Evalyasyon Aktivite Antimelanogenic ak Mekanis Galangin nan Silico ak nan Vivo

Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

Ki Wung Chung, yon Hyeong Oh Jeong, yon Eun Kyeong Lee, yon Su Jeong Kim, yon Pusoon Chun, bHae Young Chung,*, yon ak Hyung Ryong Moon*, yon

Pigmantèr nòmal akòz sentèz melanin twòp ka lakòz pwoblèm grav tankou freckles, tach laj, ak melanom. Inibitè tirozinaz yo te yon sib enteresan pou tretman ipèpigmantasyon paske tirozinaz se anzim ki limite pousantaj nan sentèz melanin. Depistaj pou inibitè tirozinaz fò te mennen nan jwenn flavonoid lagalanin, ki te montre remakab efè inhibition sou tirozinaz djondjon. Valè IC50 galanin (3.55±0.39 µM) te pi ba pase asid kojik (48.55±1.79 µM), ki te itilize kòm yon kontwòl pozitif. Nan silico docking simulation ak etid mekanistik demontre ke galanin te kominike avèk sit katalitik tirozinaz ak konpetisyon ak tirozin. Nan selil B16F10 melanom yo ankouraje ak òmòn -melanocyte-stimulan, galanin inibit aktivite tirozinaz ak pwodiksyon melanin. Malgre ke gwo dòzgalaninyo te sitotoksik, pa gen okenn efè sitotoksik yo te obsève nan dòz ki ba. Anplis de sa, yo te evalye efikasite nan galanin nan HRM2 melanin ki posede sourit san cheve. Kòm mezire pa endèks la blanchi po ak tach melanin, repete UVB ekspoze ogmante sentèz melanin po. Aplikasyon Galangin siyifikativman redwi melanogenesis pwovoke pa ekspoze UVB. Ansanm, done nou yo endike sagalaninmontre gwo aktivite anpèchman tirozinaz, ki sijere ke li ka yon ajan efikas po-blanchiman.

Mo klegalanin; melanogenesis; pigmantasyon; tirozinaz

extrait cistanche

Galangin, yon konpoze flavonoid, yo jwenn nan gwo konsantrasyon nan Alpinia officinarum ak Helichrysum) Etid anvan yo te montre ke galangin gen divès aktivite famasi, pwoteje plant kont radyasyon UV, patojèn, ak èbivò, epi li fè aktivite anti-bakteri ak antiviral.2– 4) Sepandan, li tou gen pwopriyete antioksidan, ki se atribiye a efè benefisye li yo.5) Galangin tou egzèse efè anti-kanse atravè anpèchman kwasans lan nan selil kansè yo.6,7)

Melanin se yon pigman byolojik yo jwenn nan pifò òganis yo. Nan byoloji po, melanin pwodui pa oksidasyon tirozin asid amine. Nan fizyoloji nòmal, melanin anpeche blesi sou po atravè absòpsyon radyasyon UV danjere.8) Melanin nan sentèz nan melanosit po distribiye nan keratinosit, kote li prensipalman patisipe nan pwoteksyon kont irradiation UV danjere.8) Sepandan, malgre sèten avantaj, melanin twòp. kapab lakòz tou pwoblèm estetik ak maladi po.9) Pigmantèr nòmal, tankou freckles, tach laj, melasma, ak lentigins senil, lakòz pwoblèm grav nan fizyoloji po nòmal.10,11) Se poutèt sa, modulation nan melanogenesis se yon estrateji enpòtan pou tretman an nan pigmantasyon twòp po.Yon kantite anzim patisipe nan pwosesis yo nan melanogenesis. Pami divès kalite anzim sa yo, tyrosinase, ki katalize pwosesis oksidasyon L-tirozin nan 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ak L-DOPA nan dopaquinone, se pi enpòtan an.12) Pwosesis sa yo medyatè pa tirozinaz yo se pwosesis limite pousantaj. Anba kondisyon nòmal, yo te detekte ipèaktivasyon tirozinaz ak pwodiksyon total melanin ogmante.13) Akòz wòl kle li nan melanogenesis, tirozinaz se yon sib atire pou yon ajan depigman.14) Kidonk, divès kalite inibitè tirozinaz soti nan tou de natirèlman ak sentetik. sous yo te devlope. Anpil inibitè tirozinaz, ki gen ladan hydroxyquinone, asid kojik, ak arbutin, te deja itilize nan endistri medikaman ak kosmetik. Malgre ke plizyè inibitè tirozinaz yo te devlope komèsyalman, efè segondè cytotoxik yo te vin aparan.12) Se poutèt sa, efikas ak san danje ajan blanchi po yo bezwen.

