Anti-aje Faktè Fonksyonèl ak Mekanis nan Cistanche Deserticola
May 21, 2024
[Résumé] Objektif: Pou eksplore lafaktè fonksyonèl anti-ajeak mekanis nan sibstans la manjab ak medsinCistanche deserticolabaze sou famasi rezo akan vivoeksperyans nan òganis modèl laCaenorhabditis elegans. Metòd: sib potansyèl de pi gwo konpozan nanC. deserticola yo te prevwa pa Baz done ak analiz Farmakoloji Sistèm Medsin Chinwa Tradisyonèl (TCMSP), SwissTargetPrediction, GeneCards, Online Mendelian Eritaj nan Man (OMIM), ak lòt baz done. Objektif yo prevwa yo te antre nan platfòm analiz rezo STRING pou jwenn rezo a entèraksyon pwoteyin-pwoteyin (PPI) nan eleman aktif yo ak sib maladi, konsa tankou depistaj sib debaz yo. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analiz anrichisman chemen yo te itilize pou predi ak analize chemen aji, epi Cytoscape te konstwi rezo konpozan-sib-chemen medikaman-aktif.C. eleganste divize an yon gwoup vid akC. deserticolagwoup ki gen diferan konsantrasyon. Lavi a, kapasite repwodiktif, ak kapasite fè egzèsis nanC. elegansyo te obsève dirèkteman. Aktivite superoksid dismutase (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ak kontni malondialdehyde (MDA) ak espès oksijèn reyaktif (ROS) nanC. elegansyo te detèmine pa tès twous la. Yo te itilize reyaksyon chèn polymerase quantitative an tan reyèl (qRT PCR) pou detèmine ekspresyon jèn ki gen rapò ak dire lavi ak chanjman kapasite estrès nanC. elegans. Rezilta yo: Faktè fonksyonèl potansyèl yo ka aji sou75sib ki gen rapò ak aje, ak8pwoteyin sib debaz, ki gen ladan pwoteyin chòk chalè HSP90- (HSP90AA1), reseptè estwojèn (ESR1(, GTPase Hras (HRAS), prothrombin (F2), metaloproteinaz matris-2 (MMP2), hexokinase-2 (HK2), sikraz-izomaltase (SI) ak maltase-glukoamilaz (MGAM), yo te depistaj pa analiz topoloji. Analiz KEGG te montre ke Cistanche deserticola te kapab entèfere ak27chemen ki gen ladan chemen siyal estwojèn, chemen siyal kansè, chemen siyal GnRH, ak chemen siyal ensilin pou retade aje.Cistanche deserticolaka siyifikativman pwolonje tan an siviv mwayèn ak amelyore kapasite nan estrès oksidatif nanC. elegans, amelyore aktivite SOD, CAT ak GSH-Px, epi redwi akimilasyon ROS ak MDA, ak ekspresyon dedaf-2epilaj-1yo te diminye, pandan y ap ekspresyon nandaf-16ak jèn sib en li yo (gazon-3, mtl-1, gst-4,ctl-1epictl-2) yo te ogmante, osi byen keskn-1ak jèn ki gen rapò ak chòk chalè (hsf-1, hsp-16.1epihsp-16.2). Konklizyon: se famasi a rezo aplike yo eksplike mekanis nan posib nanC. deserticolanan anti-aje, e li te pwouve keC. deserticolaka pwolonje lavi a nanC. elegansak amelyore kapasite anti-estrès la. Mekanis nan ka gen rapò ak anpèchman nan chemen an siyal ensilin ak aktivasyon nan faktè transkripsyon yo en nan.mafreze16ak chalè chòk ki gen rapò-gènes, konsa amelyore kapasite estrès oksidatif nanC. elegans.
