Yon nouvo preparasyon albumin serom imen S-sulfhydrated siprime sentèz Melanin

Kontakte:jaslyn.ji@wecistanche.com

Albumin serik imen (HSA) se pwoteyin ki pi abondan nan serom epi li lajman itilize kòm yon konpayi asirans dwòg paske nan byokonpatibilite li yo ak pwopriyete retansyon plasma long [14,15]. HSA gen yon total de 35 résidus Cys ak youn nan yo, Cys34, prezan nan fòm lan nan yon gwoup thiol gratis [16]. Cys34 se pafwa yon sib pou yon sit obligatwa dwòg, paske nan gwoup thiol reyaktif li yo [17,18]. Pou egzanp, nan prezans oksid nitrique (NO) gwoup la Cys34 thiol se S-nitrosated. Nou te deja demontre ke S-nitrosated HSA (SNO-HSA) pèmèt yo kenbe NO pou yon tan long nan serik [19]. SNO-HSA gen plizyè fonksyon byolojik, tankou yon efè pwoteksyon fwa kont iskemi/repèfizyon [20] ak efè siprime timè [21].

Kontinwe, nou te sipoze ke HSA ta ka itilize kòm yon konpayi asirans RSS (tankou SNO-HSA) atravè S-sulfhydration nan Cys34-SH. Kòm yon sous polysulfur, DATS ak DMTS limite akòz lipofilisite yo ak volatilité. Pakonsekan, Na2Sn ki disponib nan komèsyal (Na2S, Na2S2, Na2S3 ak Na2S4) te itilize nan etid sa a. Ogasawara et al. Albumin serik souf ki te prepare deja te reyaji ak sulfid sodyòm (NaHS) pa yon senp melanje reyaktif yo [22]. Souf ki soti nan NaHS te ajoute nan Cys34 ak preparasyon ki kapab lakòz pwoteje domaj nan fwa ki te koze pa oksijene lipid. Nou te adopte metòd sa a pou prepare RSS-ajoute-HSA lè l sèvi avèk Na2Sn pou livrezon RSS.

Nan travay sa a, nou rapòte preparasyon HSA trete Na2Sn ak itilizasyon li kòm yon sistèm livrezon nouvo RSS. Te ajoute souf la analize pa mwayen yon sond souf sulfan [23] ak eliminasyon nan sulfid nan polisulfid [24]. Pou evalye efè HSA trete Na2Sn sou blanchiman po, yo te etidye efè HSA trete Na2Sn sou sentèz melanin lè l sèvi avèk yon liy selil B16 melanom.

2. Materyèl ak metòd

2.1. Materyèl

Albumin serom imen (HSA) te achte nan men KAKETSUKEN (Kumamoto, Japon) ak tout echantiyon HSA yo te degras pa yon tretman chabon. Ilfid sodyòm ak tetrasulfid sodyòm yo te achte nan laboratwa DOJINDO (Kumamoto, Japon). Sulfane souf pwofonde 4 (SSP4) te prepare jan sa dekri deja [23]. L-DOPA, glutathione, (DTNB), asid ascorbic ak sodyòm satirik reyaktif Griess (sulfanilamid, naphthylethylenediamine-HCl) yo te achte nan men Nakarai Chemicals (Kyoto, Japon). Sephadex G-25 kolòn desaling (φ 1.6 × 2.5 cm) te achte nan men GE Healthcare (Kyoto, Japon). Mwayen Eagle modifye Dulbecco a (DMEM) ak 2,2-diphenyl-1-pi-crylhydrazyl (DPPH) yo te jwenn nan Wako Pure Chemical (Osaka, Japon). Tirozinaz djondjon te achte nan men Sigma-Aldrich. Tout lòt pwodui chimik yo te nan pi bon klas ki te disponib nan komès, epi tout solisyon yo te prepare nan dlo deyonize ak distile.

extrait cistanche

2.2. Test pwoteyin BCA

Konsantrasyon pwoteyin yo te mezire lè l sèvi avèk yon tès pwoteyin BCA. 10 μL aliquot nan echantiyon ak estanda albumin serom bovin (BSA) yo te enkube nan 100 μL nan tanpon reyaksyon nan 25 degre pou 30 min. Apre reyaksyon an, yo te itilize lektè mikwo-plak pou mezire absorbans 540 nm. BSA te itilize pou konstwi yon koub estanda.

