Inibitè ASK1 NQDI-1 diminye estrès oksidatif ak neroapoptoz atravè chemen siyal ASK1/p38 ak JNK nan blesi nan sèvo bonè apre emoraji subarachnoid nan rat Pati 1.
Aug 03, 2023
Résumé. Estrès oksidatif ak neroapoptoz se kle pwosesis patolojik apre emoraji subarachnoid (SAH). Etid la te evalye efè neropwotektif anti-oksidasyon ak anti-apoptotik nan inibitè kinaz kinaz 1 (ASK1) ki kontwole siyal apoptoz 1 (ASK1) ethyl-2,7-dioxo-2,7-dihydro-3H-naphtho(1,2, 3-de) quinoline1-carboxylate (NQDI-1) nan blesi nan sèvo bonè (EBI) apre SAH nan yon modèl rat. Yo te itilize yon total de 191 rat epi yo te pwovoke modèl SAH a lè l sèvi avèk pèforasyon monofilaman. Western blotting te itilize imedyatman pou detekte nivo ekspresyon andojèn pwoteyin yo. Lè sa a, te itilize imunofluorescence pou konfime lokalizasyon nè selilè ASK1. Fonksyon newolojik alontèm yo te evalye lè l sèvi avèk nòt Garcia modifye yo ak tès balans gwo bout bwa a 24 èdtan apre SAH, tandiske fonksyon newolojik alontèm yo te evalye lè l sèvi avèk tès rotarod ak tès labirent dlo Morris. Apoptoz nan newòn te evalye pa tach TUNEL ak estrès oksidatif te evalye pa tach dihydroethidium 24 èdtan apre SAH. Nivo ekspresyon pwoteyin fosforilasyon (p-)ASK1 ak ASK1 te monte apre SAH. NQDI-1 te enjekte entracerebroventricularly 1h apre SAH epi li te demontre amelyorasyon enpòtan nan tou de fonksyon newolojik kout ak alontèm ak siyifikativman redwi estrès oksidatif ak apoptoz newòn. Piki NQDI-1 te lakòz yon diminisyon enpòtan nan nivo ekspresyon pwoteyin p-ASK1, p-p38, p-JNK, 4 hydroxynonenal, ak Bax ak ogmante siyifikativman nivo ekspresyon pwoteyin heme oxygenase 1 ak Bcl-2. Itilizasyon inibitè p38 BMS-582949 oswa inibitè JNK SP600125 la mennen nan diminisyon enpòtan nan nivo ekspresyon pwoteyin p-p38 oswa p-JNK, respektivman, ak yon rediksyon enpòtan nan estrès oksidatif ak apoptoz newòn; sepandan, inhibiteurs sa yo pa t demontre yon efè sou nivo ekspresyon pwoteyin p-ASK1 oswa ASK1. An konklizyon, tretman ak NQDI-1 amelyore fonksyon newolojik ak diminye estrès oksidatif ak apoptoz newòn nan EBI apre SAH nan rat, petèt atravè anpèchman fosforilasyon ASK1 ak chemen siyal ASK1 / p38 ak JNK. NQDI-1 ka konsidere kòm yon ajan potansyèl pou tretman pasyan ki gen SAH.
Glycoside nan cistanche ka ogmante tou aktivite SOD nan kè ak tisi fwa, ak siyifikativman redwi kontni an nan lipofuscin ak MDA nan chak tisi, efektivman scavenging divès kalite radikal oksijèn reyaktif (OH-, H₂O₂, elatriye) ak pwoteje kont domaj ADN ki te koze. pa OH-radikal. Cistanche phenylethanoid glikozid gen yon gwo kapasite scavenging nan radikal gratis, yon pi wo kapasite diminye pase vitamin C, amelyore aktivite a nan SOD nan sispansyon espèm, redwi kontni an nan MDA, epi yo gen yon sèten efè pwoteksyon sou fonksyon manbràn espèm. Cistanche polisakarid ka amelyore aktivite SOD ak GSH-Px nan eritrosit ak tisi nan poumon sourit eksperimantal senesan ki te koze pa D-galaktoz, osi byen ke diminye kontni an nan MDA ak kolagen an nan poumon ak plasma, ak ogmante kontni an nan elastin, gen yon bon efè scavenging sou DPPH, pwolonje tan an nan ipoksi nan sourit senesan, amelyore aktivite a nan SOD nan serom, ak retade koripsyon fizyolojik nan poumon nan sourit senesan eksperimantal Avèk koripsyon selilè mòfolojik, eksperyans yo te montre ke Cistanche gen bon kapasite antioksidan. epi li gen potansyèl pou yo dwe yon dwòg pou anpeche ak trete maladi po aje. An menm tan an, echinacoside nan Cistanche gen yon kapasite siyifikatif pou retire radikal gratis DPPH epi li ka retire espès oksijèn reyaktif, anpeche degradasyon kolagen an gratis radikal-induit, epi tou li gen yon efè reparasyon bon sou domaj anyon radikal gratis timin.