Mo kle:Cistanche deserticola YC Ma; anti-aje; faktè fonksyonèl; mekanis; estrès oksidatif
ÈKSTRÈ CISTANCHE AK 75% GLYCOSIDE
Cistanche deserticola YC Mase yon presye materyèl tradisyonèl Chinwa medsin nan peyi mwen an. Li se ke yo rekonèt kòm "Dezè Ginseng". Li te premye anrejistre nan "Shen Nong's Materia Medica" epi li nan lis kòm klas siperyè. Li gou dous, sale, cho nan lanati, epi li retounen nan ren yo ak meridyen gwo trip. Medikaman tradisyonèl Chinwa kwè ke li gen efè nouris Yang nan ren, ranplir sans ak san, ak idrate trip yo ak laksatif[1]
. Nan 2018, Cistanche deserticola (dezè) te enkli nan "Katalòg la nan sibstans tradisyonèlman tou de manje ak Chinwa materyèl medsin" [2], ak valè li yo nan devlope nan pwodwi sante yo te rekonèt. Dapre estatistik, frekans nan Cistanche deserticola nan preskripsyon anti-aje ak pwolonje lavi se dezyèm sèlman nan jinsang [3]. Modèn rechèch famasi montre ke Cistanche deserticola gen antioksidan enpòtan, anti-aje, anti-fatig, amelyorasyon memwa ak lòt efè [4], men faktè fonksyonèl li yo ak mekanis anti-aje yo toujou klè. Caenorhabditis elegans (ki refere yo kòm nematod) se yon òganis miltiselilè ki gen yon background jenetik klè, yon lavi relativman kout, repwodiksyon rapid, ak kilti fasil. Kòm lavi li ogmante, li montre yon fenotip aje ki sanble ak sa moun. C. elegans jèn, pwoteyin, ak chemen siyal yo trè konsève ak imen.
Li gen 60% a 80% omoloji ak jèn imen. Nan dènye ane yo, nematod yo te lajman itilize nan rechèch anti-aje nan medikaman tradisyonèl Chinwa ak medikaman natirèl [5]. Etid sa a sèvi ak metòd famasi rezo pou predi engredyan aktif, objektif ak chemen siyal Cistanche deserticola nan reta aje; lè l sèvi avèk nematod kòm òganis modèl, lè yo obsève lavi yo, repwodiksyon ak lòt endikatè jeneral yo, chanjman yo nan estrès oksidatif, kapasite egzèsis ak relasyon yo ak lavi yo mezire ekspresyon jèn ki gen rapò, eksplore mekanis Cistanche deserticola nan reta aje, ak bay. enfòmasyon pou sante ki gen rapò
Bay referans pou devlopman ak aplikasyon pwodwi sante yo.
1 Materyèl
1. 1 Enstriman
SMZ-168 mikwoskòp stereo (konpayi Motic); CKX41 envèse faz kontras mikwoskòp fluoresans (konpayi Olympus); Multiskan FC lektè microplate (Thermo Fisher konpayi syantifik); Mycycler polymerase chain reaction (PCR) anplifikatè jèn, MJ Mini™ fluoresans PCR quantitative enstriman (Bio-Rad Company).
1. 2 Tès medikaman
Cistanche deserticola te kolekte nan baz plante Cistanche deserticola bon pratik agrikòl (GAP) nan Yutian County, Xinjiang. Li te idantifye pa chèchè Zhang Tiejun nan Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co, Ltd kòm Cistanche deserticola YC Ma; 2ʹ,7ʹ-dichlorodihydrofluorescein diethyl asid ester (DCFH DA), 2% NaN3 (Sigma Company); Trizol reyaktif, cDNA sentèz twous, SYBR Green Twous (Takara Bioengineering Co., Ltd.); superoksid dismutase (SOD), twous katalaz (CAT), twous glutatyon peroksidaz (GSH Px), twous malondialdehyde (MDA) (Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.); fliyoresan reyaksyon chèn polymerase quantitative (qRT PCR) Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd. te sentetize primè obligatwa yo, epi sekans Jadendanfan yo montre nan Tablo 1.
1.3 Nematod
10 diferan kalite jenetik nematod yo te itilize nan eksperyans la te soti nan Sant Jenetik Caenorhabditis. Enfòmasyon detaye yo montre nan Tablo 2.
