Pwopriyete Anti-Melanogenic Velutin ak Analog li yo

Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

Se-Hui Jung 1,‡, Hee-Young Heo 1,‡, Jung-Won Choe 1, Jaehyun Kim 1 ak Kooyeon Lee 1,2,*

Résumé:Velutin, youn nan flavon ki genyen nan plant natirèl, gen divès kalite aktivite benefisye, tankou blanchiman po, osi byen ke anti-enflamatwa, anti-alèji, antioksidan, ak aktivite antimikwòb. Sepandan, relasyon ki genyen ant estrikti a nanjelatinak aktivite anti-melanogenesis li yo poko envestige. Nan etid sa a, nou te jwenn 12 dérivés jelatin ranplase nan C5, C7, C30, ak C40 nan zo rèl do flavon ak fonksyon idwojèn, idroksil, ak metoksi pa sentèz chimik, fè analiz SAR nan analogu estriktirèl velutinous. Etid SAR la te revele ke sibstitisyon gwoup fonksyonèl nan C5, C7, C30, ak C40 nan zo rèl do flavon yo afekte aktivite byolojik ki gen rapò ak sentèz melanin. Konvivans idwoksil ak methoxy nan pozisyon C5 ak C7 esansyèl pou anpeche aktivite tirozinaz. Sepandan, 1,2-konpoze dyol ranplase nan C30 ak C40 nan zo rèl do flavon pwovoke apoptoz nan selil melanom. Anplis de sa, sibstitisyon nan C30 ak C40 ak metoksid oswa idwojèn esansyèl pou anpeche melanogenesis. Kidonk, etid sa a ta itil pou devlopman materyèl fonksyonèl ki sòti natirèl pou kontwole sentèz melanin.

Mo kle: dérivés jelatin; sentèz melanin; aktivite tirozinaz; etid SAR

benefis cistanche dezè: inibit sentèz melanin

1. Entwodiksyon

Flavon, yon kalite flavonoid ki gen de bag fenil ak yon fonksyonalite benzopyran, yo lajman prezan nan plant natirèl, ki gen ladan legim ak fwi [1]. Nan anpil konpoze, echafodaj flavon yo konsidere kòm estrikti debaz enpòtan ki aji sou divès molekil sib atravè modifikasyon senp. An patikilye, dérivés flavon ak modifikasyon metabolik oswa sentetik yo konnen yo gen aktivite anti-enflamatwa, antiestwojèn, anti-alèji, antioksidan, antimikwòb, anti-tumeur, ak anti-proliferasyon [2-4]. gwoup tankou hydroxyl ak methoxy rezilta nan aktivite byolojik trè diferan. Akòz gwo aktivite byolojik flavon yo, relasyon estrikti-aktivite yo (SAR) te atire enterè nan domèn chimi medsin, ki te ede dekouvri kèk konpoze plon pou soulaje anpil maladi. Pou egzanp, etid SAR anvan an te revele ke, kòm kantite gwoup idroksil yo te ogmante, efè radikal scavenging flavon yo te ogmante [5].

Melanin se yon pigman natirèl ki enplike nan detèminasyon po, je, ak koulè cheve, epi li gen yon wòl enpòtan nan pwoteksyon po kont domaj limyè danjere, tankou reyon iltravyolèt [6-8]. Malgre efè benefik li yo, yon règleman nòmal nan melaninsenthesis responsab pou maladi pigmantè ki gen ladan albinism, vitiligo, melasma, freckles, ak lentigo [9,10]. Melanin se sentèz nan melanosit, ki se selil espesyalize ki sitiye nan kouch fondamantal epidèm la, atravè reyaksyon katalitik milti-etap nan anzim tankou tirozinaz, pwoteyin ki gen rapò ak tirozinaz 1, ak pwoteyin ki gen rapò ak tirozinaz2 [9,11]. Tirozinaz jwe yon wòl kle nan de reyaksyon ki limite vitès nan sentèz melanin, pa idwoksilasyon L-tirozin nan L-3, 4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), ak oksidasyon L-DOPA a. dopaquinone [12]. Se konsa, regilatè divès kalite aktivite tirozinaz yo te etidye pou trete maladi pigmantè [13]. Reyaktif blanchi ki baze sou anpèchman tirosinaz, tankou idrokinòn, asid azelaik, arbutin, ak asid kojik, yo te rapòte pou anpeche ipèpigmantasyon po [11,14]. Sepandan, akòz toksisite selilè yo, efikasite ki ba, ak estabilite ki ba nan prezans oksijèn ak dlo, blanchi engredyan nan pwodwi natirèl yo konsidere kòm nan rechèch kosmetik ak devlopman jaden an pwa estrateji altènatif pou anpeche ipèpigmantasyon.