2.3. Sentèz Na2Sn trete-HSA

HSA (300 μM) te enkube ak 1 mM polisulfid sodyòm (Na2Sn) nan PBS (pH 7.4) pou 1 èdtan nan 37 degre. Apre reyaksyon an, depase polisulfid sodyòm yo te retire pa filtraj jèl ak yon kolòn Sephadex G-25.

2.4. Detèminasyon pousantaj obligatwa souf pa metòd eliminasyon pou sulfid nan polisulfid (EMSP)

EMSP te prepare jan sa dekri deja (3 × EMSP pa adisyon nan 792 mg nan L-ascorbic asid nan 5 mL nan 3 N nan NaOH) [24]. Echantiyon (7.5 μM, 133 μL) yo te enkube ak 66.7 μL nan 3 × EMSP pou 3 èdtan nan 37 degre. Lè sa a, yo te ajoute yon solisyon acetate zenk 1 pousan (600 μL) nan solisyon reyaksyon an, ki te swiv pa vortexing imedyatman. Echantiyon yo te santrifuje nan 8, 000 × g pou 5 min epi lave ak saline tampon fosfat (PBS) de fwa. Apre yo fin retire supernatant yo, dlo deyonize ak distile (200 μL) te ajoute nan presipite yo. Apre ajoute 1 pousan acetate zenk (300 μL), 50 μL nan 20 mM N,N-dimethyl-p-phenylenediamine ak 20 mM FeCl3 nan 7.2 N HCl, solisyon an te enkube pou 30 min nan 25 degre. Echantiyon yo te santrifuje nan 8000 × g pou 1 min epi transfere nan 96- plak byen ak OD a nan 665 nm mezire. Na2S te itilize pou konstwi yon koub estanda.

2.5. Deteksyon souf sulfan ak SSP4

Chak echantiyon (20 μM) te enkube ak 5 μM nan SSP4 nan 1 mM Cetyltrimethylammonium Bromide / PBS (pH 7.4) pou 10 min nan 25 degre. Apre enkubasyon, fluoresans la mezire pa yon espektrofotomètr (JASCO Corporation) ak eksitasyon nan 457nm, emisyon nan 490-535 nm.

2.6. Tès radikal DPPH

DPPH (250 μM) nan etanòl te melanje ak menm kantite tanpon MES (50 mM, pH 7.4). Na2Sn-trete HSA (40 μM) te ajoute nan solisyon DPPH sa a, ki te Lè sa a, enkube pou 30 min nan 25 degre ak absòbe nan radikal DPPH yo te mezire nan 540nm. Pousantaj radikal scavenged yo te konvèti lè l sèvi avèk fòmil sa a;

Radikal scavenged (pousan)=(Abssample-Abspbs)/ Abspbs × 100

2.7. NON ak SNO analiz

HSA trete Na2Sn (50 μM) te enkube ak yon donatè NO, NOC7 (200 μM), pou 30 min nan 25 degre. Apre reyaksyon an, yo te mezire konsantrasyon NO ak SNO pa yon esè Griess ak modifikasyon minè [25]. Solisyon reyaktif Griess la te prepare lè w melanje 0.1 pousan N-1- Naphtylethylene-diamid dihydrochloride ak 1 pousan sulfanilamid nan 2 pousan asid fosfò. Tanpon reyaksyon an te konpoze de 0.1 M NaCl, 0.5 mM DTPA ak 10 mM AcONa・AcOH (pH 5.5). Echantiyon (20 μM) te reyaji ak solisyon an reyaktif Griess (60 μL) nan tanpon reyaksyon (110 μL) ak 3 mM HgCl2 nan 10 mM Na Acetate (pH 5.5). Apre yon enkubasyon 15 min, yo te mezire absorbans 540 nm pa mwayen yon lektè microplate. Yo te kalkile rès rapò NO/SNO (pousan) epi konpare ak valè PBS pou echantiyon yo.