Objektif etid sa a se te karakterize galangin kòm yon inibitè tirozinaz ki pisan lè l sèvi avèk divès metòd eksperimantal. Pandan rechèch la pou inibitè tirozinaz ki soti nan sous natirèl, nou te jwenn ke galangin siyifikativman redwi aktivite tirozinaz ak gwo puisans. Paske efè inhibition galanin sou tirozinaz yo te deja rapòte, nou konsantre sou mekanis inhibition yo ak puisans nan eksperyans selil ak bèt. pwisan ajan blanchiman po pou tretman pigmantasyon po.

Benefis sante cistanche tubolosa:po-blanchiman

MATERYÈL AK METÒD

Materyèl

Galangin, kojic asid, djondjon tirozinaz, L-tirosin, -melanocyte-stimulating òmòn (-MSH), ak lòt reyaktif chimik yo te achte nan men Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).

Mezi Efè Inibisyon Tirozinaz ak Mekanis Inibisyon nan yon Sistèm San Selil

Pou evalye efikasite inhibition ak mekanis galangin sou tirozinaz, yo te itilize tirosinaz djondjon jan sa dekri deja. Yon ti tan, yo te fonn 1000 inite tirozinaz djondjon nan 20 µL saline ki gen tanpon fosfat (PBS) epi yo te ajoute nan 170 µL melanj tès la, ki te genyen 1 mM L-tirozin, 50 mM tanpon fosfat (pH 6.5), ak 10 µL. materyèl tès la. Te melanj lan enkube nan tanperati chanm (25 degre) pou 30 minit. Kantite dopachrome pwodwi yo te mezire espektrofotometrik nan 492 nm (OD492) nan yon lektè microplate. IC50 la te kalkile apati repetisyon eksperyans lan nan diferan dòz galangin. Pou detèmine mekanis inhibition galanin, yo te fè yon tès sinetik tirozinaz. Divès konsantrasyon L-tirozin (1, 2, 4, ak 8 mM) yo te itilize pou tès anpèchman an. Apre egzamen an, yo te konvèti chak valè nan resipwòk li yo dapre simit Lineweaver-Burk. Rezilta yo te montre trase 1/V kont 1/[S]. Yo te itilize entèseksyon chak konplo pou detèmine mekanis inhibition.

Docking Simulation

Pou simulation an silico pwoteyin-ligand debakadè, nou itilize AutoDock4.2. Siksè obligatwa yo te jwenn ant pwoteyin nan ak ligand la. Estrikti ki genyen twa dimansyon (3D) nan tirozinaz yo itilize nan estrikti kristal la te soti nan Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X) epi yo te itilize yon sit obligatwa predefini nan tirozin kòm pòch la debakadè. / asid kojik. Konpoze yo te prepare pou simulation debakadè pa etap sa yo: (1) estrikti 2D yo te konvèti nan estrikti 3D; (2) yo te kalkile chaj, epi (3) atòm idwojèn yo te ajoute lè l sèvi avèk pwogram ChemOffice. LigandScout 3 te kalkile prediksyon posib rezidi lyezon idwojèn ant konpoze yo ak tirozinaz ak jenerasyon farmakofò yo.0.