Klike sou Anti-aje Cistanche Para Que Serve
【Pou plis enfòmasyon: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】
Mo kle: emoraji subarachnoid, NQDI-1, apoptoz siyal-regleman kinaz 1, estrès oksidatif, apoptoz, blesi nan sèvo bonè
Entwodiksyon
Emoraji subarachnoid (SAH) se yon grav maladi serebwo egi ki te koze pa koule nan san nan espas subarachnoid nan sèvo a (1). Sepandan, kounye a, pa gen okenn dwòg efikas ki disponib pou amelyore domaj nan tisi nan sèvo apre SAH apre prevansyon nan rebleeding (2). Se poutèt sa, plis etid sou mekanis blesi nan sèvo apre SAH ak eksplorasyon opsyon tretman apwopriye pou amelyore pronostik SAH yo ijan nesesè.
Blesi nan sèvo bonè (EBI) refere a domaj segondè nan tisi nan sèvo ki te koze pa plizyè twoub fizyolojik ak yon seri chanjman patolojik ki rive nan 72 èdtan apre aparisyon SAH (3). Nan faz nan repons egi apre SAH, aksidan an kòmanse ak antre nan gwo kantite san nan espas subarachnoid la ak sa a se ki te swiv pa yon seri de blesi patolojik (4). Kòm mitokondri yo patikilyèman sansib a ipoksi ak aksidan ischemik, malfonksyònman mitokondriyo se youn nan blesi prensipal yo patolojik soufri apre SAH (5). Gwo kantite espès oksijèn reyaktif (ROS) yo lage, ki mennen nan amelyorasyon nan estrès oksidatif ak aktivasyon nan chemen an apoptotik mitokondriyo, sa ki lakòz blesi mitokondriyo ak malfonksyònman (6). Se poutèt sa, modalite terapetik ki diminye estrès oksidatif ak apoptoz se kle pou amelyorasyon nan pronostik SAH.
Apoptosis siyal-regleman kinase 1 (ASK1), yon manm nan fanmi an mitogen-aktive pwoteyin 3 kinaz (MAP3K), se aktive pa anpil diferan kalite estrès selilè epi li gen yon wòl enpòtan nan estrès oksidatif ak apoptoz (7). Nan kilti prensipal newòn ipokanp sourit yo, fasudil inhibiteur Rho kinaz la ranvèse elevasyon fosforilasyon (p-)ASK1 ki pwovoke nan amiloid, ki diminye apoptoz newòn nan maladi alzayme a (8). Dapre sa nou konnen, sepandan, opsyon terapetik ki vize ASK1 apre SAH pa te evalye.
Ethyl-2,7-dioxo-2,7-dihydro-3H-naphtho(1,2,3-de)quinoline1-carboxylate (NQDI-1) te rapòte ke yon inibitè espesifik nan ASK1 e li te valide lè l sèvi avèk tès kinaz vitro (9,10). Etid anvan yo te rapòte ke NQDI-1 ka efikas nan tretman anpil maladi atravè anpèchman aktivite ASK1 (11,12). NQDI-1 soulaje domaj mitokondriyo ak apoptoz nan microcystin-LR-induit nan selil granuloza nan òvèj atravè anpèchman deklanchman ASK1 (13). Anplis de sa, endometacin ka pwovoke repons kaskad apoptotik nan selil glial atravè aktivasyon ASK1 nan estrès retikul andoplasmik (14). Se poutèt sa, ASK1-espesifik inhibiteur NQDI-1 a ka egzèse efè neuroprotective apre SAH nan anpèchman nan aktivite ASK1. p38 ak JNK yo konsidere yo fòme chemen siyal en ASK1; aktive p38 ak JNK ka plis aktive yon varyete de substrats, ki gen ladan faktè transkripsyon nikleyè kòm byen ke pwoteyin kinaz ak lòt pwoteyin fonksyonèl, ki mennen nan aparisyon nan estrès oksidatif ak apoptoz (15).
Li te ipotèz ke inibitè ASK1 NQDI-1 egzèse efè neropwotektif ak diminye estrès oksidatif ak neroapoptoz atravè chemen siyal ASK1 / p38 ak JNK nan EBI apre SAH nan rat.
