Efè anti-aje Urolithin A sou ovosit bovins in vitro

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Résumé:Estrès oksidatif ak malfonksyònman mitokondriyo yo te asosye ak n bès nan bon jan kalite oosit ki gen rapò ak laj ak estrateji pou prevansyon yo kounye a ap chèche. Urolithin A (UA) se yon metabolit natirèl ak efè pro-apoptotik ak antioksidan, ki kapab anpeche akimilasyon nan mitokondri disfonksyonèl nan diferan selil ki gen laj. UA pa janm te teste nan ovosit bovins. Objektif nou se te etidye efè UA sou potansyèl devlopman konplèks cumulus-oocyte (COCs) ak ekspresyon selil granulosa (GCs) nan jèn enpòtan ki gen rapò ak konpetans repwodiktif. Pwogresyon spirasyon nikleyè, potansyèl manbràn mitokondriyo (MMP), ak konpetans devlopman fizyolojik ki gen matirite (22 h) ak in vitro ki gen laj ovosit (30 h nan IVM) yo te jwenn nan men fanm prepubertal ak adilt, swa complétée ak UA oswa ou pa. Anplis de sa, kantite mRNA plizyè jèn (NFE2L2, NQO1, ak mt-DN5) ak kantite kopi ADN mt-ND5 yo te mezire nan GC kiltive soti nan fi prepuber ak adilt, swa konplete ak UA oswa ou pa. Etid nou an konfime efè danjere nan aje oosit sou pwogresyon spirasyon nikleyè, MMP, konpetans devlopman, ak nivo ekspresyon jèn yo. Tretman UA pandan spirasyon in vitro amelyore (p<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

KSL01

Tanpri klike isit la pou konnen plis

Mo kle:oosit; aje; Urolitin A; teknoloji repwodiksyon asistans

1. Entwodiksyon

N bès nan kapasite repwodiktif fi se youn nan premye fonksyon fizyolojik ki afekte negatif pa aje e konsa konsidere kòm yon pwoblèm sante émergentes atravè lemond [1,2]. Anplis de plizyè pwoblèm patolojik, diminisyon nan fètilite fi ki asosye ak laj yo lajman atribiye a yon bès nan rezèv ovè nan ovosit [1, 3-5] alye ak yon deteryorasyon ki depann de tan nan bon jan kalite yo [2]. Pwosesis deteryorasyon sa a ka rive akòz ekspoze nan ovosit nan yon mikro-anviwònman ovè ki gen laj anvan ovilasyon. Anplis de sa, gamèt fi a souvan sibi aje apre ovulatwa lè pwosesis fekondasyon an pa rive nan pi bon peryòd pi bon an, epi ovosit ki pa fètilize a rete nan oviduct oswa nan vitro anvan fekondasyon pou peryòd pwolonje [6] bon jan kalite oosit se yon faktè kritik ki asosye ak echèk teknoloji repwodiksyon asistans (ART) paske bon jan kalite li se detèminan prensipal pou potansyèl devlopman anbriyon an apre fètilizasyon [7,8]. Asynchrony ovilasyon ak ovosit ki gen laj yo te souvan rapòte ki afekte siksè nan enseminasyon atifisyèl ak pwogram pwodiksyon anbriyon nan mare, bèf, ak mouton ki enplike pèt ekonomik enpòtan [1,9,10]. Se poutèt sa, li enpòtan anpil pou etidye mekanis ki kache nan aje ovosit, yo nan lòd yo konsepsyon pi bon apwòch terapetik pou sove fètilite nan plizyè espès, ki gen ladan moun, epi tou kòm yon zouti pou amelyorasyon jenetik nan bèt.cistanche wirkungAtansyon patikilye dwe konsakre nan amelyore kapasite devlopman oosit ki soti nan bèt prepibète, ki souvan itilize pou akselere benefis jenetik ak diminye entèval jenerasyon.