Sistèm Kilti Selil

Selil B16F10 melanom murin yo te jwenn nan Koleksyon Kilti Kalite Ameriken an (Rockville, MD, USA) te premye itilize pou evalye efè galanin sou anpèchman tirozinaz. Selil yo te kiltive nan mwayen Eagle modifye Dulbecco a (DMEM; WELGENE Inc., Kore di, LM001-05) siplemantè ak 10 pousan serom fetal bovine (FBS; WELGENE Inc., S101-01) ak penisilin/streptomycin. (100 IU/50 µg/mL; WELGENE Inc., LS202-02) a 37 degre nan yon atmosfè imidite ki gen 5 pousan CO2 nan lè a. Pou evalye efè galangin sou viabilite selil yo, yo te fè yon tès viabilite selil lè l sèvi avèk yon twous ki disponib nan komès (EZ-1000, Dogen Bio, Kore). Yon ti tan, selil yo te kiltive nan 96-plak byen epi yo te trete ak diferan konsantrasyon nan galangin. Apre tan ki endike a, yo te li absòbe a nan 450 nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate. Tout eksperyans selil yo te fèt omwen twa fwa pou asire repwodibilite.

Aktivite tirozinaz

Aktivite tirozinaz nan selil B16F10 yo te egzamine atravè mezi pousantaj oksidasyon L-DOPA. Selil yo te plake nan asyèt 60π-byen, enkubate nan prezans oswa absans 1 µM -MSH, ak Lè sa a, trete pou 24 èdtan ak 5 ak 10 µM galangin. Tretman ak asid kojik te itilize kòm yon kontwòl pozitif. Selil yo te lysed nan 500 µL nan 50 mM tanpon fosfat sodyòm (pH 6.8) ki gen 25 µL 1 pousan Triton X-100 ak 25 µL 0.1 mM fliyò phenylmethylsulfonyl ak Lè sa a, jele nan -80 degre pou 30 min. Apre dekonjle ak melanje, lisat selilè yo te klarifye pa santrifugasyon nan 12000 × g pou 30 min nan 4 degre. Supernatant yo (80 µL) yo te mete nan yon plak 96-byen, 20 µL L-DOPA (2 mg/mL) te ajoute, epi yo te li absorbans la nan 492 nm chak 10 min pou 1 èdtan nan 37 degre lè l sèvi avèk yon lektè plak.

Ekstrè Cistanche: anpeche ekspresyon tirozinaz

Melanin kontni

Nan etid aktyèl la, kontni melanin yo te itilize kòm yon endèks melanogenesis. Yon ti tan, selil B16 yo te plake nan yon plat 60π ak enkubasyon nan prezans oswa absans 1 µM -MSH. Lè sa a, selil yo te enkube pou 24 èdtan avèk oswa san galangin nan 5 ak 10 µM. Tretman an ak asid kojik te itilize kòm yon kontwòl pozitif. Apre de lave ak PBS, echantiyon yo te fonn nan 500 µL 1 NNaOH, enkubate nan 60 degre pou 1 èdtan, epi melanje yo solubilize melanin la. Yo te mezire absorbans nan 405 nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate.

Eksperyans In Vivo

Efikasite depigmantasyon nan vivo nan galangin te evalye nan eksperyans bèt. Etid yo sou bèt yo te fèt pa Bank Tisi Aging, apwouve pa Komite Enstitisyonèl Swen Animal nan Pusan ​​National University, ak fèt an akò ak direktiv yo pou eksperimantasyon bèt pibliye pa Pusan ​​National University. Sis semèn gason HRM2 ki genyen melanin sourit san cheve yo te jwenn nan Hoshino Laboratory Animals (Yoshino, Saitama, Japon) ak loje nan kondisyon kontwole (23±1 degre, 55 pousan ±5 pousan imidite, 12-h limyè). / sik nwa) ak aksè gratis nan dlo ak yon rejim laboratwa estanda. Apre yon peryòd aklimatasyon 1 semèn, sourit yo te owaza divize an kat gwoup sis bèt. Galangin (10 µM) ak asid kojik (50 µM) te prepare nan yon solisyon ki fòme ak pwopilèn glikol ak etanòl (3: 7). Solisyon ki fonn (200 µL) oswa machin te aplike topikman sou po dorsal bèt la yon fwa pa jou. Bèt yo te iradyasyon pa UVB nan yon CROSSLINKER (BEX-800, Ultra-Lum Inc., CA, USA) nan 50 mJ / cm2 an akò ak orè a eksperimantal bèt. Koulè sit po yo te mezire lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt CR-10 (Konica Minolta Sensing, Inc., Sakai, Osaka, Japon) kote yo te dekri koulè yo pa valè L*, a*, ak b* yo. an akò ak sistèm koulè Commission International de L'Eclairage. Apre bèt yo te sakrifye, po yo te ranmase, yo te fikse nan 4 pousan paraformaldehyde lannwit lan nan tanperati chanm, epi tache pou melanin lè l sèvi avèk yon twous tach Fontana-Masson ki soti nan American Master*Tech Scientific, Inc. (Lodi, CA, USA) nan. dapre enstriksyon manifakti a. Yon ti tan, po tranch yo te tache ak yon solisyon ajan amonyakal pou 60 min nan 60 degre, enkubasyon nan 0.1 pousan klori lò, ak Lè sa a, nan 5 pousan thiosulfate sodyòm.

