Rezistans apoptoz nan selil senesan se yon baryè intrinsèques pou senolysis pwovoke pa glikozid kadyak.
Jul 26, 2022
Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon
RésuméVize eliminasyon selil senesan, analiz, se youn nan tandans debaz yo nan terapi anti-aje. Glikozid kadyak yo te dènyèman pwouve yo dwe senolytics gwo-spectre. Isit la nou teste pwopriyete senolytic nan glikozid kadyak nan direksyon pou selil souch mesenchymal imen (hMSCs). Glikozid kadyak pa te gen okenn kapasite senolytic nan direksyon pou hMSC senesan ki gen plizyè orijin. Sèvi ak apwòch byolojik ak byoenfòmatik nou konpare devlopman senesans nan 'glikozid kadyak-sansib'A549 ak '-ensansib'hMSCs. Yo te jwenn absans la nan analiz yo dwe medyatè pa enpòte efikas potasyòm ak ogmante rezistans apoptoz nan hMSCs senesan. Afebli "defans antiapoptotik" predispose hMSCs nan analiz. Nou revele ke rezistans apoptoz, deja rekonèt kòm yon karakteristik komen nan senesans, an reyalite, se pa yon karakteristik jeneral nan selil senesan. Anplis, sèlman selil apoptoz-prolin senesan yo sansib nan analiz kadyak glikozid-induit. Kidonk, nou ka espekile ke efikasite nan analiz ta ka depann de si wi ou non selil senesan yo tout bon vin reziste apoptoz konpare ak tokay proliferasyon yo.
Mo kleSelil souch. Senolysis·Senescence·Apoptosis·Rezistans estrès
Tanpri klike isit la pou konnen plis
Entwodiksyon
Jodi a, senesans selilè konsidere kòm yon reyaksyon komen nan prèske tout kalite selil k ap pwopagasyon, ki gen ladan kansè ak selil tij yo, ansanm ak kèk selil post-mitotik nan yon varyete estimilis estrès [1-3]. Kalite sa yo nan senesans selilè yo ka distenge kòmsadwa nan orijin nan faktè a pwovoke: replikasyon (akòz domaj ADN nan nan bout telomè ki pi kout), onkogen-induit (an repons a aktivasyon aberan nan siyal onkogenik), estrès-induit ( medyatè pa domaj ADN ki te koze pa estrès oksidatif, chòk chalè, UV ak radyasyon y, elatriye) ak chimyoterapi pwovoke (aktive nan selil kansè yo an repons a dwòg chimyoterapi)[4-7]. Gen eterojenite nan makè ki eksprime pa selil senesan depann sou tou de kalite selil ak yon joure ki itilize pou pwovoke senesan. Sepandan, gen plizyè karakteristik komen tipik pou pifò kalite selil senesan. Karakteristik esansyèl nan senesans pou nenpòt kalite selil divize se pèt pwopagasyon irevokabl [8].ekstrè cistanche tubulosaIrevèrsibilite arèstasyon sik selil la kontwole pa inibitè kinaz siklin-depandan (CDK) pl6 ak p21 epi li souvan kontwole pa pwoteyin timè p53 [8,9]. Lòt karakteristik enpòtan selil senesan yo se deklanchman yon repons domaj ADN ki pèsistan; ipètrofi selil, ki souvan rive kòm yon rezilta nan byogenesis ribosomal andikape ak sentèz pwoteyin; twoub degradasyon lizozomal ak malfonksyònman sistèm degradasyon rès yo; ogmante aktivite anzim lizozomal espesifik ki asosye ak senesans - -galaktozidaz la; divès kalite chanjman mitokondriyo; akizisyon de fenotip sekretè senesans ki asosye (SASP), ki konpoze de faktè pro-enflamatwa, anzim ki degrade matris, espès oksijèn reyaktif, elatriye; chanjman nan jaden epigenetik ak chromatin, ki gen ladan fòmasyon fokis eterokromatik ki asosye ak senesans ak distensyon satelit ki asosye ak senesans [8-10]. Nan lòt mo, selil senesan prezève aktivite metabolik ak vitalite, men fonksyone yo chanje anpil konpare ak selil orijin yo.