Youn nan kòz pi gwo nan konpetans devlopman pwoblèm nan oosit ki gen laj se ogmantasyon nan estrès oksidatif, ki pwovoke malfonksyònman mitokondriyo, domaj ADN, ak erè fòmasyon spindle, ki enfliyanse bon jan kalite a oosit [1]. Li byen etabli ke ogmante pwodiksyon radikal gratis se yon kòz nan aje selilè nan plizyè maladi kwonik ak tou nan byoloji repwodiktif, sa ki lakòz rezilta fètilite pòv [12]. Mikwo-anviwònman nan òvèj, ki gen ladan oosit ak selil granuloza (GC), bay yon mekanis defans antioksidan ki kapab kontwole kondisyon oksidatif epi kenbe balans oksidan / antioksidan [13]. Sepandan, pandan pwosesis la aje, efikasite nan defans antioksidan netralize espès oksijèn reyaktif (ROS) diminye, kidonk ogmante nivo estrès oksidatif. Faktè nikleyè E2-faktè2 ki gen rapò (Nrf2 oswa NFE2L2), ke yo rele tou Nrf2/Kelch-like ECH-asosye pwoteyin 1 (Keap1), se yon kaskad repons dominan aktive pa estrès oksidatif[14]. Chemen sa a se yon mekanis defans selilè ke selil yo te devlope pou fè fas ak efè danjere nan estrès oksidatif. Nan kondisyon nòmal, Nrf2 se negatif reglemante pa Keap1, ki te fèt nan sitoplasm la, epi konsève nan nivo ki ba. Lè ekspoze a oksidan, Nrf2 disoye ak Keapl, sa ki pèmèt translokasyon li nan nwayo a kote li mare nan sekans ADN espesifik. Sekans sa yo, yo rele eleman repons antioksidan (ARE), mennen nan deklanchman transkripsyon jèn cytoprotective, tankou NAD(P)H:quinone-oxidoreductase-1 (NQO1), heme oxygenase-1 (HMOX1) , ak glutamate-cysteine ligase subunit katalitik (GCLC) [15,16]. Etid anvan yo te montre ke aktivasyon chemen siyal Nrf2-Keapl la diminye domaj estrès oksidatif lè yo ogmante nivo antioksidan nan GC imen ak òvèj sourit [17,18]. Sepandan, wòl li nan pwosesis aje gamèt fi a rete flotant, byenke li klèman etabli ke mitokondri yo se sit pwodiksyon prensipal pou ROS pandan pwosesis sa a [9,10].

KSL02

Cistanche ka anti-aje

Kontrèman, mitokondri yo patisipe nan plizyè fonksyon selilè kritik epi yo fondamantal pou satisfè demann pwodiksyon enèji ki nesesè pandan spirasyon ovosit ak devlopman anbriyon ki vin apre [19]. Aktivite mitokondriyo konpetan yo te trè asosye ak pi wo kontni nan ADN mitokondriyo (mt-DNA) ak jenerasyon ATP [20], pi wo potansyèl manbràn mitokondriyo [21], ak antretyen nan bon jan kalite ak kantite mitokondriyo atravè mitofagi [22]. Anplis, yo te sijere aktivite mitokondriyo yo dwe dirèkteman korelasyon ak viabilite anbriyon ak pi bon rezilta fètilite [23]. Ogmante prèv sipòte ke chanjman mitokondriyo ki gen rapò ak laj mennen nan aje nan òvèj epi imedyatman redwi viabilite anbriyon ak potansyèl enplantasyon. Chanjman sa yo gen ladan diminye kantite kopi mt-DNA, diminye jenerasyon ATP [20], chanjman nan ekspresyon jèn mitokondriyo [24, domaj mt-DNA [25], ak redwi potansyèl manbràn mitokondriyo [26].

