Yon nouvo biomateryèl natirèl antioksidan ki soti nan fèy Cinnamomum Osmophloeum Kanehira reprime Melanogenesis ak pwoteje kont domaj ADN.

Kontakte: ali.ma@wecistanche.com

Yung-Shu Ho 1, Jane-Yii Wu 1,* ak Chi-Yue Chang 2

Résumé:Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) se yon espès pyebwa endijèn nan Taiwan.Konpozisyon chimik,antioksidanaktivite, djondjontirozinazanpèchman, melanin sentèz represyon, ak pwoteksyon kont domaj ADN nan idrosol soti nan fèy COK yo pa steamdistillation yo te egzamine. Nou te fè 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radikal scavenging, metal ion chelating, rediksyon pouvwa, ak Trolox ekivalan kapasite antioksidan (TEAC) tès ak detèmine korelasyon ki genyen ant kontni total fenolik ak aktivite antioksidan. Konklizyon yo te montre ke pwopriyete anti-oksidatif COK hydrosol yo byen korelasyon ak kontni fenol yo. Anplis de sa, pi gwo konstitiyan yo nan idrosol, sa vle di, cinnamaldehyde ak benzaldehyde, te gen efè anti-tirozinaz ki depann de dòz kont tou de aktivite monophenolase ak diphenolase. Analiz GC-MS revele ke pi gwo konpozan bioaktif nan idrosol yo te trans-cinnamaldehyde (87.7 pousan), benzaldehyde (7.0 pousan), ak acetate cinnamil (5.3 pousan). Anplis, nou te jwenn ke idrosol la ak prezans nan benzaldehyde se pi pisan pase cinnamaldehyde pi, ak amelyore.tirozinazaktivite inhibition nan idrosol. Nan analiz sinetik, Lineweaver-Burk trase ak replot te montre ke idrosol COK se yon inibitè kalite melanje. Anplis de sa, nou te jwenn ke dòz trè ba nan COK hydrosol reprime sentèz òmòn-pwovoke melanosit nan faktè transkripsyon ki asosye ak mikroftalmi, ki mennen nan diminye sentèz melanin nan B16-F10melanoma selil yo. Rezilta sa yo te demontre ke pwodiksyon idrosol ki soti nan fèy COK lè l sèvi avèk distilasyon vapè ka bay yon sous san danje epi efikas nanpo-blanchimanajan pou cosmeticand aplikasyon pharmaceutique, akantioksidan, anti-tirosinaz, anti-melanogenesis, ak aktivite DNAprotective.

Mo kle: antioksidanaktivite; Cinnamomoum ​​osmophloeum; idrosol;tirozinazaktivite inhibition;blanchiman; ADN domaj efè pwoteksyon

Klike souCistanchetij ak pwodwi pou blanchi po

1. Entwodiksyon

Maladi po moun tankou lentigo, tach laj, melasma, ak melanom malfezan yo te lye nan fòmasyon ak akimilasyon melanin [1]. Anpèchman nan tirozinaz ak melanogenesis ka amelyore maladi dèrmatolojik ak sendwòm ipèpigmantasyon. Anplis de sa, mache mondyal la pou ajan blanchi po ak pwodui kosmetik yo te elaji dènyèman paske koulè po lighterskin pi pito pa anpil moun ki po fonse [2]. Se poutèt sa, efikas ak san danjetirozinazak inibitè sentèz melanin yo konsidere kòm enpòtan pou prevansyon maladi pigmantasyon ak lòt pwoblèm sante moun ki gen rapò ak melanin [3,4]. Anplis de sa, toksik anviwònman yo lakòz plizyè estrès oksidatif nan èt imen, epi yo ka pwodwi espès nitwojèn reyaktif oswa espès reactiveoxygen (ROS) [5]. Twòp radikal gratis ak ROS yo asosye ak chemen siyal enflamatwa, ki evantyèlman mennen nan domaj selilè, aje, maladi neral, dyabèt, ateroskleroz, enflamatwa, maladi kadyovaskilè, kansè, ak melanogenesis [6,7]. Plizyè etid sijere saantioksidanka anpeche domaj presyon oksidatif lè li aji kòm scavengers radikal gratis oswa ROSscavengers [7,8]. Anplis, tou de inibitè jenerasyon ROS ak ROS scavengers ka diminye pwodiksyon melaninpigments [9]. Espesyalman,tirozinazse yon anzim kle ki katalize yon etap ki limite vitès nan de premye etap yo pandan pwosesis sentèz melanin [10], ak desann-règleman nan tirosinaz se yon objektif kritik pou prevansyon maladi po ak pwodiksyon an nan.po-blanchimanajan [11].Se poutèt sa, devlopman nan antioksidan natirèl ki efektivman anpeche tirozinaz pou prevansyon oswa tretman nan ipèpigmantasyon po endezirab ak pwoteksyon kont domaj ADN se esansyèl.

Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) se yon espès kannèl endijèn Taiwan ak anpil itilizasyon kòm medikaman èrbal Chinwa. Konpoze aktif nan lwil esansyèl COK montre ekselan potansyèl kòm anti-bakteri famasi [12]. Malgre ke etid anvan yo nan ekstrè alkòl nan fèy COK demontre aktivite anti-tirozinaz, prèske tout etid sa yo konsantre sou etanòl ekstrè oswa lwil esansyèl nan COK. Anplis, pa gen okenn etid quantitative ak sistematik te rapòteantioksidanpwopriyete,tirozinazaktivite inhibition ak represyon nan sentèz melanin pa ekstrè dlo (idrosol) nan fèy COK. Se poutèt sa, etid sa a te fèt pou mennen ankèt sou efè COK hydrosol sou estrès oksidatif ak melanogenesis nan selil melanom B16F10 epi pwoteje kont domaj ADN. Etid sa a se premye rapò detaye konpozisyon chimik akantioksidan, anpèchman tirosinaz, represyon melanogenesis, ak aktivite pwoteksyon domaj ADN nan idrosol soti nan fèy COK.

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Pwodwi chimik ak antikò

Chanpiyontirozinaz, butyl hydroxytoluene (BHT), -tokoferol, 6-idwoksi-2,5,7,8-tetramethylcroman-2-asid karboksilik (Trolox), asid trichloroacetic (TCA), galik asid, potasyòmferricyanide, klori ferrik, klori fèr, ferozine, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),2,20-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline{{14} } asid sulfonik (ABTS), reyaktif Folin-Ciocalteu, L-tirozin, ak L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) te jwenn nan Merck Co. (Darmstadt, Almay).Tout pwodui chimik yo ak Solvang yo te itilize nan etid la te nan klas analyse oswa nan segondè-pèfòmans chromatografi likid. Antikò kont faktè transkripsyon ki asosye ak mikroftalmi (MITF) ak -aktin yo te jwenn nan Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) ak Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA), respektivman.

2.2. Preparasyon Hydrosol: Ekstraksyon nan fèy COK Sèvi ak Distilasyon vapè

Fèy ki soti nan yon 13-pye COK ki gen lane nan Taiwan (No.186, Yongping Road, Zhonggliao Township, Nantou County, Taiwan) te seche lè a. Lè l sèvi avèk yon moulen asye pur, fèy yo te piye nan yon poud amann (mwens pase <10 may)="" epi="" yo="" te="" estoke="" nan="" tanperati="" chanm.="" apre="" sa,="" yo="" te="" ekstrè="" 3.5="" kg="" poud="" fèy="" cok="" sèk="" lè="" l="" sèvi="" avèk="" distilasyon="" vapè="" pou="" 4="" èdtan.="" pwosesis="" sa="" a="" te="" repete="" kat="" fwa.="" lè="" l="" sèvi="" avèk="" yon="" vakyòm,="" ekstrè="" a="" te="" filtre="" ak="" lè="" sa="" a,="" lè="" l="" sèvi="" avèk="" yon="" evaporator="" rotary,="" yo="" te="" jwenn="" ekstrè="" sèk="" la="" (figi="" 1).="" ekstrè="" a="" te="" finalman="" evapore="" pou="" jwenn="" yon="" pwa="">

2.3. Gaz Chromatografi / Mass Spectrometry (GC / MS) Analiz Hydrosol

Yon enstriman Thermo-GC/MS ak yon THERMO WaxMS kwaze 5 pousan fenil- 95 pousan kolòn kapilè methylpolysiloxane (60 m × 0.25 mm id, epesè fim {{1 0}}.25 µm) te itilize ak elyòm kòm yon gaz transpòtè nan yon vitès konstan koule 1.0 mL/min. Kolòn nan te kenbe nan 200 ◦C pou 5 min apre piki epi li te chofe a 5 ◦C/min a 260 ◦C. Pi lwil esansyèl (1.0 mL) te enjekte ak yon rapò fann nan 1:100. Tanperati injector, liy transfè ak sous ion yo te 250 ◦C, 250 ◦C, ak 200 ◦C, respektivman. Deteksyon MS te fèt nan mòd enpak elèktron nan 70 enèji eVionisation ak 60 µA aktyèl ionizasyon; enstriman an te opere nan mòd akizisyon plen eskanè nan seri a nan 50-350 amu. Konpoze yo te idantifye lè yo konpare tan retansyon ak endis pik kwomatografik ak sa yo ki nan estanda referans natif natal, sou fòm piki nan menm kondisyon yo. Modèl fwagmantasyon MS yo te konpare ak sa yo ki nan konpoze pi bon kalite, epi baz done masspectrum la te fouye lè l sèvi avèk Enstiti Nasyonal pou Estanda ak Teknoloji (NIST) MSspectral baz done [13].

2.4.Total kontni fenolik

Yo te detèmine kontni fenolik total (TPC) ekstrè yo lè l sèvi avèk assayas Folin-Ciocalteu ki te dekri deja [14]. Yon ti tan, echantiyon idrosol (100 µL) yo te melanje ak 100 µL aliquot nan Folin-Ciocalteu reyaktif (10-pliye dilution) ak 10 µL aliquot nan kabonat sodyòm (10 pousan, w/v). absorbans te mezire nan 735 nm. TPC yo eksprime kòm gallic acidequivalents (GAE) an mg pou chak 100 g materyèl fre.