Materyèl ak metòd
Bèt eksperimantal.Eksperyans bèt yo te apwouve pa Komite Etik pou bèt eksperimantal nan Santral South University (apwobasyon nimewo 2019sydw0104). Yon total de 191 rat gason Sprague-Dawley (SD) ki te peze 280-320 g yo te loje nan yon anviwònman tanperati konstan (21-23˚C) ak imidite (45-50 pousan) ak yon sik limyè/fè nwa 12/12-h. epi yo te gen aksè gratis nan dlo ak manje. Tout eksperyans bèt yo te fèt dapre Animal Research: Reporting In Vivo Experiments direktiv (16) epi yo te fèt pa National Institutes of Health (NIH) Gid pou Swen ak Itilizasyon Bèt gid (17). Lè rat yo te rive nan pwen tan prereglaj yo deziyen pou eksperyans lan oswa yo te rankontre sèten kritè pou Etanazi [pèdi apeti konplè pou 24 èdtan oswa move apeti (50 pousan pi ba pase nòmal) pou 3 jou, enkapasite pou manje oswa bwè, oswa yo te evalye yo kòm yo te. pre lanmò (konpòtman blese pwòp tèt ou, pwèstans nòmal, detrès respiratwa, elatriye)], yo te mete rat yo nan yon aparèy etanasya gaz kabonik ak pousantaj deplasman volim CO2 fikse nan 30 pousan /min (18). Lanmò te konfime pa sispann respire ak batman kè ak dilatasyon elèv. Yo te mete kadav tout rat yo nan sachè epi yo te jele pou yo jete yo san danje nan anviwònman an.
SAH modèl. The rat SAH model was induced using monofil‑ ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction, 3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common, internal and external carotid arteries of the rats were exposed. The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >8 pa evalyasyon nòt nòt SAH yo te konsidere kòm satisfè egzijans eksperimantal yo epi yo dwe yon modèl siksè. Pwosedi pou gwoup sham la te sanble ak gwoup SAH a, eksepte ke fil 4-0 proline pa t pèse miray atè a. Yo te kontwole respirasyon, batman kè, koulè po, ak reflèks pedal chak 5 minit pandan tout etap rekiperasyon chirijikal ak anestezi. Nan sa yo, 23 rat te mouri ak 8 rat yo te eskli, ak lanmò sa yo ak esklizyon yo te konplete pa nouvo rat SAH-modele.
Gravite SAH.Yo te evalye gravite SAH ak nòt nòt SAH 24 èdtan apre SAH (20). Bò ventral tisi sèvo a te divize an 6 rejyon, yo chak te evalye 0-3 selon kantite kayo san ak kòman veso sangen yo te bouche: Yon nòt 0 endike pa gen okenn boul, 1 endike yon ti kantite boul, 2 endike yon kantite modere nan kaye men gwo veso nan baz zo bwa tèt yo toujou idantifye, ak 3 endike yon gwo kantite kayo ak veso ki pa idantifye nan baz zo bwa tèt la. Yo te adisyone sis nòt rejyonal yo pou kalkile yon nòt total (0-18), kote pi gwo nòt yo te endike emoraji ki pi grav. Rat ki gen yon nòt total SAH mwens pase oswa egal a 8 yo te konsidere yo gen SAH modere, eskli nan eksperyans ki vin apre yo, epi ranplase ak rat ki fèk modèl.
Administrasyon dwòg.Pou pèmèt konsantrasyon dwòg yo nan tisi nan sèvo yo dwe pi presizeman reglemante poukont fwa a ak lòt faktè, siRNA yo ak NQDI-1 yo te administre pa piki entracerebroventricularly (21). Apre anestezi (endiksyon, 3 pousan isofluran; antretyen, 2 pousan isofluran), rat yo te fikse sou yon aparèy estereyotaksik nan sèvo. Mikwoinjektè a te fikse sou bregma a nan 1.0 dèyè, 1.5 dwat, ak 3.3 mm pwofondè. ASK1 siRNA (cat. No. 4390771; Thermo Fisher Scientific, Inc.) oswa Scr siRNA kontwòl (cat. No. 4390843; Thermo Fisher Scientific, Inc.) te fonn nan 5 µl dlo esteril deyonize san nukleaz nan yon konsantrasyon de 500 pmol epi yo administre 48 èdtan anvan SAH. Sekans ASK1 siRNA yo te jan sa a: Sans 5'-CGG CAGACAUUGUUAUCAAtt-3' ak antisans 5'-UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc-3'. Konsantrasyon dwòg ak dòz rapòte nan yon etid ki sanble (22) ak solubilite nan NQDI-1 yo te itilize detèmine konsantrasyon yo itilize nan etid la prezan. Twa dòz NQDI-1 (1, 3, ak 10 µg/kg; Selleck Chemicals) oswa solisyon machin nan yon volim total de 5 µl/rat yo te enjekte 1 èdtan apre SAH. BMS-582949 (100 mg/kg; Selleck Chemicals), SP600125 (30 mg/kg; Selleck Chemicals), ak solisyon machin yo te kapab travèse baryè san-sèvo a epi yo te administre intraperitoneally 1 èdtan apre SAH (23,24).