2 Metòd
2.1 Depistaj faktè fonksyonèl Cistanche deserticola ak objektif yo
Lè yo revize literati a ak konbine gwoup rechèch sa a karakterizasyon anvan yo nan gwoup materyèl Cistanche deserticola, konpozan chimik prensipal yo ak eleman san yo te tès depistaj soti [{{0}}]. Desine estrikti konpoze an nan lojisyèl ChemDraw 19.0, antre li nan baz done SwissTargetPrediction (http://new.swisstargetprediction.ch/), epi sèvi ak metòd ranvèse pharmacophore matche pou jwenn rezilta tès depistaj vityèl. An menm tan an, yo te itilize baz done ak analiz baz done ak analiz sistèm medsin tradisyonèl Chinwa a (TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php). Sèvi ak fonksyon rechèch UniProtKB nan baz done UniProt (http://www.uniprot.org/) epi revize
Swiss-Prot filtre pwoteyin yo, limite espès yo nan "moun", epi korije pwoteyin sib konpoze an nan non jèn yo. Entegre rezilta sib yo nan de baz done yo jwenn yon bibliyotèk sib potansyèl nan konpoze.
2.2 Analiz prediksyon objektif ki gen rapò ak aje
Sèvi ak baz done GeneCards (https://www.genecards.org/) ak OMIM (https://omim.org/) pou fè rechèch ak mo kle "old, senile, decrepit, senescence, feeble, caducity", kote GeneCards GeneCards ak yon nòt ki pi gran pase oswa egal a 10% yo te tès depistaj, rezilta yo nan de baz done yo te fizyone, yo te elimine jèn kopi, epi yo te finalman jwenn objektif ki gen rapò ak aje. Lè sa a, konbine sib faktè fonksyonèl anba atik 2.1 ak sib ki gen rapò ak aje yo mansyone anwo a, pran entèseksyon an, epi trase yon dyagram Venn.
2.3 Konstriksyon rezo entèraksyon pwoteyin-pwoteyin (PPI).
Antre sib entèseksyon yo jwenn nan platfòm done STRING 11.5 (http://string-db.org/), limite espès yo a "Homo sapiens", pi wo nivo konfyans nan nòt entèraksyon an se 0.900, epi jwenn rezo PPI a. Sove done yo nan fòma .TSV epi enpòte nan Cytoscope
3. 8. 0 lojisyèl, ajiste gwosè ne ak pwofondè koulè ak valè degre pou jwenn rezo PPI nan engredyan aktif Cistanche deserticola ak objektif maladi. Pwen ki gen twa paramèt degre, ant, ak pwoksimite yo te pi gran pase medyàn yo te chwazi kòm sib debaz, epi yo te jwenn yon total 8 sib debaz apre tès depistaj.
2. 4 Gene Ontology (GO) Bioanalysis ak Kyoto Genes and Genes
Analiz anrichisman chemen Ansiklopedi Gwoup yo (KEGG) itilize baz done OmicsBean (http://www.omicsbean.cn/login/) pou fè analiz fonksyonèl GO ak analiz anrichisman chemen KEGG sou objektif entèseksyon yo, sòt selon valè P, epi Analize chemen ki kapab lakòz yo.
2.5 Materyèl medsin-konpozan-sib-chemen konstriksyon rezo
Enpòte materyèl medsin, konpozan, sib, ak chemen nan Cytoscope 3.8.0 lojisyèl pou konstwi yon rezo materyèl-konpozan-sib-chemen Cistanche deserticola.
2.6 Kilti nematod
Nematod yo te kiltive nan 20 degre lè l sèvi avèk mwayen NGM (ki gen 0.750 g NaCl, 0.625 g tryptone ak 4.250 g agar nan 250 mL dlo doub distile). Escherichia coli OP50 esterilize (65 degre, 45 min) te itilize kòm yon sous manje ak respire gaye sou sifas mwayen kilti NGM. Sèvi ak solisyon liz (5% NaClO, 5 mol·L–1 NaOH) pou senkronize nematod yo, epi kiltive nematod senkronize yo nan etap L4 nan yon enkibatè 20 degre. L4 etap nematod yo te chwazi owaza epi divize an gwoup kontwòl (NGM mwayen) ak gwoup administrasyon Cistanche deserticola ak diferan konsantrasyon mas pou eksperyans.
