Vezik bakteri yo bloke replikasyon viral nan makrofaj atravè aks TLR{0}}TRIF

Résumé

Bakteri gram-negatif natirèlman sekrete nano-gwosè vesik manbràn ekstèn (OMVs), ki se medyatè enpòtan nan kominikasyon ak patojèn. Absòpsyon OMV pa selil lame yo aktive siyal TLR atravè PAMP transpòte yo. Kòm selil iminitè rezidan enpòtan yo, makrofaj alveolè yo sitiye nan koòdone lè-tisi kote yo genyen premye liy defans kont mikwo-òganis ak patikil ki respire yo. Pou dat, yo konnen ti kras sou entèraksyon ki genyen ant makrofaj alveolatè ak OMV soti nan bakteri patojèn. Repons iminitè a nan OMV yo ak mekanis kache yo toujou flotant. Isit la, nou te mennen ankèt sou repons makwofaj prensipal imen an nan vesik bakteri (Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Streptococcus pneumoniae) ak obsève konparab aktivasyon NF-κB atravè tout vesik teste yo. Kontrèman, nou dekri yon diferans siyal IFN tip I ak fosforilasyon STAT1 pwolonje ak fò endiksyon Mx1, bloke replikasyon viris grip A sèlman pou Klebsiella, E.coli, ak Salmonèl OMVs. Efè antiviral OMV-pwovoke yo te mwens pwononse pou OMV Clear coli san endotoksin ak OMV ki trete Polymyxin. Eksitasyon LPS pa t 'kapab imite estati antiviral sa a, pandan ke TRIF knockout abroge li. Sa ki enpòtan, supernatant soti nan makrofaj OMV-trete pwovoke yon repons antiviral nan selil epitelyal alveolè (AEC), sijere OMV-pwovoke kominikasyon entèselilè. Finalman, rezilta yo te valide nan yon modèl enfeksyon ansyen vivo ak tisi prensipal nan poumon imen. An konklizyon, Klebsiella, E.coli, ak Salmonèl OMV yo pwovoke iminite antiviral nan makrofaj atravè siyal TLR4-TRIF pou diminye replikasyon viral nan makrofaj, AECs, ak tisi nan poumon. Bakteri gram-negatif sa yo pwovoke iminite antiviral nan poumon atravè OMV, ak yon enpak potansyèlman desizif ak fòmidab sou rezilta koinfeksyon bakteri ak viral.

cistanche plant-ogmante sistèm iminitè

Mo kle

Vezik ekstraselilè, vesik manbràn ekstèn, ko-enfeksyon bakteri ak viral, nemoni, makrofaj, selil epitelyal alveyòl, iminite natirèl antiviral

Entwodiksyon

Eksteryè vesik manbràn (OMVs) natirèlman lage pa bakteri gram-negatif, ki mezire jiska 300 nm an dyamèt. Bakteri gram-pozitif yo egalman kapab lage vesik manbràn (MVs). Kòm yon rezilta nan byogenesis yo, estrikti manbràn lipid bikouch sa yo genyen, anplis sa ki periplasmik, pi gwo konpozan nan manbràn bakteri (eksteryè) tankou lipid, pwoteyin, ak, nan ka bakteri gram-negatif, lipopolysaccharides (LPS). [1]. Anplis de sa nan wòl yo nan kominikasyon bakteri, OMV yo te asosye ak efè patojèn ak transpò a nan faktè virulans, egzanp VacA soti nan Helicobacter pylori, Shiga toksin soti nan Shigella dysenteriae oswa ClyA soti nan Enterohemorrhagic Escherichia coli [2]. Yo te montre OMV sa yo manipile selil epitelyal ak repons iminitè yo. Prezans endotoxin bakteri sou sifas OMV ansanm ak lòt modèl molekilè ki asosye ak patojèn transpòte (PAMP) fè yo pisan stimulateur pou selil iminitè yo, menm jan yo ka toujou rekonèt pa reseptè respektif yo [3]. Angajman reseptè Tolllike (TLRs) ak reseptè Nod-like nan selil iminitè natirèl yo ka deklanche liberasyon cytokin pro-enflamatwa ak imunoregulatwa, ki gen ladan rekritman netrofil oswa dezòd junctions sere nan kouch selil epitelyal [4]. Yon sèl kalite selil iminitè rezidan enpòtan nan poumon se macrophages alveolaire (AM), ki abite nan koòdone lè-tisi nan alveoli yo. Atravè enjèstyon nan patikil rale, AM yo reprezante premye liy defans kont mikwo-òganis ak patikil pa fagositoz ak degradasyon. Lè yo rankontre patojèn, makrofaj yo prezante antijèn nan selil iminitè adaptab yo epi yo lage sitokin pro-enflamatwa. Kidonk, yo ka aji sou tip I ak II selil epitelyal alveyòl (AECs) ak lòt selil iminitè (Fisye adisyonèl 1: Fig. S1A). AM yo ka aktive pa plizyè PAMP pou pwovoke siyal entraselilè ak endiksyon modèl ekspresyon jèn diferan atravè divès reseptè iminitè [5, 6], ki mennen nan MyD88 oswa TRIF siyal, ki tou de, nan vire, pwovoke diferan sous-ansanm nan jèn (Fisye adisyonèl 1). : Figi S1B). Anplis, yo ranpli lòt fonksyon nan omeyostaz poumon ak patojèn, ki fè yo yon sant santral siyal ak òkestro nan iminite nan poumon. Viris grip yo fè pati fanmi Orthomyxoviridae epi yo lakòz enfeksyon nan aparèy respiratwa anwo ak anba, ki soti nan ka grav ak grav. Pandan ke pifò enfeksyon viris grip sezonye yo oto-limite, gen kèk pasyan devlope nemoni ak sendwòm detrès respiratwa egi ki estime ki lakòz jiska 650,000 lanmò chak ane atravè lemond [7]. Viris Grip A (IAV) sitou enfekte selil epitelyal Airway epi replike ladan yo. Enfeksyon viral la mennen nan reseptè rekonesans modèl (PRR) aktivasyon ak siyal atravè plizyè faktè transkripsyon, sètadi faktè nikleyè kappa B (NF-κB) ak faktè entèferon regilasyon (IRF) -3/7, ki pwovoke kalite I ak III. pwodiksyon entèferon (IFN). Repons enpòtan IFN sa a lakòz yon "eta antiviral" selilè nan yon fason oto ak parakrin [8]. Anplis de sa, plizyè lòt sitokin ak chemokin yo sekrete sou enfeksyon. Rezo cytokine defans lame ki byen reglemante sa a rekrite popilasyon selil iminitè yo nan sit enfeksyon an epi li orchestre repons iminitè natirèl ak adaptasyon [9]. Sepandan, IAV kapab tou enfekte AM yo, sa ki lakòz yon kantite AM yo redwi drastikman pandan enfeksyon egi, ki bezwen re-etabli pou rezoud enfeksyon an. Aktivasyon selil iminitè natirèl yo ak sekresyon cytokin pro-enflamatwa mennen nan rekritman an plis selil natirèl, kontwole enfeksyon an ak inisyalize reparasyon tisi [10, 11]. Isit la, nou analize repons makwofaj yo nan vesik ekstraselilè bakteri ak enpak yo sou enfeksyon IAV ki vin apre.

benefis sipleman cistanche-ki jan yo ranfòse sistèm iminitè

Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity

【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Materyèl ak metòd

Pwodwi chimik ak antikò

Mwayen F12 Kam a te jwenn nan GE Healthcare Europe (Freiburg, Almay). RPMI-1640, DMEM, GlutaMAX, Penicillin/Streptomycin, ak FCS te achte nan men Life Technologies (Darmstadt, Almay). PBS te akeri nan Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund, Almay). Opti-MEM te jwenn nan Thermo Fisher Scientific (Frankfurt, Almay). Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) te founi pa Sigma-Aldrich Chemie (Munich, Almay). LPS (Salmonella Minnesota R595, klas TLR) te jwenn nan Enzo Life Sciences (Lausen, Swis). Pam3CSK4 te achte nan men Invivogen (San Diego, USA). JAK inhibitor Ruxolitinib te jwenn nan Biozol Diagnostics Vertrieb GmbH (Eching, Almay). Polymyxin B te achte nan men Merck Millipore (Billerica, USA). Antikò yo te jwenn nan Abcam (Cambridge, UK): Mx1 (ab95926), nucleoprotein grip (9G8); Siyal selilè (Cambridge, UK): fosfo-IRF-3 (Ser396)(4D4G), fosfo-TBK-1 (Ser172)(D52C2), TBK-1 (61223S), fosfo- STAT1 (Tyr) (58D6), STAT1 (D1K9Y), sourit anti-lapen (L27A9), IRAK -1 (4359S), fosfo-p38 (Tr180/Tyr182) (9211S), p38 (9212S); Thermo Fisher Scientific: kabrit anti-sourit (Alexa pou 488); ProteinTech: anti-IRF-3 (66670-1) oswa Santa Cruz Biotechnologie (Heidelberg, Almay): -actin (C4), anti-sourit (mIgGκBPHRP, sc-516102). Tout lòt pwodwi chimik aplike yo te nan klas analyse ak akeri nan sous komèsyal yo.