2.8. Kilti selilè

Selil melanom B16 yo te bay Japan Cancer Research Resources Bank (JCRB, Tokyo, Japon), epi yo te kiltive nan DMEM ki gen 10 pousan serom fetis ak yon solisyon antibyotik. Selil yo te grandi ak kenbe nan 37 degre nan lè imidite ki gen 5 pousan CO2 nan enkibatè (nimewo pasaj 10-20).

2.9. Pwodiksyon Melanin

Selil melanom B16 yo te simen nan 24 plak byen nan yon konsantrasyon 2.5 × 104 selil / pi epi kiltive anba 5 pousan CO2 nan 37 degre pou 24 èdtan. Echantiyon yo te trete ak 0.4mM tirozin ak 10mM NH4Cl nan DMEM ki gen 10 pousan FBS ak Lè sa a, enkube anba 5 pousan CO2 nan 37 degre pou 72 èdtan. Apre enkubasyon an, selil yo te lave de fwa ak PBS epi yo fonn nan 1 N NaOH (200 μL). Apre yon enkubasyon 2 èdtan sou 60 degre, absòpsyon (405 nm) te mezire pa mwayen yon lektè mikwo-plak.

Cistanche inibit pwodiksyon melanin.

2.10. Radyasyon UV

Yo te itilize yon lanp UV men ki te kenbe pou iradyasyon echantiyon yo nan yon distans 5 cm distans soti nan plak la byen. Lanp UV sa a bay yon entansite UV 614 oswa 743 μW/cm2 respektivman ak radyasyon 254 nm oswa 365 nm nan yon distans 5 cm.

2.11. Aktivite dechaj Na2S4-trete HSA kont ROS intraselilè, NO, RSS

ROS ak NO nan selil melanom B16 yo te mezire pa chak nan sond fliyoresan yo, CM-H2DCF-DA ak DAF-FM-DA, respektivman. Selil melanom B16 yo te simen nan 96-plak byen nan yon konsantrasyon 1 × 104 selil/pi epi yo te kiltive nan 37 degre, 5 pousan CO2 pou 24 èdtan. Apre kiltive, yo te retire medya yo epi ranplase ak CM-H2DCF-DA (5 μM) oswa DAF-FM-DA (10 μM) nan PBS. Sond yo te pran nan selil yo pa enkubasyon yo nan 37 degre pou 30 min. Apre reyaksyon an, yo te retire supernatant yo, echantiyon yo te dilye nan PBS epi yo te mezire fluoresans la imedyatman. Selil yo te gaye pa yon lanp UV pou 15 minit. Apre iradyasyon an, yo te mezire entansite fliyoresans (Egz. 485 nm, Em. 535 nm) pa mwayen yon lektè mikwo-plak fliyoresan.

2.12. Aktivite tirozinaz djondjon ak agrégation melanin

Solisyon Tyrosinase ak L-DOPA yo te prepare nan PBS (pH 7.4) imedyatman anvan tès la. Tyrosinase, izole nan dyondyon, te itilize pou egzamine aktivite inhibition HSA Na2Sn trete. Yon pòsyon 20 μL nan tirozinaz djondjon (537 U / mL) ak 100 μL nan Na2Sn-trete HSA (40 μM) te byen melanje ak PBS (60 μL) nan 96 plak byen ak 20 μL nan L-DOPA (5 mM) te. Lè sa a, ajoute. Apre yon enkubasyon 30 min, yo te analize nivo melanin sentèz la lè yo mezire OD 490 nm la. Pou analize agrégation melanin, yo te santrifuje melanj lan nan 20, 000 g, 15 min pou 3 èdtan. Flèch blan an montre materyèl total la. Melanin ki pa agrégées nan supernatant a te mezire nan yon OD de 490 nm.

