Antioksidan ak potansyèl anti-aje nan yon fòmilasyon peptide (Gal2-Pep) konjige ak asid galik
May 04, 2023
Po se trè vilnerab a aje twò bonèakòz estrès ekstèn, Se poutèt sa, nan etid sa a, yon fòmilasyon peptide, (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) te sentèz pa konbine peptide TPPTTP, ak galikasid (GA). Tout peptides yo te sentèz sou 2-chlorotritil klori résine lè l sèvi avèk peptide solid-faz.sentèz (SPPS), ak analize sou yon ionizasyon electrospray (ESI)/quadrupole-time-of-flflight (Q-TOF) tandem mas spectroscopy (MS) sistèm. Okòmansman, Gal2–Pep pa montre okenn toksisite anba konsantrasyon 100mM ak yon pousantaj siviv selil 88 pousan pou keratinosit akfibroblasts. Laespès oksijèn reyaktif(ROS) aktivite scavenging nan Gal2–Pep te pi estab konpare ak GA pou kont li; epi apre kat semèn nan chanmtanperati, liAktivite ROS scavengingrete pi wo pase 50 pousan. Anplis, fòmilasyon peptide a,Gal2–Pep te montre tou yon efè inhibition elastase nan CCD-1064Skfibroblastselil yo. Dapre rezilta RT-qPCR, li te pwouve nan etid sa a ke Gal2–Pep ogmante ekspresyon PGC-1a pouanpecheestrès oksidatif, ak valide potansyèl li kòm yonajan anti-ajepaogmante ekspresyon deKalite I kolagen anak padiminye ekspresyon metaloproteinaz matris -1 (MMP1). Lakonklizyon yo jwenn ranfòse sijesyon ke fòmilasyon peptide sentèz nan etid sa a ta ka itilize kòm yonantioksidan natirèlepiajan anti-ajepou aplikasyon kosmetik li yo.
Klike la a pou w jwenn plis enfòmasyon sou pwodwi anti-aje Cistanche
1. Entwodiksyon
Aje porive kòm yon rezilta nan diminisyon gradyèl nan ak evantyèlman kanpe nan divizyon selilè keratinocytes ak broeksplozyon nan po a. Ondilasyon sou po a devlope kòm kantite selil diminye, ak denaturasyon an ki kapab lakòz nan matris la ekstraselilè ki mennen nan sechrès ak yon pèt elas.tisite nan po a.1 Domaj nan ADN mitokondriyo entraselilèak yon rediksyon nan pousantaj nan sentèz pwoteyin rive toupandan pwosesis aje po a.2 Aje po gen de chemen prensipalfason, intrinsèques ak extrinsèques, ak iltravyolèt (UV) ekspoze
yon gwo chofè nanaje ekstèn. Limyè UV a reyaji ak pi gwo konpozan po yo, ki gen ladan lipid, pwoteyin, ak asid nikleyik, pou pwodui espès oksijèn reyaktif (ROS) ki mennen nan selillanmò.3–5 Nivo ROS twòp mennen tou nan klivaj la aklyezon nòmal nan chenn kolagen an oswa elastin ak ankouraje ekspresyon nan metaloproteinaz matris (MMP), tankou MMP-1, ki kraze kolagen an, ki mennen nan ondilasyon nan po a akakselere aje po.6,7 Se poutèt sa, terapi antioksidan yo retireROS ak aktive potansyèl mitokondriyo gen avantaj yo pwoteje po a kont aje.
Anplis ROS, elastase gen yon wòl enpòtan nan pèt laelastisite po, ki kraze elastin, yon pwoteyin enpòtan nan lamatris ekstraselilè.8 Elastin, akòz siyifikatif rkul elastik li yokarakteristik, bay elastisite nan po a, tandiske elastase genkapasite nan fann elastin ak lòt pwoteyin.8 Se poutèt sa, anpechesyon nan elastase anzim ta ka yon estrateji kle pou po afesman atravè anpeche pèt lastisite po a.