Kilti bakteri ak preparasyon OMV/MV

L. pneumophila souch Corby wildtype te okipe jan sa dekri deja [12]. K. pneumoniae (#700721/ MGH78578), E.coli (#25922), ak S. enterica serovar Typhimurium (#14028) te jwenn nan American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). ClearColi™ BL21 te soti nan BioCat GmbH (Heidelberg, Almay). S. pneumoniae D39 Δcps yo te byen bay Sven Hammerschmidt. Bakteri yo te grandi sou plak agar lannwit lan (MacConkey: Kp, Ec, Sal; LB: Clear coli; Plak agar san: Sp) ak Lè sa a, itilize yo vaksine medya likid (LB: Kp, Ec, Sal, Clear coli; THY: Sp) . Bakteri yo te grandi jiska faz logaritmik an reta nan 37 degre anba souke konstan (MaxQ 6000, Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Almay; eksepte pou Sp). Lè sa a, kilti bakteri yo te vire desann twa fwa (4,500 × g, 15 min, 4 degre; Multifuge X3R, Thermo Fisher Scientific). Yo te retire bakteri ki rete yo pa filtraj esteril nan porositë 0.22 µm. Supernatant a te konsantre ak 100 kDa molekilè pwa koupe filtè (Merck KGaA, Darmstadt, Almay) ak vesik yo te pirifye swa pa ultracentrifugasyon oswa pa gwosè esklizyon chromatografi (SEC). Pou ultrasantrifugasyon, supernatant la te ultracentrifuge nan 100,000 × g, 3 h, 4 degre. Apre yo fin lave grenn OMV/MV yo jwenn ak PBS esteril, yo te repete ultracentrifugasyon epi yo te fonn granules vesik la nan PBS esteril. Kontni pwoteyin yo te detèmine pa twous tès pwoteyin Pierce BCA dapre enstriksyon manifakti a (Thermo Fisher Scientific), epi yo te itilize kantite pwoteyin egal pou eksperyans eksitasyon. Pou SEC, supernatant a te konsantre nan 500 µL epi chaje sou orijinal/70 nm Gen 2 kolòn (IZON Science LTD, Lyon, Frans), ki te pre-lave ak 10 mL PBS selon pwotokòl manifakti a. Vezik yo te elimine lè l sèvi avèk PBS esteril epi yo te kolekte fraksyon nan 500 µL. Vesicles yo te eliye nan fraksyon 7-12, ki te detèmine pa nano-flow cytometry (nFCM; NanoFCM Co, Ltd, Nottingham, UK). Fraksyon ki gen vesik yo te konsantre nan 200-400 µL lè l sèvi avèk filtè ki koupe pwa molekilè (Merck KGaA). Konsantrasyon vesik nan tout preparasyon yo te detèmine pa nFCM ak kantite egal vesik yo te itilize pou eksperyans eksitasyon. Yo te tcheke preparasyon OMV/MV nan tou de metòd pou pirifye pou kontamine bakteri pa plake ak estoke nan aliquot nan -20 degre.

NFC

Pou nFCM yon analizeur Nano, (NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK) ekipe ak yon lazè 488 nm te kalibre ak 200 nm pèl polystyrène (NanoFCM Co.) ak yon konsantrasyon defini nan 2.08 × 10 ^ 8 patikil / ml epi tou yo itilize kòm yon referans pou konsantrasyon patikil. Anplis de sa, pèl silica monodisperse (NanoFCM Co.) nan kat gwosè diferan yo te itilize kòm yon estanda referans gwosè kalibre gwosè a nan vesik yo. Te fèk filtre (0.1 µm) 1 × PBS te analize kòm yon siyal background ak soustraksyon nan lòt mezi yo. Chak istogram distribisyon oswa trase pwen te sòti nan done yo kolekte pou 1 minit ak yon presyon echantiyon 1 kPa. Echantiyon OMV yo te dilye ak filtre (0.1 µm) 1 × PBS, sa ki lakòz konte patikil nan seri a pi bon nan 2,500–12, 000 evènman. Yo te kalkile konsantrasyon patikil ak distribisyon gwosè lè l sèvi avèk lojisyèl nFCM (NF Profession V1.08).

Mikwoskopi elektwonik transmisyon (TEM)

Kabòn-kouvwi gri kwiv (400 may) yo te idrofilize pa dechaj lumineux (PELCO easiGlow, Ted Pella, USA). Yo te aplike senk µL echantiyon yo sou griy idrofilize yo, epi yo tache ak 2% (w/v) acetate uranyl apre yon etap kout lave ak dlo distile doub. Yo te analize echantiyon yo avèk yon mikwoskòp elèktron transmisyon JEOL JEM-2100 lè l sèvi avèk yon vòltaj akselerasyon 120 kV. Imaj yo te akeri ak yon kamera F214 FastScan CCD (TVIPS, Gauting, Almay).

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Kilti selilè

Liy selil imen (THP-1, A549, BEAS2B, Calu-3, HCC827) yo te jwenn nan American Type Culture Collection. Selil Madin-Darby Canine Kidney II (MDCK II) yo te achte nan men ECACC-Sigma-Aldrich (Darmstadt, Almay). Selil THP-1 Dual™ (Doub) ak THP-1 Dual™ TRIF-KO (TRIF-/-) ​​te jwenn nan Invivogen Europe (Toulouse, Frans). Selil yo te kiltive nan Ham's F12, DMEM oswa RPMI-1640 konplete ak 1 mM piruvat sodyòm, 2 mM glutamin ak 10% FCS chalè inaktive nan kondisyon kilti selil yo. Selil THP-1 Dual™ yo te kiltive nan RPMI-1640 siplemantè ak 1% penisilin/Streptomycin, 2 mM glutamin, 10% FCS chalè inaktive, 100 µg/mL Normocin™ ak 25 mM tanpon HEPES. THP -1, Doub, ak TRIF-/- selil yo te diferansye nan selil makwofaj ki sanble ak adisyon nan 20 nM PMA pou 24 èdtan.

Klonaj Mx1 nan vektè SparQ

Phusion PCR te sèvi ak Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, USA) ki te pwodwi sekans kodaj Mx1 nan cDNA THP-1 dapre enstriksyon manifakti a. Yo te ajoute yon HAtag pa fusion sekans kodaj HA a nan Jadendanfan ranvèse a (sans: 5′-atcggaTTCGAAATGGTTGTT TCCGAAGTGGAC-3′, antisans: 5′-tccgatGCGGCC GCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAA CCGGGGAACTGGGCAAG-3'). Fragman PCR la ansanm ak vektè SparQ (Addgene, Watertown, USA) te dijere ak anzim restriksyon BstbI ak NotI (Thermo Fisher Scientific) epi yo te ligate ak T4 DNA Ligase (New England Biolabs) nan vektè SparQ la.

Transfeksyon nan selil HEK293T ak pwodiksyon Lentivirus

Selil HEK293T yo te transfekte ak vektè SparQ dilye nan Opti-MEM ki gen sekans pou Mx1 ak yon sekans GFP, vektè anbalaj viral psPAX2, ak plasmid anvlòp pVSV-G (Addgene) ak Lipofectamine 2000 (Thermo). Fisher Scientific) dapre pwotokòl manifakti a. Lentiviris yo te pwodwi epi yo te kolekte sipènatan ki gen viris chak jou pou 72 èdtan. Yo te filtre sipènatant la avèk yon filtè 0.45 µm epi yo te transdui selil THP-1 (gade anba a). Yo te itilize yon vektè SparQ vid san yon sekans Mx1 pou transdiksyon selil yo pou jenere yon liy selil kontwòl korespondan (VC=vektè kontwòl).

Transdiksyon nan selil THP-1

Selil THP-1 yo te transdui ak lentivirus ki soti nan sipènatan filtre nan kilti selil HEK293T (gade pi wo a). Polybrene (4 µg/mL, Sigma-Aldrich) te ajoute pou amelyore efikasite transdiksyon an. Selil yo te enkube pou jiska sis jou. Selil GFP-pozitif yo te klase pa sikometri koule.

Izolasyon ak diferansyasyon BDM yo

Monosit imen ki soti nan donatè ki an sante yo te izole pa seleksyon mayetik CD14 pozitif nan selil mononikleyè san periferik ak diferansye nan makrofaj ki sòti nan san (BDM) nan prezans 1% ABserum imen jan yo dekri deja [13].

OMV/MV eksitasyon nan macrophages

Prensipal makrofaj imen oswa selil THP-1 diferansye yo te enkube ak OMVs/MVs pirifye (1 µg/mL chak pou vesik ki pirifye atravè ultrasantrifugasyon ak yon miltiplisite vesik (MOV) 1,000 pou SEC-pirifye. vesik) pou jiska 20 èdtan nan medya konplè. Yo te fè yon lòt aplikasyon inhibitor 1 èdtan anvan tretman vesik. Te-stimile makrofaj yo te swa itilize pou izolasyon pwoteyin oswa RNA oswa eksperyans enfeksyon ki vin apre. Sipènatant ki gen sitokin yo te jwenn yo te itilize pou analiz ELISA oswa LDH oswa esteril filtre epi yo itilize pou eksitasyon selil epitelyal.