2.5. DPPH Free Radical Scavenging Assays

Jan sa te dekri deja, lè l sèvi avèk tès DPPH, yo te detèmine aktivite scavenging radikal nan idrosol [15], ak modifikasyon. Yon ti tan, yo te ajoute divès dilusyon echantiyon idrosol (75 µL an triple) nan 150 µL aliquot DPPH (0.02 g/100 mL) epi yo te mezire absorpsyon nan 517 nm apre 30 min. BHT te itilize kòm yon kontwòl pozitif (0.5 mg/mL etanòl). Aktivite dechaj radikal yo te eksprime kòm rapò anpèchman (pousan) lè l sèvi avèk ekwasyon sa a:

Pwopòsyon anpèchman (pousan)=[1 − (A/B)] × 100 pousan

kote A se absorpsyon echantiyon idrosol la epi B se absorpsyon vid la.

2.6. Konsantrasyon Inhibitory fraksyon

Esay nan konsantrasyon inhibitory fraksyon (FIC) yo te fèt jan sa dekri deja [16], ak modifikasyon. Yon ti tan, FeSO4 (20 µL; 2 mM) te melanje ak diferan dilusyon nan echantiyon idrosol (200 µL). Apre yo fin ajoute ferrozine (40 µL; 5 mM), reyaksyon yo te pèmèt yo kontinye pou 10 min ak Lè sa a, absorpsyon yo te mezire nan 562 nm. Anplis de sa, 0.5 mg / mL etilèn dyamin tetraacetic asid (EDTA) te itilize kòm yon kontwòl pozitif. Pousantaj anpèchman ferrozine-Fe2 plis konplèksformation te kalkile lè l sèvi avèk fòmil sa a:

Efè chelating metal (pousan)=[1 − (A/B)] × 100 pousan

kote A se absorpsyon echantiyon idrosol la epi B se absorpsyon vid la.

2.7. Diminye esè pouvwa

Pouvwa rediksyon COK hydrosol te detèmine pa kontwole rediksyon Fe3 plis toFe2 plis jan sa dekri anvan [17], ak modifikasyon. Yon ti tan, nan 50 µL dilusyon idrosol, 50-µLalikòt nan tanpon fosfat (pH 6.6, 200 mM) ak 50-µL alikòt nan ferryyanide potasyòm (1 pousan, w/v) yo te. te ajoute. Apre enkubasyon nan 50 ◦C pou 20 min, yo te ajoute 50 µL TCA (10 pousan, w/v); epi yo te santrifuje melanj lan nan 9,000 rpm pou 3 min. Finalman, 50 µL supernatant te melanje ak 50 µL dlo distile ak 50 µL klori ferrik nan dlo (0.1 pousan, w/v), epi yo te mezire absorpsyon nan 700 nm kont ablank apre 10 min nan tan reyaksyon. Kontwòl pozitif yo te itilize yo te butylated hydroxytoluene (BHT) ak -tocopherol.

2.8. Esè Kapasite Antioksidan Ekivalan Trolox (TEAC).

Antioksidanaktivite COK hydrosol yo te evalye dapre yon metòd ki te deja dekri [15,18], ak modifikasyon. Yon ti tan, yon solisyon konsantre ABTS kasyon radikal (ABTS• plus ) te dilye nan salin tampon fosfat (pH 7.4) nan yon absorpsyon final 0.80 ± 0.05 nan 734 nm. Apre melanje (0.02 mL) echantiyon ak 1 mL ABTS plis solisyon, te gen rediksyon nan absorpsyon nan 734 nm apre 5 min.Trolox te itilize kòm yon estanda, ak aktivite idrosol yo te eksprime kòm TEAC pa trase koub Troloxcalibration. Valè TEAC ekivalan molè echantiyon idrosol yo te kalkile dapre diminisyon nan absòbe solisyon Trolox. BHT ak -tokoferol yo te itilize kòm kontwòl pozitif.

2.9. Efè Hydrosol sou Anpèchman Tirozinaz djondjon

Chanpiyontirozinazaktivite yo te mezire lè l sèvi avèk analiz espektrofotometrik jan yo te dekri anvan, ak modifikasyon [19]. Yon ti tan, yo te ajoute 20 µL L-tirozin oswa 20 µL L-DOPA nan PBS (pH 6.8; 80 µL) ak 80 µL PBS avèk oswa san idrosol tès nan 96-byen mikroplak, epi answit 20 µL djondjon tirozinaz (100 U/). mL) te ajoute. Apre melanje ak enkubasyon nan 37 ◦C pou 20 min, yo te detèmine dopachromeproduction (oswa konsomasyon) nan melanj reyaksyon an nan 475 nm absòbe. Kojik asid, ki inibit tirosinaz, te itilize kòm yon kontwòl pozitif. Pousantaj anpèchman tirozinaz la te kalkile jan sa a:

Anpèchman (pousan) ≡ {[(A − B) − (C − D)]/(A − B)} × 100 pousan

kote A endike absorpsyon ak anzim nan absans echantiyon idrosol, B endike absorpsyon san anzim oswa echantiyon idrosol, C endike absorpsyon ak anzim, ak idrosol ak Dindicate absorpsyon san anzim la men ak idrosol. Nou tou kalkile 50 poursantirozinazkonsantrasyon inhibitory (IC50) nan echantiyon tankou sa yo ki anpeche aktivite tirozinaz pa 50 pousan.