Analiz estatistik

Yo te itilize tès t Elèv la pou analize diferans ki genyen ant de gwoup yo epi yo te itilize ANOVA pou analize diferans ant gwoup yo. Valè p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" analysis="" was="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 5="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">

cistanche tubolosa

REZILTA

Nan Silico Docking Simulation nan Galangin sou Tyrosinase

Galangin se yon fitochimik ki fèt natirèlman epi li gen yon pati flavonoid nan estrikti li yo (figi 1). Okòmansman, yo te fè yon simulation debakadè ant tirozinaz djondjon (estrikti siperyè) ak konpoze (galangin, asid kojik, ak tirozin). Sit debakadè kote galangin ak asid kojik yo te mare te deja detèmine kòm sit la aktif nan tirosinaz.15) Simulation sa a te reyisi epi yo te reyalize yon nòt enpòtan. Enèji obligatwa ant galangin ak tirozinaz te -7.67 kcal / mol, jan yo detèmine pa analiz lè l sèvi avèk Autodock4.2. Enèji obligatwa ant tirozinaz ak asid kojik (kontwòl pozitif la) te -4.09 kcal / mol, ak -5.13 kcal / mol ant tirozinaz ak substrate orijinal la, tirozin (Tablo 1). Rezilta sa yo te montre ke galangin te mare tyrosinase ak yon afinite ki pi wo pase lòt entèraksyon yo. Dapre rezilta simulation debakadè yo, nou te chèche entèraksyon ant tirozinaz ak konpoze lè l sèvi avèk pwogram LigandScout la. Nou te jwenn ke galangin te kominike avèk ASN-260, VAL-283, ALA-286, ak PHE-292, tandiske asid kojik te kominike sèlman ak ASN-260 ak MET280 ( Fig. 2, Tablo 1). Se poutèt sa entèraksyon sa yo ka detèminan kle nan aktivite inibitè epi yo gen yon efè enpòtan sou nòt debakadè.

Detèminasyon nan efè anti-melanogenic ak mekanis nan Tyrosinase djondjon

Baze sou rezilta nan silicolè ak lòt rezilta deja rapòte, nou evalye efè antimelanogenic ak mekanis lè l sèvi avèk tirozinaz djondjon. Lè yo teste ak tirosinaz djondjon nan sistèm selil gratis, efikasite inhibition galangin te pi fò pase asid kojik (figi 3A). Anplis de sa, galangin dòz-depandan diminye aktivite tirozinaz (figi 3B). Valè IC50 galangin ak asid kojik yo te kalkile epi yo prezante nan Tablo 2. Valè IC50 ki ba galangin (3.55±0.39 µM) te endike ke puisans la te siyifikativman pi wo pase sa kojic. asid (48.55±1.79 µM). Mekanis inhibition galangin te evalye plis lè l sèvi avèk simit Lineweaver-Burk doub-resipwòk. Divès konsantrasyon L-tirozin (1, 2, 4, ak 8 mM) ak galangin (0, 7.5, ak 15 µM) yo te itilize pou tès anpèchman an. Chanjman ki depann de tan nan absorpsyon yo te mezire ak rezilta doub-resipwòk yo te trase (figi 3C). Rezilta yo te endike ke trase 1/V kont 1/[S] te pwodui twa liy diferan ak pant diferan, ki te kwaze sou menm aks vètikal la. Kòm konsantrasyon nan konpoze an ogmante, valè a nan Km ogmante, men valè Vmax yo rete menm jan an, ki sijere ke galangin te yon inibitè konpetitif nan obligatwa nan tirozinaz. Done sa yo te dakò ak rezilta in silico ke galangin te mare ak inibit sit aktif tirozinaz la.