Pirifikasyon viris ak titrasyon viris

Pirifikasyon viris ak titrasyon viris yo te fèt nan selil MDCK II jan sa dekri anvan [14]. Titer viral la te detèmine pa tès plak jan sa te dekri deja [15]. Yon ti tan, selil MDCK II konfluyan yo te enfekte ak yon viris dilye seri oswa sipènatant tisi (nan yon mwayen kilti MDCK II san FCS). Yo te pèmèt viris la adsorbe nan selil yo pou 1 èdtan nan 37 degre. Dis, inoculum la te ranplase ak medya fre (sipleman ak 1 ug / mL TPCK trete tripsin (pou IAV) ak 1% Avicel® PH -101 (Sigma-Aldrich)). Selil MDCK II yo te tache ak kristal vyolèt oswa selil ki enfekte ak viris yo te tache ak antikò prensipal (1:2,000) (nukleoprotein sourit anti-grip A, MCA400, Bio-Rad, Almay) ak antikò segondè ( 1:4,000) (Goat Anti-Mouse IgGHRP, 170–6516, Bio-Rad, Almay) pou tès plak. Plak yo te manyèlman konte epi eksprime kòm inite ki fòme plak (pfu) pou chak mL.

benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè

Enfeksyon viris

Apre 20 èdtan pre-stimulasyon ak vesik bakteri oswa sipènatan ki gen sitokin, selil yo te enfekte ak IAV oswa viris stomatit vesikulèr (VSV). Makwofaj yo te enfekte ak H1N1 (A/WSN/33) oswa VSV, pandan y ap selil epitelyal yo te enfekte ak H1N1 (A/Hamburg/2009/PDM) tou de nan medya fre san FCS. Apre 1 èdtan nan inokulasyon, yo te retire viris gratis la epi yo te ranplase medya yo ak medya ki gen TPCK-trypsin pou IAV oswa medya vid pou VSV. Selil yo te enkube pou jiska 48 èdtan pou pèmèt replikasyon multicyclic.

Preparasyon nan PCLS imen

Tisi nan poumon yo te akeri nan pasyan ki te sibi reseksyon lòb akòz kansè nan poumon nan Hannover Medical School (MHH, Hannover, Almay). Se sèlman tisi ki soti nan pati makwoskopik ak mikwoskopik nan poumon ki pa gen maladi yo te itilize pou eksperyans. Yo te prepare tranch nan poumon ak presizyon imen (PCLS) jan sa dekri anvan [16]. Yo te kiltive de tisi pou chak pi nan yon plak 24-byen anba kondisyon submerged (DMEM/F12 konplete ak 1% penisilin/Streptomycin) nan 37 degre, 5% CO2 lannwit lan.

IAV enfeksyon nan PCLS

Yo te ankouraje PCLS ak 1 µg/mL OMV ki pirifye nan L. pneumophila oswa K. pneumoniae dilye nan DMEM/F12 ki te konplete ak 1% penisilin/Streptomycin nan 37 degre, 5% CO2 pou 20 h. Yo te retire medya yo epi yo te bay PCLS 25,000 pfu/byen nan 250 µL viris grip A/California/04/2009(H1N1pdm). PCLS yo te enkube a 35 degre epi yo te balanse chak 15 minit pandan inokulasyon pou pèmèt enfeksyon viris omojèn. Apre sa, inoculum la te jete epi ranplase pa DMEM/F12 ki te konplete ak 1% Penisilin/Streptomycin. Apre enkubasyon pou 48 èdtan, yo te kolekte supernatant la pou deteksyon viris, lage LDH, ak quantification cytokine. Echantiyon pou mezi cytokin yo te konplete ak yon bwason 0.2% inibitè proteaz (P1860, Sigma-Aldrich, Minik, Almay) epi estoke nan 80 degre jiskaske analiz. PCLS yo te jele ak estoke nan 80 degre jiskaske pirifikasyon RNA jan sa te dekri deja [17].

PICHAY

Yo te fè tès lage LDH dapre enstriksyon manifakti a lè l sèvi avèk Pierce™ LDH Cytotoxicity Assay Kit yo te jwenn nan Roche (Mannheim, Almay) oswa Cytotoxicity Detection KitPLUS (LDH) (Roche, Merck). Absorbans la te mezire lè l sèvi avèk yon lektè microplate enfini F200Pro (Tecan, Männedorf, Swis).

ELISA

Cytokines CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10, ak IL-1 yo te quantifye nan supernatant san selil lè l sèvi avèk twous ELISA ki disponib nan komès (R&D Systems, Wiesbaden, Almay) dapre manifakti a. enstriksyon yo.

Esè QUANTI-blue™

Pou detèmine aktivite repòtè SEAP nan supernatant kilti selil ki soti nan THP-1 Dual™ ak selil TRIF-/- korespondan yo, yo te fè tès QUANTI-Blue™ dapre pwotokòl manifakti a. Yon ti tan, yo te kolekte supernatant kilti selil apre eksitasyon selil ak OMV yo. Premyèman, yo te jete solisyon QUANTI-Blue™ ak sipènatant kilti selil yo nan yon plak ki gen yon twou byen gra. Apre enkubasyon nan 37 degre pou 150 min, yo te detèmine dansite optik nan 630 nm nan yon lektè microplate enfini F200Pro.

QUANTI-luc™ tès

Pou detèmine aktivite repòtè Lucia luciferase nan supernatant kilti selil ki soti nan THP{{0}} Dual™ ak selil TRIF-/- korespondan yo, yo te fè tès QUANTI-Luc™ dapre pwotokòl manifakti a. Yon ti tan, sipènatant kilti selil yo te distribye nan yon plak byen gra 96-blan (BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Almay). Yo te ajoute solisyon tès QUANTI-Luc™ epi yo te fè mezi luminesans imedyatman ak yon tan lekti 0.1 s nan yon lektè microplate enfini F200Pro.

Lwès blòt

Pou detèminasyon ekspresyon pwoteyin oswa fosforilasyon, Western Blot te fèt jan sa dekri deja [18].

Preparasyon RNA ak PCR an tan reyèl

Pou analiz ekspresyon jèn yo, izolasyon RNA te fèt pa ekstraksyon fenol-kloroform ak ranvèse transkri jan sa dekri anvan [12]. Yo te fè PCR an tan reyèl nan yon ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) ak Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs) ak pè primè espesifik. Lè w itilize metòd 2-ΔΔCT [19], yo te kalkile endiksyon x-fold epi rezilta yo te nòmalize nan selil kontwòl korespondan yo. 18S: fwd: 5′-GACTCTTTCGAGGCCCTGTA-3′, rev: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3′ CXCL8: fwd: 5′-ACTGAGAGTGATTGAGAG TGGAC-3′, rev: 5′-CACCACCCTC-3′ {20}}′ IFI44: fwd: 5′-TATCCAGACAGAGCAGCTACC-3′, rev: 5′-ATAGAGAAGGCTAAGCCGCTTC-3′ IFIT1: fwd: 5′-ATGCAGGAAGAACATGACAACC-3′, rev: ′-TCTGGACACTCCATTCTATAGCG-3′ IFNA1: fwd: 5′-ACAGGAGGACCTTGATGCTC-3′, rev: 5′-TCTGCTGGATCAGCTCATGG{-3′ IFNB: fwd: 5′-AACATGACCAACAA4GTCTCCA4}} , rev: 5′-TGTCCTTGAGGCAGTATTCAAG-3′ IL1B: fwd: 5′-AGCTCGCCAGTGAAATGATGG-3′, rev: 5′-CAGGTCTGGAAGGAGCACTTC{-3′ IL12B: fwd: 5′-GCCCAG{ATCAAG-3′ 58}}′, rev: 5′-CACCATTTCTCCAGGGGCAT-3′ Mx1: fwd: 5′-GGGCTTTGGAATTCTGTGGC-3′, rev: 5′-CCTTGGAATGGTGGCTGGAT{-3′ NP: fwd: 5' -GAAATTTCAAACAGCTGCACAAAG -3′, rev: 5′-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3′ RPS18: fwd: 5'-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′, rev: 5′-GATCACCACGTTCCACCTCATC-3

Iminofluoresans

Selil THP{{0}} yo te diferansye sou kouvèti kouvèti lè yo ajoute 20 nM PMA epi yo te enkube ak OMVs/MVs pou 20 h. Selil yo te vin enfekte ak H1N1 (A/WSN/33; miltiplisite enfeksyon (MOI) 0.1) pou 4 èdtan. Apre 15 min fikse ak 3% paraformaldehyde, glisad yo te lave twa fwa ak PBS ak pèmeabilize ak 0.2% triton X-100 nan TBS (10 min, tanperati chanm). Apre bloke (1% BSA nan TBS/0.2% triton X-100), selil yo te enkube ak -NP antikò (1:250, nan solisyon bloke). Antikò segondè a (1:1000) ansanm ak DAPI (1:2000) te enkube pou 1 èdtan nan fè nwa a. Yo te analize kouvèti ki monte sou yon mikwoskòp fliyoresan (AxioVision, Zeiss, Jena, Almay).

