Yon estrateji deteksyon patojèn natirèl ki enplike ubiquitination nan pwoteyin sifas bakteri Pati 2

DISKISYON

Metazoans itilize ubiquitination kòm yon mekanis versatile pou kenbe omeyostazi sitosolik, anpeche akimilasyon nan pwoteyin domaje / òganèl ak defann kont patojèn anvayi (40, 41). Bay varyete patojèn ak divès kalite pwoteyin domaje rankontre, idantifikasyon motif komen pou rekonesans substra ak ubiquitination ki vin apre reprezante yon estrateji entelijan pou optimize resous yo. Pwoteyin nan selil ekaryotik ki destine pou proteoliz yo anjeneral idantifye pa yon motif triparti degron (24).

Iminite se kapasite kò a pou konbat maladi, ki gen ladan repons a bakteri, viris, ak lòt sibstans danjere. Si sistèm iminitè kò a konpwomèt, li pa pral ase fò pou fè fas ak ofansiv maladi a. Etid yo montre ke malnitrisyon gen yon enpak sou fonksyon sistèm iminitè a, fè kò a pi fasil pou enfeksyon ak maladi. Pwoteyin se youn nan sibstans ki enpòtan pou kenbe iminite.

Pwoteyin yo fèt ak asid amine, kèk ladan yo rele asid amine esansyèl paske yo dwe bay yo nan manje epi yo pa ka sentèz pa kò a. Asid amine esansyèl sa yo gen ladan triptofan, leucine, fenilalanin, lizin, izoleucin, methionine, valin ak histidine. Si kò a pa jwenn ase esansyèl asid amine, li ka mennen nan metabolis pwoteyin ki gen pwoblèm, ki ka afekte fonksyon sistèm iminitè a.

Anplis de sa, yon bon kalite konsomasyon pwoteyin ede kenbe yon sistèm iminitè nòmal ak fonksyon kò. Lè kò a manke pwoteyin, li ka mennen nan yon sistèm iminitè konpwomèt ak kò a pi fasil pou maladi. Si kò imen an manke pwoteyin pou yon tan long, li ka lakòz domaj alontèm nan sistèm iminitè a, fè moun sansib a divès maladi.

Se poutèt sa, yon rejim ekilibre ak egzèsis apwopriye yo se kle yo kenbe konsomasyon pwoteyin. Moun ka satisfè bezwen pwoteyin kò yo lè yo manje plis manje ki gen anpil pwoteyin tankou vyann, bèt volay, pwason, pwa, ze, pwodui letye, grenn, nwa ak grenn. Anplis de sa, egzèsis modere ka ogmante demann kò a pou pwoteyin ak efikasite absòpsyon. Yon rejim balanse ak varye ak yon vi ki an sante se kle pou kenbe iminite, kenbe kò a an sante ak ki estab, ak reziste envazyon an nan maladi. Soti nan pwennvi sa a, nou bezwen amelyore iminite nou an. Cistanche ka siyifikativman amelyore iminite paske polisakarid yo nan vyann ka kontwole repons iminitè a nan sistèm iminitè imen an, amelyore kapasite nan estrès nan selil iminitè, ak amelyore iminite a nan selil iminitè yo. Efè bakterisid.

Klike sou sipleman cistanche deserticola

Sa a te pouse nou eksplore si wi ou non motif ki sanble yo ka jwenn sou sifas patojèn, kote yo ta ka fonksyone kòm yon prokurasyon pou rekonesans substra. Isit la, nou demontre ke ligaz ubiquitin lame itilize siyati molekilè ki sanble pou santi patojèn filogenetik diferan. Rekonesans patojèn atravè modèl molekilè komen/motif (PAMP) se yon karakteristik ki byen karakterize nan iminite natirèl (42). Rezilta nou yo sijere ke sekans ki tankou degron nan pwoteyin sifas bakteri yo aji nan yon fason ki ekivalan a PAMPs, pou bay siveyans patojèn entraselilè. Operand modil sa a ta ka pi plis eksplwate pa lame a pou prezantasyon an nan antijèn pwoteyin mikwòb sou gwo konplèks istokonpatibilite I pou pwovoke yon repons CD8 fò ki dirije kont patojèn intraselilè.