Velutinous fè pati yon klas flavonoid ki gen gwoup idwoksil, metoksi, metoksi ak idroksil.C5', C7', C3', ak C4'nan zo rèl do a flavon, respektivman (Figi 1).Valyasyon yo jwenn nan kaka a nan fwi akai epi li se konnen yo montre aktivite anti-enflamatwa ak antioksidan [15,16]. Anplis de sa, velutinous jwenn pa deglycosylation nan homo-flavoya-dorinin B nan ekstrè gi gen yon efè inhibition sou tirosinaz ak melanogenesis [8]. Sepandan, relasyon ki genyen ant modifikasyon estriktirèl velutinous ak aktivite anti-tirosinaz li yo ak anti-melanogenesis yo poko envestige.

Nan etid sa a, nou te prepare 12 dérivés jelatin pa sibstitisyon nan C5', C7', C3', andC4' nan zo rèl do flavon ak fonksyon idwojèn, idroksil, ak metoksi, toperform SAR analiz nan evaliasyon pwopriete analogu estriktirèl yo. Tout 12 dérivés yo te evalye pou aktivite inhibition yo kont aktivite tirozinaz ak melanogenesis. Nou te jwenn ke gwoup methoxy nan pozisyon C7 ak gwoup idroksil nan pozisyon C5 ak C40 nan kilè eskèlèt flavon te esansyèl pou gen aktivite inhibition. Anplis de sa, fòm 1,2-diol la ak gwoup idwoksil nan pozisyon C30 ak C40 nan flavon ki pwovoke dapoptoz nan selil melanom yo. Kidonk, rezilta sa yo ta itil pou envestige efè dérivés flavon yo sou byosentèz melanin, ak pou devlope nouvo dwòg chimik pou siprime sentèz melanin.

Ki sa ki itilize cistanche pou: siprime sentèz melanin.

2. Rezilta ak Diskisyon

2.1. Sentèz chimik nan dérivés Velutin

Pou konprann relasyon ki genyen ant modifikasyon estriktirèl kolòn vètebral evalyasyon an ak aktivite byolojik li yo, onz dérivés jelatin (V1–V12, eksepte V11) yo te pwodui chimikman sentèz soti nan 2-idwoksi acetophenone dérivés ak dérivés aldehyde aromat, atravè senk etap konvansyonèl. metòd [17]. Twa dérivés velutinous, V1 (velutinous), V5, ak V8, te sentèz atravè yon reyaksyon sèt etap, jan yo montre nan Scheme 1. Premyèman, fè sentèz 1-(2-(benzyloxy)-6- hydroxy-4-methoxyphenyl) Etan-1-one (V1e), asetofenon bis-MOM-pwoteje (V1b) te sentèz soti nan 20, 40, 60-trihydroxy asetophenone (V1a) ki disponib nan komès (V1a), sibi depwoteksyon. reyaksyon, apre sentèz acetophenone benzylated (V1c), ak sibstitisyon selektif methoxygroup nan pozisyon C4 1-(2-(benzyloxy)-4,6-dihydroxy phenyl)Ethan -1-youn (V1d) te fè. Lè sa a, V1, V5, ak V8 dérivés yo te sentèz pa kondansasyon aldol ki vin apre a, sikilasyon oksidatif, ak rediksyon soti nan acetophenone modifye (V1e).

V2 ak V3 te sentèz atravè reyaksyon ki vin apre, jan yo montre nan Scheme 2; O-alkylation nan R2 ak R1 nan de konpoze asetofenon dihydroxy ki disponib nan komès, kondansasyon aldol, sikilasyon oksidatif, ak depwoteksyon.