Deklarasyon etik

Komite etik nan Hannover Medical School (MHH, Hannover, Almay) te apwouve eksperyans ak tranch tisi nan poumon imen e yo an konfòmite ak Kòd Etik Asosyasyon Medikal Mondyal la (nimewo 2701–2015). Tout pasyan yo oswa fanmi yo te bay konsantman eklere alekri pou itilize tisi nan poumon pou rechèch. Tout donatè san yo te bay konsantman ekri enfòme (Nimewo apwobasyon Etik: 161/17).

Fig. 1 Karakterizasyon vesik bakteri ak repons nan makrofaj imen. Yon Separasyon nan vesikil bakteri ekstraselilè soti nan pwoteyin gratis atravè chromatografi eksklizyon gwosè soti nan diferan supernatant bakteri (Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal), ak Streptococcus pneumoniae (Sp) ). Konsantrasyon vesik nan chak fraksyon te detèmine pa nano-flow cytometry (nFCM) ak pwoteyin yo te quantifye pa BCA. B NFC te detèmine distribisyon gwosè vesik nan OMVs/MVs pirifye. C TEM imaj OMVs/MVs pirifye. Ba echèl=50 nm. D-G ​​BDM yo te ankouraje ak OMVs/MVs (1 µg/mL chak) ki soti nan diferan bakteri oswa kite yo pa trete pou kontwole pou jiska 48 èdtan. D CXCL8 lage te detèmine pa ELISA epi li montre nan ng/mL. Ekspresyon IL1B (E) ak IL12B (F) te detèmine pa qPCR, rezilta yo nòmalize nan RPS18 epi yo montre parapò ak selil kontwòl ki pa trete. G Apre 1 èdtan enkubasyon ak vesik bakteri, ekspresyon ak fosforilasyon IRAK-1, p38, ak TBK-1 te detèmine pa Western Blot. Yo montre rezilta reprezantatif kat replike byolojik endepandan yo. Ba yo reprezante valè mwayen + SEM soti nan twa (B) a kat (D-F) eksperyans endepandan. Estatistik: 2-fason ANOVA (DF); *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; ns=not significant; n=3–4

Estatistik

Done yo montre kòm valè mwayèn + SEM pou omwen twa eksperyans byolojik endepandan. Prism 6.07 (GraphPad, La Jolla, USA) te itilize. Yo te fè tès ANOVA yon sèl-oswa de-fason pou echantiyon ki pa pè. P-valè mwens pase oswa egal a 0.05 yo te konsidere estatistik enpòtan. Si yo pa endike otreman, yo te fè tès kont kontwòl korespondan (*).

Disponibilite done ak materyèl

Tout done ki pwodui oswa analize pandan etid sa a yo enkli nan atik sa a ak dosye siplemantè li yo.

Rezilta yo

Aktivasyon pro-enflamatwa nan macrophages pa OMVs / MVs

Pou teste repons iminitè natirèl nan makwofaj prensipal yo nan san (BDM) nan OMVs/MVs ki soti nan diferan bakteri, vesik ki soti nan Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella). ) ak Streptococcus pneumoniae (Sp) yo te izole atravè kromatografi esklizyon gwosè (SEC). Fraksyon yo te analize pou kantite vesik pa nano-flow cytometry (nFCM) ak pou prezans nan pwoteyin pa BCA (Fig. 1A). Vezik ki soti nan fraksyon 7-12 yo te pisin epi yo te itilize pou eksperyans. OMVs / MVs te gen yon pwofil distribisyon gwosè konparab (figi 1B), pa t 'diferan nan gwosè mwayèn (fichye adisyonèl 1: Fig. S2A), yo te konsantre egalman (fichye adisyonèl 1: Fig. S2B), epi yo te vizyalize pa elèktron transmisyon. mikwoskopi (TEM; Fig. 1C). BDM yo te ankouraje ak OMVs / MVs pou jiska 48 èdtan, ki koresponn ak konsantrasyon vesik egal nan bakteri yo diferan (Fichye adisyonèl 1: Fig. S2C). Enkubasyon nan BDM ak vesik pa t 'sitotoksik (Fisye adisyonèl 1: Fig. S2D). OMVs / MVs lajman pwovoke ekspresyon CXCL8 ak lage soti nan macrophages (Fichye adisyonèl 1: Fig. S3A ak 1D), pandan y ap IL1B ak IL12B mRNA endiksyon te tan ak espès-depandan (Fig. 1E + F). Liberasyon IL-1 te depann de espès vesik bakteri yo te izole nan (Fichiye adisyonèl 1: Fig. S3B). Malgre ke fosforilasyon p38 te konparab nan BDM apre 1 èdtan nan enkubasyon vesik, sèlman OMV ki soti nan degradasyon bakteri gram-negatif pwovoke nan IRAK-1 ak fosforilasyon nan TBK-1 men se pa MVs soti nan gram-pozitif (figi). 1G ak dosye adisyonèl 1: S4A-D).

Fig. 2 Vezik ekstraselilè bakteri aktive repons entèferon tip I nan BDM yo. BDM yo te ankouraje ak OMVs/MVs (1 µg/mL chak) ki soti nan diferan bakteri oswa kite trete kòm yon kontwòl. Yon Fosforilasyon ak ekspresyon IRF-3 te detèmine apre 1 èdtan nan enkubasyon OMV/MV pa Western Blot. Yo montre rezilta reprezantatif twa replike byolojik endepandan. Ekspresyon de IFNA1 (B), IFNB (C), IFIT1 (E), ak IFI44 (F) te mezire pa qPCR, rezilta yo nòmalize nan RPS18 epi yo montre parapò ak selil kontwòl ki pa trete. D Fosforilasyon STAT1 te detèmine pa Western Blot apre 2 èdtan nan eksitasyon OMV/MV. Yo montre rezilta reprezantatif kat replike byolojik endepandan. G Fosforilasyon STAT1 ak ekspresyon Mx1 te detèmine pa Western Blot apre 20 èdtan nan eksitasyon vesik bakteri. Rezilta reprezantatif kat replike byolojik endepandan yo montre. Ba yo reprezante valè mwayen + SEM ki soti nan kat eksperyans endepandan. Estatistik: 2-fason ANOVA; *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=4

Anplis aktivasyon NF-κB ak AP-1 ak sib en yo, siyal PRR ka mennen nan aktivasyon IRF yo. Kidonk, yo te detèmine fosforilasyon IRF-3. Kp/Ec/SalOMVs ogmante fosforilasyon IRF -3 nan BDMs (figi 2A), sa ki lakòz ekspresyon IFN mwen (figi 2B + C), fosforilasyon en STAT1 (figi 2D ak dosye adisyonèl 1: S4E) ak endiksyon entèferon-stimile jèn (ISGs; IFIT1, IFI44 ak Mx1; Fig. 2E-G). Kòm evènman fosforilasyon yo anjeneral kout epi yo konnen yo jwe yon wòl kritik nan chanje kaskad siyal iminitè sou ak nan, fosforilasyon nan STAT1 te egzamine tou 20 èdtan apre adisyon a nan Kp / Ec / SalOMVs (Fig. 2G ak dosye adisyonèl 1: S4F+G). Eksperyans yo te montre ke OMV yo pa sèlman aktive siyal pro-enflamatwa nan makrofaj, men tou siyal antiviral pwovoke.

OMV pre-enkubasyon chanje replikasyon IAV nan makrofaj yo

Mx1 se yon faktè antiviral byen li te ye ki anpeche replikasyon IAV [20], ki te eksprime sou tretman Kp / Ec / SalOMV nan macrophages. Se poutèt sa, nou te ipotèz ke pre-tretman OMV chanje replikasyon viral. Eksperyans enfeksyon IAV yo te mete sou pye nan selil THP-1, ki eksprime nivo menm jan Mx1 sou tretman Kp/Ec/SalOMV sou nivo mRNA ak pwoteyin (Fichye adisyonèl 1: Fig. S5A+B) epi pwovoke fosforilasyon STAT1. , pandan ke total STAT1 pwoteyin rete estab (Fisye adisyonèl 1: Fig. S5C), ak yon souch H1N1 (A/WSN/33) ki enfekte ak replike nan makrofaj [21]. Pre-estimulasyon selil THP-1 ak LpOMV/SpMV ogmante replikasyon IAV 24 èdtan apre enfeksyon (pi) konpare ak kontwòl ki enfekte (--), tandiske pre-tretman ak Mx1-pwovoke OMVs (Kp). /Ec/Sal) bloke replikasyon IAV (figi 3A). Pandan ke TLR2/1 agonist Pam3CSK4 pre-tretman te kapab imite efè a obsève ak LpOMV/SpMV, ki tou de konnen siyal atravè TLR2/1 [12, 22, 23], LPS idrosolubl kòm yon agonist TLR4 pa t 'repwodui Kp/Ec la. /SalOMV efè (Fichye adisyonèl 1: Fig. S5D). Diferans nan chaj IAV apre pre-tretman ta ka obsève tou pa tach imunofluoresan kont nukleoprotein viral (NP) (Fig. 3B). Kp / Ec / SalOMV pre-tretman bloke replikasyon IAV ak zòn nan NP-pozitif te siyifikativman redwi (figi 3C). Sa a pa t 'kapab obsève apre LpOMV / SpMV pre-tretman. Pou envestige si Mx1 endiksyon ase pou obsève bloke IAV replikasyon an, Mx1 te stab overexpressed (sèks) nan THP -1 macrophages imite OMV pre-stimulasyon (Fichiye adisyonèl 1: Fig. S5E). Enfeksyon IAV nan selil Mx1oex te lakòz yon rediksyon nan zòn imunofluoresan NP-pozitif 4 h pi (Fig. 3D) ak nan yon rediksyon viral rediksyon 6 h pi konpare ak yon kontwòl vektè vid (VC) (Fig. 3E) byenke nan yon pi piti. limit konpare ak OMV prestimulation (Fig. 3A). An konklizyon, Kp / Ec / SalOMV aktive macrophages nan yon fason klasik pro-enflamatwa ak pwovoke jèn antiviral ki lakòz deklanchman IFN- / reseptè (IFNAR), fosforilasyon en STAT1 ak ekspresyon Mx1, ki ka dirèkteman entèfere ak replikasyon IAV ( Fig. 4A). Pou konfime enpòtans ki genyen nan siyal JAK/STAT pou endiksyon an obsève nan repons antiviral, yo te aplike yon inibitè JAK (JAKi) anvan eksitasyon vesik. JAK anpèchman pa t 'chanje ekspresyon CXCL8 Kp / SalOMV-induit (figi 4B), men siyifikativman redwi Mx1 sou mRNA (figi 4C) ak nivo pwoteyin menm sou enfeksyon IAV (figi 4D ak dosye adisyonèl 1: S6A). An konsekans, JAKi ranvèse OMV pwovoke blokaj replikasyon viral (Fig. 4E).