2.7 Preparasyon dwòg
Pran 1 0 g Cistanche deserticola materyèl medsin, ajoute dlo distile selon rapò materyèl-likid 1:10, rflu ak ekstrè de fwa, 2 h chak fwa, konbine ekstrè dlo yo, filtre ak konsantre nan sechrès anba. presyon redwi. Sèvi ak dlo distile esteril pou prepare yon solisyon manman ak yon konsantrasyon mas 50 mg·mL–1 (ki baze sou kantite dwòg brit). Sèvi ak mwayen kilti NGM pou prepare solisyon ak konsantrasyon mas final 0, 25, 50, 75, 100, 200, ak 500 ug·mL–1 pou itilize pita.
2.8 Tès toksisite
N2 nematod yo te transfere nan plat Petri ki gen diferan konsantrasyon mas Cistanche deserticola (0, 25, 50, 100, 200, 500 ug·mL-1), 100 nan chak gwoup. Jou administrasyon an te konte kòm jou 0. Chanje mwayen ki gen medikaman fre chak jou epi anrejistre lanmò nematod pou jwenn seri dòz Cistanche deserticola san danje.
2.9 Eksperyans estrès
N2 nematod yo te transfere nan selil ki gen diferan konsantrasyon mas Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 ug·mL–1).
) nan plat Petri a, 100 nan chak gwoup. Jou administrasyon dwòg la te konte kòm jou 0. Yo te ranplase nouvo mwayen kilti ki gen dwòg chak jou. Yo te fè yon eksperyans estrès sou 7yèm jou administrasyon dwòg la. Nan eksperyans nan estrès oksidatif, nematod ki soti nan chak gwoup yo te transfere nan mwayen NGM (10 μL nan 30% H2O2 te ajoute nan chak 10 mL nan mwayen NGM), ak siviv nan nematod yo te anrejistre chak 30 min. Nan eksperyans estrès chalè a, nematod yo te kontinyèlman ekspoze a 35 degre ak kiltive, epi estati siviv nematod yo te anrejistre chak 2 èdtan.
2. 10 Eksperyans koube kò
Pran nematod N2, gwoupe yo epi administre menm tretman ki nan 2.9. Sou 3yèm ak 7yèm jou apre administrasyon dwòg la, yo te fè yon eksperyans koube kò. 20 nematod yo te pran nan chak gwoup, epi kantite koube kò nematod yo nan 30 s yo te detekte ak anrejistre.
2. 11 Eksperyans ponp farinj
Pran N2 nematod, gwoupe epi administre yo nan menm kondisyon ak 2.9, mete 1 nematod nan chak plat Petri, epi mete 5 paralèl pou chak konsantrasyon mas. Obsève anba yon stereomikwoskòp nan jou 0, 3, ak 7 nan administrasyon an. Yo te obsève frekans vale a nan nematod pou 60 s chak fwa epi yo te anrejistre kantite ponp farinj lan.
2.12 Eksperyans repwodiksyon
Pran nematod L1 etap N2 epi mete yo nan medyòm dwòg-medikaman epi kiltive yo nan etap L4 la. Lè sa a, transfere yo nan nouvo mwayen ki gen dwòg ak konsantrasyon mas diferan chak jou, epi mezire kantite ze nematod yo mete. Yo mete ansyen plak ki gen ze yo apre kiltive pou 48 èdtan nan 20 degre, yo te detèmine kantite pitit pitit yo. Chak plat Petri gen 1 nematod, ak 5 paralèl yo mete pou chak konsantrasyon mas.
2.13 Detèminasyon akimilasyon lipofuscin
Pran N2 nematod, gwoup epi administre tretman yo menm jan ak nan 2.9, ak 100 nematod nan chak gwoup. Eksperyans mezi Lipofuscin yo te pote soti nan 7yèm ak 11yèm jou nan administrasyon dwòg la. 35 nematod yo te chwazi owaza epi mete yo sou fèy agaroz 2%, anestezi ak 2% NaN3, epi yo itilize yon mikwoskòp fliyoresan (longèdonn limyè eksitasyon an te 360 ~ 370 nm, ak limyè ki emèt (longèdonn: 420 ~ 460 nm) Obsève ble a. otofluoresans nan nematod la, epi sèvi ak lojisyèl imageJ 1.51 pou quantifier entansite fliyoresans lan.