Fig. 1. Estrikti Galangin, Asid Kojik, ak Tirozin

Evalye Aktivite Depigmantasyon Galangin nan B16F10 Selil Melanom Murin

Apre sa, yo te evalye aktivite depigmantasyon galangin lè l sèvi avèk selil melanom murin B16F10. Premyèman, yo te teste efè sitotoksik galangin sou selil melanom murin B16F10. Jan yo montre nan Fig. 4A, galangin siyifikativman diminye viabilite selil yo nan dòz ki pi wo a 25 µM. Se poutèt sa, pou evite sitotoksisite, nou te itilize 5 µM ak 10 µM galangin nan eksperyans yo pou evalye efè antimelanogenic yo. Selil B16F10 yo te trete ak galangin nan prezans 1 µM -MSH. Sentèz melanin total ki te koze pa tretman -MSH te vizib nan je a toutouni epi li te montre ke galangin pisan anpeche -MSH-deklanche sentèz melanin (figi 4B). -MSH tretman siyifikativman ogmante aktivite tirozinaz ak kontni an melanin nan selil B16F10 (figi 4C, D). Tretman Galangin inibit melanogenesis selilè, ki te ogmante pa -MSH nan yon fason ki depann de dòz (figi 4C, D). Ansanm, rezilta sa yo endike ke galangin ta ka yon ajan ki pisan pou repwesyon melanogenesis atravè anpèchman tirozinaz.

Tablo 1. Nòt Docking ak prensipal rezidi entèaktif konpoze yo

Efè Galangin sou Pigmantasyon Po in Vivo

Efè inhibition galangin yo te imedyatman egzamine nan sourit san cheve ki genyen melanin ki te trete jan sa dekri nan orè a nan Figi 5A. Koulè sit po yo te mezire avèk presizyon lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt. Ekspozisyon UVB nan sourit mennen nan yon diminisyon nan valè a L *, ki te reprezantan pigmantèr (figi 5B). Diminisyon UVB-pwovoke nan valè L * yo te siyifikativman bloke nan bèt galanin-trete an konparezon ak sa ki nan bèt yo kontwòl trete ak machin, ki te demontre efikasite nan depigmenting ki pisan nan galanin (figi 5B). Valè ΔL* te endike tou puisans galangin pandan peryòd eksperimantal yo (figi 5C). Anplis de sa, koulè po yo detekte pa je a toutouni nan jou 14 tou endike pisans nan antimelanogenic nan galangin (figi 5D). Fontana-Mas son tach, ki mete aksan sou melanin, verifye efè galangin. Echantiyon po bèt UVB yo te demontre ogmante tach melanin (figi 5E). An akò ak done nimerik ki soti nan spèktrofotometri, bèt galanin-trete te montre yon diminisyon nan tach melanin yo tache an konparezon ak bèt kontwòl UVB-iradyasyon yo (Fig. 5E). Ansanm, done sa yo sijere sagalaninse te yon ajan anjyojenik tan efikas nan modèl melanogenesis in vivo UVB-induit.

Fig. 2. Rezilta simulation an Silico Docking ant Tyrosinase ak konpoze kandida yo

DISKISYON

Li te deja rapòte ke galangin egzèse divès efè byolojik, ki gen ladan cytoprotection. Malgre ke aktivite anti-tyrosinase nan galangin te deja etidye, mekanis yo ak efikasite egzat nan sistèm kilti selil yo pa te konplètman dekri.1,16) Se poutèt sa, nou vize eksplore puisans ak mekanis inhibition nan galangin. Efikasite inhibitor galangin te okòmansman evalye lè l sèvi avèk simulation debakadè silico. Simulation debakadè yo te revele ke obligatwa nan galangin nan sit la aktif nan tirozinaz te pi estab pase sa yo ki nan substrate orijinal la (tirosin) oswa asid kojik (kontwòl pozitif). Efikasite ak mekanis yo te konfime tou lè l sèvi avèk tirozinaz djondjon. Finalman, yo te evalye efikasite inhibition galangin kont melanogenesis nan selil melanom murin B16F10 ki ankouraje -MSH. An rezime, etid prezan an te idantifye galanin kòm yon ajan ki pisan.