Enpòtans potansyèl de deteksyon ubiquitin-medyatè nan patojèn nan lame defans se plis make pa ubiquitination nan rezidyèl sibstansyèl detekte nan SPN mutan ki manke tou de BgaA ak PspA. Sa a endike ke gen plis, substrats idantifye nan machin ubiquitin la, ak redondance ki kapab lakòz asire entèsèpsyon patojèn gaya. Miyò, kèk kesyon imedya sou motif degron ak enpòtans li pou bakteri yo (lòt ke yo te yon inite rekonèt) bay yon ang evolisyonè enteresan.

Motif la degron se dispansab nan vivo, epi si anyen, mitasyon oswa efase motif la amelyore pèsistans yap ogmante jiska intracellulaire sa ki lakòz ogmante virulans. Sa a se pwouve pa rezilta nou yo ke mitasyon nan motif degron yo ta ka itilize pa patojèn yo sove rekonesans ubiquitin-medyatè jan yo wè pou SPN serotip 19F. Sepandan, nati a konsève nan motif degron nan BgaA atravè majorite nan serotip SPN yo ta ka sijere yon estrateji vann san preskripsyon adopte pa bakteri yo dwe mwens letal nan lame a.

Sa a ta ka bay yon opòtinite pou patojèn nan ogmante abita li yo. An menm tan, ubiquitination nan sifas bakteri an oswa pwoteyin sekrete nan motif degron an te kapab modile yo fonksyonèl pou dekouraje oswa rewire repons lame a pou benefis evantyèlman (43). Se poutèt sa, prezans oswa absans domèn fonksyonèl oswa motif ekaryotik (tankou degrons) ta ka depann sou yon nich patojèn ak adapte yo evade oswa modile repons iminitè lame yo.

Yon mekanis deteksyon patojèn ki sanble ki enplike pwoteyin obligatwa guanyl te enplike tou nan clearance bakteri; sepandan, kontrèman ak ubiquitination, yo rapòte wòl yo limite a patojèn Gram-negatif (44-47). Ubiquitination vize patojèn nan kèlkeswa orijin Gram, pou egzanp, RNF213 te dokimante pou vize Listeria spp. kèlkeswa absans LPS (48). Se poutèt sa, nou pa elimine posiblite pou aksyon antimikwòb li kont SPN tou.

Yon sifas patojèn ka ubiquitinated ak plizyè kalite chèn pa diferan ligaz E3 ak entèraksyon interchain (41). An patikilye, nan ka Mtb, Smurf1, ak Parkin yo te pwouve yo fòme kalite chèn K48 ak K63 ki fonksyone sinèrjetik degrade patojèn nan (12). Konprann wòl mekanistik K48 ubiquitination ak ligaz E3 ki enplike pandan senaryo enfeksyon toujou pa etidye. Nan ka STm, yo te montre yon sèl E3 ligase ARIH1 pou vize STm cytosolic ak chenn ubiquitin K48 ki mennen ale nan eliminasyon yo nan sistèm nan (15). Dapre rezilta nou yo ak lòt moun, patojèn ki gen etikèt K48-Ub yo finalman degrade pandan y ap asosye ak machin proteazomal.

Sepandan, etid sa a montre K48-Ub dekorasyon nan pwoteyin sifas espesifik bakteri. Gen kèk patojèn yo konnen yo aktivman modifye pwoteyin sifas yo, pwoteje yo kont ubiquitination ak touye ki vin apre, konsa mete aksan sou siyifikasyon an nan lokalizasyon sifas nan substra a ubiquitin (10). Anplis de sa, plizyè patojèn obligatwa intracellular te evolye estrateji pou de-ubiquitinate tèt yo, oswa òganize eleman regilasyon, evade clearance ubiquitin-medyatè (5). Ansanm, rezilta sa yo souliye enpòtans ki genyen nan eksitasyon alam ubiquitin-medyatè kòm yon mekanis deteksyon fondamantal patojèn intraselilè santral nan defans lame yo.