Scheme 1. Sentèz dérivés V1, V5, ak V8.

Kat dérivés, ki gen ladan V4, V6, V9, ak V10 yo te sentèz atravè reyaksyon apre, jan yo montre nan Scheme 3; O-alkylation nan C4 ak C6 nan 2', 4', 6'-trihydroxy acetophenone konpoze (V1a), kondansasyon aldol, sikilasyon oksidatif, ak depwoteksyon.

Dérivés V7 la te sentèz atravè reyaksyon ki vin apre yo, jan yo montre nan Scheme 4; pwoteksyon benzil nan C4 ak C6 nan 2', 4', 6'-trihydroxy acetophenone konpoze ki disponib nan komès (V1a), kondansasyon aldol, sikilasyon oksidatif, ak rediksyon.

V12 derive te sentèz atravè yon reyaksyon de etap, jan yo te deja rapòte [18]; kondansasyon aldol de 2'-idwoksi asetofenon ak benzaldeyid ki disponib nan komès, ak sikilasyon oksidatif.

Scheme 2. Sentèz dérivés V2 ak V3.

2.2. Karakterizasyon Dérivés Velutin Sentetik

2.2.1. Sentèz Velutin (V1)

(V1): 1H RMN (400 Mhz, DMSO-d6) δ (12.97 (s, 1H), 10.01 (br, s, 1H), (7.61-7.59) (m, 2H), (6.96-6.94) (m , 2H), 6.80 (d, J=1.52 Hz, 1H), 6.37 (d, J=2.08 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.88 (s, 3H). )).

2.2.2. Sentèz 2-(4-Idroksi-3-metoksifenil)-7-metoksi-4H-kromèn-4-yon sèl (V2)

(V2): 1H RMN (400 Mhz, DMSO-d6) δ (9.88 (s, 1H), 7.92 (d, J=8.84 Hz, 1H), (7.61-7.58) (m, 2H) , 7.32 (d, J=2.36 Hz, 1H), 7.05 (dd, J1=8.80 Hz, J{2=2.40 Hz, 1H), (6.95-6.93) (m, 1H), 6.89 (s, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.91 (s, 3H)).

2.2.3. Sentèz 5-Idroksi-2-({4-idroksi-3-metoksifenil)-4H-kromèn-4-yon (V3)

(V3): 1H RMN (400 Mhz, DMSO-d6) δ (12.85 (s, 1H), (7.69-7.62) (m, 3H), 7.21 (d,J=8.36 Hz, 1H) , 7.07 (s, 1H), 6.96 (d, J=8.16 Hz, 1H), 6.81 (d, J=8.16 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H)).

2.2.4. Sentèz Genkwanin (V4)

(V4): 1H RMN (400 Mhz, DMSO-d6) δ (12.96 (s, 1H), (7.97-7.95) (m, 2H), (6.95-6.92) (m, 2H), 6.85 (s, 1H) ), 6.77 (d, J=2.24 Hz, 1H), 6.38 (d, J=2.28 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H)).

2.2.5. Sentèz 5-Idroksi-7-metoksi-2-({3-metoksifenil)-4H-kromèn-4-yon sèl (V5)

(V5): 1H RMN (400 Mhz, CDCl3) δ (12.71 (s, 1H), (7.45-7.39) (m, 3H), (7.10-7.07) (m, 1H), 6.65 (s, 1H), 6.50 (d, J=2.28 Hz, 1H), 6.38 (d, J=2.24 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.89 (s, 3H)).

2.2.6. Sentèz 2-(4-Idroksi-3-metoksifenil)-5,7-dimetoksi-4H-chromen-4-yon sèl (V6)

(V6): 1H RMN (400 Mhz, DMSO-d6) δ (7.53-7.52) (m, 2H), (6.93-6.86) (m, 1H), 6.86 (d, J=2.24 Hz, 1H), 6.49 (d, J=2.20 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.83 (s , 3H)).

2.2.7. Sentèz Chrysoeriol (V7)

(V7): 1H RMN (400 Mhz, DMSO-d6) δ (12.97 (s, 1H), (7.57-7.55) (m, 1H), 6.93 (d,J=8.92 Hz, 1H) , 6.88 (s, 1H), 6.47 (d, J=1.87 Hz, 1H), 6.16 (d, J=1.91 Hz, 1H), 3.89 (s, 3H)).