Fonksyon newolojik kout tèm.Yo te itilize nòt Garcia modifye ak nòt balans gwo bout bwa a pou evalye fonksyon newolojik a kout tèm 24 èdtan apre SAH. Nòt Garcia modifye a te divize an sis kategori jan sa a: Mouvman volontè, mouvman volontè manm, ekstansyon paw devan, kapasite grenpe, repons somato-sansoryèl, ak repons tentacle, yo chak nan yo te fè nòt endividyèlman ak adisyone yo bay yon nòt total ki sòti nan 3-18. (25). Pi gwo nòt yo te konsidere pou endike pi bon fonksyon newolojik. Pou nòt balans gwo bout bwa a, yo te mete rat sou yon gwo bout bwa pou 1 minit epi yo te evalye yon nòt ki sòti nan 0-4 dapre distans yo te mache (26). Pi gwo nòt yo te konsidere pou endike pi bon fonksyon newolojik.
Fonksyon newolojik alontèm.Eksperyans pre-adaptasyon Rotarod yo te fèt sou rat lè l sèvi avèk menm vitès inisyal la ak akselerasyon anvan modèl SAH. Yo te mete rat yo sou yon tèsteur Rotamex (Columbus Instruments) pou tès Rotarod nan jou 7, 14, ak 21 apre SAH (27). Premyèman, vitès Rotarod inisyal la te fikse a 5 revolisyon pou chak minit ak akselerasyon an nan 2 revolisyon pou chak 5 segonn. Apre yo fin mete sou rat yo, yo te anrejistre latansi tonbe nan rat yo. Lè sa a, rat yo te pèmèt yo repoze pou 1 èdtan. Finalman, latansi tonbe rat yo te teste ankò nan vitès inisyal la nan 5 revolisyon pou chak minit ak yon akselerasyon nan 2 revolisyon pou chak 5 segonn. Pi long latansi tonbe te konsidere kòm endike pi bon kowòdinasyon motè nan rat la. Nan semèn 4 apre modèl SAH, yo te itilize tès labirent dlo Morris pou evalye memwa aprantisaj la ak oryantasyon espasyal rat yo (27). Egzèsis aprantisaj naje ak jwenn yon platfòm ki sitiye anba sifas dlo a te fèt soti nan jou 1 rive nan jou 5 nan semèn 4 (jou 28-33 apre-SAH) epi yo te anrejistre trajectoire naje, latans chape, ak distans naje. Nan dènye jou a, yo te retire platfòm la pou fè tès, epi yo te anrejistre trajectoire naje, distans naje ak dire kadran ankèt la pou 60 segonn.
SI tach.Apre perfusion sekans nan 4˚C saline ak 4˚C, 4 pousan paraformaldehyde nan kè a pou retire san nan tisi sèvo a, yo te jwenn tisi nan sèvo entak. Apre dezidratasyon sikwoz gradyan, yo te koupe tisi nan sèvo a an seksyon 10-µm nan yon pozisyon koronèl epi yo te estoke nan -20˚C. IF tach te itilize pou evalye ko-lokalizasyon ASK1 ak selil nève yo. Seksyon tisi ki nan frizè yo te bloke lè l sèvi avèk 5 pousan serom bourik (cat. No. G1217-5ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) pou 2 èdtan nan tanperati chanm ak enkubasyon lannwit lan nan 4˚C ak antikò prensipal jan sa a: Anti-ASK1 (sourit; 1:200; cat. No. 67072-1-Ig; ProteinTech Group, Inc.), anti-NeuN (lapen; 1:200; Cat. No. 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc.) , molekil adaptè kalsyòm anti-ionize-1 (Iba-1; lapen; 1:200; cat. No. 10904-1-AP; ProteinTech Group, Inc.), ak pwoteyin asid fibrilè anti-glial (GFAP; poul). ; 1:200; nimewo kat ab4674; Abcam). Lè sa a, seksyon tisi yo te enkube pou 2 èdtan nan tanperati chanm ak antikò segondè fliyoresan ki koresponn yo jan sa a: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H plis L) (chat No. 715-585-150; 1:500). Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H plis L) (cat. No. 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), ak Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H plis L) (chat No. 703-545-155; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Imedyatman, yo te tache pou nwayo selil yo lè l sèvi avèk 2 µg / ml DAPI (cat. No. G1012-100ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) pou 10 min nan tanperati chanm. Seksyon yo te evalye lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan Olympus BX53 (Olympus Corporation) ak imaj yo te kaptire.