KSL03

Apwòch terapetik ki vize mitokondri yo te ankouraje yon gwo enterè nan plizyè patoloji ki asosye ak aje akòz gwo potansyèl yo nan amelyore fonksyon mitokondriyo [27]. Nan kad sa a, Urolithin A (UA)—yon metabolit natirèl ki te jwenn apre enjèstyon manje tankou grenad ki te swiv pa konvèsyon li pa mikrobiota zantray la—yo te demontre pou anpeche akimilasyon mitokondri disfonksyonèl ak laj, pwovoke mitofaji epi tou kenbe mitokondriyo. byogenesis ak kapasite respiratwa [28,29]. UA te aplike kòm yon dwòg pwomèt terapetik pou anpeche kèk kansè, tankou kansè kolorektal ak pwostat [30,31]. Anplis de sa, UA gen tou anti-enflamatwa [32], anti-obezite [33], antioksidan [34] ak pwopriyete anti-aje [35].bioflavonoid CitrusYon etid resan te mete aksan sou efè sipleman UA nan fibroblast po moun senesan sou deklanchman chemen Nrf2-Keapl ki amelyore kapasite antioksidan yo. Aktivasyon sa a nan chemen Nrf2-Keapl la efektivman diminye nivo ROS la, atravè regilasyon ekspresyon Nrf2 en ARE-repons jèn (SOD, NQO1, GCLC, ak HMOX1), ki endike yon efè anti-aje pwomèt [ 35].

KSL04

Plizyè etid yo te fèt ak objektif pou retade aje ovè, kidonk amelyore kalite ovosit ak rezilta fètilite. Akòz kontribisyon estrès oksidatif nan pwosesis aje òvèj la, osi byen ke malfonksyònman mitokondriyo, sipleman ak antioksidan te parèt kòm yon terapi pwomèt [36,37]. Sepandan, li se enkoni si sipleman Urolithin A ka retabli domaj ki fèt pandan aje òvèj kontribye nan anpeche pwoblèm lakòz. Se poutèt sa, objektif etid sa a se te: (1) demontre ke aje te kapab chanje potansyèl devlopman cumulus-oocyte complex (COC) ak ekspresyon GCs 'nan jèn enpòtan ki enplike nan chemen siyal Nrf2 la; (2) detèmine si UA ka sove. fètilite fi demontre yon efè anti-aje nan COC ak GC ki gen laj; ak (3) pou evalye efè UA sou nivo ekspresyon jèn ki enplike nan chemen siyal Nrf2 a ansanm ak bon jan kalite oosit.

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Konsepsyon eksperimantal

Etid sa a te apwouve pa Komite Swen Animal nan Otorite Veterinè Nasyonal la (N degre 08965DGAV), swiv direktiv Inyon Ewopeyen an (no.86/609/EEC). Pou mennen ankèt sou efè aje sou chanjman bon jan kalite oosit ak efè potansyèl anti-aje UA, yon modèl ki itilize COC yo kolekte nan bèf prepuber ak adilt soumèt nan aje in vitro (30 èdtan nan spirasyon) oswa nan spirasyon fizyolojik (22). h) pwosesis yo te aplike.

2.1.1.Previous essai—Etid Dòz-Repons

Yo te fè yon tès anvan pou detèmine konsantrasyon UA ki ta dwe itilize pandan pwosesis spirasyon COC bovins yo baze sou yon etid dòz-repons nan kat sesyon. Depi UA pa janm te teste nan ovosit bovins, dòz anvan yo te aplike avèk siksè pou prevansyon ak alèjman kèk kansè ak demontre efè anti-aje UA nan diferan liy selil yo [28,39]. COC yo te jwenn nan bèf adilt ki gen matirite ak matirite (n=978) yo te chwazi epi yo te divize owaza nan senk gwoup pou teste diferan dòz UA: kontwòl, 1,10,25, ak 50 uM pandan spirasyon fizyolojik in vitro. Apre peryòd spirasyon an, kèk oosit (n=154) te tache pou detèmine konfigirasyon kwomozòm yo ak etap spirasyon yo. Rès ovosit ki gen matirite yo te soumèt nan enseminasyon in vitro ak espèm espèm nan frizè/degel. Zigòt sipoze yo te kiltive, epi yo te detèmine pousantaj klivaj ak blastosist nan jou 2 ak jou 7 nan kilti, respektivman. Dapre rezilta yo jwenn, sètadi absans efè danjere ak pwomosyon spirasyon ak devlopman blastocyst, yo te chwazi konsantrasyon 1 uM nan UA.