2.2.8. Sentèz 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-5-idwoksi-7-metoksi-4H-chromen-4-yon (V8)

(V8): 1H RMN (400 Mhz, DMSO-d6) δ (12.99 (br, s, 1H), (7.47-7.44) (m, 2H), 6.90 (d, J=8.21 Hz, 1H), (6.74-6.73) (m, 2H), 6.38 (d, J=2.24 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H)).

2.2.9. Sentèz 2-(3,4-Dimethoxyphenyl)-5-idwoksi-7-metoksi-4H-chromen-4-yon (V9)

(V9): 1H RMN (400 Mhz, CDCl3) δ (12.80 (s, 1H), 7.53 (dd, J1=8.48 Hz, J2=2.12 Hz, 1H), 7.34 ( d, J=2.08 Hz, 1H), 6.98 (d, J=8.54 Hz, 1H), 6.50 (d, J=2.24 Hz, 1H), 6.37 (d, J=2.22 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.89 (s, 3H)).

2.2.10. Sentèz 2-(3,4-Dimethoxyphenyl)-5,7-dimethoxy-4H-chromen-4-yon sèl (V10)

(V10): 1H RMN (400 Mhz, DMSO-d6) δ (7.64 (dd, J1=8.48 Hz, J2=2.16 Hz, 1H), 7.53 (d, J {{{ 14}}.12, 1H), 7.11 (d, J=8.62, 1H), 6.87 (d, J=2.30, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.50 ( d, J=2.30,1H), 3.91 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.83 (s, 3H)).

2.2.11. 2-Fenilkrom-4-yon sèl (V12)

(V12): 1H RMN (400 Mhz, CDCl3) δ (8.24 (dd, 1H, J1=1.66 Hz, J2=7.94 Hz), (7.96-7.93)(m, 2H ), (7.73–7.69) (m, 1H), (7.59–7.57) (m, 1H), (7.56–7.53) (m, 3H), 7.45–7.41 (m, 1H), 6.84 (s, 1H) ).

Tablo 1. Gwoup sibstitisyon ak pwodiksyon an jeneral nan dérivés velutinous sentèz yo.

2.3. Efè Dérivés Velutin sou Aktivite Radical Scavenging ABTS

Apre sa, yo te evalye aktivite radikal ABTS nan douz dérivés jelatin oswa arbutin (kontwòl pozitif) nan seri konsantrasyon 50-200 µM, ak Tablo 2 bay lis demi-maksimòm konsantrasyon efikas yo (EC50). Pifò dérivés, eksepte V10, te montre aktivite depandan dòz radikal (done yo pa montre), ak valè EC50 ki sòti (5.47-100.13) µM (Tablo 2). An patikilye, V8 ak V11 (luteolin) konpoze ki gen yon estrikti 1,2-dyol-kalite, te montre yon pi bon aktivite radikal scavenging pase lòt dérivés yo. Kontrèman, konpoze V10 oswa V12 ranplase ak methoxy oswa gwoup idwojèn nan C5', C7', C3', ak C40 nan zo rèl do a, pa te gen okenn efè enpòtan sou aktivite radikalscavenging. Rezilta sa yo te endike ke pwezans gwoup hydroxyl la sou zo rèldo thevaluation te kritik pou aktivite scavenging radikal li. Anplis de sa, yon ogmantasyon nan kantite fonksyon methoxy nan C5', C7', C3', ak C40 nan zo rèl do a bese ABTSradical scavenging aktivite.

Tablo 2. Efè inhibition nan dérivés velutinous sou ABTS radikal scavenging ak aktivite tirozinaz djondjon.