Cistanche ka anti-aje
Kounye a li klè ke selil senesan yo ka modifye mikwo-anviwònman ki antoure ki afekte tou de selil vwazen yo ak nich selilè yo, sa ki ka mennen nan fonksyone byen tisi yo epi kidonk yo ka gen rapò ak pwogresyon nan aje ak maladi ki gen rapò ak laj [11,12]. Kenbe sa nan tèt ou, jodi a plis atansyon konsantre sou estrateji yo pou vize "touye" selil senesan [13-15]. Pou sa ka fèt, yon nouvo klas dwòg yo rele senolytics ap devlope aktivman. Senolytics vize chemen siyal ki kontribye nan rezistans nan selil senesan nan direksyon pou apoptoz, kidonk pwovoke apoptoz preferansyèlman nan selil senesan [16]. Lis la nan senolytics se toujou ap ranplir ak nouvo ajan. Konpoze ki pi li te ye ak aktivite senolytic deklare a se navitoclax (inibitè fanmi Bcl-2), yon konbinezon dasatinib (yon inibitè nan miltip tirozin kinaz) ak quercetin (yon flavonol natirèl), inibitè Hsp90, inibitè MDM2, FOXO{ {8}}P53 entèferans peptide, yon degrade pwoteyin fanmi BET, CAR-T espesifik pou uPAR, navitoclax galakto-konjige ak divès konpoze natirèl senolytic[16-24]. Dènyèman, lè l sèvi avèk tès depistaj dwòg wo-debi, de gwoup rechèch endepandan idantifye glikozid kadyak, patikilyèman ouabain, digoxin, ak bufalin, kòm senolytics gwo spectre [25,26].revizyon cistanche tubulosaLi se vo mansyone ke prèske tout nan senolytics yo te deklare gen limit, tankou efè segondè endezirab oswa inefikasite nan direksyon pou kèk kalite selil. Selil souch mesenchymal (MSCs), yo jwenn nòmalman nan tout ògàn/tisi apre akouchman yo, yo karakterize pa kapasite pou renouvle pwòp tèt ou (divizyon simetrik) ak diferansye, kidonk kontribye nan antretyen ak rejenerasyon tisi ki abite [27]. Akòz pwopriyete inik sa yo, ansanm ak fonksyon ki pisan anti-enflamatwa ak imunosuppressive, MSC yo lajman aplike nan terapi ranplasman selil pou tretman divès maladi, ki gen ladan dyabèt melitu, paralezi miltip, enfaktis myokad, ak sou sa [28]. Sepandan, menm jan ak pwojeniti différenciés yo ak lòt selil unipotan, MSC yo kapab senesce swa replikatif oswa prematireman an repons a deklanchman onkogen yo ak estimilis estrès [29, 30]. nan pisin nan selil souch, redwi antretyen tisi ak rejenerasyon, kapasite diferansyasyon ki gen pwoblèm, gaye senesans SASP-medyatè, redwi pwopriyete anjyojenik, modifikasyon nich selil souch [29,31-33]. Lè w konsidere siyifikasyon byolojik bon fonksyone MSC yo, MSC senesan yo ta ka konsidere kòm sib enpòtan pou analiz. Nan liy ak sijesyon sa a, yo te pibliye yon kantite revizyon ki mete aksan sou rezilta avantaje posib pou retire MSC senesan yo pandan ane ki sot pase a [29, 31,34,35]. Men, gen sèlman kèk done eksperimantal konsènan pwoblèm sa a [36-40].
Nan etid sa a, nou demontre pou premye fwa ke glikozid kadyak, sètadi ouabain ak bufalin, pa montre aktivite emolitik nan direksyon MSC imen (hMSCs) ki sòti nan andometri a (END-MSCs), tisi adipoz (AD-MSCs), kaka dantè (DP-MSCs) ak Warton jele (WJ-MSCs).Anplis de sa, nou konfime ke tou de glikozid kadyak yo kapab pwovoke apoptoz preferansyèlman nan senes-sant A549 ak SK-HEP -1, jan yo te dekri deja. nan etid pilòt yo [25,26]. Lè nou evalye chanjman nan omeyostazi iyonik ki te koze pa Nat/K plis -ATPase bloke ak nivo ekspresyon jèn ki gen rapò yo, nou revele ke absans analiz ouabain-induit ta ka medyatè pa efikasite amelyore konpansatwa K plis enpòtasyon nan senesan END- MSC yo konpare ak senesan A549. Anplis de sa, lè l sèvi avèk bioenfòmatik avanse nou demontre ke senesans nan END-MSCs, rezistan nan analiz ouabain-induit, se akonpaye pa akizisyon de fenotip apoptoz ki reziste, pandan y ap senesans nan ouabain-sansib A549 se pa. Sa ki enpòtan, bloke aktivite pwoteyin antiapoptotik MCL-1 anvan tretman glikozid kadyak te lakòz analiz de END-MSCs senesan ki reziste apoptoz. Se poutèt sa, nou bay prèv klè ke apoptoz-rezistans se pa yon karakteristik jeneral nan selil senesan. Ki baze sou done yo jwenn nou konkli ke efikasite nan apwòch analitik ta ka depann de si wi ou non selil yo te vin reziste apoptoz pandan devlopman senesans.