Nan etid sa a, nou te fèt yon nouvo materyèl ki konbine aperoxisome proliferator-aktive reseptè gamma coactivator1-alfa (PGC-1a)-deriv peptide TPPTTP ak asid galik (GA)pou itilize nan pwodui kosmetik anti-aje. GA se yon fitochimik yo jwenn nan fwi ak legim divès kalite, ki gen ladan rezen, tomat, ak te vèt, ki konnen yo gen gwo antioksidan ak anti-bakteri. effects.9 Menm si GA yo itilize nan pwodui kosmetik ak endistri manje poutèt sa yo benefisye effects, fòmilasyon li yo gen tandans yo dwe enstab.10 Nou konsa devlope (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) pou ogmante estabilite GA lè li mare l ak PGC -1a-derivé peptide TTPTTP.
Nan etid sa a, nou sentèz yon (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2– Pep) fòmilasyon peptide nan konjigezon ak asid galik ak konfimepotansyèl li kòm yon ajan antioksidan ak antiaging.
2. Materyèl ak metòd
2.1. Materyèl
Dulbecco a modifyeEagle's Medium (DMEM), penisilin/streptomycin, serom fetal bovine (FBS), fosfat-bufferedsaline (PBS), ak tripsin yo te achte nan men Gibco (Carls
move, CA). Hydroxybenzotriazole (HOBt), diisopropyl carbodiimide (DIC), 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diisopropylethylamine (DIEA), asid galik akN-succinyl-tri-alanyl-pnitroanilide yo te jwenn nan Sigma-Aldrich (St Louis, MO).L-Fòm asid amine (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tBu)–OH, ak Fmoc-Pro–OH) yo te achte nan men Bead-Tech (Seoul,Kore).
2.2. Sentèz peptides ak asid galik makonnen peptides
Tout peptides yo te sentèz sou 2-rezin klori chlorotrityl (200mmol echèl, valè sibstitisyon¼ 1.46 mmol g 1) lè l sèvi avèk HOBt–DIC medyatè solid-faz peptide sentèz (SPPS).
Sentèz peptide lè l sèvi avèk metòd SPPS te pote soti ak mod ti taykasyon ki refere a etid anvan yo.11–13 2- laChlorotrityl klori (CTC) résine te anfle nan dichloro
metàn (DCM, 8 mL) pou 30 min. Te résine a lave akdimetilformamid (DMF). Tout reyaksyon yo te fèt nan tanperati chanm. Fmoc pwoteje dérivés asid amine (2 ekivalan(Equiv.), pou lafipremye asid amine tache oswa 5 ekivalan, pou lòt asid amine yo) yo te makonnen ak swa DIEA (5 ekivalan, pou yon asid amine tache) oswa HOBt/DIC (6 ekivalan/5 ekivalan) nan DMF afterfè depwoteksyon nan Fmoc lè l sèvi avèk 2 pousan (v / v) DBU nan DMF (2 fwa, 2 min yon tan, 8 mL). Ak tout etap yo te lave 5 fwa ak DMF. Final asid galik te makonnen ak peptides lysine-tache.Apre kouple a nan asid la galik, résine a teafiltre, lave,epi seche anba yon vakyòm segondè. Solisyon klivaj la (TFA:deyonize [DI] dlo: TIS¼ 95: 2.5: 2.5, v/v/v pousan) te trete pou 2 èdtanpou jwenn peptides brit yo. Peptid brit yo te presipite epi lave twa fwa ak etè dyetil frèt.
Analitik ranvèse-faz segondè-pèfòmans likid kromatografi(RP-HPLC) te fèt sou yon Separasyon Waters 2695Modil ak yon kolòn Capcell Pak C18 (4.6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). Faz mobil la konsiste de 0.05 pousan TFA nan H2O (mobil faz A) ak 0.05 pousan TFA nan asetonitrile (mobil faz B).
Elisyon te reyalize pa anplwaye yon gradyan lineyè pou mobilfaz B nan 5 pousan a 65 pousan sou 30 min nan ato koule nan 1.0 mL min 1. Pik peptides yo te detekte nan yon longèdonn 230 nm. Semi-preparasyon RP-HPLC te fèt sou yon sistèm Waters HPLC (Ponp 600E, Detektè UV-484) ak yon Gemini RP-C18.kolòn (21.2 mm 250 mm, 5mm, Phenomenex). Faz mobil la konsiste de 0.05 pousan TFA nan H2O (faz mobil A)ak 0.05 pousan TFA nan asetonitrile (mobil faz B). Elisyon te reyalize pa anplwaye yon gradyan lineyè pou faz mobil B nan7 pousan a 22 pousan sou 15 min nan alvitès koule nan 10 mL min 1. Lapik peptide yo te detekte espektrofotometrik nan yon longèdonn 230 nm.