2.4. Efè Dérivés Velutin sou Aktivite Inhibition Tirozinaz djondjon

Pou plis konprann efè potansyèl elektwostatik dérivés yo sou aktivite inhibition yo kont tirozinaz, yo te evalye efè inhibition douz dérivés jelatin yo sou tirosinaz djondjon. Senk dérivés jelatin V1, V4, V8, V9, ak V11 te gen potansyèl aktivite inhibition kont tirozinaz djondjon, ak valè IC50 ki te varye 37-910 µM, men sèt lòt dérivés jelatin V2, V3, V5, V6, V9, V10, ak V12. pa te gen okenn efè enpòtan (Tablo 2). Rezilta sa yo te endike ke kantite gwoup hydroxyl nan C5', C7', C3', ak C40 nan zo rèl do flavon te yon faktè enpòtan pou aktivite inhibition yo kont tirozinaz. An patikilye, konpoze V11 la te montre pi ba valè IC50 nan douz dérivés yo, pandan y ap V10 ak V12 pa te gen okenn efè ontyrosinase aktivite enpòtan, sijere ke egzistans gwoup hydroxyl, olye ke gwoup methoxy orhydrogen, nan C5', C7', C3', ak C40 nan zo rèl do a flavon te pi enpòtan pou efè anti-tirozinaz. Anplis de sa, fonksyonalite hydroxyl ak methoxy nan pozisyon R1 ak R2 ta ka jwe yon wòl enpòtan nan anpèchman tirozinaz.

2.5. Sitotoksisite nan dérivés Velutin nan selil melanom

Sitotoksisite se yon enkyetid pou nenpòt ki konpoze potansyèl, epi konsa apre trete selil yo ak dérivés, nou mezire kantitativman sitotoksisite nan onz dérivés jelatin yo ki te gen potansyèl pou anpeche melanogenesis, eksepte pou V12, ki pa te gen okenn potansyèl pou anpeche melanogenesis atravè tès MTT. Nèf dérivés, eksepte V8, V10, ak V11, pa te gen okenn efè enpòtan sou viabilite selil nan konsantrasyon jiska 20 µM (done yo pa montre). Sepandan, tretman an ak V8, V10, ak V11, pwovoke lanmò selil nan yon fason ki depann de konsantrasyon, ak pousantaj lanmò nan 71.8, 24.0, ak 69.7 pousan, respektivman, nan 20 µM (Figi 2). Rezilta sa a endike ke fòm nan 1,2-dyol ak gwoup idroksil nan pozisyon C30 ak C40 nan flavon nan pwovoke apoptoz nan selil melanom, ki te konsistan avèk rapò anvan an ki eksplike sitotoksisite nan dérivés flavonoid nan1,2- fòm dyol, tankou catechin ak epicatechin [19].

Figi 2. Sitotoksisite nan dérivés jelatin nan selil melanom B16F10 yo.

2.6. Efè dérivés Velutin sou Melanogenesis nan selil Melanom

Apre sa, efè nèf dérivés jelatin eksepte V8 ak V11, ki gensitotoksisite, sou melanogenesis ankouraje pa -melanocyte-stimulating òmòn (-MSH) nan selil melanom yo te detèmine. Tretman ak -MSH te ankouraje yon ogmantasyon 1.9-pliye nan kontni melanin nan selil melanom yo (Figi 3A). Nou te jwenn ke -MSH-stimuledmelanogenesis te konplètman inibit pa V1 ak V2 (p <{{10}}.{{20}}01), ak="" pasyèlman="" inibit="" pa="" v3="" (50.7="" pousan,="" p="">< 0.005),="" v4="" (69.1="" pousan,="" p="">< 0.001),="" ak="" v5="" (39.3="" pousan,="" p="">< 0.005),="" pandan="" y="" ap="" -msh-stimile="" melanogenesis="" pa="" te="" siyifikativman="" chanje="" pa="" v7,="" v9,="" ak="" v10="" (figi="" 3a).="" etonan,="" derive="" v6="" la="" siyifikativman="" ogmante="" sentèz="" melanin="" pa="" 3.0-pliye="" (p=""><0.001). rezilta="" sa="" yo="" sijere="" ke="" dérivés="" jelatin="" yo="" ak="" estrikti="" menm="" jan="" an="" men="" diferan="" gwoup="" sibstitisyon="" yo="" gen="" diferan="" aktivite="" byolojik="" sou="" melanogenesis.further,="" aktivite="" yo="" inhibition="" nan="" nèf="" dérivés="" jelatin="" yo="" sou="" -msh-medyatè="" deklanchman="" tirozinaz="" entraselilè="" yo="" te="" detèmine,="" depi="" anzim="" sa="" a="" jwe="" yon="" wòl="" kle="" nan="" melanogenesis.="" .="" tretman="" ak="" -msh="" pwovoke="" yon="" deklanchman="" tyrosinase="" apeprè="" 1.7-pliye="" nan="" selil="" b16f10="" (figi="" 3b).="" kat="" dérivés="" v1="" (87="" pousan,="" p="">< 0.001),="" v3="" (97="" pousan,="" p="">< 0.001),="" v4="" (100="" pousan,="" p="">< 0.001),="" ak="" v5="" (80="" pousan,="" p="">< 0.001)="" ranvèse="" aktivasyon="" tirozinaz="" medyatè="" pa="" -msh,="" tandiske="" kat="" lòt="" dérivés="" v2,="" v7,="" v9,="" ak="" v10="" pa="" t="" '(figi="" 3b).="" rezilta="" sa="" yo="" endike="" ke="" kat="" dérivés="" v1,="" v3,="" v4,="" ak="" v5="" inibit="" -msh-induit="" sentèz="" melanin,="" pa="" anpeche="" aktivite="" a="" tirozinaz="" intraselilè="" nan="" selil="">