Etid nou an plis demontre wòl santral SCF E3 ligase, patikilyèman ak FBXW7, nan ubiquitination bakteri ogmante degradasyon patojèn. Mitasyon eterozigot nan FBXW7, patikilyèman R505C (yon rezidi kritik nan pòch rekonesans substra) varyant, deklanche plizyè karsinom ak lesemi lenfositik nan imen (49, 50). Yon etid resan ki baze sou kòwòt te endike ke prèske 43 pousan nan pasyan ki gen lesemi lenfositik kwonik (CLL) mourir nan nemoni bakteri ak sepsis, ki te swiv pa enfeksyon chanpiyon (51).

Sa a konfime obsèvasyon nou an sou kapasite abroge selil lame ki gen mitasyon FBXW7 pou santi ak elimine patojèn. Konklizyon nou yo, Se poutèt sa, bay yon eksplikasyon molekilè inatandi sou risk ogmante nan enfeksyon nan pasyan ki gen CLL. Lyen ki genyen ant polimorfis jenetik nan jèn E3 ligaz ak sansiblite nan enfeksyon bakteri tou pwouve pa pasyan ki gen maladi Parkinson la, ki vilnerab a lafyèv tifoyid oswa lèp (14), sijere kontribisyon nan remakab nan ligaz E3 nan iminite lame kont enfeksyon bakteri ak antretyen. nan eta selilè fiks.

An konklizyon, nou te dechifre yon lang inivèsèl pou detekte patojèn ki rete nan sitosol ki ta ka aplike avèk efikasite pa lame a pou rekonèt mikwo-òganis pou eliminasyon ki vin apre. Ansanm, rezilta sa yo bay limyè sou konpreyansyon pwosesis iminitè selilè rudimantè yo, ki ta ka itilize pou entansifye iminite anti-bakteri.

MATERYÈL AK METÒD

Kilti selilè

Tou de moun nan poumon alveolaire kansòm (tip II pneumocyte) liy selil A549 [American Type Culture Collection (ATCC) no. CCL185)] ak liy selil adenokarcinom nan matris HeLa (ATCC pa gen CRM-CCL-2) yo te kiltive nan mwayen Dulbecco a modifye Eagle's (DMEM; HiMedia) complétée ak 10 pousan serom fetis bovin (Gibco) nan 37 degre ak 5. pousan CO2.

Tansyon bakteri ak kondisyon kwasans

SPN (R6, serotip 2, kado Tim J. Mitchell, University of Birmingham, Wayòm Ini) te grandi nan bouyon Todd-Hewitt complétée ak 1.5 pousan ekstrè ledven nan 37 degre nan 5 pousan CO2. Yo te itilize antibyotik sa yo pou grandi kilti SPN lè sa nesesè: kanamycin (200 ug/ml), spectinomicin (100 ug/ml), ak kloranfenikòl (4.5 ug/ml). Nèf san mikrolit 0.4 OD600 (dansite optik nan 600 nm) kilti SPN grandi yo te melanje ak 600 ul nan 80 pousan gliserin esteril (32 pousan konsantrasyon final gliserin) epi estoke nan yon frizè -80 degre. Stock gliserin sa yo te itilize kòm inoculum kòmanse pou tout eksperyans.

Escherichia coli DH5 ak STm (ATCC 14028) kilti yo te grandi nan bouyon Luria-Bertani (LB) nan 37 degre nan kondisyon souke (200 rpm), epi lè sa nesesè, antibyotik sa yo te itilize: kanamycin (50). ug/ml), spectinomicin (100 ug/ml), kloranfenikòl (20 ug/ml), ak ampicillin (100 ug/ml). Pou tout tès enfeksyon, bakteri yo te grandi jiska OD600 ~ 0.4, ki te swiv pa resuspension nan saline fosfat-tanpon (PBS) nan yon dansite menm jan an anvan enfekte selil lame yo.

