lè l sèvi avèk ChimeraX [38]. Efè mitasyon R431W la sou koòdone K3 (rès 425-441) ak K4 (rès 442-465) karakterize pa analiz kosyon idwojèn (H-kosyon) ak distans COM ant de gwoup yo. H-bond yo te evalye nan chak ankadreman lè l sèvi avèk zouti GROMACS gmx hbond, ak distans ak ang koupe nan 3.5 Å ak 30 degre, respektivman. Distans COM yo te evalye menm jan an nan chak ankadreman - distribisyon tou de Hbonds yo ak distans COM yo te vizyalize kòm trase violon. Mwayèn yo te kalkile sou trajectoire ak kopi.
Elektwostatik nan pòch WNK4-obligatwa a te kalkile lè l sèvi avèk g_elpot [39]. Kou tan nan potansyèl elektwostatik la nan pòch obligatwa a te evalye pa defini yon volim esferik ak yon reyon 8 Å, santre nan sant jeyometrik nan rezidi yo ki gen ladan pòch la obligatwa. Pou evalye divèjans nan elektwostatik yo, yo te kalkile 50-ns mwayèn blòk. Distribisyon potansyèl elektwostatik nan pòch obligatwa pou mutan WT ak R431W yo te parèt sou fòm violon, ak mwayèn yo kalkile sou 50-ns blòk ak trajectoire.
Sèvis sipò Wecistanche-Pi gwo ekspòtatè cistanche nan Lachin nan:
Imèl:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Achte pou plis detay espesifikasyon:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