2.13. Tès sekirite

Krèm aktualite yo itilize nan etid sa a te prepare nan melanje dlo (30 ml) lwil Jojoba (15 ml) ak 5 g sir emulsifyan nan 60 degre. Apre refwadisman, Na2S 4-trete HSA a (20 μM) ak sispansyon ki lakòz yo te byen melanje. Yo te fè tès iritasyon po a swivan OECD Egzamen Gid 439 lè l sèvi avèk LabCyte Epi-Model (yon modèl po moun kiltive 3D).

2.14. Analiz estatistik

Siyifikasyon estatistik done yo kolekte te evalye pa analiz ANOVA ki te swiv pa metòd Newman-Keuls pou plis pase 2 vle di. Diferans ki genyen ant gwoup yo te evalye pa T-tès Elèv la. P < 0.05="" te="" konsidere="" kòm="" estatistik="">

3. Rezilta yo

3.1. Preparasyon HSA S-sulfydrated

Na2Sn-trete HSA te prepare nan HSA ki te enkube ak Na2Sn ak sibi filtraj jèl apre reyaksyon an. Pou evalye kantite silfan souf nan echantiyon an, EMSP, yon nouvo metòd quantitative nou te deja devlope, te anplwaye [24]. Kidonk, HSA trete Na2S4- te prepare apati HSA ak Na2Sn lè yo pèmèt re-agents yo reyaji pou 1 èdtan nan 37 degre. Yo te pèmèt diferan kantite polisulfid sodyòm reyaji ak HSA. Lè sa a, echantiyon HSA yo te enkube ak solisyon EMSP, ki te prepare nan moman yo itilize, pou 3 èdtan nan 37 degre. Ki baze sou analiz EMSP yo, nivo S-sulfydration ogmante poukont kantite souf (figi 1A). Nan lòt men an, jan yo montre nan Fig. 1B, Na2S3- oswa Na2S4-tretman an amelyore entansite fliyoresan SSP4 (yon sond fliyoresan pou souf souf) konpare ak Na2S- oswa Na2S{{24. }} tretman, sijere ke SSP4 pètèt reyaji ak polysulfide nan pwoteyin nan yon fason ki pa lineyè (Fig. 1B).

3.2. Antioksidan ak NO efè suppressive nan Na2S-trete HSA

Nou postule ke HSA trete Na2Sn ta siprime pwodiksyon melanin akòz aktivite antioksidan li yo. Pakonsekan, yo te fè yon tès radikal DPPH [26,27] pou analize aktivite antioksidan an vitro. Kòm yon rezilta, Na2Sn-trete HSA a te gen yon siyifikativman pi wo konsantrasyon nan ajoute souf (Fig. 2A). Pou elicide efè NO, NOC7 (yon donatè NO) te ko-enkube ak Na2S4-trete HSA a 25 degre. Apre yon peryòd enkubasyon 30 minit, yo te quantitative konsantrasyon NO ki rete a pa yon esè Griess. Jan yo wè nan ba yo fèmen nan Fig. 2B, Na2S 4-trete HSA a siyifikativman plis NO konpare ak kontwòl la ak HSA (Fig. 2B). Yo konnen mèki elemantè (Hg) diminye SNO ak lage NO2-. Lè Hg te ajoute nan yon solisyon Na2S4-trete HSA, NO2- te lage, sa ki sijere ke Na2S4- HSA trete a te scavened atravè S-nitrosation.

3.3. Melanin siprime efè HSA trete Na2Sn

B16 sourit melanom selil yo te kiltive ak sentèz melanin te ankouraje lè yo ajoute tirozin nan medya yo. Jan yo montre nan Fig. 3, HSA a Na2Sn-trete inibit sentèz melanin ak anpèchman an te depann sou kontni an souf. Imaj selil B16 selil melanom apre aplikasyon HSA trete Na2Sn te demontre tou ke HSA trete Na2Sn diminye rapò pwodiksyon melanin.selil pozitif (figi 3).