Dihydroethidium (DHE) tach.Yo te fè tach DHE pou evalye estrès oksidatif sèvo a (28). Seksyon tisi nan sèvo nan frizè yo te enkube ak 2 µmol/l DHE (Thermo Fisher Scientific, Inc.) nan 37˚C pou 30 min nan fè nwa. Apre tach pou nwayo selil yo lè l sèvi avèk 2 µg/ml DAPI pou 10 min nan tanperati chanm, yo te evalye seksyon yo lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan Olympus BX53. Yon total de sis seksyon nan chak tisi nan sèvo yo te chwazi owaza ak sis zòn nan chak seksyon yo te chwazi owaza pou D. Kantite selil DHE pozitif yo te konte lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ 1.4 (National Institutes of Health) epi yo te kalkile mwayèn nan epi yo te pran pousantaj final yo pou chak seksyon tisi nan sèvo.
TUNEL tach.Yo te itilize TUNEL tach pou evalye pousantaj newòn apoptotik (29). Seksyon tisi ki nan frizè yo te bloke lè l sèvi avèk 5 pousan serom bourik pou 2 èdtan nan tanperati chanm epi yo te enkube lannwit lan nan 4˚C ak antikò prensipal anti-NeuN (lapen; 1:200; cat. No. 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc. .). Lè sa a, yo te enkube seksyon tisi yo ak antikò segondè fliyoresan Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H plis L) (chat No. 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) pou 2 èdtan. nan tanperati chanm. Yo te fè tach TUNEL lè l sèvi avèk yon sèl etap TUNEL Apoptosis Assay twous (cat. No. C1090; Beyotime Institute of Biotechnology) dapre pwotokòl manifakti a. Finalman, seksyon tisi yo te tache pou nwayo selil yo lè l sèvi avèk 2 µg/ml DAPI pou 10 min nan tanperati chanm. Seleksyon owaza kote konte TUNEL ak kalkil newòn TUNEL-pozitif pou chak seksyon yo te fèt lè l sèvi avèk metòd mansyone pi wo a pou konte DHE.
Western blot (WB).WB te itilize pou semi-quantifier nivo ekspresyon pwoteyin. Apre perfusion 4˚C saline nan kè a pou retire san nan tisi sèvo a, yo te jwenn tisi nan sèvo entak. Etid anvan yo te rapòte ke modèl SAH, pwovoke atravè twou goch andovaskilè, rezilta nan yon degre nan patipri nan direksyon evènman senyen epi yo ka relativman grav an tèm de domaj nan tisi nan sèvo bò gòch (30). Se poutèt sa, tisi nan sèvo bò gòch yo te itilize pou evalye domaj patolojik apre modèl SAH. Pwoteyin tisi nan sèvo yo te ekstrè lè l sèvi avèk RIPA lysis solisyon (cat. No. P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) dapre pwotokòl manifakti a. Konsantrasyon pwoteyin echantiyon yo te detèmine pa tès BCA (cat. No. P0012; Beyotime Institute of Biotechnology) epi answit ajiste a 5 µg/µl lè w ajoute diferan kantite dlo distile. Yo te ajoute 5 µl nan echantiyon pwoteyin 5 µg/µl nan chak liy epi yo te separe echantiyon pwoteyin sa yo sou 10 pousan jèl pa elektwoforèz SDS-PAGE epi yo te transfere nan manbràn PVDF. Manbràn yo te bloke pou 2 èdtan nan tanperati chanm lè l sèvi avèk 5 pousan lèt an poud ki pa gen anpil grès (cat. No. P0216-300g; Beyotime Institute of Biotechnology). Yo te enkube manbràn yo lannwit lan nan 4˚C ak antikò prensipal yo jan sa a: Anti-p-ASK1 (Ser-83; 1:1,000; No cat. MA5-28020; Thermo Fisher Scientific, Inc. .), anti-ASK1 (1:1,000; Cat. No. 8662; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (1:1 ,000; Cat. No. 9216; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑p38 MAPK (1:1,000; Cat. No. 8690; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-fosfo-estrès-aktive pwoteyin kinaz/Jun-amino-terminal kinaz (phospho-SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185; 1,000; cat. No. 9255; Siyal selilè Technology, Inc.), anti-SAPK/JNK (JNK; 1:1,000; Cat. No. 9252; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-4 hydroxynonenal (4-HNE; 1:1). ,000; Cat. No. ab46545; Abcam), anti-heme oxygenase 1 (HO-1; 1:1,{000; Cat. No. 82206; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-Bcl-2 (1:1,000; Cat. No. 26593-1-AP; ProteinTech Group, Inc.), Anti-Bax (1,1{000; Cat. No. 60267-1-Ig; ProteinTech Group, Inc.) ak anti--aktin (1:2,000; Cat. No. 4970; Cell Signaling Technology, Inc.). Sa a te swiv pa enkubasyon ak antikò segondè ki konjige ak peroksidaz refor pou 2 èdtan nan tanperati chanm: Kabrit anti-sourit IgG-HRP (cat. No. sc-2005; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology). , Inc.) oswa kabrit anti-lapen IgG-HRP (cat. No. sc-2004; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), ak gwoup espesifik yo te vizyalize lè l sèvi avèk yon twous ECL (cat. No. P0018AS; Beyotime Institute of Biotechnology) ak imaj lè l sèvi avèk yon sistèm UVP Che Studio PLUS (Analytik Jena GmbH). Analiz relatif densitometrik bann WB yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ 1.4 (NIH) ak nivo ekspresyon pwoteyin yo te nòmalize kont ‑aktin.