2.7. Nan Silico Molekilè Docking Simulation nan anpèchman anzim

Pou predi entèraksyon ki genyen ant dérivés velutinous ak tirozinaz, yo te fè yon etid anbako silicomolekilè lè l sèvi avèk lojisyèl Maestro. Etid molekilè debakadè a te revele ke V9 ak V10 dérivés, trè ranplase ak gwoup metoksid, pa t 'lye nan anzim la (Tablo 3); rezilta sa a te konsistan avèk rezilta nou yo jwenn nan eksperyans nan vitro. Anplis de sa, pi fò nan dérivés flavon yo, eksepte V9 ak V10, kominike avèk tirozinaz ak enèji obligatwa ki sòti nan -4.983 a -5.677 kcal/mol (Tablo 3). De dérivés yo, V1 ak V4, te montre aktivite inhibition kont aktivite tirozinaz nan selil melanom, ak nòt debakadè nan -5.043 ak -5.136 kcal / mol, respektivman. Yo te estabilize pa π-π anpile ak Phe 264 (A ak C bag) ak His 259 (B bag), ak entèraksyon π-cation ak Arg 268 (A bag), jan yo montre nan Figi 4. De dérivés ki te trè ranplase ak gwoup idroksil, V7 ak V11, te fòme lyezon idwojèn ak anzim, epi li te montre relativman wo debakadè. nòt nan -5.174 ak -5.677 kcal/mol, respektivman. Rezilta sa a te konsistan avèk rezilta nou yo, ki montre relativman ba valè IC50 kont aktivite tirozinaz yo te jwenn nan eksperyans in vitro. Sepandan, V7 pa te gen okenn efè sou melanogenesis ak aktivite tirozinaz nan selil melanom, pandan y ap V11 te montre cytotoxicity nan selil melanom.

cistanche phelypaes

3. Seksyon eksperimantal

3.1. Chimi

Yo te itilize reyaktif ki disponib nan komès san yo pa pirifye adisyonèl. Tout melanj reyaksyon yo te brase mayetik epi yo te kontwole pa chromatografi kouch mens, lè l sèvi avèk jèl silica plak vè pre-kouvwi visualized ak limyè UV, ak Lè sa a, devlope lè l sèvi avèk swa yòd oswa yon solisyon nan anisaldehyde. Flash kolòn chromatografi te pote ouusing silica jèl ((230-400) may). 1H NMR (400 Mhz) ak espèk yo te anrejistre pa NMRspectrometri. Chloroform Deuterate yo te itilize kòm sòlvan yo ak valè chanjman chimik (δ) yo te rapòte nan pati pou chak milyon, parapò ak siyal rezidyèl yo nan sòlvan sa a [δ 7.26 for1H (chloroform-d), δ 2.50 pou 1H (dimethyl sulfoxide-d)] .

3.2. Materyèl

Reyaktif tankou 2,20-zenk bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) ak3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromur (MTT), -melanocyte-stimulating hormone (a-MSH), ak anzim, tankou djondjon tirozinaz, yo te jwenn nan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) Potasyòm persulfate (K2S2O8), pyrocatechol violet, ak 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) te achte nan men Alfa Aesar (Haverhill, MA, USA).