Depistaj pwoteyin sib ubiquitin

Tout pwoteyin sifas ki prezan nan STm ak SPN proteome te premye idantifye nan literati pibliye. Sekans pwoteyin konplè nan pwoteyin sifas yo te jwenn nan UniProt, ki te Lè sa a, itilize yo idantifye prezans nan motif degron. Yo te chwazi yon seri 29 motif degron ki soti nan literati pibliye (24, 52, 53) ak baz done Eukaryotic Linear Motif. Modil regex Python a te itilize pou idantifye kote tout motif sa yo òganize nan sekans pwoteyin sifas yo. Yo te fè yon rechèch lineyè pou idantifye prezans yon rezidi lizin ki tou pre (8 a 14 rezidi asid amine) nan chak motif degron idantifye. Rezid lizin sa a sipoze aji kòm sit atachman pou mwatye ubiquitin. Anfen, yo te bay sekans pwoteyin ki te seleksyone yo nan IUPred (54), yon zouti predi estrikti pwoteyin, pou lokalize prezans yon rejyon dezòd ant motif degron ak lizin proximal. Pwoteyin rezilta yo (BgaA ak PspA pou SPN ak RlpA pou STm) yo te chwazi pou evalyasyon kòm sib ubiquitination ak dekodaj wòl yo nan clearance patojèn.

Konstriksyon souch bakteri

Echanj alelik pa recombination omologe te fèt lè l sèvi avèk rejyon ki antoure jèn ki te pote yon kasèt antibyotik mete pou jenerasyon tansyon mutan nan tou de SPN ak STm (tablo S2).

Pou SPN, 500-bp rejyon en ak en nan bgaA, pspA, ak jèn li yo te anplifye soti nan genòm nan ak primè apwopriye (tablo S3) epi reyini nan vektè pBKS la. Apre klonaj fragman sa yo, yo te mete yon kasèt rezistans antibyotik (spectinomicin pou sak ak pspA ak chloramphenicol pou hysA) nan konstriksyon sa a. Lè sa a, yo te transfòme plasmid recombinant linearize nan WT SPN lè l sèvi avèk konpetans eksitan peptide 1 (GenPro Biotech), recombinants yo te chwazi lè l sèvi avèk antibyotik respektif, ak ranplasman jèn yo te konfime pa reyaksyon chèn polymerase (PCR) ak sekans nan loci yo jèn respektif. Pou STm, yo te itilize metòd recombinase λ-wouj pou jenerasyon mutan sipresyon jèn (55).

Yon ti tan, sekans omològ nan pwent jèn kòd la te ajoute nan sekans Jadendanfan yo itilize pou anplifikasyon kasèt rezistans kanamycin la. Lè sa a, kasèt la te elektwoporasyon nan souch WT STm, epi yo te chwazi knockouts ki te pwodwi pa recombination omologe ki baze sou rezistans kanamycin. Sipresyon jèn yo te konfime lè l sèvi avèk PCR ak sekans nan lokal jèn yo. Fulllength pspA, hysA, ak yon bgaA-T tronke (1 a 3168 bp) yo te klonaj anba pwomotè P23 nan vektè navèt pIB166 (56) epi yo te itilize pou konplemantasyon.

Plasmid recombinant sa yo te itilize tou pou mutajenèz ki dirije sou sit pou jenere diferan varyant bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R, ak bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAKs, pspAK315R, pspAK315R, pspAK315R, pspAK315R, pspAK315R, pspAK315R n ), ak li (hysADegron-BgaA ak hysADegron-PspA) lè l sèvi avèk seri Jadendanfan apwopriye (tab S3) ak transfòme nan mutan ΔbgaA ak ΔpspA. Tout klon yo te verifye pa sekans ADN. Ekspresyon diferan varyant BgaA, PspA, ak HysA te konfime pa Western blot lè l sèvi avèk antikò apwopriye.