Konsepsyon eksperimantal
Chanjman ekspresyon ak lokalizasyon selilè ASK1 apre SAH. Yon total de 36 rat yo te plase owaza nan sis gwoup (n=6/gwoup) jan sa a: i) Opere ak fot (sham), ii) 3 èdtan apre-SAH, iii) 6 èdtan apre-SAH, iv ) 12 èdtan apre-SAH, v) 24 èdtan apre-SAH ak vi) 72 èdtan apre-SAH. WB te itilize pou evalye chanjman nan nivo ekspresyon pwoteyin nan andojèn ASK1 ak p-ASK1. Yon total de 4 rat adisyonèl yo te divize an gwoup sham (n=2) ak SAH 24 h (n=2) epi yo te itilize tach IF pou evalye ko-lokalizasyon ASK1.
Efè ki ka geri ASK1 inhibiteur NQDI-1 sou fonksyon newolojik kout ak alontèm apre SAH. Yo te divize yon total 30 rat an 5 gwoup (n=6/gwoup) jan sa a: i) Sham, ii) SAH plis machin, iii) SAH plis 1.0 µg /kg NQDI-1, iv) SAH plis 3.0 µg/kg NQDI-1 ak v) SAH plis 10.0 µg/kg NQDI-1. Yo te itilize nòt Garcia modifye ak balans travès yo pou evalye fonksyon newolojik a kout tèm 24 èdtan apre SAH. Dapre limit amelyorasyon newolojik a kout tèm, yo te evalye 3.0 µg/kg NQDI-1 kòm gwoup dòz ki pi apwopriye epi yo te itilize dòz NQDI-1 sa a nan eksperyans ki vin apre yo. Yon total de 30 rat yo te divize an 3 gwoup (n=10) jan sa a: i) Sham, ii) SAH plis machin, ak iii) SAH plis NQDI-1. Yon eksperyans rotarod te itilize pou evalye fonksyon newolojik alontèm nan jou 7, 14, ak 21 apre SAH, epi yo te fè tès labirent dlo Morris nan semèn 4 apre SAH pou evalye fonksyon newolojik alontèm.
Efè ki ka geri ASK1 inhibitor NQDI-1 sou estrès oksidatif ak apoptoz. Yon total de 12 rat yo te divize an 3 gwoup (n=4/gwoup) jan sa a: i) Sham, ii) SAH plis machin, ak iii) SAH plis NQDI-1. (THE) tach te fèt pou evalye estrès oksidatif epi yo te itilize tach TUNEL pou evalye apoptoz newòn 24 èdtan apre SAH.
Wòl chemen siyal ASK1/p38 ak JNK nan efè terapetik NQDI-1. Yon total de 48 rat yo te divize an 8 gwoup (n=6/gwoup) jan sa a: i) Sham, ii) SAH, iii) SAH plis machin, iv) SAH plis NQDI-1, v) SAH plis scrambled (Scr) kout entèferans (si)RNA, vi) SAH plis ASK1 siRNA, vii) SAH plis BMS-582949 ak viii) SAH plis SP600125 gwoup. ASK1 siRNA, p38 inhibitor BMS-582949, ak JNK inhibitor SP600125 yo te sou fòm piki pou evalye si ASK1, p38, ak JNK te enplike nan efè neuroprotective NQDI-1.