Fig. 3 Mx1-pwovoke OMV yo bloke replikasyon viris grip A nan selil THP-1 yo. Yon replikasyon viris Grip A nan selil diferan THP-1. Selil yo te swa pre-trete ak OMVs / MVs (1 µg / mL chak) oswa kite yo pa trete pou kontwòl (-). Apre 20 èdtan pre-tretman, selil yo te enfekte ak A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) pou 24 ak 48 èdtan. Replikasyon IAV te detèmine pa qPCR kont IAV-NP nòmalize nan 18S. Yo montre valè mwayen ± SEM nan twa a senk eksperyans endepandan. B Selil THP-1 diferan yo te trete davans ak OMVs/MVs (1 µg/mL chak) oswa yo te kite yo pa trete pou kontwòl (–). Apre 20 èdtan pre-enkubasyon, selil yo te enfekte ak A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) pou 4 èdtan. Apre fiksasyon, selil yo te tache ak yon antikò -influenza NP (jòn) ak DAPI (ble). Yo montre yon rezilta reprezantan kat eksperyans byolojik endepandan. C Quantification de NP pozitif (NP +) zòn nan (B). Ba yo reprezante valè mwayen kat eksperyans endepandan + SEM. D THP-1 selil ki estab Mx1 (Mx1oex) ak selil vid vektè kontwòl (VC) te enfekte ak viris grip A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) pou 4 èdtan. Apre fiksasyon ak tach imunofluoresans ak -grip NP, zòn NP + yo te quantifye epi yo montre parapò ak selil VC yo. Ba yo montre valè mwayen kat eksperyans endepandan + SEM. E Mx1oex ak selil VC yo te enfekte ak A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) pou 6 èdtan. Replikasyon viral te detèmine pa tès plak ak rezilta yo montre kòm inite ki fòme plak (pfu) pou chak mL. Ba yo reprezante valè mwayèn + SEM nan kat eksperyans endepandan. Estatistik: 2-fason ANOVA (A), 1-fason ANOVA (C), tès t ki pa pè (D+E); *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=3–5

Repons antiviral sou OMV yo depann de TLR4-TRIF

Pou idantifye PRR ki enplike, yo te aplike agonist iminitè komèsyal poukont yo oswa an konbinezon ak LPS pou imite OMV yo. Sepandan, pa gen okenn endiksyon reflete Mx1 obsève ak KpOMVs (Fisye adisyonèl 1: Fig. S7), sijere yon diferans ak pwolonje aktivasyon nan makrofaj pa OMVs akòz konpozisyon ligand yo oswa prezantasyon espasyal nan PRRs. Reseptè iminitè ki enplike yo te evalye plis pa selil repòtè THP -1 pou siyal NF-κB- ak IRF (figi 5A). Apre tretman KpOMV, selil THP-1 yo te montre siyifikativman ogmante ekspresyon nan pwoteyin Mx1 (figi 5B ak dosye adisyonèl 1: S6B), ki te pèdi nan selil TRIF ki ensufizant (TRIF-/-) ​​THP-1 ( Figi 5B ak dosye adisyonèl 1: S6B). Menm bagay la tou te obsève pou repòtè IRF la (Fig. 5C), pandan y ap aktivasyon repòtè NF-κB ak endiksyon CXCL8 yo te wo nan tou de THP -1 ak TRIF-/- selil sou eksitasyon (Fig. 5D + E). STAT-depandan IFIT1, IFI44, ak ekspresyon jèn Mx1 yo te pwovoke sou eksitasyon KpOMV nan selil repòtè THP -1 (Fig. 5E), pandan ke li te siyifikativman redwi nan egalman ankouraje TRIF-/- selil (Fig. 5E). Lòt enfeksyon IAV apre pre-stimulasyon te lakòz diminye replikasyon viral, tandiske sipresyon TRIF sove replikasyon IAV (Fig. 5F). Pou envestige si KpOMV yo pwovoke yon repons jeneral antiviral nan makrofaj, selil yo te enfekte ak viris stomatit vesikulèr (VSV), ki te repwodui nan selil kontwòl, men yo te bloke nan selil KpOMV pre-trete epi yo ta ka sove pa sipresyon TRIF tou (Fig. 5G). Depi rekonesans LPS atravè TLR4 esansyèl pou andositoz ak aktivasyon TRIF, LPS sou sifas OMV yo te netralize pa lipopeptide antibyotik Polymyxin B (PB), sa ki lakòz 50% diminye endiksyon Mx1 (figi 6A + B ak dosye adisyonèl 1). : S6C), men pa gen okenn diferans enpòtan nan NF-κB-depandan transkripsyon CXCL8 (Fig. 6C). Replikasyon viral te sove nan nivo fondamantal sou KpOMV + PB pre-stimulasyon (Fig. 6D). Kòm anpèchman nan rekonesans LPS pa PB te ensifizan pou konplètman bloke Mx1, OMV ki soti nan endotoxin-gratis Clear coli (Cc) yo te izole epi yo te itilize pou pre-stimulasyon. Cc eksprime yon lipid A ki chanje epi li pa ka pwovoke yon konplèks TLR4/MD2 aktive [24]. CcOMVs pa t 'pwovoke Mx1 (figi 6A + B ak dosye adisyonèl 1: S6C) epi yo pa t 'diminye replikasyon IAV nan makrofaj (figi 6D). Li se byen li te ye ke izolasyon nan vesik ekstraselilè atravè diferans ultrasantrifugasyon rezilta nan ko-izolasyon nan kontaminan (egzanp pwoteyin oswa anèks selil bakteri) ansanm ak vesik yo. Dapre direktiv MISEV2018 [25], eksperyans kle yo te repete ak OMV izole atravè yon konbinezon ultrafiltrasyon (UF) ak kromatografi esklizyon gwosè (SEC). Stimulasyon selil repòtè THP-1 ak KpOMV pirifye UF-SEC te lakòz endiksyon Mx1 (Fichye adisyonèl 1: Fig. S8A) ak repòtè IRF (Fig. S8B), pandan ke li te pèdi nan TRIF-/- macrophages ( Fichye adisyonèl 1: Fig. S8A + B). Replikasyon IAV te bloke nan selil KpOMV pretrete epi yo te sove lè yo te retire TRIF (Fichiye adisyonèl 1: Fig S8C). Aktivite repòtè NF-κB te pwovoke pa KpOMVs kèlkeswa estati TRIF selil yo (Fichye adisyonèl 1: Fig. S8D).