3.3. Detèminasyon nan ABTS Aktivite gratis Radikal Scavenging

Yo nan lòd yo evalye aktivite antioksidan nan dérivés evaliasyon pwopriete yo, yo te detèmine aktivite radicalscavenging ABTS, jan sa te dekri deja [20]. Pou jenere ABTSradical la, 10 mL nan 7 mM ABTS yo te melanje ak 176 µL nan 140 mM potasyòm peroxy-disulfatein dH2O, ak enkubasyon nan fè nwa a nan tanperati chanm (RT) pou 16 èdtan, anvan yo itilize. Solisyon radikal ABTS te dilye ak metanol absoli, pou jwenn yon absòbe prèske 0.7 nan 734 nm. Aliquot 100 µL chak dérivés nan seri konsantrasyon ki endike 2 a 200 µM yo te ajoute nan 100 µL solisyon radikal ABTS dilye ak enkubasyon pou 10 min nan fè nwa nan RT. Lè sa a, yo te mezire absorpsyon an nan 732 nm lè l sèvi avèk yon lektè Microplate SpectraMaxM5 Multi-Mode (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Yo te kalkile aktivite scavenging ABTSradical jan sa a:

Aktivite radikal ABTS (pousan)=1 − (yon echantiyon/yon kontwòl) × 100 (1)

3.4. In Vitro Chanpiyon Tirozinaz Anpèchman

Efè inhibition dérivés jelatin sou aktivite tirozinaz te evalye pa kantite dopachrome sentèz nan reyaksyon katalitik tirozinaz [8,21]. An brèf, 50 µL de dérivés jelatin nan seri konsantrasyon 0.01-1 mM te melanje ak 50 µLof 50 U/mL djondjon tirozinaz, nan 50 mM fosfat-tanpon saline (PBS; 8.1 mMNa2HPO4, 1.2 mM KH2PO4, pH 6.8, 2.7 mM KCl, 138 mM NaCl) nan yon plak 96-byen, ak enkube pou 30 minit nan RT. Lè sa a, yo te ajoute 100 µL 0.4 mM L-tirozin nan chak pi, ki te swiv pa enkubasyon pou yon lòt 10 min nan 37 ◦C. Yo te mezire absorbans solisyon an nan 475 nm, lè l sèvi avèk yon lektè Microplate SpectraMax M5 Multi-Mode.

3.5. Kilti Selil

Selil melanom murin B16F10 yo te kiltive nan medyòm DMEM (Gibco, Gaithersburg, USA) ki te konplete ak 10 pousan serom fetis bovin inaktive chalè (Gibco), 100 inite/mLpenisilin, ak 100 µg/mL streptomycin (Gibco), nan 37 ◦C. imidite 5 pousan CO2.

3.6. Viabilite selilè

Vitabilite selil B16F10 yo te detèmine lè l sèvi avèk yon tès MTT, jan sa te dekri anvan [22]. An brèf, selil B16F10 yo te simen nan 24-plak byen nan yon dansite 1 × 104 selil pou chak pi. Apre 24 èdtan, selil yo te trete ak konsantrasyon endike nan velutinousderivatives pou 48 èdtan. Lè sa a, selil yo te enkube ak solisyon MTT pou 4 èdtan, ak kristal formazan ki te redwi yo te fonn nan DMSO. Solisyon ki te lakòz yo te transfere nan 96-plak byen, epi yo te mezire absòbe a nan 540 nm, lè l sèvi avèk yon lektè mikwoplak SpectraMax M5Multi-Mode.

3.7. Detèminasyon kontni Melanin

Kontni melanin la te detèmine jan sa dekri deja, ak kèk modifikasyon [23]. Selil melanom yo te kiltive nan yon plak 6-pou 24 èdtan. Yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan dérivés velutinous pou yon lòt 48 èdtan, nan prezans 100 nM -MSH. Apre yo fin lave de fwa ak salin Dulbecco ki gen tanpon fosfat ki refwadi ak sipleman klori kalsyòm ak klori mayezyòm (D-PBS, Gibco), selil ki te lakòz yo te detache pa enkubasyon ak solisyon trypsin-EDTA. Apre santrifijasyon a 1000 rpm pou 3 minit, yo te fonn grenn selil la nan 150 µL NaOH 1 M ki gen 10 pousan DMSO pou 1 èdtan nan 60 ◦C. Te kontni an melanin detèmine pa absòbe a nan 405 nm, lè l sèvi avèk lektè a microplate.