2.10. Analiz sinetik nan anpèchman Tirozinaz djondjon

Melanj reyaksyon yo te genyen 20 µL L-tirozin oswa L-DOPA (0.25 mg/mL) kòm substrate, 100 µLof djondjon tirozinaz (20 inite/mL) nan 0.2 M tanpon fosfat sodyòm ( pH 6.8) ak 80 µL nan chak echantiyon idrosol nan yon volim total de 200 µL. Yo te fè tès la nan 25 ◦C, ak sinetik inhibitor nan chak echantiyon idrosol aktirozinazte analize lè l sèvi avèk simit Lineweaver–Burk. Yo te itilize ekwasyon resipwòk la pou ekilib rapid ki soti nan anpèchman ki pa konpetitif nan kalite melanje, jan yo eksprime nan Ekwasyon (1) [20]. Valè Ki pou echantiyon idrosol yo te estime apati de replot pant (Ekwasyon (2)). Yo te kalkile valè Ki pou idrosol apati aks 1/v rekòmanse (Ekwasyon (3)),

kote Vmax se vitès maksimòm nantirozinazaktivite, Ksis konstan disosyasyon substra a (S) soti nan konplèks la anzim-substra (ES), Ki se konstan disosyasyon nan inibitè a [I] soti nan konplèks la anzim-inibitè ak Ki se konstan disosyasyon nan inibitè a soti nan anzim-substra. -inibitè konplèks (ESI).

2.11. Kilti Selil ak Vitabilite Selil Assays

Selil melanom B16-F10 (BCRC60031) yo te jwenn nan Bioresource Collection and ResearchCenter (BCRC), Taiwan. Selil B16-F10 yo te kiltive nan mwayen Eagle's modifye Dulbecco a (Gibco, California, USA) ki gen 10 pousan FBS a 37 ◦C nan 5 pousan CO2. Pa tripsinizasyon, selil yo te rekòlte. Vitabilite selil yo te mezire lè l sèvi avèk 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolimbromide (MTT) assay jan sa dekri pa Lee [15 ].

2.12. Melanin selilè kontni

Melanin kontni yo te mezire lè l sèvi avèk metòd ki dekri pa Lee. [15]. Yon ti tan, B16-F10 selil yo te kiltive nan 6-plak byen nan yon dansite 0.8 × 105 selil pou chak pi epi yo te enkube pou 24 èdtan. trete ak 100-nM -melanocyte-stimulating òmòn (-MSH), asid kojik (positivecontrol) ak idrosol nan divès konsantrasyon pou 24 èdtan. Apre yo fin lave de fwa ak PBS, selil yo te lysedin yon tanpon ki gen 100 mM fosfat sodyòm (pH 6.8), 1 pousan Triton X -100 ak 0.1 mM fliyò fenilmethanesulphonyl epi estoke nan -80 ◦C pou 30 min. Apre yo fin kolekte selil yo, yo te fonn grenn selil yo nan 1N NaOH ki gen 10 pousan DMSO a 65 ◦C pou 1 èdtan. Apre sa, yo te mezire absorbans nan 405 nm.

2.13. Western Blot

Selil yo te lysed jan sa dekri nan Seksyon 2.11 epi yo te sibi Western blotting pou pwoteyin MITF lè l sèvi avèk yon antikò Anti-MITF.

2.14. Egzamen Pwoteksyon ADN

Domaj ADN oksidatif yo te detèmine dapre konvèsyon ADN sikilè supercoiledpCI neo plasmid nan fòm nicked sikilè oswa plis degrade lè l sèvi avèk yon metòd ki te deja dekri [21,22] ak modifikasyon ti tay. Melanj reyaksyon 20 µL te genyen 2.5 µL supercoiledpCI neo (150 ng/µL), 10 µL solisyon reyaksyon Fenton ki gen 30 mM oksijene idwojèn, 100-µMferric klori ak 100 µM asid ascorbic nan 20 mM Tris-HCl tanpon (pH 7.6), ak 5µL nan idrosol (0.3325-5.32 mg/mL) oswa quercetin (kontwòl pozitif; 250 µg/mL). Melanj reyaksyon yo te enkube a 37 ◦C pou 30 min epi yo te separe fòm ADN plasmid sou 0.7 pousan jèl agaroz epi yo te tache avèk SafeView™ (Applied Biological Materials (ABM) Inc., Richmond, Kanada).