Materyèl ak metòd
Selil
END-MSCs, WJ-MSCs, DP-MSCs, AD-MSCs, A549, ak SK-Help yo te jwenn nan Koleksyon Ris selil Kilti (Enstiti Sitoloji, Saint-Petersburg, Larisi). Liy A549 ak SK-Help yo te otantifye pa karyoloji, tumorigenicity, isoenzyme (LDH ak G6PD) tès, ak analiz STR. Selil yo te kiltive nan mwayen konplè DMEM F12 (Gibco BRL) siplemantè ak 10 pousan FBS (HyClone), 1 pousan penisilin-streptomycin (Gibco BRL) ak 1 pousan glutamik (Gibco BRL).Tout selil yo te regilyèman teste pou kontaminasyon mycoplasma.
Senesans- ak kondisyon ki pwovoke estrès
Pou senesans estrès oksidatif, yo te trete END-MSCs / WJ-MSCs ak 200 uM / 100 uM HO (Sigma) pou 1 èdtan. Pou doxorubicin-induit senesans, DP-MSCs/A549 yo te trete ak 1 μM nan doxorubicin （Veropharm） pou 3 jou. Nan chak ka, selil yo te konsidere kòm senesan pa pi bonè pase 14 jou apre tretman an. Pou repwodiktif senesans AD-MSC yo te idantifye pi bonè pase 4yèm pasaj la kòm selil kontwòl epi pita pase 10yèm lan kòm senesan. Pou senesans etoposid pwovoke A549 / END-MSCs / SK-Help yo te trete ak 2 uM / 5 uM / 3 uM etoposide (Veropharm) pou 3 jou epi yo analize pa pi bonè pase 7 jou apre endiksyon senesans. Nan ka sa a, konsepsyon tretman an konplètman kowenside ak sa ki dekri nan etid la ki soti nan ki done RNA-seq soti (Wang et al., 2017). De glikozid kadyak nou aplike kòm konpoze senolytic - Ouabain (Sigma) ak Bufalin (Calbiochem).
Yo nan lòd yo konpare rezistans estrès ant kontwòl ak senesan END-MSCs oswa A549, selil yo te trete swa ak 4 00/800 uM H O2 (Sigma) pou 1 èdtan oswa ak 0.3/1 uM staurosporine (Sigma). Vitabilite selil yo te analize 48 èdtan apre endiksyon estrès.
Pou bloke aktivite MCL-1 END-MSC yo te pretrete ak 10 uM nan A-1210477(Sigma) pou 3 jou.
Analiz sikometri koule
Mezi nan viabilite selil, pwopagasyon, gwosè selil, oto-fluoresans, pousantaj apoptoz, kaspase 3/7 klivaj, potansyèl manbràn mitokondriyo, ak depolarizasyon manbràn te pote soti nan sikometri koule. Sitometri koule yo te fèt lè l sèvi avèk CytoFLEX (Beckman Coulter) epi yo te analize done yo jwenn lè l sèvi avèk CytExpert lojisyèl vèsyon 2.0. Selil aderan yo te rense de fwa ak PBS ak rekòlte pa trypsinization. Selil detache yo te pisin ak resuspend nan mwayen fre ak Lè sa a, konte ak analize pou otofluoresans. Pou jwenn aksè nan rantabilite selilè yo, yo te ajoute 50ug/ml propidium yodide （Life Technologies） nan chak echantiyon jis anvan analiz la. Gwosè selil la te evalye pa cytometric pi devan gaye limyè nan selil PI-negatif. Endiksyon apoptoz te verifye lè l sèvi avèk Annexin-V-APC (Invitrogen) ak DAPI (Sigma) ko-tach swiv enstriksyon manifakti. Aktivite Caspase te evalye lè l sèvi avèk CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Twous (Invitrogen) swiv pwotokòl manifakti. Pèt potansyèl manbràn mitokondriyo yo te evalye lè l sèvi avèk lank rasyonometrik JC -1 (Invitrogen). Pwosedi tach la te fèt an akò ak pwotokòl manifakti a. Pou depolarization manbràn, nou te itilize yon DiBAC4 (3) pwofonde fluorescent (Invitrogen).