2.1.2.Eksperyans1

Nan eksperyans sa a, ki te fèt nan sis sesyon, tou de COC soti nan prepibète (mwayèn laj=9 mwa, n=660) ak granmoun (mwayèn laj =39mwa, n=674) bèf yo te kolekte pou evalye kalite oosit ak potansyèl devlopman nan ovosit ki gen laj ak fizyolojik matirite ak efè UA pou sove fètilite fi. COC yo te owaza divize an 8 gwoup: (1) kontwole gwoup prepibètè, COC ki soti nan ti towo bèf prepibètè ki gen matirite pou 22 h (n=148); (2) UA gwoup prepibètè, COC ki soti nan ti towo bèf prepibètè ki gen matirite nan mwayen siplemantè ak 1 uM nan UA pou 22 èdtan (n=155);(3)kontwole ki gen laj 30 èdtan gwoup prepibète, COC ki soti nan ti towo bèf prepibètè ki gen laj jiska 30 èdtan nan matirite nan oitro (n{=149);(4)UA ki gen laj 30 èdtan gwoup prepibètè, COC ki soti nan ti towo bèf prepibètè ki gen laj nan vitro pou 30h nan mwayen spirasyon siplemantè ak 1 uM nan UA(n=144);(5) gwoup adilt kontwòl, COC soti nan bèf adilt ki gen matirite pou 22h (n=155 );(6) gwoup adilt UA, COC ki soti nan bèf adilt ki gen matirite nan mwayen siplemantè ak 1 uM UA pou 22 h (n=129);(7) gwoup adilt ki gen laj 30 h kontwole, COC soti nan bèf adilt ki gen laj jiska 30 h nan matirite nan oitro (n=148); ak (8) UA ki gen laj 30 h gwoup adilt, COC ki soti nan bèf adilt ki gen laj nan oitro pou 30 h nan mwayen spirasyon siplemantè ak 1 uM nan UA(n=138).benefis cynomoriumApre peryòd matirite in vitro respektif yo, yo te ensemine ovosit ak espèm towo bèf ki dekonjle. Imedyatman, yo te evalye devlopman anbriyon an, evalye tou de pousantaj anbriyon k ap fè ak pwodwi, ansanm ak bon jan kalite yo.

Anplis de sa, nan eksperyans sa a, COC nan chak gwoup yo te rekipere pou evalye etap spirasyon nikleyè yo (kontwole gwoup prepibètè, n=7; UA gwoup prepibètè, n =7; kontwòl ki gen laj 30 h gwoup prepibètè, n{ {3}}; UA ki gen laj 30 h gwoup adilt, n=6; kontwole gwoup adilt, n=16;UA gwoup adilt, n=21;kontwole ki gen laj 30 h gwoup adilt, n{ {9}}; UA ki gen laj 30 h gwoup adilt, n=18). Yo te evalye potansyèl manbràn mitokondriyo (MP) COC yo tou (kontwòl gwoup prepibète, n=10; UA gwoup prepibète, n{ {13}};kontwole gwoup adilt ki gen laj 30 h, n=9; gwoup adilt UA ki gen laj 30 h, n=9; gwoup adilt kontwole, n=15; gwoup adilt UA, n{ {19}}; kontwole gwoup adilt ki gen laj 30h,n=10;UA ki gen laj gwoup adilt 30h,n=14).