Pou semi-quantifierantioksidanaktivite ekstrè yo, kantite fòm supercoiled ak nicked nan pCI neo yo te quantifye lè l sèvi avèk yon enstriman AlphaImager Mini (pwoteyin senp), ak gwoup entansite sou jèl agaroz yo te quantifye lè l sèvi avèk lojisyèl Gelpro. Kòm kontwòl negatif ak pozitif, pCI neoplasmid te enkube pou kont li ak melanj reyaktif Fenton la, respektivman. Done yo eksprime kòm kantite ADN supercoiled parapò ak sa (100 pousan) nan kontwòl negatif. Aktivite pwoteksyon ekstrè yo te kalkile apati kantite ADN plasmid supercoiled ak nicked lè l sèvi avèk ekwasyon sa yo [23]:

Pwoteksyon plasmid supercoiled( pousan ) =supercoiled form intensitypCI neo DNA band intensity × 100

Pwoteksyon plasmid nicked( pousan ) =entansite fòm nickedpCI neo ADN bann entansite × 100

2.15. Analiz estatistik

Tout done yo eksprime kòm vle di ± devyasyon estanda (SD). Diferans ant tretman yo te idantifye lè l sèvi avèk t-tès Student oswa ANOVA ki te swiv pa tès Scheffe a. Diferans yo te konsidere kòm siyifikatif lè p <>

3. Rezilta ak Diskisyon

3.1. Idantifikasyon konpoze temèt nan idrosol

Sa ki nan idrosol yo te analize lè l sèvi avèk GC/MS. Konpozan yo te idantifye dapre tan retansyon estanda yo ak kantite yo te detèmine nan zòn pik nan eluyan yo (Figi 2). Jan sa endike nan Figi 2A-D, trans-cinnamaldehyde, benzaldehyde, ak cinnamil acetate te konpoze prensipal yo nan idrosol COK epi yo te prezan nan 87.7 pousan, 7.0 pousan, ak 5.3 pousan, respektivman. Eugeno te deja jwenn nan lwil esansyèl soti nan C. verum nan 7.29 pousan [24] men li pa te detekte nan prezan COK idrosol la (Figi 2). Diferans nan pwosesis ekstraksyon ak metòd tès yo ka kontribye nan diferans ki genyen nan kontni cinnamaldehyde nan lwil esansyèl C. cassia [25].

3.2. Pwopriyete antioksidan nan idrosol ki soti nan fèy COK

3.2.1. Aktivite Radical Scavenging DPPH

Nan Figi 3A, aktivite DPPH pou netwaye radikal idrosol ki soti nan 1.06×10-2 rive 5.32×10-1 mg/mL te genyen ant 5.04. pousan ± 0.96 pousan ak 41.76 pousan ± 2.50 pousan, respektivman. Done sa yo endike dòz-dependentradical scavenging pa COK hydrosol la. An konparezon, kontwòl pozitif BHT ak -tocopherolscavenged 94.32 pousan ± 0.08 pousan ak 93.82 pousan ± 0.13 pousan nan radikal reyaktif DPPH, respektivman, nan 0.5 mg/mL. ).Anpil etid montre ke fenolik ak flavonoid anpeche fòmasyon nan radikal DPPH pa donatinghydrogen atòm. Pakonsekan, aktivite radikal DPPH espès Cinnamomum yo ka reflete aksyon kòm yon donatè idwojèn [26,27].

3.2.2. Metal Ion Chelation

Nou evalye Fe2 plis kapasite obligatwa nan idrosol nan 1.06 × 10−3 ak 5.32 × 10−1 mg / mL, jan yo montre nan Figi 3A. Chelasyon metal pa konpozan idrosol majinal ogmante ak konsantrasyon, men at6 mg / mL, te gen sèlman 37.3 pousan nan aktivite a chelating nan EDTA (Figi 3A).

3.2.3. Diminye pouvwa

Jan yo montre nan Figi 3A, pouvwa rediksyon konpozan idrosol yo te depann de konsantrasyon e li te pi wo pase BHT ak -tokoferol (0.22 ± 0.01 ak {{9}). }}.33 ± 0.15, respektivman) nan 0.5 mg/mL. Nan etid anvan yo, pouvwa a diminye nan ekstrè brit soti nan C. osmophloeum brendiy nan fraksyon BuOH te pi wo a nan mitan tout fraksyon ak ogmante lineyè ak konsantrasyon [28].antioksidanpotansyèl diferan ant konpoze nan ekstrè, aktivite an jeneral antioksidan ofextracts fòtman depann sou sòlvan an fè ekstraksyon. Sepandan, pouvwa rediksyon (valè OD {{0}}.7) nan ekstrè dlo ki soti nan brendiy C. osmophloeum te sanble (valè OD=0.66 ± 0.01) ak sa yo ki nan prezan C. idrosol osmophloeum (Figi 3A), ki te pwodwi lè l sèvi avèk distilasyon vapè. Diminye pouvwa se jeneralman asosye ak prezans nan ajan diminye ak aktivite antioksidan, reflete sispansyon nan reyaksyon chèn radikal gratis pa dispozisyon pou diminye atòm idwojèn. Pouvwa rediksyon nan C. osmophloeum se pwobableman akòz prezans gwoup idroksil yo nan konpoze fenolik (Figi 2), ki ta ka aji kòm donatè elèktron.