Senesans ki asosye -galactosidase tach
Senesans-asosye -Galactosidase (SA- -Gal)tach te fèt lè l sèvi avèk yon senesans -galactosidase tach twous (Cell Signaling Technology) dapre enstriksyon manifakti a. Yo te pwodwi analiz quantitative nan imaj ak aplikasyon MatLab pake a, dapre algorithm ki dekri deja [41]. Pou chak pwen eksperimantal, pa mwens pase 50 selil chwazi owaza yo te analize.
Western blotting
Western blotting te fèt jan sa dekri deja [41]. Elektwoforèz SDS-PAGE, transfere nan yon manbràn nitrocellulose, ak imunoblotting ak deteksyon ECL (Thermo Scientific) yo te fèt dapre pwotokòl manifakti estanda (Bio-Rad Laboratories). Yo te itilize antikò kont pwoteyin sa yo: glyceraldehyde -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (klonaj 14C10), fosfo-p53 (Ser15), p21 (klon 12D1), fosfo-Rb (Ser807/811) , HMGB1 (klonaj D3E5), osi byen ke refor peroksidaz-konjige kabrit antirabbit IgG. Pousantaj dilution yo te 1:1000 pou tout antikò prensipal yo ak 1:7000 pou antikò segondè yo. Tout antikò yo te achte nan men Cell Signaling. Scion Image 4.0(Scion Corporation) te itilize pou chwazi ak detèmine dansite background-soustraksyon nan bann yo nan tout jèl yo ak blots.
Analiz transcriptomic
Echantiyon ki soti nan twa Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq done sa yo te itilize nan analiz la: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 ak GSM2742121-GSM2742122forcontrol ak senescentA549cells, kòmsadwa); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 ak GSM3454500-GSM3454502 pou selil kontwòl ak senesan IMR-90, kòmsadwa); ak done nou an GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 ak GSM4877907-GSM4877910 pou kontwòl ak senesan END-MSCs, respektivman). Done yo pou tout ansanm done yo te trete nan menm fason an.
Done lekti kri yo te sibi bon jan kalite filtraj ak taye adaptè atravè FilterByTile ak scripts BBDuk ki soti nan pake BBtools (vèsyon 38.75) lè l sèvi avèk opsyon default yo. Lekti ki rete yo te anplis filtre ak koupe ak itilizasyon yon script trimès ki soti nan pake FastqPuri (vèsyon 1.0.7).cistanche UKOperasyon taye te aplike pou tou de bout li yo si yo te genyen N oswa bon jan kalite yo te pi ba pase papòt bon kalite ki te fikse a 27, tout lekti ki pi kout pase 25 baz yo te abandone. Kontwòl kalite taye te fèt ak lojisyèl FastQC (vèsyon 0.11.7) ak FastqPuri scripts. Lekti yo, yo te pase tout operasyon yo, pa gen mwens pase 90 pousan nan premye done yo.
Abondans transkripsyon yo te estime lè l sèvi avèk kat jeyografik ki lejè Salmon (vèsyon 1.1.0) kouri nan mòd aliyman selektif la. Lis dekoy yo te pwodwi ki baze sou Gencode genòm referans imen GRCh38.p13 (lage 33) epi yo te itilize plis pou bati endèks la sou transcriptome konkatèn ak dosye referans Gencode (lage 33) lè l sèvi avèk yon gwosè kmer de 21. Operasyon kat yo te kouri. ak drapo adisyonèl——numBootstraps 30——payèt——gcBias——valide kat yo. Pousantaj kat yo ki te lakòz yo te alantou 70 pousan.
Yo te fè plis tretman done lè l sèvi avèk vèsyon R 3.6.3 ak koleksyon pakè Tidyverse (vèsyon 1.3.0). Estimasyon konte jèn, metadata, ak seri transkripsyon yo te chaje nan R ak rezime nan yon nivo jèn lè l sèvi avèk tximeta (vèsyon 1.4.5). Matris konte ki kapab lakòz yo te filtre pou genyen ranje ki gen omwen 5 konte estime atravè tout echantiyon yo, matris ki lakòz yo te genyen 20,400 jèn.