2.1.3.Eksperyans2

Kòm GC yo jwe yon wòl esansyèl nan kwasans folikulèr ak devlopman oosit, yo te fè yon dezyèm eksperyans nan senk sesyon pou plis etidye efè laj ak UA sou ekspresyon NFE2L2, NQO1, ak mt-ND5. Yo te evalye kantite kopi jèn mt-ND5 tou. Yo te jwenn GC apre santrifijasyon likid folikilè aspire nan òvèj prepibète (laj mwayèn=10 mwa) ak bèf adilt (laj mwayèn =62mwa). Selil sa yo te kiltive nan kondisyon sa yo: (1) kontwòl prepibète, kilti GC nan ti towo bèf prepibète; (2) UA prepibètè, kilti GC nan ti towo bèf prepibètè ki konplete ak 1 uM UA;(3)kontwòl adilt, kilti GCs nan bèf adilt; ak (4) granmoun UA, kilti GCs de bèf adilt siplemantè ak 1 uM UA. Apre konfluyans GC yo nan 5yèm jou kilti yo, yo te jele nan nitwojèn likid, epi pita yo te ekstrè ADN ak RNA, sa ki te pèmèt quantification ki vin apre a nan transkripsyon mRNA NFE2L2, NQO1 ak mt-ND5 epi tou nimewo kopi mt-ND5.

2.2. Koleksyon Ovosit ak Matirite In Vitro

òvèj ki soti nan bèf adilt ak prepibètè (test anvan yo, n {{0}} ak eksp. 1, n{=1334) yo te ranmase nan yon labatwa lokal, epi yo te kenbe nan 35-37 degre, nan yon saline phosphate-buffered (PBS) complétée ak 0.15 pousan albumin sewòm bovine (w/v, BSA) complétée ak 0.05 mg mL-l kanamycin. Nan laboratwa a, yo te aspire folikulèr ovè ki gen 2-8 mm an dyamèt ak yon zegwi 19-. Se sèlman COC ki gen omwen twa kouch selil kimil kontra enfòmèl ant ak yon ooplasm omojèn yo te lave epi chwazi pou spirasyon dapre konsepsyon eksperimantal la.jasent dezèMatirite te akonpli nan yon enkibatè nan 38.8 degre, 5 pousan CO2 nan lè imidifye pou 22 oswa 30 èdtan nan yon mwayen spirasyon ki konpoze de mwayen kilti tisi 199 (TCM) ak 10 pousan nan serom fetis bovin, 0.2mM sodyòm. piruvat, 10 ng mL-l nan faktè kwasans epidèm, ak 10 μL mL-l nan gentamicin【40】.

2.3.Granulosa Selil Koleksyon ak Kilti

Selil granuloza yo te jwenn nan likid folikilè refè apre santrifujasyon pou 10 min nan 200x g [41]. Yo te sispann granules a nan 1 mL mwayen kilti (TCM199 plis 10 pousan serom) pou fè yon lòt santrifujasyon pou 5 min. Nouvo granules la te resuspend nan 1 mL nan mwayen kilti swa complétée ak 1 uM nan UA oswa ou pa selon konsepsyon eksperimantal la ak omojeneize ak yon sereng tache ak yon zegwi 19G, omwen 30 fwa pou detache selil yo. Apre evalyasyon viabilite GC (koloran ble tripan, 0.4 pousan w/v), selil yo te simen nan yon konsantrasyon 2 × 105 selil solid mL -1 epi kiltive pandan senk jou nan 38.8 degre, 5 pousan CO2 nan yon imidite imidite. atmosfè jiska konfluans. Nan chak 48 èdtan, mwayen kilti a te egzeyate ak rafrechi ak yon nouvo. Pou ekstraksyon ADN ak RNA, GC yo te kolekte epi lave pa santrifujasyon nan 200x g pou 10 min. Granules selil yo te resuspend nan 1 mL PBS, imedyatman menen jele nan nitwojèn likid, epi estoke nan -80 degre.