Antikò ak reyaktif

Anti-Enolase ak anti-PspA serom (S. Hammerschmidt, University of Greifswald, Almay); serom anti-BgaA (S. King, The Ohio State University, USA); ak antikò espesifik pou His6 (Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub linkage (Millipore, 05-1307), K63-Ub linkage (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratory, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], fosfotreonin (CST, 9381S), IgA, Kappa ki soti nan myeloma murin, script TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421), ak PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) yo te pwokire. Antikò segondè sa yo te itilize: peroksidaz refor (HRP)-tagged anti-lapen (BioLegend, 406401), HRP-tagged anti-sourit (BioLegend 405306), anti-lapen Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-lapen Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), biotin-konjige anti-sourit imunoglobulin A (Life Technologies, M31115), anti-sourit Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), anti-sourit Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), anti-goat Alexa Fluor 633 (Invitrogen, A21082), ak FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Ekspresyon pwoteyin ak pirifikasyon

BgaA-T ak variants li yo te klonaj nan pET28 lè l sèvi avèk sit restriksyon Xba I / Not I. Plasmid recombinant ki kode BgaA-T ak N-tèminal His-tag yo te transfòme nan selil E. coli BL21 (DE3) pou ekspresyon pwoteyin. Koloni ki fèk transfòme yo te grandi nan LB ki gen kanamicin (50 ug/ml) nan 37 degre sou yon enkibatè shaker pou 12 èdtan. Yo te ajoute youn pousan nan kilti prensipal la nan 1 lit bouyon LB epi yo te enkube a 37 degre sou yon enkibatè shaker jiskaske OD600nm te rive nan ant 0.6 ak 0.8. Ekspresyon pwoteyin te pwovoke pa adisyon a nan 100 μM isopropyl - - D-thiogalactopyranoside (IPTG) ak grandi kilti a pi lwen nan 37 degre pou 5 a 6 èdtan ak ajitasyon nan 150 rpm.

Selil yo te rekòlte pa santrifujasyon nan 6000 rpm pou 10 min nan 4 degre. Te grenn selil la resuspend nan tanpon A [25 mM tris (pH 8.0) ak 300 mM NaCl] ak lysed pa sonication. Yo te separe debri selil yo pa santrifijasyon (14,000 rpm, 50 min, 4 degre), epi yo te aplike supernatant la sou yon kolòn Ni-NTA, ekilibre ak tanpon A. Yo te lave kolòn nan ak 10 volim kolòn nan tanpon. A, ak pwoteyin His-tagged yo te eliye ak imidazol (250 mM) nan tanpon A. Tout varyant yo nan BgaA-T yo te eksprime ak pirifye lè l sèvi avèk menm pwosedi a. FBXW7 te subklonaj nan vektè pGEX-4 T{-1 ki gen yon tag N-terminal glutatyon S-transferaz (GST) ki soti nan vektè pCMV6-Entry-FBXW7 lè l sèvi avèk anzim restriksyon Eco RI.

FBXW7 ki make GST te eksprime nan selil E. coli BL21 (DE3) apre endiksyon ekspresyon pwoteyin ak 0.1 mM IPTG ak kwasans nan 30 degre pou 4 èdtan. GST-FBXW7 soti nan E. coli ekstrè brut te pirifye lè l sèvi avèk Glutathione-Sepharose (GE HealthCare) kolòn chromatografi. Fraksyon ki gen pwoteyin pirifye yo te rasanble ak konsantre jiska 0.5 mg/ml lè l sèvi avèk yon filtè kDa molekilè pwa koupe (Amicon) pa santrifujasyon nan 4700 rpm nan 4 degre. Pite pwoteyin yo te tcheke sou SDS-polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) ki te swiv pa tach ak Coomassie ble.

Transfèksyon selil lame yo

BgaA-T te klonaj nan vektè pAK_Tol2_TRE{_Blast (Addgene No. 130261) ki ka endui nan doxycycline (Addgene No. 130261) lè l sèvi avèk yon twous klonaj perfusion (Takara). Yon script pozitif te konfime pa sekans Sanger. Mitasyon FBXW7R505C te pote soti nan mutagenezis ki dirije sou sit lè l sèvi avèk pMRX-GFP-FBXW7 kòm yon modèl epi konfime pa sekans Sanger. Tout transfèksyon yo te fèt lè l sèvi avèk Lipofectamine 3000 reyaktif (Thermo Fisher Scientific), ak seleksyon yo te fè nan prezans idroklorid blasticidin (2 ug / ml; HiMedia).

knockdown jèn ki dirije siRNA

Pou knockdown RNA entèferans-medyatè nan jèn espesifik, siRNA sa yo te itilize: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819), ak siGSK3 (Dharmacon ON-TARGET). SMARTpool L-003010-00-0005). Yon ti tan, selil A549 ki grandi nan yon plak 24-byen yo te transfekte tanporèman ak siRNA espesifik oswa scramble (siControl) (150 pmol) lè l sèvi avèk Lipofectamine 3000 dapre enstriksyon manifakti a. Trant-sis èdtan apre transfeksyon, selil yo te trete pou Western blotting ak imunofluoresans oswa tès pwoteksyon penisilin-gentamycin.