Pou reprezantasyon PCA ak kat chalè a, konte lekti yo te nòmalize lè l sèvi avèk transfòmasyon log ki soti nan pake DESeq2 (vèsyon 1.26.0).cistanche wirkungHeatmap yo te konstwi ak itilizasyon filtè jèn (vèsyon 1.38.0) ak pakè heatmap (vèsyon 1.0.12)R. Validasyon echantiyon divizyon yo pa varyab senesans te fèt atravè yon seri konte lekti nòmalize pa jèn ki gen rapò ak tèm Ontoloji Gene "Senesans selilè" (GO 0090398). Analiz ekspresyon diferans ak estimasyon chanjman pliye yo te kalkile lè l sèvi avèk DESeq2 pou dènye varyab nan fòmil konsepsyon kontwòl-ling pou estati senesans selil yo, reyaksyon tretman ouabain, ak entèraksyon faktè ki endike yo. Pou ranfòse tès ekspresyon diferansye, yo te aplike koreksyon chanjman pliye nan boutèy demi lit lè l sèvi avèk yon konbinezon estimatè kontraksyon adaptab ki soti nan pake palmis la (vèsyon 1.8.0) epi yo te aplike yon lòt papòt chanjman pliye ki egal a 0.667. Estimasyon retresi ki kapab lakòz yo te itilize plis pou klasman jèn ak kouri analiz anrichisman seri jen yo lè l sèvi avèk pwofil gwoup (vèsyon 3.14.3) ak pakè fuse (vèsyon 1.12.0) R ak valè p ajiste pou konparezon miltip dapre metòd Benjamin-Hochberg. Affymetrix microarray echantiyon pou kontwòl ak senes-sant AD-MSC yo te jwenn nan baz done a GEO (GSE66236) ak trete ak Phantasus aplikasyon entènèt ak log2 ak nòmalizasyon konte quantile. Gene Set Enrichment Analysis te fèt ak itilizasyon yon pake fuse (vèsyon 1.12.0) R.
Ekstraksyon RNA, transkripsyon ranvèse, ak PCR an tan reyèl
Ekstraksyon RNA, transkripsyon ranvèse, ak PCR an tan reyèl yo te fèt jan sa dekri nan etid anvan nou an [32]. Evrogen te jwenn reyaktif pou fè ekstraksyon RNA (ExtractRNA reyaktif), transkripsyon ranvèse (MMLV RT kit), ak PCR an tan reyèl (HS SYBR kit). Nivo ekspresyon jèn yo te evalye lè l sèvi avèk anplifikatè PCR BioRad CFX-96 an tan reyèl (BioRad) ak pwogram kouri sa a pou tout jèn envestige yo: 40 sik k ap fonn pou 10 s a 95 degre, rkwir pou 15 s nan 57.5 degre. , ak sentèz pou 15 s nan 72 degre . Yo te aplike analiz koub k ap fonn pou kontwole espesifik reyaksyon yo. Analiz sa a nan done yo jwenn yo te fèt lè l sèvi avèk Bio-Rad CFX Manadjè lojisyèl an (BioRad) ak metòd la quantifikasyon estanda 2deltaCt ak itilizasyon ekspresyon GAPDH kòm referans. Yo bay sekans Primer yo nan Tablo 1.
Analiz estatistik
Pou jwenn siyifikasyon nan diferans ki genyen ant de gwoup yo, yo te aplike tès t Elèv la oswa tès t Welch a. Pou konparezon miltip ant gwoup yo, yo te itilize ANOVA ak HSD Tukey a. Sòf si yo endike otreman, tout done quantitative yo montre kòm mwayen ± SD epi asteris yo endike diferans enpòtan jan sa a: ns, pa enpòtan,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">
Rezilta yo
H2O2-END-MSC trete antre nan senesans twò bonè
Nan etid prezan an, nou te itilize selil souch mesenchymal imen izole nan andometri desquamated (END-MSCs), ki satisfè kritè minimòm ISCT sijere pou defini hMSCs [41]. Précédemment, nou te devlope yon modèl eksperimantal serye pou etidye divès aspè nan senesans twò bonè nan END-MSCs [30]. Savwa, nou te montre ke END-MSCs sibi estrès oksidatif subletal piti piti akeri tout karakteristik tipik nan selil senesan, ki gen ladan fokis ki pèsistan ADN ki gen laj domaj ak repons aktif domaj ADN, arèstasyon sik selil irevokabl medyatè pa p53 / p21 / Rb klasik la. chemen, pèt pwopagasyon, ipètrofi selil, aparans nan tach SA - -Gal ak devlopman fenotip sekretè ki asosye ak senesans [30, 32, 42]. Isit la nou aplike modèl ki fèt la pou etidye efè senolytic ouabain ak revele chanjman ki kache nan omeyostazi iyon yo. Okòmansman, lè nou estime paramèt ki pi komen yo, nou konfime ke yon sèl dòz (1 h, 200 μM) tretman HO te ase pou pwovoke senesans nan END-MSCs. Sa ki enpòtan, ensiste END-MSC yo te konsidere kòm senesan de semèn apre estrès oksidatif la; Se poutèt sa, tout makè senesans yo te evalye pa pi bonè pase 14 jou apre tretman H-Oz. Vreman vre, tretman H-Oz nan END-MSCs te mennen nan blòk pwopagasyon, ipètrofi selil jan sa endike nan ogmante gwosè selil la, akimilasyon nan lipofuscin la detekte pa elevasyon nan otofluoresans, aparans nan SA - -Gal, aktivasyon nan p21 / Rb chemen ak pèt HMGB1 ansanm sipòte etablisman senesans anba kondisyon yo chwazi eksperimantal (figi ac, e, f).