Fig. 4 Anpèchman JAK-siyal sove replikasyon viris grip A nan macrophages. Yon OMV aktive TRIF-IRF-siyal nan makrofaj, ki an vire pwovoke IFN-ekspresyon ak lage ak IFNAR-siyal ki vin apre. IFNAR siyal atravè JAK / STAT epi pwovoke ekspresyon ISG yo, youn nan yo se Mx1. Sa a mennen nan yon blòk nan replikasyon IAV. Selil B–E THP-1 yo te pre-enkube pou 1 èdtan ak 10 µM inibitè JAK (JAKi) anvan adisyon OMVs (1 µg/mL; Kp/Sal) pou 2{{22 }} h. B–C CXCL8 (B) ak Mx1 (C) ekspresyon yo te detèmine pa qPCR ak rezilta yo nòmalize nan RPS18 ak montre parapò ak kontwòl ki pa trete. Ba yo montre valè mwayen twa a kat eksperyans endepandan + SEM. D + E OMV selil pre-trete yo te anplis enfekte ak IAV (MOI 0.001). D Western blot montre ekspresyon pwoteyin Mx1 nan 0-3 èdtan apre enfeksyon (pi). E Replikasyon viral yo te detèmine pa tès plak 24 èdtan apre enfeksyon. Ba yo montre valè mwayen kat eksperyans endepandan + SEM. Estatistik: 1-fason ANOVA (B+C+E); *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; *compared to DMSO control, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=4

Fig. 5 OMV yo pwovoke siyal antiviral nan makrofaj atravè TRIF. Yon selil repòtè doub THP-1 pwovoke ekspresyon fosfataz alkalin anbriyon an sekrete (SEAP) apre deklanchman chemen NF-κB la ak ekspresyon ak sekresyon Lucia luciferase lè yo aktive chemen IRF la. Anplis de sa, TRIF (bawo gri) yo te diferansye epi answit ankouraje ak selil -/- gen yon knockout ki estab nan molekil adaptè TRIF la. (BF) THP-1 selil repòtè yo ({=Doub; ba nwa) ak TRIF-/- selil KpOMV (1 µg/mL) pou 20 èdtan oswa yo pa trete pou kontwòl. Apre tan ki endike a, yo te kolekte supernatant, RNA ak/oswa pwoteyin. B Reprezantan imaj Western Blot nan ekspresyon pwoteyin Mx1. C + D Lucia repòtè aktivite (C) ak aktivite repòtè SEAP (D) te detèmine nan sipènatant kilti selil. Yo te itilize menm supernatant pou detèmine aktivite tou de repòtè yo. E ekspresyon mRNA relatif pou jèn sib depandan STAT ak NF-κB (soti anba: IFIT1, IFI44, Mx1, CXCL8) te detèmine pa qPCR ak rezilta yo nòmalize nan RPS18 ak dekri parapò ak kontwòl Doub unstimulated. Chanjman pliye yo te transfòme log2. Selil yo te anplis enfekte ak A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) pou 24 èdtan (F) oswa VSV (MOI 0.1) pou 12 èdtan (G). Replikasyon viral te detèmine pa tès plak. Ba yo montre valè mwayen kat (C–F) jiska fve (G) eksperyans endepandan + SEM. Estatistik: 2-fason ANOVA (C–G); *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to unstimulated Dual control, # as depicted in the graph; ns=not signifcant; n=4–5

Fig. 6 OMV-pwovoke ekspresyon Mx1 pèdi apre anpèchman LPS. Selil THP-1 yo te enkube pou 20 èdtan ak OMVs (1 µg/mL; Kp oswa Clear coli (Cc)) poukont yo oswa an konbinezon ak 20 µg/mL Polymyxin B (PB) oswa yo pa trete. pou kontwòl. Western Blot te detèmine yon ekspresyon pwoteyin Mx1. Yo montre yon rezilta reprezantan twa eksperyans byolojik endepandan. Mx1 B ak CXCL8 C ekspresyon yo te detèmine pa qPCR. Ba yo montre valè mwayen kat eksperyans endepandan + SEM. Selil D THP-1 yo te enkube pou 20 èdtan ak OMVs (1 µg/mL; Kp oswa Cc) poukont yo oswa an konbinezon ak 20 µg/mL PB oswa yo te kite yo pa trete pou kontwole epi anplis enfekte ak A/WSN/33. (H1N1) (MOI 0.001). Replikasyon viris la te detèmine pa tès plak 24 èdtan apre enfeksyon. Ba yo montre valè mwayen kat eksperyans endepandan + SEM. Estatistik: 1-fason ANOVA B–D; *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; *compared to control, #compared to KpOMV; ns=not significant; n=3–4

Efè ki anpeche replikasyon IAV nan OMV yo transfere nan AEC yo

Depi makrofaj yo pa kalite selil prensipal pou replikasyon IAV nan poumon epi kòm IFN mwen tou aji parakrin, yo te teste transferabilite efè replikasyon IAV nan AECs, paske selil sa yo, kontrèman ak makrofaj yo, pa reponn dirèkteman nan OMVs/MVs ( Lòt dosye 1: Fig. S9). Supernatant (SN) soti nan macrophages KpOMV-trete pwovoke Mx1 nan selil A549, kontrèman ak LpOMV-SN (Fig. 7A), pandan y ap CXCL8 te pwovoke apre tou de (Fig. 7B). KpOMVSN redwi replikasyon viral (Fig. 7C), ki te nan liy ak eksperyans macrophage ak modèl endiksyon Mx1. Pou konfime depandans efè IAVlimiting yo obsève sou siyal JAK / STAT, KpOMV-SN te konbine avèk JAKi, bloke Mx1 endiksyon sou tretman KpOMV-SN (figi 7A) ak restore replikasyon IAV (figi 7C). Pou imite règleman konplèks nan pwosesis iminitè nan poumon an, yo te etabli enfeksyon IAV ex vivo nan tranch nan poumon ak presizyon moun (PCLS). Lp / KpOMV yo pa t 'sitotoksik nan PCLS la (Fig. 8A) ak konbinezon an nan OMV pre-stimulasyon ak enfeksyon IAV te lakòz Mx1 endiksyon (Fig. 8B) ak lage CXCL10 (Fig. 8C). KpOMVs men pa LpOMVs siyifikativman redwi replikasyon IAV nan PCLS (Fig. 8D). Efè yo te obsève yo te aboli pa enfeksyon ak UV inaktive IAV (Fig. 8A-C). Konklizyon nou yo mennen nan yon modèl enflamasyon nan poumon kote AM yo reponn a OMV soti nan bakteri gram-negatif ak endiksyon nan IFN I, pwovoke repons antiviral nan yon fason otokrin nan AMs ak nan yon fason parakrin nan AECs in vitro ak nan yon ansyen modèl PCLS. (Fig. 8E).

Fig. 7 Grip Yon efè ki anpeche replikasyon viris OMV yo transfere nan AEC yo. Selil THP-1 yo te enkube ak LpOMV oswa KpOMV pou 20 èdtan oswa kite yo pa trete pou kontwòl. Supernatant a (SN) te esteril filtre epi yo te itilize pou pre-estimulasyon selil A549 pou 20 h pou kont li oswa nan konbinezon ak 10 µM JAKi. A + B Mx1 (A) ak ekspresyon CXCL8 B yo te detèmine pa qPCR nan moman enfeksyon an (0 h pi). Ba yo montre valè mwayèn nan kat eksperyans endepandan + SEM nòmalize nan selil kontwòl ki pa trete. C Selil A549 ki te deja trete yo te anplis enfekte ak viris grip A/Hamburg/5/2009(H1N1pdm) (MOI 0.01) pou 24 èdtan. Replikasyon viral te detèmine pa tès plak. Ba yo se valè vle di nan kat eksperyans endepandan + SEM. Estatistik: 1-fason ANOVA; **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to control-SN; # compared to KpOMV-SN; n=4

Diskisyon

Nou te jwenn ke vesik ki soti nan bakteri diferan pwovoke siyal diferans nan makrofaj ki kapab limite replikasyon IAV nan yon enfeksyon ki vin apre. Nan liy ak literati a, izole OMV ki soti nan Lp, Kp, Ec, ak Sal, ak MV ki soti nan Sp yo te konparab nan gwosè [26-28]. Macrophages enkubasyon ak vesik bakteri pa t 'montre sitotoksisite [29, 30], men pwovoke yon repons pro-enflamatwa. Tout vesik yo te deklanche fosforilasyon p38 ak lage CXCL8 ak IL-1 nan makwofaj prensipal imen yo, pandan ke te gen diferans nan endiksyon IFN I ak siyal en yo. Nou menm ak lòt moun te deja montre ke LpOMVs siyal atravè TLR2 [12, 22] epi tou SpMVs pwovoke yon modèl aktivasyon diferan nan macrophages [31]. LpOMVs/SpMVs aktive pro-enflamatwa NF-κB jèn sib, jan sa dekri pou bakteri ki gen orijin [12, 22, 31]. Men, rekonesans Kp/Ec/SalOMVs te pwovoke, anplis de jèn sib NF-κB, endiksyon IRF-3 fosforilasyon ak ekspresyon IFNB en ak fosforilasyon ki dire lontan nan STAT1 ansanm ak endiksyon ISG yo, diskite pou aktif. IFNAR-JAK/STAT siyal. OMV yo pote LPS sou sifas yo, men kapasite pro-enflamatwa OMV yo pa t 'kapab imite ak LPS pi bon kalite. Nou menm ak lòt moun te obsève ke makrofaj yo pi sansib a OMV yo konpare ak menm kantite LPS pi [32, 33]. OMV yo genyen yon sòm agonist iminitè ki nesesè pou endiksyon yon repons iminitè solid [32]. Komèsyal TLR ak RIG-I agonist pou kont yo oswa nan konbinezon ak LPS pa t 'kapab imite efè a. Li te demontre anvan ke lipozom LPS-chaje pwovoke yon aktivasyon ki pi pwolonje nan TRIF-IRF-3 nan macrophages konpare ak LPS gratis [34]. Lè nou itilize TRIF-/- macrophages, nou te montre depandans endiksyon ISG sou molekil adaptè sa a. Anplis, endotoxin-gratis CcOMV oswa OMVs konbine avèk LPSmasking PB yo te ase pou anile repons makwofaj yo. Sa a endike rekonesans OMV yo atravè TLR4 ak andositoz ki vin apre ak siyal TRIF. An konsekans, Kp / Ec / SalOMV yo te kapab pwovoke deklanchman pro-enflamatwa nan makrofaj atravè TLR4 ki mennen nan siyal MyD88 ak ekspresyon jèn depandan NF-κB kòm byen ke siyal TRIF ak repons IFN I. Sa a se nan liy ak literati ki montre ke TLR4 ak TRIF ansanm yo obligatwa pou iminojenisite nan Neisseria meningitidis OMVs nan sourit [35]. Kòm IFNs tip I yo se regilatè mèt repons antiviral, nou te sipoze ke rekonesans Kp/Ec/SalOMVs afekte replikasyon IAV. Nou te demontre ke makrofaj yo bloke avèk efikasite IAV ak VSV replikasyon apre TRIF-aktive OMV pre-tretman, pandan y ap TRIF-/- sove replikasyon viral. Pou detèmine efè a sou siyal IFNAR, anpèchman JAK1/2 konbine avèk OMVs, avèk siksè bloke endiksyon Mx1 STAT1-depandan STAT epi sove replikasyon viral nan makrofaj yo. Konbinezon KpOMVs ak PB oswa aplikasyon CcOMVs endotoxin-gratis pa t 'diminye replikasyon IAV nan makrofaj yo paske yo pa t' kapab pwovoke jèn antiviral yo. Kòm preparasyon vesik ekstraselilè yo te jwenn pa ultracentrifugasyon gen ladan pwoteyin gratis ak atachman selil bakteri ansanm ak vesik yo, preparasyon OMV yo te anplis pwodwi atravè yon konbinezon ultrafiltrasyon ak chromatografi esklizyon gwosè [25].