3.2.4. Test TEAC

Valè TEAC nan idrosol la prezan yo te ogmante nan konsantrasyon ki pi wo pase 5.32 × 10−3 mg / mLand yo te pi gran pase sa yo ki nan konpoze yo referans -tocopherol ak BHT, jan yo montre nan Figi 3A. Aksè esterik nan sit la radikal nan ABTS plis se kritè prensipal pou aktivite nan tès TEAC. An konsekans, gwoup yo fenil nan konstitiyan yo idrosol prezan yo se yon ti kras mwens anpeche thanthat Trolox.

3.2.5. Korelasyon ant TPC ak Aktivite Antioksidan

Jan yo montre nan Figi 3B, te gen yon korelasyon trè siyifikatif ant TPC yo ak aktivite DPPH pou netwaye radikal nan GAE soti nan 1.75 ± 0.438 a 100.41 ± 1.581 mg/g. . Koefisyan korelasyon TPC ak aktivite DPPH radikal gratis, aktivite FIC, rediksyon pouvwa ak TEAC yo te 0.980, 0.925, 0.967 ak 0.902, respektivman (Figi 3B). Ansanm, done sa yo demontre ke laantioksidanaktivite hydrosols COK yo byen asosye ak kontni fenol.

3.3. Efè COK Hydrosol Konsantrasyon sou Aktivite Tirozinaz

Nou detèmine efè COK idrosol konsantrasyon sou oksidasyon L-tirozin ak L-DOPA pa djondjon.tirozinazepi fè konparezon ak aktivite asid kojik, ki se yon inibitè tirozinaz ki byen koni (Figi 3C, D). Aktivite oksidaz L-tirozin ak L-DOPA oksidaz nan djondjon (Figi 3C) idrosol la te pisan ak dòz-depandans, men li te gen pi wo aktivite inhibitor tirosinaz nan prezans substra L-tirozin (aktivite monofenolaz) pase L-DOPA (aktivite difenolaz). Valè IC5{{10}} asid kojik kont aktivite monofenolaz ak difenolaz yo te 4.0 × 10-5 ak 7.8 × 10−3 mg/mL (Figi 3C), respektivman, siyifikativman plis pase sa yo nan idrosol la prezan (7.96 × 10-4 mg / mL ak 0.35 mg / mL, respektivman; Figi 3D). Pakonsekan, pou reyalize 90 pousan aktivite inhibitor tirozinaz (aktivite monofenolaz), idrosol ak asid kojik yo te obligatwa nan 0.52 mg / mL ak 4.0 × 10-3 mg / mL, respektivman, lè yo te itilize L-tirosin kòm substra a (Figi 3C, D). ). Malgre ke efè inhibition tirozinaz mande pou pi wo konsantrasyon nan COK hydrosolthan asid kojik, pisan aktivite inhibition tirozinaz te evidan nan eksperyans sa yo.

Divèstirozinazpreparasyon, metòd tès aktivite, ak pite inhibitor ak konpozan te kapab kontribye nan diferans ki genyen nan sinetik inhibiteur anzim [29]. Sepandan, aktivite byolojik ekstrè plant yo kontribye pa eleman byoaktif yo, ki ka afekte pa espès plant yo, tan rekòt, sezon, orijin jewografik, pratik agronomi ak metòd ekstraksyon. Inibitè yo te idantifye ak karakterize nan sous natirèl nan anpil etid resan, ak relasyon ant aktivite inhibitory ak engredyan natirèl yo byen etabli (Tablo 1).An patikilye, anpil aldehydes ak lòt konpoze yo te izole ak karakterize kòm tyrosinaseinhibitors. Men sa yo enkli cinnamaldehyde, 2-idwoksi-4-methoxy benzaldehyde, anisaldehyde, kiminaldehyde, asid kimik, flavonol, flavon, ak izoflavan [4,19,30–37]. Idrosol prezan an te gen 87.7 pousan cinnamaldehyde ak 7.0 pousan benzaldehyde, ki sijere ke cinnamaldehyde, ki te swiv pa benzaldehyde, se sibstans prensipal ki responsab pou aktivite inhibition tirozinaz idrosol. thanpure cinnamaldehyde, ak amelyore latirozinazaktivite inhibition nan idrosol. Benzaldehydes yo te konfime tou pou anpeche tou de aktivite diphenolase ak aktivite monophenolase nan mushroomtyrosinase [38]. Mekanis inibitè tirozinaz nan inibitè benzaldehyde-kalite presumably soti nan kapasite yo nan fòme yon baz Schiff ak yon gwoup amine prensipal nan anzim la [33,39]. Anplis de sa nan yon gwoup elèktron-donasyon nan pozisyon an para nan benzaldehyde ogmante aktivite tirosinaseinhibitory, pwobableman estabilize baz Schiff la.