Efè ki pi danjere nan selil senesan nan nivo tisi ak òganis yo kwè se konsekans vitalite pwolonje yo. Nan liy ak pwen sa a, HO?-trete END-MSCs kenbe gwo viabilite menm nan etap yo an reta nan devlopman senesans (yo te evalye viabilite nan senesan END-MSCs 17 jou (14 jou + 3 jou) apre premye estrès oksidatif la) (Fig.1d ). An rezime, tretman subletal HO2- nan END-MSCs se modèl ki apwopriye nan senesans la twò bonè epi li enpòtan pou mennen ankèt sou efè konpoze senolytic yo sou END-MSCs.
Ouabain glikozid kadyak pa gen okenn aktivite senolitik nan direksyon senesan END-MSC nan yon pakèt konsantrasyon.
Dènye prèv sijere ke glikozid kadyak, ki gen ladan ouabain, digoxin, ak bufalin, reprezante yon fanmi konpoze ak aktivite emolitik [25,26]. Menm si jodi a glikozid kadyak yo konsidere kòm senolitik laj spectre, done yo konsènan efè yo sou hMSC senesan yo manke. Se poutèt sa, isit la nou teste si ouabain gen potansyèl pou pwovoke lanmò selektivman nan senesan END-MSCs. Pou fè sa, nou te evalye viabilite kontwòl ak senes-sant END-MSCs apre tretman ak ouabain nan ranje konsantrasyon lajè (soti nan 10-' rive nan 10 ~ M). Enteresan, ni konsantrasyon aplike te mennen nan yon diminisyon aparan nan viabilite tou de kontwòl ak selil senesan nan premye jou apre aplikasyon ouabain (Fig.2 ak Fig.S1 siplemantè).
Sepandan, sou twazyèm jou a apre tretman ouabain, nou revele yon bès enpòtan ki depann de dòz la nan viabilite kontwòl END-MSCs (figi 2a ak Figi siplemantè S1). San atann, selil senesan yo te vin pi rezistan a ouabain nan chak konsantrasyon teste. Dapre rezilta sa a, 10-M ouabain te mennen nan lanmò apoptotik ki gen plis tandans nan selil kontwòl (20.75 pousan An plis /PI-ak 36.47 pousan An plis /PI plis )konpare ak moun ki senesan yo (15.01 pousan An＋/PI). -ak 12.15 pousan An plis /PI plis )(Fig.2b). Rezilta yo jwenn klèman demontre ke nan kontèks senesan END-MSCs ouabain pa gen okenn aktivite senolytic.
Pou eskli efè posib ki asosye ak varyasyon nan estimilis senesans-induit sou aksyon senolytic nan ouabain, nou fè yon seri adisyonèl nan eksperyans. Savwa, nou trete END-MSCs ak etoposide olye de estrès oksidatif pou pwovoke twò bonè senesans.bioflavonoid CitrusEtoposide-trete END-MSC yo montre tout karakteristik tipik pou selil senesan (Fig.3a-e).
Sa ki enpòtan, ouabain pa te gen okenn aksyon emolitik nan direksyon senesan END-MSCs trete etoposide (figi 3f ak Figi siplemantè-mantal S2). Done sa yo bay plis konfimasyon pou rezilta ki anwo yo ak prèv ke mank de analiz ouabain pwovoke se pa konsekans deklanche senesans konkrè yo itilize pou pwovoke senesans.
Fig.1 Validasyon oksidatif estrès-induit END-MSCs twò bonè senesans modèl. Senesan END-MSC yo yon pwopagasyon ki lach, b sibi ipètrofi, c jwenn otofluoresans ki wo, kenbe rantabilite selil segondè d epi montre aktivite SA- -Gal konpare ak sa yo ki kontwole. f Nivo fosforilasyon p53 ak Rb ak nivo ekspresyon p21 ak pwoteyin HMGBI nan kontwòl ak senesan END-Ouabain pa gen okenn aksyon emolitik nan direksyon selil souch mesenchymal imen ki gen divès orijin Pou elaji obsèvasyon nou yo konsènan absans analiz ouabain-induit nan END-MSCs. , nou analize efè ouabain sou hMSC yo izole nan lòt sous ki gen ladan tisi adipoz, kaka dantè, ak jele Wharton. Pou ranfòse done nou yo, nou aplike diferan modèl senesans——replicative senesans pou AD-MSCs, doxorubicin-induit senesans pou DP-MSCs, ak oksidatif estrès-pwovoke senesans pou WJ-MSCs (Fig.4a-f).