2.4. Matirite Nikleyè Oosit

Etap spirasyon nikleyè yo te evalye apre peryòd 22h oswa 30h nan spirasyon in vitro.metòd ekstraksyon flavonoid pdfYo te fikse ovosit denuded nan yon solisyon asid acetic / etanòl (1:3, v / v), epi yo te kenbe nan 4 degre pou 48 èdtan. Lè sa a, ovosit yo te tache ak 1 pousan solisyon aceto-lacmoid, monte nan yon chanm Neubauer, epi yo obsève anba yon mikwoskòp kontras faz (Olympus BX41). Ovocytes yo te klase jan sa a: Vesicle jèminal (GV), Kondansasyon Chromo-somes I (CCI), Kondansasyon Kwomozòm II (CCII), Dyakinesis, Anaphase-I/Telophase-I (AI/TI), ak MII (Metaphase-II) . Se sèlman ovosit ki gen tach kwomatin vizib yo te pran an kont [42].

2.5. Evalyasyon potansyèl manbràn mitokondriyo

Pou mezire potansyèl manbràn mitokondriyo (MP), yon endikatè nan aktivite mitokondriyo, yo te tache mitokondri ak 5, 6, 6'-tetrachloro-1, 1', 3, 3'tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1 , Invitrogen, Waltham, MA, USA). Yo te enkube ovosit denuded ak 5 ug mL-l JC-1 [37] nan yon mwayen spirasyon pou 30 min nan 38.8 degre ak 5 pousan CO2 nan lè imidite nan fè nwa. Oosit yo te lave de fwa nan PBS epi imedyatman transfere nan yon vè glise pre-chofe epi obsève anba yon mikwoskòp fliyoresan (Olympus BX51) lè l sèvi avèk filtè a fliyoresan ble (BP 470-490 objektif UPlanFI 20 ×/0.50). Yo te kalkile potansyèl manbràn mitokondriyo kòm rapò ki mezire fluoresans wouj / vèt la lè l sèvi avèk lojisyèl Imaj] (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). 2.6.Filizasyon an vitro ak kilti anbriyon

Yo te fè fekondasyon an vitro ak espèm yon ti towo bèf Holstein-Frisyen ki jele-degel, ki te deja soumèt nan kapasite ak metòd gradyan Percoll (45 ak 90), nan yon konsantrasyon 2 x 10 degre espèmatozoyid mL-4.COCs ak espèm yo te ko-enkube pou 20 èdtan nan 38.8 degre ak 5 pousan CO2 nan lè imidite. Lè sa a, zigòt sipoze yo te transfere nan ti gout nan medyòm sentetik oviductal (SOF) ki konplete ak BME ak MEM asid amine, glutamin, glutatyon, ak BSA [40]. Apre 48 èdtan nan fekondasyon an, yo te pase pousantaj klivaj (anbriyon klivaj pou chak total ovosit enseminasyon) epi yo te kenbe anbriyon klivaj nan SOF siplemantè ak BSA ak 10 pousan nan serom fetal bovine (FBS). Anbriyon yo te kiltive pou 12 jou [41,43] pou evalye to devlopman blastocyst (nan jou 7,9, ak 12; D7 anbriyon pou chak anbriyon cleaved) ak to anbriyon kale (anbriyon kale pou chak anbriyon D7) ak kalite yo [43]. Jou 7 anbriyon yo te klase kòm klas 1 (bon kalite), 2 (bon kalite), ak klas 3 (move kalite) [4].

2.7.DNA ak RNA Ekstraksyon ak Quantification

Yo te izole total ADN ak RNA nan GC yo lè l sèvi avèk High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Basel, Swis) ak PureLinkTM RNA Mini Kit (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA), respektivman, dapre enstriksyon manifakti a. Pwotokòl sa yo enkli itilizasyon kolòn vire yo itilize pou izole ADN total ak RNA ak DNase bon jan kalite kòm yon tretman pou retire ADN jenomik nan RNA[40]. Apre ekstraksyon, echantiyon yo te estoke nan -80 degre. Konsantrasyon ak kalite ADN ak RNA yo te detèmine lè l sèvi avèk yon NanoDropTM One/OneC Spectrophotometer (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA).