3.4. Mòd sinetik nan anpèchman Tirozinaz djondjon pa COK Hydrosol

Konpòtman sinetik hydrosol, sou monophenolase a ak aktivite diphenolase nan tyrosinauseing L-tirosin ak L-DOPA kòm substra a te etidye, respektivman. LatirozinazInibitorykinetics idrosol yo te analize lè l sèvi avèk simit Lineweaver-Burk doub-resipwòk, jan yo montre nan Figi 4. Nan Figi 4A, B, kat liy yo reprezante anzim san anpèchman (Liy 1) ak anpèchman pa twa konsantrasyon (Liy 2 - Liy 4) nan idrosol, ak liy sa yo kwaze sou bò gòch 1/v aks anlè aks 1/S la. Anba kondisyon eksperimantal san anpèchman yo, vitès maksimòm (Vmax) nan reyaksyon oksidasyon L-tirozin ak L-DOPA katalize pa tirosinaz la te {{10}}.055 ∆OD475/min ak 0.096 ∆OD475/min san yo pa genyen ladan li. hydrosol (Liny 1 nan Figi 4A, B), respektivman. Kineticparameters Km (Michaelis konstan) pou djondjontirozinazyo te jwenn nan yon Lineweaver-Burk ki te itilize L-tirozin ak L-DOPA kòm substrats yo, respektivman, montre ke Km te 0.534 mg/mL ak 0.511 mg/mL san yo pa gen idrosol (Liny 1 nan Figi 4A, B).

Kat liy yo, ki te jwenn nan anzim la uninhibited ak nan twa konsantrasyon divès ofhydrosol, kwaze sou bò gòch la nan aks 1/v anlè aks 1/S la. Ogmantasyon konsantrasyon nan idrosol te lakòz diminye Vmax ak yon ogmantasyon Km. Espesyalman, lè yo te itilize L-tirozin kòm substra a, ogmante konsantrasyon idrosol yo te lakòz plizyè liy ki gen plizyè pant ak entèsepte, men sa yo te kwaze youn ak lòt nan dezyèm kadran an (Liy 1-4 nan Figi 4A). Rezilta menm jan yo te jwenn lè L-DOPA te itilize kòm substra a (Liny 1-4 nan Figi 4B), sipòte afimasyon an ke idrosol pote inibitè melanje-tip nan tirozinaz. An akò ak anpèchman kalite melanje, konpozan idrosol gen anpil chans mare anzim gratis ak konplèks anzim-substra a. Enhibisyon-tip melanje yo ka parèt nan plizyè fason: anpèchman idrosol la ka rive paske yo kominike avèk yon entèmedyè apre nan modèl reyaksyon an, men se pa ak yon konplèks inisyal anzim-substra [40]. Kidonk, nou detèmine konstan disosyasyon (Ki ak Ki, respektivman) pou lyezon inibitè a nan anzim gratis (E) ak konplèks anzim-substra a lè l sèvi avèk trase doub-resipwòk ak trase nan pant ak entèsepte vètikal kont konsantrasyon yo nan idrosol nan prezans L-tirosin (Figi 4C, D) oswa L- DOPA kòm substrats (Figi 4E, F). Jan yo montre nan Figi 4A, B, valè Ki lè L-tirozin te itilize kòm substra a te apeprè 1.28 fwa pi ba pase sa nan prezans L-DOPA, ki endike pi efikas inhibition anzim obligatwa ak L-tirosin pase ak L-DOPA. Anplis de sa, valè Ki a te 1.71 fwa pi gran pase valè Ki pou oksidasyon L-DOPA, sa ki endike ke affinityof konpozan idrosol pou anzim gratis se pi fò pase sa pou konplèks anzim-substra. Done sa yo sijere ke idrosol afekte afinite nan. anzim pou L-DOPA men li pa mare sit aktif la. Anplis, valè Ki te prèske menm jan ak Ki pou oksidasyon L-tirozin, ki endike ke inibitè melanje yo se inibitè ki pa konpetitif, ki mare nan yon anzim gratis ak yon konplèks anzim-substra ak menm ekilib konstan lè l sèvi avèk L-. tirozin kòm substra a (Figi 4A). Sepandan, konstan yo obligatwa ekilib pou anzim gratis la ak anzim-substratecomplex la, respektivman, yo diferan lè l sèvi avèk L-DOPA kòm substra a (Figi 4B), ki endike ke kalite amixed (konpetitif ak ki pa konpetitif melanje) inibitè ka mare pa sèlman ak yon anzim gratis, men tou ak konplèks anzim-substra lè l sèvi avèk L-DOPA kòm substra a. Etid anvan yo te revele tou ke lwil esansyèl C. cassia ak cinnamaldehyde se inibitè melanje-kalite [19]. Kontrèman, trans-cinnamaldehyde izole nan jape C. Cassia endike anpèchman konpetitif pou oksidasyon L-DOPA pa djondjon.tirozinaz[32], pandan y ap cinnamaldehyde izole nan rasin P. cernua se te yon anpèchman ki pa konpetitif [35].