Jan yo montre nan Fig.4g, divès kalite hMSC yo diferan nan rantabilite a sou tretman ouabain, pou egzanp, tou de kontwòl ak senesan DP-MSC yo te pi plis rezistan nan aksyon ouabain pase WJ-MSCs (Fig.4g ak Fig. S3b siplemantè, c). Men, ouabain pa t 'kapab pwovoke senolysis nan nenpòt kalite hMSCs senesan (figi 4g ak Figi siplemantè S3). Ansanm, done yo jwenn yo demontre absans analiz ouabain-induit se yon karakteristik komen pou divès kalite hMSCs. MSC yo. Valè yo prezante yo vle di ± SD. Pou konparezon plizyè gwoup nan a ak d, yo te aplike ANOVA yon sèl-fason, n=3, ns pa enpòtan,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">
GAPDH te itilize kòm yon kontwòl chajman
Bubalin glikozid kadyak echwe pou touye senesan END-MSCS
Pou verifye absans aksyon senolytic nan glikozid kadyak nan direksyon pou hMSCs, nou aplike bufalin, yon lòt konpoze ak aktivite senolytic deklare ki fè pati fanmi an glikozid kadyak [25]. Bufalin te prèske pa gen okenn efè sou rantabilite kontwòl ak H2O2-trete senes-sant END-MSCs nan yon seri konsantrasyon lajè (soti nan 10-7 a 10-5 M) (Fig. 5a ak siplemantè) Fig. S4a).
Menm jan ak sa nou te obsève pou tretman ouabain, absans analiz sou bufalin te endepandan de stimuli senesans ki pwovoke, depi viabilite ESC ki senesce swa an repons a estrès oksidatif oswa nan etoposid pa te afekte (Fig. 5a, b, Fig Siplemantè). S4a, b). Rezilta yo dekri pi wo a konfime ke glikozid kadyak yo te tounen inefikas pou endiksyon lanmò vize nan senesan END-MSCs. MSC yo. Valè yo prezante yo vle di ± SD. Pou konparezon plizyè gwoup nan a ak d, yo te aplike ANOVA yon sèl-fason, n=3, ns pa enpòtan,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">
Bubalin glikozid kadyak echwe pou touye senesan END-MSCS
Pou verifye absans aksyon senolytic nan glikozid kadyak nan direksyon pou hMSCs, nou aplike bufalin, yon lòt konpoze ak aktivite senolytic deklare ki fè pati fanmi an glikozid kadyak [25]. Bufalin te prèske pa gen okenn efè sou rantabilite kontwòl ak H2O2-trete senes-sant END-MSCs nan yon seri konsantrasyon lajè (soti nan 10-7 a 10-5 M) (Fig. 5a ak siplemantè) Fig. S4a).
Menm jan ak sa nou te obsève pou tretman ouabain, absans analiz sou bufalin te endepandan de stimuli senesans ki pwovoke, depi viabilite ESC ki senesce swa an repons a estrès oksidatif oswa nan etoposid pa te afekte (Fig. 5a, b, Fig Siplemantè). S4a, b). Rezilta yo dekri pi wo a konfime ke glikozid kadyak yo te tounen inefikas pou endiksyon lanmò vize nan senesan END-MSCs.
Fig.2 Ouabain pa gen okenn aktivite emolitik anvè HO2-trete senes-sant END-MSCs nan yon pakèt konsantrasyon. Relatif viabilite selil (pousan) nan kontwòl ak senesan END-MSCs nan 3 jou apre tretman ak 1077,10 ~ 6,10-5 M ouabain. b Endiksyon apoptoz nan END-MSCs sou 10-6 M ouabain evalye pa Annexin V/DAPI doub tach. n=3 eksperyans endepandan. Tout done koresponn ak mwayèn ± SD. Siyifikasyon estatistik te evalye pa tès t Welch la: ns pa enpòtan,***p<>
Tou de glikozid kadyak ouabain ak bufalin yo kapab pwovoke lanmò selil oaza nan selil senesan A549 ak SK-Hep1.