Prediksyon estrikti ak modèl

AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) te prevwa tout estrikti yo epi yo te vizyalize yo lè l sèvi avèk PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, vèsyon 2.0 Schrödinger, LLC). Estrikti yo te kode koulè nan PyMol ki baze sou nòt IUPred (54) ki soti nan lòd (ble) nan dezòd (wouj) jiska blan.

Western blotting

Kilti SPN grandi nan {{0}}.4 OD600nm yo te lysed pa sonication, ak ekstrè brit yo te kolekte apre santrifujasyon (15, 000 rpm, 30 min, 4 degre). Pou A549s, monokouch yo te lave plizyè fwa ak PBS ak lysed nan glas-frèt radioimmunoprecipitation assay (RIPA) tanpon [50 mM tris-Cl (pH 7.89), 150 mM NaCl, 1 pousan Triton X-100, 0.5 pousan sodyòm. deoxycholate, ak 1 pousan SDS] ki gen bwason inibitè proteaz (Promega), fliyò sodyòm (10 mM), ak EDTA (5 mM). Te sispansyon selil la yon ti tan sonike ak santrifuje kolekte lysate selil yo. Pwoteyin ki prezan nan lysates selil bakteri oswa A549 (10 oswa 20 ug) yo te separe sou 12 pousan jèl SDS-PAGE ak transfere nan yon manbràn aktive polyvinylidene difluoride. Apre bloke nan 5 pousan lèt ekreme, manbràn yo te sonde ak antikò prensipal apwopriye ak HRP-tagged segondè. Yo te devlope tach yo finalman lè l sèvi avèk yon substra kimiluminesans amelyore (Bio-Rad).
Esè pwoteksyon penisilin-gentamicin

Souch SPN grandi jiskaske OD600nm 0.4 nan bouyon Todd-Hewitt ki te konplete ak 0.2 pousan ekstrè ledven (THY) yo te granules, resuspend nan PBS ( pH 7.4), ak dilye nan medyòm tès pou enfeksyon nan monokouch A549 ak yon miltiplisite nan enfeksyon (MOI) nan 10. Apre 1 èdtan nan enfeksyon, monokouch yo te lave ak DMEM ak enkubasyon ak yon mwayen tès ki gen penisilin (10 ug / ml). ) ak gentamicin (400 ug/ml) pou 2 èdtan pou touye SPN ekstraselilè. Lè sa a, selil yo te lysed ak 0.025 pousan Triton X-100, epi lisate la te plake sou plak agar Brain Heart Infusion pou enumere SPN solid. Pousantaj envazyon te kalkile kòm [inite koloniforming (CFU) nan lysate/CFU yo itilize pou enfeksyon] × 100. Pou evalye siviv entraselilè a, nan 9 èdtan apre enfeksyon (depi nan konmansman an nan tretman penisilin-gentamycin), lisat selil yo te prepare kòm mansyone pi wo a, ak gaye plake ak siviv bakteri yo te enimere. Efikasite siviv (pousan) te reprezante kòm yon chanjman pliye nan pousantaj siviv parapò ak kontwòl nan pwen tan endike (nòmalize a 0 èdtan).