Peptides sentèz yo te fonn nan 5 pousan asid fòmik nan dlo ak analize sou yon ionizasyon electrospray (ESI) /kadripole-tan-de-light (Q-TOF) tandem mas spectroscopy(MS) sistèm (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Echantiyon yo te sou fòm piki nan sistèm Q-TOF ekipe akyon sous nano-espre nan alto kouran 1mL min 1. Iyon ESI aparamèt sous yo te jan sa a: yon vòltaj espre ion nan 1.5 kV, gaz rido nan 10 psi, ak gaz djenn nan 5 psi. Spectre yo nanmòd plen-eskanè ak MS / MS yo te kolekte nan seri a nanm/z
100–1200 Da nan yon tan akimilasyon nan 25 ms pou chak spectre.Enèji kolizyon an te monte soti nan 10 a 80. Rezilta adone yo te akeri lè l sèvi avèk Analis TF konsaware ak otomatikmanplase pa santwoyid 80 pousan ak yon pik minimòm, rediksyon bri 10 pousan, deisotoping mwayen ak yon papòt 3 pousan, pa gen rediksyon bri, e pa gen atenuasyon. Yo te idantifye peptides sentèz yoak yon tolerans mas de 0.05 Da ak manyèlman sekans lè l sèvi avèk yon MS/MS tolerans nan 0.01 Da.
2.3. Kilti selilè ak tès viabilite
Selil imen, granmoun, ki ba kalsyòm, tanperati ki wo (HaCaT).ak CCD-1064Sk (po moun nòmalfibroblast) selil yo tekiltive nan DMEM ak 10 pousan FBS ak 1 pousan penisilin /streptomycin. Selil yo te enkube nan 37 C nan yon chanm lè imidite ak 5 pousan CO2.Pou tès viabilite yo, yo te itilize twous konte selil-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Beijing, Lachin). Selil HaCaT ak CCD-1064Skyo te simen nan 96-pye mikroplak (5 103 selil pou chak pui) ak enkubasyon nan 37 C nan 5 pousan CO2 pou 24 h. Lè sa a, kilti yo te ekspoze a diferan konsantrasyon nan peptides sentèz yo oswa GA ak enkubasyon nan 37. C nan 5 pousan CO2 pou 24 h. Viabilite selilèanswit te mezire lè l sèvi avèk yon CCK-8 swiv direktiv manifakti a.
2.4. Detèminasyon aktivite antioksidan
2.4.1. DPPH tès.Aktivite antioksidan nan sentèz lapeptides ak GA yo te evalye endividyèlman lè l sèvi avèk tès DPPH. Yo te fè tès DPPH apre yon rapò deja
metodoloji ak modi minèkatyon.12,14–16 Premyèman, yon 0.12 mg mL 1 Solisyon DPPH te prepare nan metanol, Lè sa a, 100mL nan solisyon DPPH ak 100mL nan peptides sentèz yo oswa GA yo te melanje nan diferan konsantrasyon ({{0}}.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM, ak 1mM) nan 96-byen mikroplak yo. Nan yon enkibatè souke òbital, lamelanj yo te reyaji pou 30 minit nan 37 C ak 100 rpm san yo palimyè. Lè sa a, absorpsyon an te mezire nan 517 nm epi yo te kalkile kapasite antioksidan an.