Lè n konsidere lefèt ke rezilta nou yo pa koresponn ak prèv ki fèk pibliye konsènan aksyon senolytic gwo spectre nan glikozid kadyak, nou deside repwodui efè sa a lè l sèvi avèk modèl selilè ki dekri nan etid ki enpòtan yo [25,26]. Se konsa, nou te fè yon seri de eksperyans lè l sèvi avèk kontwòl ak senesan A549 selil kansè nan poumon. Senesans nan selil A549 te pwovoke pa tretman etoposid. Senesans Etoposide-induit nan selil A549 se yon modèl souvan itilize e konsa byen karakterize nan senesans terapi-induit [4]. Epitou, ouabain yo te montre selektif touye etoposide-trete selil senesan A549[25].Pou pwouve senesans nan A549, nou evalye pousantaj pwopagasyon, gwosè selil, akimilasyon nan lipo-fin, SA- -Gal tach, estati a aktivasyon. nan chemen an p53 / p21 / Rb, ak nivo ekspresyon nan HMGB1 (Fig. 6a-e).
Pou verifye aktivite emolitik ouabain anvè selil kansè senesan, nou te premye estime rantabilite selil ki depann de dòz la. Nan liy ak rezilta nou yo dekri pi wo a, nou pa t 'kapab detekte okenn bès enpòtan nan kantite kontwòl solid oswa selil A549 senesan nan 24 èdtan apre aplikasyon ouabain (Siplemantè Fig. S5a). Sepandan, nan 3 jou apre tretman ouabain siyifikativman redwi viabilite nan selil A549 senesan nan yon fason ki depann de dòz, pandan y ap kantite selil kontwòl A549 diminye nan yon limit anpil pi piti (Fig.7a ak Fig. Siplemantè S5a). Savwa, apeprè 90 pousan nan selil kontwòl konsève viabilite nan 10- M ouabain konpare ak 50 pousan nan selil senesan A549 trete ak menm dòz la (Fig.7a). Anplis, selil senesan A549 yo te gen plis tandans pou lanmò selil bufalin-induit pase tokay kontwòl yo (Fig.7b) (Fig.5b ak Fig.S5b siplemantè).
Dapre done ki te pibliye yo, ouabain te deklanche apoptoz ki depann de kapasaz -3- nan selil senesan A549 [26]. Vreman vre, nou revele yon ogmantasyon enpòtan nan doub pozitif ak / oswa PI-fraksyon nan selil kansè senesan trete ak 10-6 M ouabain (Fig.7c). Anplis de sa, lè l sèvi avèk tès fliyoresan nou obsève aktivasyon kapase -3 nan selil A549 senesan ouabain-trete (Fig.7d). Ansanm, rezilta sa yo konplètman konsistan avèk done ki dekri pa lòt otè epi konfime aktivite emolitik ouabain nan direksyon pou A549.
Epitou, nou itilize doxorubicin olye de etoposide pou lakòz senesans nan A549 (Fig.8a-e). Kòm espere, A549 senesan doxorubicin-trete, osi byen ke etoposid-trete demontre pi wo sansiblite tou de nan ouabain ak bufalin konpare ak tokay kontwòl yo (Fig. 8g ak Fig. Siplemantè S6). Lèt la konfime ke efè senolytic nan glikozid kadyak yo endepandan de senesans pwovoke stimuli. Kidonk, glikozid kadyak tout bon gen senolytic
Fig.3 Ouabain pa kapab pwovoke senolysis nan senesan END-MSCs trete etoposide. Validasyon modèl senesans epizòd-induit pou END-MSCs: yon kapasite pwopagasyon, b gwosè selil, c nivo otofluoresan ak d SA - -Gal aktivite, e nivo fosforilasyon Rb ak nivo ekspresyon p21 ak HMGBI pwoteyin. f Vitabilite relatif selil (pousan) kontwòl ak selil senesan apre tretman ak 10-6 ouabain. Valè yo vle di ± SD. Pou plizyè gwoup konparezon nan yon ANOVA yon sèl-fason yo te aplike,n=3, ns pa enpòtan,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">
Finalman, nou deside repwodui eksperyans analiz sou selil kansè fwa trete etoposid SK-Help, yon lòt modèl selil ki gen efè senolytic pwouve nan glikozid kadyak dapre Guerrero et al. etid [25] (Fig.9a-e). Etoposide-trete senesan SK-Help demontre pi wo sansiblite nan tou de ajan yo konpare ak tokay kontwòl yo, pwouve aksyon an emolitik nan glikozid kadyak nan direksyon pou kalite selil sa a (Fig.9f ak Fig. Siplemantè S7).
Ansanm done sa yo prèv ke selektivite nan emoliz pwovoke pa glikozid kadyak depann plis sou nati selil pase sou deklanche senesans konkrè a.
Atik sa a soti nan Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x