3.8. Detèminasyon Aktivite Tirozinaz Selilè nan Selil Melanom

Aktivite tirozinaz nan selil B16 yo te egzamine sou baz kantite dopachrome ki pwodui nan reyaksyon katalitik tirozinaz entraselilè [24]. An brèf, melanomacell yo te kiltive nan yon plak 6-byen pou 24 èdtan, ki te swiv pa tretman ak konsantrasyon diferan nan dérivés velutinous pou yon lòt 48 èdtan, nan prezans 100 nM nan -MSH. Apre yo fin lave de fwa ak glas frèt D-PBS, selil yo te lysed nan 200 µL nan tanpon tès radyo-imunopresipasyon (RIPA) (Sigma-Aldrich), ki gen inibitè proteaz ak fosfataz. Apre santrifijasyon nan lisat selil yo kolekte nan chak pi nan 15, 000 × g pou 15 min, 100 µL supernatant te melanje ak 100 µL 1 mM L-DOPA inPBS (pH 6.8), ki te swiv pa enkubasyon pou 30 min. nan 37 ◦C. Absorbans dopachrome te mezire nan 475 nm lè l sèvi avèk lektè mikroplak la. Done yo te nòmalize ak pwoteyin konsantrasyon, detèmine pa tès asid bicinchoninic.

3.9. Modeling molekilè

Estrikti kristal tirosinaz djondjon pou modèl molekilè se te yon tirozinaz Agaricus (PDB fè: 2Y9X) jwenn nan Bank Done Pwoteyin (PDB). Theenzyme te prepare lè l sèvi avèk workflow preparasyon sòsye pwoteyin ki entegre nan pwogram Maestro (Maestro, vèsyon 11.9.011, Schrödinger, LLC, New York, NY, USA, 2019). Dlo, ak tout lòt molekil ki prezan nan dosye PDB yo, yo te retire. Moleculardocking te fèt lè l sèvi avèk pwotokòl Induced Fit Docking (IFD) (Schrödinger Suite2019 Induced Fit Docking pwotokòl), jan yo te rapòte deja [25].

3.10. Analiz estatistik

Tout done nan etid sa a te eksprime kòm mwayen ± devyasyon estanda (SD) soti nan twa eksperyans endepandan. Analiz estatistik yo te fè lè l sèvi avèk Graph-PadPrism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Diferans ki genyen ant meanvalues ​​kontwòl la ak gwoup ekspoze yo te analize lè l sèvi avèk yon analiz yon sèl-fason ofvariance (ANOVA). Yon valè p < 0.05="" te="" konsidere="" kòm="" estatistik="">

ki sa ki itilize cistanche pou: blanchiman po

4. Konklizyon

Nan etid sa a, nou te jwenn douz dérivés jelatin atravè sentèz chimik ak comparativement analize relasyon ki genyen ant estrikti chimik derive sa yo ak aktivite yo ki gen rapò ak sentèz melanin. Etid SAR la te revele ke sibstitisyon gwoup fonksyonèl nan C5', C7', C3', ak C40 nan zo rèl do flavon la afekte aktivite byolojik ki gen rapò ak sentèz melanin (Figi 5). Coexist ofhydroxyl ak methoxy nan R1 ak R2, respektivman, te esansyèl pou anpeche aktivite tirozinaz. Sepandan, konpoze 1,2-diol yo ranplase nan R3 ak R4 te pwovoke apoptoz nan selil melanom yo. Pli lwen, sibstitisyon nan R3 ak R4 ak metoksid oswa idwojèn te esansyèl pou anpeche melanogenesis. Etid sa a ta itil pou devlopman materyèl fonksyonèl natirèl ki sòti, pou kontwole sentèz melanin.

sipleman cistanche