Iminofluoresans

Pou tès imunofluoresans, selil A549 oswa HeLa yo te grandi sou kouvèti vè ak enfekte ak tansyon SPN oswa STm nan MOI ~ 25 pou 1 èdtan ki te swiv pa tretman antibyotik pou 2 èdtan. Nan pwen tan vle apre enfeksyon (9 èdtan pou enfeksyon SPN nan A549s ak 3 èdtan pou enfeksyon ak STm nan HeLa), selil yo te lave ak DMEM epi yo te fikse ak metanol glas frèt nan -2 0 degre pou 10 min. Pli lwen, kouvèti yo te bloke ak 3 pousan albumin serom bovin (BSA) nan PBS pou 2 èdtan nan tanperati chanm (RT). Lè sa a, selil yo te trete ak yon antikò prensipal apwopriye nan 1 pousan BSA nan PBS lannwit lan nan 4 degre, lave ak PBS, ak enkubasyon ak yon antikò apwopriye segondè nan 1 pousan BSA nan PBS pou 1 èdtan nan RT. Anfen, yo te lave kouvèti kouvèti ak PBS epi yo te monte sou glisyè vè ansanm ak VECTASHIELD avèk oswa san 4′,6-diamidino{-2-phenylindole (Vector Laboratories) pou vizyalizasyon lè l sèvi avèk yon mikwoskòp konfokal lazè (LSM 780, Carl Zeiss). ) anba 40 × oswa 63 × objektif lwil oliv. Imaj yo te akeri apre seksyon optik ak Lè sa a, trete lè l sèvi avèk lojisyèl ZEN lite (vèsyon 5.0). Yo te fè mikwoskopi superrezolisyon menm jan an lè l sèvi avèk Elyra 7 (Carl Zeiss) nan mòd SIM. Pou analiz colocalization, bakteri yo te bay nòt pa vizyèl konte nan n> 100 bakteri pou chak replike.

Mikwoskopi elektwonik transmisyon

Apre enfeksyon ak SPN ak STm, selil yo te lave ak {{{0}}.1 M tanpon kakodilat sodyòm, fiks ak 2.5 pousan glutaraldehyde (Sigma-Aldrich) nan {{{0}.1 M tanpon kakodilat sodyòm ( Sigma-Aldrich) pou 3 èdtan nan 4 degre. Apre yo fin fikse yo, selil yo te kolekte atravè yon grate selil epi yo te pilye nan 2000 rpm pou 10 min. Lè sa a, selil yo te lave ak 0.1 M tanpon kakodilat sodyòm ak postfixed ak 1 pousan tetoksid osmyòm nan 0.1 M tanpon kakodilat sodyòm pou 20 min nan 4 degre. Apre lave ki vin apre yo ak tanpon kakodilat ak dlo distile, selil yo te dezidrate nan ogmantasyon konsantrasyon etanòl (50, 70, 95, ak 100 pousan) ak oksid pwopilèn pou 30 minit epi finalman entegre nan résine epoksidik (Electron Microscopy Sciences, 14300) polimerizasyon nan 75 degre pou 45 min. Apre sa, kapsil yo te transfere nan yon fou 95 degre pou 45 min. Seksyon ultrathin (70 nm) yo te koupe lè l sèvi avèk yon kouto dyaman sou yon Leica EM UC7 Ultramicrotome ak tache ak 2 pousan acetate uranyl ak 1 pousan sitrat plon epi yo te wè lè l sèvi avèk yon mikwoskòp elèktron transmisyon (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) nan 120 KV.

Ex vivo ubiquitination

Yon 549-eksprime BgaA-T ak varyant li yo te trete ak MG132 (5 μM), ak ekspresyon pwoteyin yo te pwovoke ak doxycycline (100 ug / ml) pou 24 èdtan. Lè sa a, selil yo te lysed nan tanpon RIPA, ak echantiyon yo te electrophoresed pa SDS-PAGE (8 pousan). Konfimasyon ekspresyon pwoteyin ak ubiquitination nan BgaA-T ak variants li yo te pwouve pa Western blot apre sonde ak anti-BgaA ak anti-K48-Ub, respektivman.

In vitro ubiquitination

Pou tès ubiquitination in vitro, pwoteyin recombinant yo te pirifye jan sa dekri pi bonè (58). SCFFBW7 E3 ligase konplèks la te enkube ak recombinant 0.1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0.25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem), ak ubiquitin (2.5 ug/ml; Boston). Biochem) nan prezans BgaA-T pirifye ak variants li yo. Reyaksyon ubiquitylation yo te fèt nan tanpon tès [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenozin trifosfat (ATP), 1 mM -mercaptoethanol, ak 0.1 pousan Tween 20] pou 2 èdtan nan 25 degre. . Reyaksyon yo te sispann ak 5 × tanpon Laemmli, rezoud sou jèl SDS-PAGE, epi analize pa imunoblot lè l sèvi avèk yon antikò anti-BgaA.