Analiz estatistik. Done yo te prezante kòm mwayèn ± devyasyon estanda ak done eksperimantal WB yo te jwenn nan 6 replike endepandan, pandan y ap tach DHE ak tach TUNEL yo te fèt kòm 4 replike endepandan. Done yo te analize lè l sèvi avèk SPSS vèsyon 17 (SPSS, Inc.). Done ki soti nan tès labirent dlo Morris yo te evalye lè l sèvi avèk yon melanj ANOVA/de-fason repete mezi ANOVA, ki te swiv pa tès la LSD post hoc. Done ki soti nan eksperyans ki rete yo te teste pou distribisyon nòmal lè l sèvi avèk tès distribisyon nòmal Shapiro-Wilk ki te swiv pa yon fason ANOVA ki te swiv pa tès konparezon miltip post hoc Tukey la. Grafik yo te trase lè l sèvi avèk GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.). P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.
Rezilta yo
Mòtalite ak severite SAH. Yon total de 191 SD rat yo te itilize nan etid la prezan, nan ki 8 rat yo te eskli akòz sèlman modere SAH (SAH nòt nòt mwens pase oswa egal a 8). Nan rat SD yo te itilize nan eksperyans yo, 34 rat yo te nan gwoup sham la ak 149 rat te sibi modèl SAH. Pa gen okenn rat nan gwoup la sham te mouri; sepandan, 23 rat te mouri apre modèl SAH (to mòtalite 15.4 pousan) (Tablo SI-V). Konpare ak gwoup la simulation, boul nan espas subarachnoid yo te sitou sitiye tou pre bag Willis la ak sou tou de bò nan atè bazilèr la apre modèl SAH (Fig. 1A). Nòt nòt SAH 24 h apre modèl SAH a pa montre okenn diferans enpòtan nan gravite emoraji ant tout gwoup ki pa simul ak yon diferans enpòtan ant gwoup ki pa simul ak tout gwoup ki pa simul (Fig. 1B).
Chanjman ekspresyon pwoteyin ak lokalizasyon selilè ASK1 apre SAH. Nivo ekspresyon pwoteyin ASK1 te ogmante e li te rive nan yon pik nan 24 èdtan nan sèvo apre SAH (Fig. 1C ak D). Sepandan, rapò a nan ekspresyon an pwoteyin nan p-ASK1 / ASK1 demontre pa gen okenn diferans enpòtan (Fig. 1C ak E). Lokalizasyon selilè ASK1 ak NeuN-pozitif newòn, Iba-1-pozitif microglia, ak GFAP-pozitif astrosit yo te demontre nan tou de gwoup la sham ak SAH 24 h (Fig. 1F-H).
Inibitè ASK1 NQDI-1 amelyore fonksyon newolojik a kout tèm 24 èdtan apre SAH. NQDI-1 (1, 3, ak 10 µg/kg) yo te enjekte entracerebroventricularly 1 èdtan apre SAH. Rat ki te sibi modèl SAH te siyifikativman pi ba nòt Garcia modifye ak balans gwo bout bwa 24 èdtan apre modèl SAH; sepandan, tout twa dòz NQDI-1 te mennen nan yon amelyorasyon pasyèl enpòtan nan fonksyon newolojik a kout tèm (figi 2A ak B). Nòt Garcia modifye yo te siyifikativman pi wo nan gwoup SAH plis NQDI-1 (3.0 µg/kg) konpare ak gwoup SAH plis NQDI-1 (1.0 µg/kg); sepandan, pa gen okenn diferans estatistik enpòtan yo te demontre konpare ak gwoup SAH plis NQDI-1 (10.0 µg/kg) (Fig. 2A ak B), ki sijere ke plis ogmante konsantrasyon NQDI-1 te fè. pa lakòz plis amelyorasyon nan fonksyon newolojik a kout tèm apre SAH. Se poutèt sa, NQDI-1 (3.0 µg/kg) te konsidere kòm konsantrasyon efikas efikas epi yo te itilize nan eksperyans ki vin apre yo.
Inibitè ASK1 NQDI-1 amelyore fonksyon newolojik alontèm apre SAH. Sèvi ak vitès demaraj 5 oswa 10 rpm pou tès Rotarod la, latansi otòn yo te diminye anpil nan gwoup machin SAH plis la konpare ak gwoup sham la, tandiske latansi otòn la te pwolonje anpil apre piki NQDI-1 nan serebroventrikulè konpare ak machin SAH plus la. gwoup (figi 2C ak D). Anplis de sa, pandan jou 1-5 nan faz fòmasyon nan tès labirent dlo Morris nan semèn 4 apre-SAH, gwoup machin SAH plis la te demontre latansi evape ak distans naje siyifikativman pi long konpare ak gwoup simulation, tandiske tretman NQDI-1 te demontre yon diminisyon enpòtan konpare ak gwoup machin SAH plis la (Fig. 2E-G). Nan faz tès la ak retire platfòm sikilè anba dlo a, pa gen okenn diferans enpòtan yo te obsève nan vitès naje ant twa gwoup yo (Fig. 2H). Dire kadran ankèt la te siyifikativman pi kout nan gwoup machin SAH plis la konpare ak gwoup sham la ak tretman NQDI-1 siyifikativman pwolonje tan eksplorasyon an konpare ak gwoup machin SAH plis la (figi 2I).