3.4. Efè antioksidan Na2S4-trete HSA ak iradyasyon UV

Pou egzamine si HSA trete Na2Sn te siprime fòmasyon UV-induit ROS oswa NO, yo te fè yon tès estrès oksidatif lè l sèvi avèk selil B16 melanom kòm modèl. Pwodiksyon ROS pa Na2S4-trete HSA nan selil melanom B16 pa iradyasyon ak 2 aparèy UV diferan pou 15 minit pa CMH2-DCF-DA. Konklizyon yo endike ke Na2S 4-trete HSA a te lakòz yon diminisyon enpòtan nan fliyoresans CMH{2-DCF-DA nan PBS ak HSA pa iradyasyon nan 254 nm ak 365 nm (Fig. 4AB). Okontrè, Na2S4-trete HSA a tou siprime pwodiksyon NO nan selil melanom B16 pa iradyasyon ak UV 254 nm (Fig. 4CD). Rezilta sa yo endike ke HSA trete Na2Sn siprime sentèz melanin pa anpeche ROS ak NO ki te pwodwi pa iradyasyon UV.

3.5. Suppression dirèk nan tirozinaz ak melanin agrégation pa Na2Sn-trete HSA

Gen kèk ajan komèsyal anti-melanin yo konnen dirèkteman anpeche aktivite tirozinaz. Kidonk, nou teste si HSA trete Na2Sn te chanje aktivite tirozinaz la. Konklizyon yo te endike ke HSA a Na2Sn-trete inibit tirozinaz djondjon nan yon pi gwo limit pase HSA ki pa trete (Fig. 5A). Apre yo te pwodwi, melanin fasilman sibi agregasyon ak pwovoke fòmasyon medul [28]. Se poutèt sa, nou pwochen adrese pwoblèm nan si wi ou non Na2Sn-trete HSA inibit agrégation nan melanin. Kontinwe, lè tyrosinase ak L-DOPA yo te enkube ansanm pou 3 èdtan, pigman melanin te vin rasanble, men HSA a Na2Sn-trete anpeche aggregasyon an (Fig. 5B). Sou yon bò, yo te jwenn HSA tou pou anpeche agrégation, ki endike ke HSA tèt li ta ka anpeche obligatwa L-DOPA a tirozinaz.

3.6. Tès sekirite nan HSA trete Na2Sn lè l sèvi avèk po moun kiltive 3D

Tès iritasyon po pou HSA trete Na2S4-yo te fè lè l sèvi avèk selil po moun kiltive 3D dapre direktiv OECD. Kòm yon rezilta, kantite selil ki siviv yo pa t diminye lè HSA trete Na2S4-ak oswa san yo pa itilize yon krèm aktualite (Fig. 6A). Itilizasyon yon twous deteksyon sitotoksisite LDH te revele tou ke selil po yo pa te domaje pa HSA trete Na2S 4-(figi 6B). Done sa yo endike ke HSA trete Na2Sn trè an sekirite pou itilize kont po moun anba konsantrasyon yo egzamine nan etid sa a.