Chinwa zèb cistanche plant-Antitumor

Preparasyon vesik pi bon kalite yo te jwenn yo te egalman kapab pwovoke siyal TRIF-IRF ak endiksyon Mx1 en ak bloke replikasyon viral ki te diskite pou yon efè vesik dirèk. Malgre ke ATM yo se premye liy defans nan poumon, majorite enfeksyon IAV ak replikasyon nan yon poumon moun pran plas nan AECs [36]. Se poutèt sa, AEC yo te ankouraje ak OMV, men yo pa t reponn a eksitasyon an tankou makrofaj. Se sèlman liy selil epitelyal bwonch BEAS2B la reponn ak ekspresyon CXCL8, men li te manke endiksyon Mx1. Depi nou te kapab montre yon ekspresyon jèn antiviral ki depann de TLR4 ak TRIF nan makrofaj, nou ipotèz ke kat liy selil epitelyal yo teste yo pa eksprime TLR4 nan yon limit menm jan ak makrofaj yo e ke yo echwe pou yo andositoz OMVs sou aktivasyon TLR4. Sa a se nan liy ak literati ki montre ke izole AEC imen pa reponn a LPS kòm pè AMs te fè [37]. Kòm nou te lye estati antiviral la sou OMV pre-enkubasyon ak IFN I, nou te itilize yon supernatant nan makrofaj OMV-stimile pou pre-estimile AECs. Mwayen kondisyone nan macrophages ki ankouraje KpOMV, kontrèman ak eksitasyon vesik dirèk, pwovoke ekspresyon Mx1 nan selil sa yo ak redwi replikasyon IAV nan eksperyans enfeksyon ki vin apre yo. Supernatant soti nan makrofaj LpOMV-trete pwovoke CXCL8 nan selil epitelyal men li pa lakòz okenn endiksyon Mx1 ak chanjman nan replikasyon viral. Pou atribiye efè a obsève ak medya kondisyone nan IFN I, supernatant la te konbine avèk yon inibitè JAK1/2, bloke endiksyon Mx1, epi li pa te gen okenn efè sou replikasyon viral. Piske entèraksyon diferan kalite selil yo nan yon poumon imen an pi konplèks epi yo pa kapab konplètman imite pa medya kondisyone, nou pwolonje apwòch nou an nan seksyon solid nan tisi distal nan poumon imen, ki te lajman itilize pou etid sou entèraksyon lame-patojèn ki gen ladan. viris grip ak enfeksyon bakteri [38-41]. Kontrèman modèl yo itilize in vitro, ansyen tisi nan poumon moun vivan kenbe achitekti ki genyen twa dimansyon nan poumon an epi li pèmèt yon entèraksyon fizyolojik nan mitan kalite selil rezidan yo nan poumon, men li manke posiblite pou aflu plis selil iminitè rekrite. Enfeksyon konsekitif nan KpOMV-stimile PCLS ak IAV diminye chaj viral la konpare ak kontwòl ki pa pre-trete. Kòm tout AEC yo teste an vitro pa t 'reponn a eksitasyon vesik bakteri dirèk, nou ipotèz ke nan modèl ansyen vivo sa a, AM yo se kalite selil ki reponn dominan. Depi yo te chwazi yon izole grip pou enfeksyon ki vin apre a ki sèlman enfekte ak repwodui nan AECs, li ka sipoze ke sa a se yon efè antiviral parakrin ki soti nan AMs ak transmèt nan AECs. Dapre done yo jwenn isit la, nou pwopoze modèl sa a (Fig. 8E): OMV ki soti nan bakteri gram-negatif ka aktive makrofaj imen nan yon fason klasik pro-enflamatwa ak anti-viral prime yo atravè TLR4 ak TRIF apre andositoz siksè nan la. vesik. IFN mwen lage ka nan vire rann makrofaj ak / oswa AECs antiviral atravè siyal IFNAR ak JAK / STAT. Enfeksyon ki vin apre nan selil sa yo lakòz yon diminisyon Mx1-nan chaj viral. Depi nou pa t 'gen aksè a AM prensipal imen, eksperyans yo te fèt lè l sèvi avèk BDM imen kòm yon modèl. Lè ou konsidere diferan orijin devlopman ak priming makwofaj sa yo, li posib ke AM yo ta montre yon repons pro-enflamatwa pi fèb kontrèman ak BDM yo. Vezik bakteri yo deja itilize nan estrateji vaksinasyon kont diferan patojèn ki pwovoke nemoni (revize nan [42]). Pakonsekan, OMV yo pa sèlman reprezante yon zouti pou potansyèl estrateji vaksinasyon sistemik kont bakteri lame yo, men yo ta ka itilize tou lokalman pou konbat enfeksyon viral lè yo aktive selil iminitè natirèl rezidan yo. Yo bezwen etid nan lavni an vivo pou teste si rezilta sa yo an vitro aplikab pou lòt patojèn viral. Anplis de sa, li ta dwe remake ke yon repons endotoksik posib yo dwe kontwole kritik pou evite repons iminitè ekzajere nan vivo. Endiksyon IFN tip I bezwen byen kontwole, jan yo te montre nan moun ki an sante yo te byen tolere rale yon agonist TLR7 okòmansman apre premye dòz la, men li te lakòz yon ogmantasyon repons TNF ak IFN I ak sentòm grip la. , apre yon dezyèm dòz [43]. Pou konbat efè negatif, vèsyon jenetikman modifye nan OMV yo ka bezwen, pwovoke yon repons iminitè ekilibre epi reyalize bon aplikasyon. Ansanm, nou prezante yon modèl sou fason OMV yo ka pwovoke siyal antiviral nan makrofaj imen ak kijan sa ka itilize pou anpeche replikasyon IAV.

Fig. 8 KpOMV diminye replikasyon viris grip A nan tranch nan poumon moun koupe ak presizyon. Yo te enkube PCLS imen ak 1 µg/mL OMVs (Lp/Kp) pou 20 èdtan epi anplis enfekte ak grip A/California/04/2009(H1N1pdm) pou 48 èdtan. Inaktivasyon UV nan viris la te sèvi kòm yon kontwòl. Sitotoksisite te detèmine pa quantification LDH lage nan PCLS epi li montre an % konpare ak liz total. Ekspresyon B Mx1 te quantifye pa qPCR epi li prezante parapò ak RPS18 ak PCLS kontwòl ki pa trete. C CXCL10 lage te detèmine pa ELISA epi li montre nan ng/mL. D Replikasyon viral yo te detèmine pa tès plak epi li montre nan pfu/mL. Ba yo montre valè mwayen twa a senk replike byolojik + SEM. E Modèl pwopoze pou endiksyon iminite antiviral OMV nan poumon. Estatistik: 1-fason ANOVA (AC), Friedman-test (D); *p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; * compared to IAV infected, but not pre-treated PCLS, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=5

Referans

1. Kulp A, Kuehn MJ. Fonksyon byolojik ak byogenesis nan vesik manbràn ekstèn bakteri sekrete. Annu Rev Microbiol. 2010;64:163–84.

2. Ellis TN, Kuehn MJ. Virulans ak wòl iminomodulatwa nan vesik manbràn ekstèn bakteri. Microbiol Mol Biol Rev 2010;74(1):81–94.