Inibitè ASK1 NQDI-1 diminye estrès oksidatif ak apoptoz newòn 24 èdtan apre SAH. Yo te mezire nivo estrès oksidatif lè l sèvi avèk tach DHE epi yo te evalye pwopòsyon newòn apoptotik lè l sèvi avèk pousantaj newòn TUNEL-pozitif 24h apre SAH. Pousantaj selil DHE-pozitif yo te siyifikativman pi wo nan gwoup machin SAH plis la konpare ak gwoup sham la ak tretman NQDI-1 siyifikativman diminye sa a konpare ak gwoup machin SAH plis la (figi 3A ak). Pousantaj newòn TUNEL-pozitif yo te siyifikativman pi wo nan gwoup machin SAH plis la konpare ak gwoup sham la. Sepandan, pousantaj newòn TUNEL-pozitif diminye anpil apre tretman ak NQDI-1 konpare ak gwoup machin SAH plis la (figi 3B ak D).
ASK1 siRNA, BMS-582949, ak SP600125 amelyore fonksyon newolojik a kout tèm 24 èdtan apre SAH. Konpare ak gwoup SAH plis Scr siRNA oswa gwoup SAH plis veyikil la, administrasyon ASK1 siRNA, BMS-582949 oswa SP600125 te demontre amelyorasyon siyifikatif nan modifye Garcia ak nòt balans gwo bout bwa (Fig. 4A ak B).
NQDI-1 diminye estrès oksidatif ak apoptoz apre SAH atravè fosforilasyon diminye ASK1, p38, ak JNK. Nivo ekspresyon pwoteyin nan ASK1, p-p38, p-JNK, 4-HNE, HO-1, Bax, ak Bcl-2 te siyifikativman pi wo apre SAH konpare ak gwoup la sham; sepandan, rapò p-ASK1/ASK1 pa t diferan anpil (figi 5A-M). Piki nan machin oswa Scr siRNA pa t 'pwovoke diferans enpòtan nan nivo ekspresyon pwoteyin yo konpare ak gwoup SAH la. Konpare ak gwoup machin SAH plis la, tretman ki itilize NQDI-1 te lakòz yon diminisyon enpòtan nan nivo ekspresyon pwoteyin p-ASK1/ASK1, p-p38, p-JNK, 4-HNE, ak Bax, tandiske nivo ekspresyon pwoteyin nan HO. ‑1 ak Bcl‑2 te ogmante anpil. Konpare ak gwoup SAH plis Scr siRNA, nivo ekspresyon pwoteyin ASK1 siyifikativman diminye apre piki ASK1 siRNA. Tretman ak ASK1 siRNA te lakòz tou yon diminisyon enpòtan nan nivo ekspresyon pwoteyin p-p38, p-JNK, 4-HNE, ak Bax ak yon ogmantasyon siyifikatif nan ekspresyon HO-1 ak Bcl-2 konpare ak SAH plis Scr siRNA. gwoup.
Inibitè p38 BMS-582949 diminye nivo ekspresyon pwoteyin p-p38 men li pa afekte nivo ekspresyon pwoteyin p-ASK1, ASK1, oswa p-JNK. Tretman ak inibitè p38 BMS-582949 la demontre yon diminisyon enpòtan nan nivo ekspresyon pwoteyin p-p38, 4-HNE, ak Bax epi tou li ogmante siyifikativman ekspresyon pwoteyin HO-1 ak Bcl-2 konpare ak gwoup machin SAH plis la; sepandan, nivo ekspresyon pwoteyin ASK1, p-ASK1/ASK1 ak p-JNK pa montre okenn diferans enpòtan (figi 6A-M). JNK inhibitor SP600125 diminye nivo ekspresyon pwoteyin p-JNK men li pa afekte nivo ekspresyon pwoteyin p-ASK1, ASK1 oswa p-p38. Tretman ak inibitè JNK SP600125 te lakòz yon diminisyon enpòtan nan nivo ekspresyon pwoteyin p-JNK, 4-HNE, ak Bax ak yon ogmantasyon siyifikatif nan nivo ekspresyon pwoteyin HO-1 ak Bcl-2 konpare ak gwoup machin SAH plus la; sepandan, nivo ekspresyon pwoteyin nan ASK1, p-ASK1/ASK1, ak p-p38 pa te chanje anpil (figi 7A-M).
【Pou plis enfòmasyon: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