2.4.2. Aktivite ROS scavenging.
Yo te evalye aktivite ROS entraselilè yo lè l sèvi avèk yon twous 20,70-dichlorofluorescein diacetate.(DCF-DA, Abcam, USA). Selil HaCaT yo te simen nan 96-microplates byen (5 103 selil pou chak pui) ak enkubasyon nan 37 C pou 24 h.AftApre enkubasyon, kilti yo te ekspoze a peptides sentèz yo oswa GA (100mM) ak enkubasyon nan 37 C pou 24 h. Lè sa a, selil yo te ekspoze a yon 10mM DCF-DA solisyon ak enkubasyon pou 30 min. AftApre enkubasyon, yo te lave solisyon an ak PBS. Laselil yo te analize lè l sèvi avèk yon lektè microplate nan eksitasyon ak
longèdonn emisyon nan 485 nm ak 530 nm, respektivman.
Fig. 1Etap sentetik ak konfimasyon sekans nan peptides lè l sèvi avèk quadrupole-tan nanvòl(Q-TOF) mas spèktrometri: (a) detaye pwosedi sentetik (b) TPPTTP, (c) galloyl–TPPTTP, ak (d) (galloyl)2–KTPPTTP.
2.5. Egzamen potansyèl manbràn mitokondriyo
Yo te itilize lank JC-1 (Thermo Fisher, USA) pou mitokondriyo atès potansyèl manbràn (MmP). Selil CCD-1064Sk ak HaCaT yo te simen nan 96-mikwoplak byen (5 10 3selil pou chak pui)
ak enkubasyon nan 37 C ak nan 5 pousan CO2 pou 24 h. Aftapre enkubasyon,kilti yo te ekspoze a diferan konsantrasyon nan peptides sentèz yo ak enkubasyon nan 37 C nan 5 pousan CO2 pou 24 h.JC-1 te ajoute nan selil CCD-1064Sk ak HaCaT poupwodwi a konsantrasyon final 10mM. AftApre 10 minit nan enkubasyon, selil yo te lave de fwa ak 37 C PBS. Vèt ak woujfliyoresansyo te mezire lè l sèvi avèk yon Varioskan LUXMultimode Microplate Reader (ThermoFisher, USA) nan yon eksitasyon (lEgz)/emisyon (lEm) nan 475/530 nm ak alEgz/lEmnan 475/590 nm, respektivman.
2.6. Elastase inhibition aktivite tès
Selil CCD-1064Sk yo te simen nan 6-plak byen epi yo te enkube a 37 C nan 5 pousan CO2 pou 24 h. Lè sa a, kilti yo te ekspoze a yon konsantrasyon 100mM nan peptides sentèz yo oswa GA ak enkubasyon nan 37 C nan 5 pousan CO2 pou 24 h. Selil yo te lave ak dPBS de fwa epi nou kolekte chak selil lè l sèvi avèk grate selil. Aer ajoute 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) ak 0.1 pousan Triton-X nan kolekteselil yo, selil yo te homogenized pa ultrasonicator. Solisyon omojenize a te santrifuje pou 20 minit nan 3000 rpmak 4 C. Lè sa a, after pran supernatant a, kantite pwoteyin-kasyon te fèt lè l sèvi avèk tès pwoteyin BCA. Pwoteyin pou chakechantiyon te dispanse nan lafikonsantrasyon final nan 100mgmL 1, epiN-succinyl-tri-alanyl-p-nitroanilide te ajoute nan lakonsantrasyon final la nan 1.6 mM ak reyaji nan 36 C pou 1 h.Lè sa a, yo te mezire absorbans la nan 405 nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate.
2.7. RT-qPCR
Nivo mRNA makè anti-aje nan selil CCK-1064Sk yoyo te evalye lè l sèvi avèk RT-qPCR. Total RNA te kolekte lè l sèvi avèk TRIzol reyaktif (Life Technologies, Carlsbad, CA) ak ranvèse
transkri lè l sèvi avèk twous reyaktif PrimeScript RT (Takara BioInc., Kusatsu, Japon). Yon sistèm CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ak iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratwa
tories) yo te itilize pou RT-qPCR.b-Actin te itilize pou nòmalize nivo mRNA kolagen tip I, MMP-1, ak PGC-1a.
2.8. Analiz estatistik
Done yo prezante kòm mwayen an devyasyon estanda detwa mezi endepandan epi analize yo itilize Student'st-tès, ak yonp < 0.05 considered to be a signipa ka diferans.
Mande plis:
Imèl:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plis 86 15292862950