3. Giordano NP, Cian MB, Dalebroux ZD. Eksteryè sekresyon lipid manbràn ak repons iminitè natirèl la nan bakteri gram-negatif. Enfekte Immun. 2020. https://doi.org/10.1128/IAI.00920-19.

4. Mancini F, et al. Vaksen OMV ak wòl agonist TLR nan repons iminitè. Int J Mol Sci. 2020. https://doi.org/10.3390/ijms21124416.

5. Hu G, Christman JW. Editoryal: macrophages alveolaire nan enflamasyon nan poumon ak rezolisyon. Avant Immunol. 2019;10:2275.

6. Grassin-Delyle S, et al. Wòl reseptè toll-like nan pwodiksyon cytokines pa makwofaj nan poumon imen. J Innate Immun. 2020;12(1):63–73.

7. Fèy enfòmasyon sou grip (sezon). 2018; https://www.who.int/news-room/ fact-sheets/detail/influenza-(seasonal)

8. Crotta S, et al. Kalite I ak tip III entèferon yo kondwi bouk anplifikasyon redondants pou pwovoke yon siyati transkripsyon nan epiteli Airway ki enfekte grip la. PLoS Pathog. 2013;9(11): e1003773.

9. Bals R, Hiemstra PS. Iminite natirèl nan poumon: ki jan selil epitelyal goumen kont patojèn respiratwa. Eur Respir J. 2004;23(2):327–33.

10. Helft J, et al. Selil dendritik CD103+ ki prezante kwaze yo pwoteje kont enfeksyon viris grip la. J Clin Invest. 2012;122(11):4037–47.

11. Ghoneim HE, Thomas PG, McCullers JA. Rediksyon nan makrofaj alveolatè pandan enfeksyon grip fasilite sipèfeksyon bakteri. J Immunol. 2013;191(3):1250–9.

12. Jung AL, et al. Legionella pneumophila-derive vesik manbràn ekstèn ankouraje replikasyon bakteri nan makrofaj. PLoS Pathog. 2016;12(4): e1005592.

13. Lindhauer NS, et al. Aktivite anti-bakteri nan yon defans Tribolium castaneum nan yon modèl enfeksyon in vitro nan Streptococcus pneumoniae. Virilans. 2019;10(1):902–9.

14. Danov O, et al. Lafimen sigarèt afekte popilasyon selil dendritik, fonksyon baryè epitelyal, ak repons iminitè a nan enfeksyon viral ak H1N1. Devan Med. 2020. https://doi.org/10.3389/fmed.2020.571003.

15. Matrosovich M, et al. Nouvo mwayen ki ba-viskozite kouvri pou tès plak viral. Virol J. 2006;3:63. 16. Neuhaus V, et al. Evalyasyon efè cytotoxik ak imunomodulateur sibstans ki sou nan tranch nan poumon moun koupe ak presizyon. J Vis Exp. 2018. https://doi.org/10.3791/57042. 17. Niehof M, et al. Izolasyon RNA soti nan tranch nan poumon koupe presizyon (PCLS) ki soti nan diferan espès. BMC Res Nòt. 2017;10(1):121.

18. Schulz C, et al. Makwofaj ki sòti nan THP-1-fè selil epitelyal nan poumon yo ipo-reponn a Legionella pneumophila - yon etid byoloji sistèm. Sci Rep 2017;7(1):11988.

19. Livak KJ, Schmittgen TD. Analiz de done ekspresyon jèn relatif lè l sèvi avèk PCR quantitative an tan reyèl ak metòd 2(-Delta Delta C(T)). Metòd. 2001;25(4):402–8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.

20. Haller O, et al. Mx GTPases: machin antiviral tankou dinamin nan iminite natirèl. Tandans Microbiol. 2015;23(3):154–63. 21. Anastasia M, et al. Tèminal C nan pwoteyin NS1 viris grip A/WSN/1933(H1N1) modil repons antiviral nan makwofaj imen ak sourit ki enfekte. J Gen Virol. 2015;96(8):2086–91.

22. Jager J, et al. Fizyon vesik manbràn ekstèn Legionella pneumophila ak sistèm manbràn ekaryotik se yon mekanis pou delivre faktè patojèn nan manbràn selil lame yo. Microbiol selilè. 2015;17(5):607–20.

23. Lammers AJ, et al. Wòl TLR2 nan repons lame a nemoni nemokòk nan absans larat la. BMC Enfekte Dis. 2012. https://doi. org/10.1186/1471-2334-12-139.

24. Mamat U, et al. Pwodiksyon pwoteyin san endotoksin—teknoloji ClearColi™. Metòd Nat. 2013;10:916.

25. Théry C, et al. Enfòmasyon minimòm pou etid vesik ekstraselilè 2018 (MISEV2018): yon deklarasyon pozisyon Sosyete Entènasyonal pou vesik ekstraselilè ak yon aktyalizasyon direktiv MISEV2014 yo. J Vezik Ekstraselil. 2018;7(1):1535750. https://doi.org/10.1080/20013078.2018. 1535750. 26. Bonnington KE, Kuehn MJ. Pwodiksyon vesik manbràn ekstèn fasilite renovasyon lps ak antretyen manbràn ekstèn nan salmonèl pandan tranzisyon anviwònman an. MBio. 2016. https://doi.org/10.1128/mBio. 01532-16.

27. Jasim R, et al. Analiz lipidomik nan vesik manbràn ekstèn ki soti nan izolasyon klinik klebsiella pneumoniae polymyxin-sansib ak rezistan. Int J Mol Sci. 2018. https://doi.org/10.3390/ijms19082356.

28. Olaya-Abril A, et al. Karakterizasyon vesik pwoteksyon ekstraselilè ki sòti nan manbràn ki pwodui pa Streptococcus pneumoniae. J Proteomik. 2014;106:46–60.

29. Kuhn T, Koch M, Fuhrmann G. Probiomimetics-lactobacillus nouvo imite mikropartikil montre efè anti-enflamatwa ak pwoteksyon baryè nan modèl gastwoentestinal. Ti. 2020;16(40): e2003158.

30. Mehanny M, et al. Vezik manbràn ekstraselilè strèptokok yo rapidman entènalize pa selil iminitè yo epi yo chanje lage sitokin yo. Avant Immunol. 2020;11:80.

31. Volgers C, et al. Wòl imunomodulateur pou vesik manbràn ki te pibliye pa macrophages THP-1 ak patojèn respiratwa pandan enfeksyon makwofaj. BMC Microbiol. 2017;17(1):216.

32. Ellis TN, Leiman SA, Kuehn MJ. Vezik manbràn ekstèn ki pwodui natirèlman nan Pseudomonas aeruginosa lakòz yon repons iminitè natirèl ki pisan atravè deteksyon konbine tou de lipopolysakarid ak eleman pwoteyin. Enfekte Immun. 2010;78(9):3822–31.

33. Alaniz RC, et al. Vezik manbràn yo se faks imunojèn nan Salmonella typhimurium ki pisan aktive selil dendritik, premye repons selil B ak T, epi ankouraje iminite pwoteksyon an vivo. J Immunol. 2007;179(11):7692–701.

34. Watanabe S, Kumazawa Y, Inoue J. Lipopolysaccharide lipozomal inisye chemen siyal TRIF ki depann de CD14. PLoS YONN. 2013;8(4): e60078.

35. Fransen F, et al. Efè diferans TLR2 ak TLR4 sou repons iminitè a apre vaksen ak vaksen kont Neisseria meningitidis oswa Bordetella koklich. PLoS YONN. 2010;5(12): e15692.

36. Travanty E, et al. Sensibilite diferan nan selil prensipal nan poumon moun nan viris grip H1N1. J Virol. 2015;89(23):11935–44.

37. Mubarak RA, et al. Konparezon repons pro- ak anti-enflamatwa nan pè selil epitelyal prensipal moun ak makrofaj alveolè. Respir Res. 2018;19(1):126.

38. Wu W, et al. Repons iminitè natirèl nan enfeksyon viris grip H3N2 ak H1N1 nan yon modèl kilti ògàn nan poumon imen. Viroloji. 2010;396(2):178–88.

39. Wu W, et al. Grip A(H1N1)pdm09 viris siprime repons antiviral natirèl RIG-I inisye nan poumon imen an. PLoS YONN. 2012;7(11): e49856.

40. Delgado-Ortega M, et al. Repons iminitè natirèl nan yon viris grip pòsin subtip H3N2 nan selil trachea pòsin ki fèk fèt, makrofaj alveolatè, ak tranch nan poumon koupe ak presizyon. Vet Res. 2014;45:42.

41. Kolbe U, et al. Endiksyon cytokine bonè sou enfeksyon pseudomonas aeruginosa nan tranch nan poumon ak presizyon murin depann sou deteksyon viabilite bakteri. Avant Immunol. 2020. https://doi.org/10.3389/fmmu. 2020.598636.

42. Jung AL, et al. Wòl nan klinik lame ak bakteri ki sòti nan vesik ekstraselilè nan nemoni. Adv Drug Deliv Rev. 2021. https://doi.org/10. 1016/j.addr.2021.05.021.

43. Delaney S, et al. Tolerabilite nan moun apre dòz rale nan agonist TLR7 selektif la, AZD8848. BMJ Open Respir Res. 2016;3(1): e000113.