3.5. Konsantrasyon-depandan efè nan konsantrasyon idrosol sou Melanogenesis

Pou analize efè hydrosol sou viabilite selil ak melanogenesis nan divès konsantrasyon ({{0}}.0035-10.64 mg/mL), nou pwovoke melanogenesis nan selil melanom B{16-F10 lè l sèvi avèk -MSH ak konpare efè yo lè l sèvi avèk asid kojik kòm yon kontwòl pozitif (Figi 5). Rezilta viabilityassay selil sa a te endike ke idrosol pa te gen okenn sitotoksisite nan konsantrasyon 0.0035-1.064 mg / mL nan selil B16F10melanoma (Figi 5a). Kòm inibitè melanogenesis yo ap devlope, sekirite ak efikasite ta dwe konsiderasyon ki pi enpòtan pou anpil aplikasyon. Sepandan, tretman nan selil B16F10melanoma ak idrosol te lakòz yon rediksyon ki make nan viabilite selil nan konsantrasyon nan 5.32-10.64 mg / mL. Dapre rezilta etid tès depistaj sekirite ak efikasite nanpo-blanchimanpwodwi nan kilti selil B16F10, 1.064 mg/mL se yon konsantrasyon papòt pou tès depistaj prensipal ki baze sou selil yo. Se poutèt sa, yo te itilize konsantrasyon 0.1064-1.064 mg/mL pou egzamine mekanis anti-tirosinaz nan selil melanom B16F10 pa idrosol.

Represyon nan melanogenesis pa tretman idrosol nan divès konsantrasyon te detèmine aspercentages nan kontni melanin nan selil yo (Figi 5b). Nou menm tou nou analize nivo ekspresyon MITF lè l sèvi avèk Western blot (Figi 5c). Nan eksperyans sa yo, kontni melanin ak nivo ekspresyon MITF yo te siprime COK hydrosol, sa ki sijere ke COK hydrosol diminye kontni melanin nan selil yo lè yo reprime sentèz MITF.

3.6. Egzamen Pwoteksyon ADN

Espès oksijèn reyaktif yo byen konnen yo domaje ADN ak lakòz aje selil ak kansè. Egzamen DNAnicking yo ofri yon sistèm modèl pratik san selil pou detèmine sansiblite pwodiksyon radikal ki domaje ADN [41]. Nan eksperyans sa yo, reyaksyon Fenton yo te pwodui radikal idwoksil ki koupe ADN plasmid supercoiled epi konvèti li nan fòm ADN nicked, ki te diminye mobilite elektwoforetik. [42,43]. Kidonk, pou evalye aktivite pwoteksyon ADN idrosol yo, nou enkube pCI neo DNA ak reyaktif Fenton yo [44]. Jan yo montre nan Figi 6, fòm plasmid supercoiled ak nicked yo byen klè distenge pa pousantaj relatif mobilite elektwoforetik yo sou jèl agarose; supercoiledDNA te deplase pi rapid la, ak ADN nicked te deplase pi dousman, respektivman. Apre tretman ak idrosol, domaj ADN yo te yon ti kras redwi nan konsantrasyon idrosol 1.33-5.32 mg/mL, ak 28-58 pousan pwoteksyon fòm supercoiled, respektivman (liy 6-8). Nan konsantrasyon idrosol nan 0.3325–0.665 mg/mL, pa gen okenn pwoteksyon obsève parapò ak kontwòl negatif la (liy 4 ak 5). fwagmantasyon medyatè, jan yo montre deja [45]. Sa yo se premye done ki montre efè pwoteksyon ekstrè idrosol soti nan C. osmophloeum Kanehira kite sou domaj ADN pa reyaksyon Fenton. Efè sa yo gen anpil chans akòz prezans nan konpoze polifenol.

4. Konklizyon

COK te itilize depi lontan kòm yon plant medsin nan Taiwan. Sepandan, selon sa nou konnen, sa a se premye rapò ki montre ke idrosol ki prepare pa distilasyon vapè nan fèy COK gen aktivite antioksidan, jan yo obsève nan tès yo.antioksidanaktivite ak domaj ADN. Nou te montre tou ke idrosol sa a reprime melanogenesis. Nan analiz GC/MS, yo te jwenn pi gwo konpoze ki genyen nan COK hydrosol yo se cinnamaldehyde ak benzaldehyde, ak ajan sa yo te potentlyinhibitory kont aktivite monophenolase ak diphenolase nan tirozinaz. Nan evalyasyon nou yo nan sinetik anpèchman tirozinaz, COK hydrosol te montre yon anpèchman ki depann de dòz la nan tou de aktivite L-tirosin ak L-DOPA oksidaz.tirozinaz. Konpoze idrosol prezan yo tou siprime ekspresyon pwoteyin MITF, ki mennen nan sentèz melanin redwi -MSH-induit.

Finalman, sekirite se yon gwo konsiderasyon pou inibitè tirozinaz, espesyalman pou moun ki itilize enkosmetik ak pwodwi manje, ki ka itilize nan kantite reglemante. COK se deja yon aditif natirèl manjab ak anpil itilize pou manje ak pwodui kosmetik. Anplis de sa, cinnamaldehyde jeneralman rekonèt kòm san danje pou konsomasyon imen. COK hydrosol se yon ekselan biomateryèl natirèl ki efikas ak san danjetirozinazak aktivite inhibitor sentèz melanin ak potansyèl pou pwoteje kont domaj ADN. Se poutèt sa, nou kwè ke COK hydrosol ta ka itilize kòm yon ajan epigmantasyon san danje epi efikas pou anpil aplikasyon.