2. 14 Detèminasyon MDA, kontni ROS ak aktivite anzim antioksidan
Pran N2 nematod, gwoup epi administre menm tretman ak nan 2.9, ak 100 nematod nan chak gwoup. Nan 7yèm jou apre administrasyon an, nematod yo sou mwayen kilti chak gwoup yo te lave ak 0.9% solisyon klori sodyòm epi yo te kolekte nan yon tib santrifij 1.5 mL, omojeneize sou glas, ak santrifuje nan 3000 r·min{{ 10}} pou 10 min (reyon santrifujeur 42. 5 mm), pran supernatant la apre santrifujasyon, epi sèvi ak yon twous pou mezire aktivite SOD, CAT, GSH-Px ak kontni MDA. Nan eksperyans detèminasyon ROS la, nematod yo te lave twa fwa ak tanpon M9, yo te mete yo nan yon solisyon DCFH-DA ak yon konsantrasyon final 10 μmol·L-1, epi yo te enkube a 37 degre nan fè nwa a pou 20 minit, souke chak 5. min. Lè sa a, lave de fwa ak tanpon M9, epi mete nematod yo sou yon glise an vè. Pran foto lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan (longèdonn limyè eksitasyon 485 nm, longèdonn limyè emisyon 520 nm), epi sèvi ak lojisyèl ImageJ 1.51 pou evalye entansite fluoresans relatif.
2. 15 Faktè akselere dekonpozisyon -16 (DAF-16), translokasyon nikleyè SKN-1 ak SOD-3, glutatyon S-transferaz-4 (GST{{ 8}}), pwoteyin chòk chalè -16. 2 (HSP -16. 2) Vizyalizasyon lè l sèvi avèk nematod transjenik TJ356 ak LG333 respektivman pou eksperyans translokasyon nikleyè pwoteyin DAF-16 ak SKN-1.
CF1553, CL2166, ak TJ375 transjenik nematod yo te itilize pou detèmine ekspresyon SOD-3, GST-4, ak HSP-16.2 pwoteyin. Gwoupman ak administrasyon se menm jan ak sa ki anba 2.9. Nan 7yèm jou apre administrasyon dwòg, yo te itilize yon mikwoskòp fliyoresan pou pran foto nematod nan chak gwoup, epi yo te itilize lojisyèl ImageJ 1.51 pou quantifier entansite fluoresans GFP.
2. 16 Detèminasyon lavi nematod mutan yo
Eksperyans yo te fèt lè l sèvi avèk CF1038, EU1, PS3551, ak DA1116 nematod, respektivman, epi yo te divize an gwoup kontwòl ak gwoup administrasyon Cistanche deserticola 75 ug·mL-1. Yo te konte pousantaj siviv nematod nan chak gwoup chak jou. 2. 17 eksperyans qRT-PCR: L4 etap N2 nematod yo te transfere nan mwayen kilti NGM (ki gen 150 μmol·L-1 pentfluorouracil) ki gen diferan konsantrasyon mas nan Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 ug·mL-1), 20 Enkube nan degre pou 6 jou. RNA total ki soti nan nematod yo te ekstrè lè l sèvi avèk metòd Trizol la ak ranvèse transkri nan cDNA pou quantifikasyon mRNA. Done yo te trete lè l sèvi avèk metòd 2-ΔΔCt, epi yo te itilize aji -1 kòm jèn referans entèn la.
2. 18 Analiz done
Yo te itilize lojisyèl SPSS 19.0 pou analiz estatistik, epi done yo eksprime kòm (-x ± s). Diferans ant gwoup yo te analize pa yon sèl-fason ANOVA, ak P<0.05 was considered a statistically significant difference.
3. Rezilta
3.1 Engredyan potansyèl aktif ak objektif Cistanche deserticola
Lè yo revize literati a ak konbine avèk rechèch anvan gwoup rechèch sa a, 12 eleman chimik ki gen ladan glikozid fenilethanoid, iridoid ak lignan yo te chwazi kòm konpoze sib pou rechèch famasi rezo. Enfòmasyon espesifik yo montre nan Tablo 3. Apre yo fin retire kopi nan baz done a, yo te jwenn yon total 86 sib pou 12 potansyèl engredyan aktif.