Simulation debakadè enfòmatik yo te etabli kòm yon zouti pwisan nan ekran ak evalye nouvo ajan famasi.17) Rezilta simulation debakadè bay non sèlman sit yo obligatwa, men tou, afinite a obligatwa ant konpoze an ak anzim la, ki bay premye enfòmasyon san yo pa bezwen fizik. experiments.18) Malgre ke prediksyon yo pa toujou egzat epi mande pou plis eksperyans, simulation debakadè a diminye materyèl yo ak resous ki nesesè yo epi tou li ka sipòte done yo eksperimantal byolojik. Simulation docking enfòmatik nou an te endike ke galangin ta ka mare plis fòtman nan tirozinaz pase tirozin oswa asid kojik. Anplis de sa, kantite résidus kominike ant galangin ak tirozinaz te pi gwo an konparezon ak tirozin oswa asid kojik. Done premye debakadè yo te verifye plis lè l sèvi avèk yon tès anzim tirozinaz, ki te montre ke IC50 nan galangin te pi ba pase asid kojik; konsa, efè inhibition galangin sou tirozinaz te pi pisan pase asid kojik.

Mekanis inhibition galangin sou tirozinaz te plis egzamine lè l sèvi avèk tirozinaz djondjon. Paske done simulation debakadè yo sigjere ke galangin mare nan menm sit aktif ke tirozinaz mare, li te antisipe ke galangin ka yon inibitè konpetitif nan tirozinaz. Rezilta eksperimantal yo te revele ke galangin a konpetitif inibi tirosinaz soti nan obligatwa substrate orijinal li, tirozin, ki konfime rezilta yo simulation debakadè. Ansanm, rezilta yo demontre fyab nan simulation debakadè enfòmatik la ak potansyèl li pou tès depistaj inhibiteurs.

Efikasite galangin te evalye tou nan selil melanom murin B16F10. Galangin te montre efè sitotoksik enpòtan nan selil B16F10 lè yo te administre nan yon gwo dòz. Sa a te konsistan avèk rapò anvan yo nan aktivite antikansè galangin nan plizyè liy selil kansè.19,20) Akòz efè sitotoksik, eksperyans yo pou verifye efè anti melanogenic selil yo te mande pou seleksyon ak anpil atansyon nan kondisyon yo. Sepandan, valè IC50 galangin la te ba anpil lè yo teste nan yon sistèm san selil ki pa montre okenn efè sitotoksik. Vreman vre, efikasite nan galangin pou anpèchman nan melanogenesis te akseptab nan dòz ki ba ki pa t 'fè egzèsis sitotoksisite. Dòz ki ba nan galangin efektivman redwi kontni an melanin, osi byen ke aktivite a tirozinaz, nan sistèm nan kilti selil. Ansanm ak sistèm nan san selil,galaninte montre yo gen yon efè inhibition fò sou tirozinaz nan sistèm nan kilti selil.

Finalman, efè antimelanogenic galangin te evalye lè l sèvi avèk yon sourit san cheve HRM2. Modèl sourit HRM2 san cheve bay yon baz itil pou eksperyans melanogenesis in vivo, kòm sourit la ka pwodwi melanin, espesyalman anba estrès anviwònman an.21,22) Nan modèl sourit sa a, galangin te montre yon efè antimelanogenic enpòtan sou sentèz melanin UVB-induit. Pou konesans nou, sa a se premye etid ki montre efikasite antimelanogenic galangin lè l sèvi avèk yon modèl melanogenesis in vivo. Li enpòtan pou etabli efikasite nan vivo paske anpil lòt inibitè melanogenesis te echwe pou yo aji an vivo akòz enkapasite yo pou travèse stratum corneum po a. An rezime,galaninte idantifye kòm yon pisan ajan anjyojenik bèt nan vivo. Nou konkli ke galangin inibitè tirozinaz la ofri yon nouvo kandida dwòg pou tretman maladi ipèpigmantasyon.

cistanche capsules