Nan tès kinaz vitro

Pou fè tès kinaz vitro, yo te itilize sistèm anzim kinaz GSK3 (Promega) dapre pwotokòl manifakti a ak modifikasyon sa yo. Yon ti tan, yo te ajoute 3 ug recombinant BgaA-T nan 0.5 ug GSK3 aktif ak 400 μM ATP nan tanpon reyaksyon ki konpoze de 40 mM tris, (pH 7.5), 20 mM MgCl2. , BSA (0.1 mg / ml), ak 50 μM dithiothreitol. Reyaksyon an te enkube pou 2 èdtan nan 30 degre ak sispann lè w ajoute 1 × tanpon Laemmli. Lè sa a, echantiyon yo te bouyi ak elektwoforèz pou Western blotting jan mansyone deja. Fosforilasyon BgaA-T te detekte ak yon antikò anti-fosfotreonin.

An vivo modèl

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 pousan kòmanse pwa kò, ak pwononse nan nen oswa okilè egzeyat. Echantiyon san yo te jwenn pa pike kadyak anba anestezi tèminal, epi yo te retire larat apre mortem pou enimerasyon bakteri. Echantiyon tisi yo te trete ak yon omojèn tisi ki kenbe men yo, ak omojene yo te seri dilye nan PBS anvan yo takte sou plak agar san. Plak yo te enkube lannwit lan nan 37 degre, 5 pousan CO2, ak nimewo koloni bakteri yo te evalye jou apre a.

Analiz estatistik

GraphPad Prism vèsyon 5 te itilize pou analiz estatistik. Tès estatistik yo fè pou eksperyans endividyèl yo mansyone nan lejand figi respektif yo. P < 0.05 te konsidere kòm estatistik enpòtan. Done yo te teste pou nòmal ak defini divèjans nan chak gwoup teste. Tout analiz miltiparamèt enkli koreksyon pou konparezon miltip, epi done yo prezante kòm vle di ± SD sof si yo di otreman.

REFERANS AK NÒT

ME Bianchi, DAMPs, PAMPs, ak alarmins: Tout sa nou bezwen konnen sou danje. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Patojèn rekonesans ak siyal enflamatwa nan defans iminitè natirèl. Clin. Microbiol. Rev. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Life on the inside: The intracellular lifestyle of cytosolic bakteri. Nat. Rev Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Wòl ubiquitylation nan defans iminitè ak levasyon patojèn. Nat. Rev Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, Sistèm nan ubiquitination nan entèraksyon bakteri lame-patojèn. Mikwo-òganis 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Global analiz de lame ak bakteri ubiquitinome an repons a enfeksyon salmonèl typhimurium. Mol. Selil 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, A mycobacterium tibèkiloz sifas pwoteyin rekrite ubiquitin pou deklanche ksenofaj lame. Nat. Komin. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubiquitylation nan lipopolysaccharide pa RNF213 pandan enfeksyon bakteri. Nature 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubiquitin ligase konplèks dirije ksenofaj atravè rekonèt glycan sifas bakteri. Rep. EMBO 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Lysine methylation pwoteje yon patojèn entraselilè soti nan omniprésente ak otofaji. Sci. Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, yon E3 ubiquitin ligase ak yon sans pou bakteri. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, Ubiquitin ligase Smurf1 fonksyone nan otofaji selektif nan tibèkiloz mycobacterium ak defans lame anti-tibèkiloz. Cell Host Microbe 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, LUBACsynthesized lineyè ubiquitin chenn mete restriksyon sou cytosol-anvayi bakteri pa aktive otofaji ak NF-κB. Nat. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, Ubiquitin ligase parkin mediate rezistans nan patojèn intraselilè. Nati 501, 512-516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Elaji machin ubiquitylation selil lame ki vize salmonèl sitosolik. Rep. EMBO 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com