4. Diskisyon

Melanin se sentèz pa oksidasyon nan tirozin. Tirozin se soksid nan L-DOPA, ak Lè sa a, dopaquinone pa aksyon an nan tirozinaz. Dopaquinone se espontaneman soksid nan melanin. Melanin pwovoke fòmasyon nan pigman nwa ak freckles, men tou, jwe yon wòl nan pwoteje po a soti nan domaje nan radyasyon UV. Nan po moun, melanosit pwodui ROS ak NO lè yo ankouraje pa radyasyon UV [2,29,30]. ROS ankouraje sentèz melanin lè li aktive tirozinaz atravè aksyon ATP synthase, phenylalanine hydroxylase, ak fosforilasyon MAPKs [31,32]. NO aktive tirozinaz atravè ogmante nivo selilè cGMP [6]. Se poutèt sa, ROS ak NO scavengers yo konsidere kòm ajan anti-melanogenesis. Isit la, nou te envestige efè sentèz anti-melanin HSA trete Na2Sn. Na2Sn-trete HSA fòtman siprime nivo selilè ROS ak NO ki te pwodwi pa radyasyon UV (figi 4). Anplis de sa, Na2Sn-trete HSA te gen yon efè dirèk sou anpeche aksyon an nan tirozinaz (Fig. 5A) ak agrégation nan melanin (Fig. 5B). Nou pa t 'kapab klarifye mekanis pou kijan souf silfan te transfere soti nan HSA trete Na2Sn nan yon selil. Se poutèt sa, nati a nan fason efè dirèk nan Na2Sn-trete HSA fonksyon rete klè. Yamashita et al. te demontre ke dopaquinone mare nan pwoteyin thiol atravè rezidi sistein [33]. Ansanm, anpèchman melanin agrégation pa HSA ak Na2Sn-trete HSA ka enplike tou fòmasyon lyezon disulfid ak dopaquinone oswa melanin. Nan lòt men an, anpèchman tirozinaz te depann sou kontni an nan ajoute souf (figi 5A). GSH se li te ye pou mare tirozinaz ak diminye aktivite li [34]. Paske sistein S-sulfhydrated gen yon reyaksyon pi fò pase sistein nòmal [11], glutathione persulfide (GSSH) ka anpeche aksyon tirozinaz la plis pase GSH. Plis etid konsènan pwoblèm nan si wi ou non HSA Na2Sn-trete ogmante entraselilè GSSH nesesè nan lavni an.

ROS yo pwodui pa iradyasyon UV oswa estrès ekstèn pwovoke siy aje, pa sèlman nan fòm lan nan sentèz melanin, men tou pa aparans nan ondilasyon ak po afesman, ki te koze pa domaj ADN ak fòmasyon nan kolagen an kwa. Li konnen tou ke ROS yo se yon faktè agrave nan divès kalite enflamasyon tankou bouton ak psoriasis. Divès ajan blanchiman po, tankou asid tranexamic [35] ak arbutin [36], yo te fèt pou adrese pwoblèm sa yo. Sepandan, konpoze sa yo sèlman anpeche sentèz melanin epi yo pa gen okenn efè sou estrès oksidatif. Kidonk, risk ki genyen nan toksisite ROS-induit rete. Yon avantaj lè w sèvi ak Na2Sn-trete HSA se ke li efikasman scavenges ROS (figi. 2 ak 4).

Ilfid idwojèn te etidye kòm yon twazyèm molekil esansyèl apre oksid nitrique ak monoksid kabòn. Yo montre efè ki ka geri sulfid idwojèn yo aplikab pou tretman iskemi/repèfizyon [37], ateroskleroz [38], sepsis [39] ak toksisite ki gen anpil grès nan rejim alimantè [40]. Anplis de sa, idropersulfid gen yon aktivite ki pi wo pase sulfid idwojèn. Pou egzanp, Na2S4 efektivman dezentoksike mèki methyl ak inibit diferansyasyon nan selil neuroblastom, pandan y ap Na2S pa fè sa [12,41]. Se poutèt sa, pa sèlman yon efè blanchiman po, men tou lòt efè pozitif nan Na2Sn-trete HSA yo posib.

An konklizyon, nou te rapòte sou devlopman yon nouvo sistèm livrezon RSS lè l sèvi avèk albumin serom kòm yon konpayi asirans ki estab. Souf reyaktif, lè yo konbine avèk HSA, te gen yon efè antioksidan pi fò pase HSA ak inibit sentèz melanin nan selil melanom. Mekanis nan anti-melanogenesis enplike pa sèlman ROS ak NO scavenging, men tou, repwesyon nan aktivite tirozinaz ak agrégation melanin. Pakonsekan, HSA trete Na2Sn gen potansyèl konsiderab pou itilize kòm yon ajan blanchiman po san danje.

Sa a se pwodwi nou an.

Pou plis enfòmasyon, tanpri klike sou foto a.