2.7.1. Sentèz ADN konplemantè

Sentèz ADN konplemantè (cDNA) ki soti nan izolat RNA yo te fèt lè l sèvi avèk Xpert cDNA Synthesis Mastermix kit (GRiSP, Porto, Pòtigal, dapre enstriksyon manifakti a. RNA te ranvèse transkri lè l sèvi avèk 500 ng nan RNA ekstrè soti nan chak echantiyon fè sentèz cDNA, ki te fèt lè l sèvi avèk yon thermocycler (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).CDNA yo te estoke nan -20 degre jiskaske yo itilize pou plis tès. 2.7.2.Primer Design.

Pou etid sa a, yo te fèt primè pou sible yo (NFE2L2 ak NQO1) ak yon jèn kontwòl andojèn (6-aktin) lè l sèvi avèk lojisyèl Primer-BLAST nan Sant Nasyonal pou Enfòmasyon sou Bioteknoloji (NCBI) (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, jwenn aksè nan dat 6 mas 2020). Yo montre sekans primè pou jèn referans yo ak jèn sib yo nan Tablo 1. Anplis de sa, yo te itilize jèn mt-ND5 nan travay sa a, epi yo te jwenn detay sou premye mt-ND5 nan yon etid anvan [45].

2.7.3.Kantitatif Reverse-transcription Polymerase Chain Reaction

Yo te fè analiz PCR an tan reyèl lè l sèvi avèk Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X ak ROX nan yon thermocycler QuantStudio 3 (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA), lè l sèvi avèk cDNA nan yon konsantrasyon 25 ng uL-l. Evalyasyon kantite kopi ADN mitokondriyo (mt-DNA) jèn ND5 la te fèt pa qPCR atravè ADN ki te deja ekstrè, lè l sèvi avèk ekipman menm jan ak pou quantification jèn yo. Chak reyaksyon optimize te fèt, ki gen ladan Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X ak ROX, Jadendanfan (Forward and Reverse) nan chak jèn sib, echantiyon (cDNA/DNA), ak RNase-gratis dlo ki fè yon volim total de 10 μL. Yo te analize echantiyon yo an kopi ak reyaksyon ki gen dlo olye pou yo modèl yo te enkli kòm kontwòl negatif. Echantiyon yo te sibi yon pwotokòl anplifikasyon ki konsiste de yon sik inisyal nan 95 degre pou 2 min nan faz denaturasyon, ki te swiv pa 40 sik denaturasyon nan 95 degre pou 55s, 40 sik rkwit pou 30 s nan 60 degre (ki depann sou tanperati a k ap fonn nan). sekans primè), ak faz ekstansyon nan 72 degre pou 30 s epi, anfen, yon peryòd ekstansyon final nan 72 degre pou 10 min.

Pou quantifikasyon ekspresyon jèn yo, yo te itilize metòd quantifikasyon relatif la. Metòd sa a nan quantification relatif nan ekspresyon jèn yo te pote soti ak nivo yo ekspresyon nan jèn yo sib anba etid, ki te nòmalize ak jèn yo antretyen, pa metòd la konparatif CT. Kòm anplifikasyon RT-qPCR te fèt an kopi, yo te detèmine valè CT mwayèn pou chak jèn epi yo te kalkile nivo ekspresyon yo lè l sèvi avèk fòmil sa a:

kote △Ct=Jèn sib Ct -Ct jèn kontwòl andojèn.

Pou quantification kantite kopi mt-DNA yo, yo te itilize quantification relatif nòmalize kont metòd mas inite a. Metòd sa a te pote soti ak valè CT nan GC yo trete ak UA (yo te rele kòm yon tès), ki te nòmalize ak echantiyon kontwòl (aktyèlman deziyen kòm kalibratè). Kòm nimewo kopi mt-ND5 la te evalye pa qPCR epi yo te fè an kopi, yo te detèmine valè CT mwayèn pou echantiyon tès yo ak kalibratè yo epi yo te kalkile rapò yo lè l sèvi avèk fòmil sa a: