CAR-netrofil medyatè akouchman nan timè nan mikroanviwònman reponn nanomedikaman pou glioblastoma chimyo-iminoterapi

Glioblastoma (GBM) se youn nan timè solid ki pi agresif ak letal nan imen. Pandan ke terapetik efikas, tankou émergentes reseptè antijèn chimerik (CAR)-T selil ak chimyoterapi, yo te devlope pou trete divès kalite kansè, efikasite yo nan tretman GBM te anpeche lajman pa baryè san-sèvo ak san-sèvo-timè baryè. Netrofil imen yo efektivman travèse baryè fizyolojik yo epi montre iminite efèktè kont patojèn, men tan lavi kout ak rezistans nan koreksyon genòm nan neutrofil prensipal yo te limite aplikasyon laj yo nan imunoterapi. Isit la nou jenetikman enjenyè selil souch pluripotant imen ak CRISPR/Cas9-knock-in jèn medyatè pou eksprime divès kalite konstriksyon CAR anti-GBM ak T-espesifik CD3ζ oswa domèn siyal espesifik neutrofil. CAR-neutrophils ak pi bon aktivite anti-timè yo pwodui pou espesyalman ak noninvasively delivre ak lage timè microenvironment-reponn nano dwòg yo vize GBM san yo pa bezwen pwovoke enflamasyon adisyonèl nan sit timè yo. Chimyo-iminoterapi konbinezon sa a montre aktivite anti-GBM siperyè ak espesifik, diminye livrezon dwòg ki pa sib, ak pwolonje lavi nan sourit fi ki gen timè. Ansanm, sistèm livrezon dwòg byomimetik CAR-netrofil sa a se yon platfòm ki an sekirite, ki pisan ak versatile pou trete GBM ak pètèt lòt maladi devaste.

Benefis cistanche tubulosa-Antitumor

Glioblastoma (GBM) karakterize pa yon to mòtalite segondè, yon lavi kout, ak yon move pronostik ak yon tandans segondè nan repetition1,2. Efikasite terapetik tou de operasyon ak chimyo-dwòg yo prensipalman anpeche pa estrikti nan sèvo amann ak baryè san-sèvo fizyolojik (BBB) ​​oswa baryè san-sèvo-timè (BBTB)3-5. Patikilyèman, livrezon dwòg nan sistèm nève santral la (CNS) pou trete timè nan sèvo trè difisil:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

Iminite natirèl netrofil yo ak plastisit kont divès kalite kansè12–16, ki gen ladan GBM, yo te mwens eksplore pase aplikasyon yo kòm transpòtè selil nan livrezon dwòg8–10. Sikile netrofil nan san an lakay yo nan microenvironment timè ipoksik (TME), kote yo vin etewojèn timè-asosye neutrophils (TANs), yon eleman esansyèl nan imunosuppressive TME ki kontribye nan pwogresyon kansè ak rezistans terapetik12,17. Menm jan ak makrofaj, yo te jwenn fenotip anti-timè N1 ak pro-timè N2 nan TAN nan TME18-21 ipoksik la. Yo te devlope plizyè estrateji ki ka geri pou dirèkteman vize netrofil ak yon konsantre sou rediksyon oswa anpèchman netrofil12,22, ki mennen nan plizyè esè klinik (egzanp, CCR5 inhibitor Maraviroc nan NCT03274804). Kidonk, aplikasyon dirèk netrofil ki pa trete kòm yon nanopòtè ka poze yon risk adisyonèl pou pasyan kansè nan kote netrofil trafik dwòg yo ka repwograme nan fenotip N2 pro-timè imunosuppressive nan TME apre yo fin ale nan sit timè13,23. Anplis de sa, yo ta dwe eksplore ak ranfòse aktivite anti-timè yo nan netrofil nayif pou reyalize yon efikasite terapetik optimize lè yo itilize kòm yon konpayi asirans dwòg nan konbinezon ak chimyoterapi.

Benefis cistanche tubulosa-ranfòse sistèm iminitè

Modifikasyon reseptè antijèn chimerik (CAR) te siyifikativman amelyore aktivite anti-timè nan selil T iminitè oswa selil asasen natirèl (NK)24–27. Sepandan, efikasite yo nan timè solid toujou limite akòz trafik relativman ba yo ak kapasite pénétration timè yo. Prezans fizyolojik BBB ak BBTB plis anpeche efikasite sa yo terapetik émergentes kont GBM nan sèvo a. Nou te espekile ke konbinezon an nan jeni CAR ak netrofil trè mobil ta ka kenbe fenotip anti-timè N1 yo epi yo bay ekselan efikasite terapetik nan trete GBM. Netrofil prensipal yo dire kout epi yo reziste nan koreksyon genòm28, sa ki limite aplikasyon yo nan iminoterapi ki dirije CAR. Selil souch pluripotent imen (hPSCs), ki pi aksesib a koreksyon jèn epi ki kapab diferansye nan netrofil masiv, ta ka bay yon sous san limit nan bon jan kalite CAR-netrofil pou iminoterapi vize anba kondisyon chimik defini, kseno-gratis29. Neutrophils tou preferansyèlman phagocytose patojèn mikwòb ak sifas ki graj oswa long, tankou S. aureus ak E. coli30, ki ta dwe pran an kont pou konsepsyon nanopartikul nan livrezon dwòg netrofil-medyatè. Vreman vre, Safari et al. dènyèman rapòte fagositoz la pi pito nan patikil long ki administre nan venn, san yo pa modifikasyon sifas konplike, pa sikile neutrophils30. Yon konsepsyon fasil ak byoenspire nan nanopartikil ki chaje ak dwòg ka maksimize chaj dwòg nan netrofil epi pèmèt nivo ki ka geri nan livrezon dwòg nan sit vize.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20% nan nanodrog yo administre yo delivre nan timè nan sèvo pa CAR neutrophils konpare ak 1% nan nanomedikaman gratis. An rezime, sistèm livrezon dwòg byomimetik CAR-netrofil nou an se yon platfòm ki an sekirite, ki pisan ak versatile pou trete GBM ak lòt maladi devaste.

Benefis cistanche tubulosa-Antitumor

Rezilta yo

Depistaj estrikti CAR espesifik pou neutrofil pou aktivite anti timè amelyore

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%, ak majorite klon vize yo eterozigòt (figi siplemantè 1a-d). Ekspresyon CAR sou hPSCs Enjenieri te konfime plis pa RT-PCR ak analiz sikometri koule nan CLTX-IgG4 (figi siplemantè 1e-g). Kòm espere, hPSC ki eksprime CAR yo te kenbe nivo ekspresyon segondè nan makè pluripotent, ki gen ladan OCT4, SSEA4, ak SOX2 (figi siplemantè 1f).

Pou pwodwi de novo CAR-neutrophils, hPSCs ki eksprime CAR yo te premye diferansye nan miltipotan ematopoyetik ak Lè sa a, myeloid progenitors ak etap-espesifik tretman cytokine35 (Fig. 2c). Travay ki vin apre nan G-CSF ak agonist asid retinoik AM580 ankouraje pwodiksyon netrofil gaya36. Menm jan ak tokay yo nan san periferik (PB), netwofil CLTX-CAR ki sòti nan hPSC prezante mòfoloji netwofil tipik ak makè sifas CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b, ak CD18 (figi siplemantè 2). Apre sa, nou te detèmine efè ekspresyon CAR sou sitotoksisite anti timè netwofil hPSC ki sòti nan ko-kilti yo ak selil U87MG glioblastoma (GBM) an vitro. Kòm espere, hPSC-sòti CLTX-CAR netrofil prezante amelyore kapasite pou touye timè yo konpare ak PB neutrophils (Fig. 2d), ki konsistan avèk obsèvasyon anvan yo nan CLTX CAR-T cells27. Pami diferan CAR sa yo, CAR #1 te medyatè aktivite siperyè pou touye timè nan hPSC-netrofil yo. Miyò, -chèn ki baze sou CAR #4 se pi piti efikas nan deklanche neutrofil-medyatè timè-touye, ki ka akòz kopi ki pi ba nan ITAM nan pase ζ-subunit ak pi ba ekspresyon nan CARs ki bay sou sifas selil la28. Neutrophils lage espès oksijèn reyaktif citotoksik (ROS) ak faktè nekwoz timè- (TNF-) pou touye selil sib yo. Pwodiksyon ROS ak TNF- (Fig. 2e, f) soti nan diferan neutrophils te kowenside byen ak ogmante sitoliz yo. Kòm espere, pwodiksyon an nan ROS ak TNF- soti nan netrofil diferan apre coculturing ak nòmal SVG p12 selil glial rete osi ba ke gwoup la kontwòl negatif (Siplemantè Fig. 3a, b). Anplis de sa, sitotoksisite anti-timè amelyore nan CAR-netrofil yo te sèlman obsève nan ko-enkubasyon ak selil GBM, ki gen ladan U87MG, prensipal GBM43 adilt, ak selil SJ-GBM2 pedyatrik (Siplemantè Fig. 3c), ki demontre espesifik espesifik CLTX nou an. -MACHIN. Miyò, netrofil CAR yo te montre gwo byokonpatibilite ak selil glial nòmal SVG p12, hPSCs, ak selil ki sòti nan hPSC (Siplemantè Fig. 3d), ki konsistan avèk yon obsèvasyon anvan ke neutrofil prensipal inaktive pa touye selil ki an sante16. Ansanm, hPSC-sòti CAR neutrophils, patikilyèman CD3ζ-pote CAR-neutrophils, te pwezante améliorée anti-timè cytotoxicity ak pwodwi plis ROS ak TNF- in vitro, en potentiel yo nan imunoterapi vize.

Figi 1|Chema efikasite anti-glioblastom amelyore lè l sèvi avèk imunoterapi konbinatwa nan CAR-neutrophils ak timè microenvironment reponn nano-dwòg. Selil souch pluripotent imen yo te enjenyè ak CARs ak diferansye nan CAR-neutrophils ki chaje ak nanopartikul silica ki graj (SiO2 NPs) ki gen tirapazamine ki vize ipoksi (TPZ) oswa lòt dwòg, kòm yon imunochimoterapi doub. b CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NP yo administre sistemikman premye atake selil timè nòrmoksik ekstèn yo lè yo fòme sinaps iminolojik epi touye selil timè yo atravè fagositoz. Apre apoptoz, CAR-netrofil yo ka lage R-SiO2-TPZ NP, ki depase pa selil timè yo. Apre sa, nano-prodrogs reponn a microenvironment timè hypoxic ak efektivman touye selil timè yo. TEOS tetraethyl orthosilicate, BTES bis[3-(triethoxysilyl) propyl] tetrasulfide, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinyl.

CAR-neutrophils soutni aktivite siperyè anti-timè anba mikwo-anviwònman timè imunosuppressive

Menm jan ak makrofaj yo, yo te jwenn fenotip anti-timè N1 ak pro-timè N2 nan neutrofil ki asosye ak timè nan mikwo-anviwònman timè imunosuppressive17 la. Pro-timè N2 netrofil jwe wòl enpòtan nan anjojenèz timè, metastaz, ak imunosuppresyon, men vize ki ka geri nan kalite selil sa a te difisil.

Olye ke yon estrateji rediksyon sistemik22, isit la nou evalye potansyèl CAR-Engineering nan soutni fenotip anti-timè netrofil yo. CAR hPSC-sòti ak PB neutrophils yo te trete ak ipoksi (3% O2) ak TGF, ki kontribye nan imunosuppression nan mikro-anviwònman timè37,38, pou evalye aktivite soutni timè-touye yo. Pandan ke PB neutrophils prezante siyifikativman diminye sitoliz kont selil GBM nan kondisyon imunosuppressive, CAR-neutrophils soutni gwo aktivite pou touye timè (Siplemantè Fig. 4a). Obsèvasyon menm jan an te fè tou nan lage TNF ak jenerasyon ROS (Siplemantè Fig. 4b, c) soti nan PB oswa CAR-neutrophils anba kondisyon imunosuppressive ak nòmal. Pou plis konfime fenotip netrofil nan kondisyon ipoksik ak TGF, nou mezire ekspresyon N1-iNOS espesifik ak N2- N{2- arginase espesifik sou netrofil izole yo pa sikometri koule (figi siplemantè. 4d–f). Konpare ak normoksi, ipoksi imunosuppressive, ak TGF siyifikativman diminye nivo ekspresyon iNOS ak ogmante nivo arginase nan PB neutrophils, tandiske neutrophils CAR kenbe nivo ekspresyon segondè nan iNOS. Etid anvan yo endike deklanchman chemen siyal Syk-Erk mennen nan pwodiksyon ROS39-42. Se poutèt sa, nou te detekte ak konpare deklanchman Syk-Erk nan netwofil ki pa modifye ak CAR-neutrophils, ak rezilta nou yo sijere yon aktivasyon siyifikativman pi wo nan chemen Syk-Erk nan CAR-neutrophils anba ipoksi (figi siplemantè 5a-d), ki ka kenbe. pwodiksyon ROS ki pa chanje nan CAR-neutrophils anba ipoksi. Ansanm, CAR-neutrophils soutni yon fenotip anti-timè epi kenbe gwo aktivite anti-timè anba timè mikro-anviwònman imite kondisyon an vitro, mete aksan sou potansyèl yo nan imunoterapi vize.

Figi 2|Depistaj estrikti reseptè antijèn chimerik (CAR) espesifik neutrofil yo ak aktivite anti-timè améliorée. yon Chema divès estrikti CAR. b Chema konstriksyon CAR #1 ak estrateji knock-in vize nan plas AAVS1 safe harbour nan selil souch pluripotent imen (hPSCs). Flèch vètikal la endike sgRNA ki vize AAVS1 la. Flèch orizontal wouj ak ble endike primè pou analize efikasite vize ak omozigozite, respektivman. HDR: Reparasyon recombination homologue. c Schema diferansyasyon optimize netrofil soti nan hPSC nan kondisyon chimik defini. d Yo te fè tès sitotoksisite kont selil glioblastom U87MG nan diferan rapò sib neutrofil-a-timè lè l sèvi avèk netrofil ki endike yo. Done yo reprezante kòm mwayèn ± SD nan senk replike byolojik endepandan, tès t Student a de ke. Yo te detèmine jenerasyon espès oksijèn reyaktif (ROS) (e) ak analiz ELISA sou liberasyon TNF (f) ki soti nan diferan neutrofil apre yo fin fè kokilti ak selil U87MG. n=5 echantiyon byolojik endepandan. Done yo reprezante kòm mwayen ± SD, tès t Student a de ke. Done Sous yo bay kòm yon dosye Done Sous.

Preparasyon ak karakterizasyon hPSC CAR-neutrophils chaje ak tirapazamine (TPZ) ki gen nanopartikil SiO2

PB netrofil yo te itilize kòm transpòtè selilè pou delivre D ak dwòg ki ka geri nan timè nan sèvo8-10, menm si enfiltrasyon netrofil vize mande pou operasyon-oswa limyè-pwovoke enflamasyon ak livrezon dwòg ki pa sib ka yon enkyetid11. Pou amelyore plis aktivite anti-timè nan CAR-neutrophils, nou prepare nanopartikil silica (SiO2-NP) ak yon sifas ki graj oswa lis pou chaje dwòg chimyoterapi oswa radyasyon nan netrofil. Imaj mikwoskòp elèktron transmisyon (TEM) te demontre ke tou de nanopartikil SiO2 yo te byen gaye epi yo te montre mòfoloji esferik ak yon gwosè inifòm (figi 3a, Figi siplemantè 6a). Analiz distribisyon konpozisyon atravè optik TEM (STEM) ak espektroskopi X-ray enèji ki gaye (EDS) te montre ke eleman souf (S) la te distribye respire nan tout nanopartikil SiO2 ki graj (R-SiO2) (Fig. 3b). Sèvi ak izotèm adsorption-desorption nitwojèn (N2) ak analiz distribisyon gwosè pò ki koresponn, gwosè pò yo nan R- ak SSiO2 NP yo te mezire kòm 25 nm ak 35 nm (figi 3c, Figi siplemantè 6b), respektivman. Bay zòn nan sifas ki wo ak gwo gwosè pò, dwòg ki ka geri ou ka efektivman chaje nan tou de R- ak S- SiO2 NPs, jan egzanplè pa ipoksi-reponn pro-dwòg tirapazamine (TPZ) (Fig. 3d, Figi siplemantè 6c) . Apre loading TPZ, chanjman enpòtan yo pa te obsève nan dispèsyon, mòfoloji, ak gwosè R-SiO 2- TPZ lè l sèvi avèk TEM ak analiz dinamik gaye limyè (Siplemantè Fig. 6d, e). Lyezon tetra-sulfid ki enkòpore nan R-SiO2 NP yo sansib nan anviwònman rediksyon epi yo ka rapidman degrade pa gwo kantite glutatyon (GSH) ki prezan nan selil timè yo43. Apre sa, nou te detèmine degradabilite GSH ki reponn nan R-SiO2-TPZ NPs nan prezans 10 mM, 1 mM, ak 10 μM GSH, ki te menm jan ak kondisyon entraselilè selil kansè yo, selil nòmal, ak anviwònman ekstraselilè43, respektivman. Apre tretman 10 mM GSH, estrikti inisyal esferik R-SiO2-TPZ NPs te detwi anpil apre 24 èdtan (figi siplemantè 6f, g). Nanopartikil yo te konplètman dezentegre nan ti debri apre 48 èdtan, sa ki lakòz lage TPZ nan yon fason GSH-reponn (figi 3e). Debri yo nan R-SiO2 NPs pa t 'kòz okenn sitotoksisite enpòtan nan selil yo teste an vitro (Siplemantè Fig. 6h), ki endike sekirite relatif la nan R-SiO2 NPs.

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity

【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Apre sa, nou te evalye posibilite pou itilize SiO2-TPZ NPs pou chaje dwòg terapetik nan CAR-neutrophils kòm yon chimyoimmunoterapi konbinatwa pou reyalize efikasite terapetik ranfòse. Apre santrifijasyon, nou mezire absorption selilè nan SiO2-TPZ NPs pa netrofil lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fluoresans ak analiz sikometri koule (Fig. 3f, g), epi detekte yon absorption selilè ki pi enpòtan nan R-SiO2-TPZ NP pase S-SiO2- TPZ NP pa netrofil. Selilè Si kontni nan neutrophils te mezire kòm 11.3 ak 19.1 ng Si/ug pwoteyin pou lis ak ki graj SiO2 NPs@TPZ (Fig. 3h), respektivman, pa endiktif makonnen espektrometri mas plasma (ICP-MS). Bay gwo kapasite chaje yo nan neutrophils, R-SiO2-TPZ NP yo te anplwaye pou eksperyans ki vin apre yo. Lè sa a, nou t'ap chache teste fonksyon fizyolojik netrofil CAR apre yo fin chaje R-SiO2-TPZ NPs. Pa gen okenn chanjman yo te obsève nan viabilite selil (Fig. 3i, Fig. Siplemantè 6i), kapasite migrasyon transwell (Fig. 3j), chemotaxis, ak vitès korespondan (Fig. 3k, l) nan CAR-neutrophils anvan oswa apre chaje R-SiO2. –TPZ NPs, demontre gwo biocompatibility yo. Te analiz tan-depandan nano-dwòg loading tou fèt ak kontni an chaj maksimòm rive nan 1 h apre enkubasyon selil-NP (Siplemantè Figi 7a). Plis pase 95% CAR-netrofil yo te chaje avèk siksè ak R-SiO2-TPZ NPs (figi siplemantè 7b). Nivo ekspresyon CD11b, yon pwoteyin sifas netrofil ki medyatè adezyon ak fonksyon migrasyon sou eksitasyon molekil enflamatwa, pa te chanje sou CAR-neutrophils avèk oswa san chaj R-SiO 2- TPZ (figi siplemantè 7c, d). Superoksid oswa espès oksijèn reyaktif (ROS) yo lage nan netrofil aktif pou touye mikwòb ak selil timè44. Kòm espere, jenerasyon ROS pa CAR-neutrophils te ogmante siyifikativman apre tretman N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP), ak diferans enpòtan yo pa te obsève nan pwodiksyon ROS pa CAR-neutrophils anvan ak apre chaje R-SiO 2- TPZ (figi 3m). Ansanm, done nou yo te demontre ke R-SiO2-TPZ chaje CAR-netrofil kenbe aktivite fizyolojik netrofil sovaj yo epi yo ka aktivman imigre nan direksyon estimilis enflamatwa, mete aksan sou potansyèl yo nan kimoiminoterapi kansè vize.

CAR-neutrophils chaje ak R-SiO2-nanopartikil TPZ efektivman touye selil glioblastom

Apre sa, nou te evalye efè R-SiO2-TPZ sou kapasite CAR-neutrophils pou touye timè yo. Entèraksyon entim efèktè-sib se te yon avantou pou cytolysis netrofil-medyatè. Kòm espere, CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ te fòme sinaps iminitè ak selil timè yo nan 2 èdtan epi yo te montre nimewo entèraksyon efèktè-sib ki sanble ak CAR-neutrophils san dwòg (figi 4a, Figi siplemantè 8) . Miyò, yo pa jwenn okenn entèraksyon obsèvab ant CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ ak selil somatik ki pa kansè (figi siplemantè 8), ki mete aksan sou espesifik CLTX-CAR kont timè nan sèvo. Anplis de sa, R-SiO2-TPZ NP yo te lage nan netrofil nan mwayen kilti a (figi siplemantè 9a, b) 12 èdtan apre ko-kilti ak antre nan selil timè ki rete yo (figi 4a). Vennkat èdtan apre ko-enkubasyon nan SiO2-TPZ NP-chaje CAR-neutrophils ak selil timè, jiska 95% nan selil timè ki genyen R-SiO2-TPZ NPs (figi 4a, Figi siplemantè 9c), ki endike yon siksè. kaskad transpò ki enplike netrofil transpòtè ki egzèse fonksyon selil efèktè yo epi sibi apoptoz, kidonk lage pasif R-SiO2-TPZ NP nan selil timè yo sib45. Nou menm tou nou valide fonksyon repons ipoksik ak sitotoksisite pro-dwòg TPZ nan selil timè yo pa analiz spektroskopi elèktron paramayetik (EPR) nan jenerasyon radikal soti nan TPZ (Siplemantè Fig. 9d) ak analiz sikometri TOPRO-3 sou timè. selil (figi siplemantè 9e) anba ipoksi ak normoksi. Pou detèmine cytolysis R-SiO2-TPZ NP-chaje CAR neutrophils, nou aplike yon modèl rechallenging nan vitro normoxia-hypoxia timè (Fig. 4b). Vennkat èdtan apre kokilti normoxic, CAR-neutrophils chaje ak R-SiO2-TPZ NPs oswa ou pa montre sitotoksisite anti-timè ki sanble (figi 4c), ak tou de te pi wo pase sa yo ki nan PB-neutrophil chaje ak R. -SiO2-TPZ NPs oswa ou pa ak R-SiO2- TPZ NPs pou kont li. Sitotoksisite amelyore a se sitou akòz ogmante kapasite netrofil yo pou sibi timè apre jeni CAR. Apre yon lòt 12 ak 24-h kokilti ipoksik ak selil timè yo, R-SiO2- TPZ NP-chaje CAR-neutrophils parèt siperyè kapasite anti-timè konpare ak lòt gwoup (figi 4d, e). Anplis de sa, netrofil CAR ki chaje ak R-SiO2-TPZ NPs te montre ekselan sitoliz kont re-semenn selil timè fre (figi 4f), ki endike kapasite anti-timè R-SiO2-TPZ lage. nanopartikil apre apoptoz netrofil.

Lè sa a, nou te fè analiz RNA sekans (RNA-seq) sou selil timè yo elicide potansyèl mekanis molekilè ki kache ranfòse sitoliz anti-timè nan netrofil pa ekspresyon CAR ak R-SiO2-TPZ NPs. Analiz ekspresyon jèn yo te demontre ke konpare ak kontwòl ak R-SiO2-TPZ NPs, CAR-neutrophils chaje ak oswa san R-SiO2-TPZ NPs siyifikativman diminye ekspresyon sitoplasm ak jèn manbràn nan selil timè yo ( Figi siplemantè 10a, Fig. 4g), plis sipòte fagositoz yo nan selil timè yo sou kokilti. Pandan ke tout gwoup eksperimantal ogmante estrès oksidatif selilè nan selil timè yo, R-SiO2-TPZ-chaje CAR-neutrophils depase lòt gwoup nan deklanche siyal estrès oksidatif. Anplis de sa, R-SiO2-TPZ-chaje CAR-neutrophil siyifikativman ankouraje apoptoz ak diminye pwopagasyon nan selil timè yo. Pou nou konprann plis aktivite anti-timè R-SiO2-TPZ-chaje CAR-neutrophils, nou te aplike yon fagocytosis inhibitor cytochalasin D ak yon espès oksijèn reyaktif (ROS) scavenger N-acetyl-cysteine ​​(NAC) ak yon inibitè ROS GSK2795039 nan kokilti timè-netrofil. Cytolysis nan selil timè pa CAR-neutrophils te siyifikativman redwi pa 5 μM cytochalasin D, 5 mM NAC, ak 100 nM GSK2795039 (Siplemantè Fig. 10b, c), ki endike wòl nan enpòtan nan fagositoz ak ROS nan CAR neutrophil-medyatè timè-selil. touye. Rès 40% -50% liz selil timè a nan prezans neutrofil ak NAC oswa GSK2795039 endike patisipasyon mekanis endepandan ROS nan touye timè netwofil-medyatè ki vo plis envestigasyon.

Figi 3|Preparasyon ak karakterizasyon hPSC CAR-neutrophils chaje ak tirapazamine (TPZ) ki gen nanopartikul SiO2. a–e Transmisyon mikwoskòp elèktron (TEM) (a) ak espektroskopi dispèsyon enèji (EDS) imaj kat eleman (b) nan nanopartikil ki graj SiO2 yo montre. c Azòt adsorption-desorption izotèm ki graj SiO2 nanopartikul ansanm ak Barrett-JoynerHalenda (BJH) pore distribisyon trase yo montre. Yo te fè triple byolojik poukont yo. Kontni chaje TPZ nan SiO2 nanopartikil (d) ak glutatyon (GSH) --reponn TPZ lage (e) yo te mezire nan moman ki endike a. n=3 echantiyon byolojik endepandan. One-way analiz de divèjans (ANOVA) pou (e). Imaj fliyoresan (f) ak analiz sikometri koule (g) nan netrofil chaje ak SiO2-TPZ lis ak ki graj. Yo te fè triple byolojik poukont yo. h Yo te mezire kontni SiO2 selilè nan CAR-neutrophils ki sòti nan hPSC. n=5 echantiyon byolojik endepandan, tès t Student a de ke. Viabilite selilè (i), n=3 echantiyon byolojik endepandan, transmigrasyon (j), n=5 echantiyon byolojik endepandan, kapasite chimyoatraksyon (k, l), n=20 echantiyon byolojik endepandan, ak Yo te montre kapasite jenerasyon ROS (m) nan CAR-neutrophils ki sòti nan hPSC ki chaje ak oswa san ki graj SiO2-TPZ, n=5 echantiyon byolojik endepandan, tès t Student de-ke. PMA: Phorbol myristate acetate. Tout done nan figi sa a reprezante kòm mwayen ± SD. Done Sous yo bay kòm yon dosye Done Sous.

Evalyasyon fonksyonèl nan CAR-netrofil chaje ak nano dwòg lè l sèvi avèk modèl byomimetik glioblastom nan vitro

Pou plis evalye aktivite yo nan R-SiO2-TPZ NP-chaje CAR-neutrophils, nou aplike yon modèl timè baryè san-sèvo (BBB) ​​ki baze sou transwell lè l sèvi avèk selil endothelial mikwovaskilè imen serebral (figi 5a, Fig siplemantè). . 11a). Kòm espere, R-SiO2-TPZ NP-chaje CAR-neutrophils te montre kapasite transmigrasyon ekselan atravè modèl BBB in vitro (figi 5b), efektivman touye selil timè vize apre transmigrasyon anba kondisyon normoxic ak ipoksik (figi 5c). , d), ak divilge plis cytokines enflamatwa (Fig. 5e) ki ka atire lòt selil efèktè yo touye selil timè yo. Anplis de sa, netrofil CAR pa t 'siyifikativman afekte viabilite nan selil andothelial apre transmigrasyon (Siplemantè Fig. 11b). R-SiO2-TPZ NP-chaje CAR-neutrophils kenbe ekselan kapasite transmigrasyon pandan dezyèm eksperyans transmigrasyon an (figi 5f) ak siperyè kapasite anti-timè konpare ak lòt gwoup (figi 5g). Lè sa a, yo te itilize yon modèl spheroid timè ki genyen twa dimansyon (3D) pou evalye kapasite pénétration timè R-SiO2-TPZ NP-chaje CAR-neutrophils (figi 5h). CAR-neutrophils piti piti imigre nan direksyon sant la nan spheroid timè a ak inifòm distribye nan spheroid la apre 8 h nan enkubasyon (Fig. 5i). Yo te obsève yon wo degre de ko-lokalizasyon ant CAR neutrophils ak R-SiO2-TPZ NPs (Siplemantè Fig. 12a-c), ki montre ke R-SiO2-TPZ NPs yo te enkapsule estab nan CAR la. -netrofil pandan enfiltrasyon timè anvan sitoliz yo. San yo pa livrezon netrofil, yo te jwenn NP R-SiO2-TPZ sèlman sou kouch deyò esferoyid timè yo. Konpare ak R-SiO2-TPZ NPs ak CAR-neutrophils, R-SiO2-TPZ NP-chaje CAR neutrophils ekspoze siperyè anti-timè cytolysis nan modèl timè 3D (figi 5j). CAR-neutrophils@R-SiO2 NP yo ka itilize tou pou delivre lòt dwòg, tankou temozolomid klinik (TMZ) ak JNJ - 64619187, nan modèl timè 3D epi touye selil GBM avèk efikasite (figi siplemantè 12d-f). Ansanm, netrofil yo CAR combinatory ak nano dwòg parèt ekselan aktivite anti-timè nan microenvironment timè biomimetic imite kondisyon an vitro, mete aksan sou potansyèl la terapetik nan chimyoimmunoterapi ki baze sou netrofil combinatory.

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Distribisyon nan vivo nan CAR neutrophil-delivery R-SiO2-TPZ nanoparticules

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20% nan nanomedikaman administre yo te lage nan timè nan sèvo pa CAR-neutrophils as compared to 1% nan nanodrugs gratis ki se ki konsistan avèk rapò anvan yo. Livrezon vize nan R-SiO2-TPZ NPs nan sèvo lame a atravè BBB pa CAR-neutrophils te konfime tou pa analiz histoloji (Fig. 6d). Okontrè, R-SiO2-TPZ NPs pou kont li sitou akimile nan fwa a ak nan larat. Ansanm, done nou yo demontre amelyore livrezon vize R-SiO2-TPZ NPs pa CAR neutrophils san yo pa bezwen pwovoke plis enflamasyon nan sit timè a, mete aksan sou posibilite ak sekirite nan chimyoimmunoterapi ki baze sou netrofil nan tretman kansè.

Chimyoimmunoterapi konbinatwa nan CAR-neutrophils ak R-SiO2-TPZ nanopartikul te montre ekselan aktivite anti glioblastom nan vivo.

Pou detèmine efikasite terapetik R-SiO2-TPZ NP-chaje CAR neutrophils, yon modèl xenograft in situ nan glioblastom te etabli nan sourit NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) lè l sèvi avèk selil luciferase eksprime U87MG. Sourit ki bay timè yo te administre nan venn 5 × 106 netrofil chak semèn (Fig. 7a), ak fado timè nan lame yo te mezire ak quantifier (Fig. 7b, c). Konpare ak sourit PBS oswa PB-netrofil-trete, tretman ak CAR-neutrophils ak CAR neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs efektivman ralanti kwasans timè. CAR neutrophils@R-SiO2–TPZ NPs te montre pi wo cytotoxicity anti-timè pase nenpòt lòt gwoup eksperimantal. Okontrè, PB-neutrophils siyifikativman ankouraje kwasans timè nan sèvo a, sa ki lakòz lanmò sourit ki gen timè osi bonè ke jou 23 (Fig. 7d), sijere ke netrofil san enjenyè ka poze risk adisyonèl. Nou pwochen mezire lage cytokine imen nan plasma diferan gwoup sourit eksperimantal (Fig. 7e). Tout gwoup eksperimantal ki pa PBS yo te pwodui TNF ak IL-6 ki detekte nan plasma a soti nan jou 5 rive nan jou 26, sa ki sijere deklanchman netrofil imen an sou eksitasyon timè. Konfòm ak to kwasans timè yo obsève, neutrofil ki pa modifye piti piti lage plis IL-6 ak TNF, sa ki ka mennen nan sendwòm lage cytokine nan pasyan yo epi ki ka mande plis etid sekirite apwofondi ak IL-6 blockers46,47. . Miyò, CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ NPs te parèt diminye kapasite pwodiksyon cytokine nan pwen tan pita (jou 19 ak jou 26), sijere yon risk potansyèlman ba nan sendwòm lage cytokine nan pasyan trete ak chimyoimmunotherapy ki baze sou CAR-neutrophil. Yo te evalye byokonpatibilite CAR-neutrophils combinatory ak R-SiO2-TPZ NPs atravè mezi chak semèn nan pwa kò ak siveyans nan chanjman patolojik nan ògàn pi gwo nan sourit. Pa gen okenn diferans obsève nan pwa kò ant CAR neutrophils@R-SiO2-TPZ NP-trete sourit ak nenpòt lòt gwoup eksperimantal (Fig. 7f), ki endike minimòm toksisite sistemik ak ekselan byokonpatibilite nan CAR-neutrophils@ R-SiO2-TPZ NPs nan 28 jou tretman. Analiz histolojik sou gwo ògàn ki te koupe nan sourit nan jou 30 te montre ke sourit CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ NP-trete pa t lakòz anòmal aparan oswa domaj nan ògàn nan kè, fwa, larat, poumon, ak ren (figi siplemantè. 13), plis konfime sekirite konbinatwa CAR-neutrophils ak R-SiO2-TPZ NPs.

Figi 4|CAR-neutrophils chaje ak nanopartikil R-SiO2-TPZ yo efektivman touye selil glioblastom yo. Imaj reprezantan nan sinaps imunolojik ki endike pa akimilasyon polarize F-aktin nan koòdone ant CAR-neutrophils ak selil timè nan 6, 12, ak 24 èdtan yo te montre. Selil timè yo te pran nanopartikil R-SiO2-TPZ ki te pibliye nan CAR-neutrophils sou fagositoz selil timè yo. Triple yo te fèt poukont yo. b Chema nan tès cytotoxisite anti-timè ki te medyatè nan neutrofil. Sitotoksisite kont selil glioblastom U87MG yo te fèt nan diferan rapò sib neutrofil-a-timè lè l sèvi avèk netrofil endike nan 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e), ak 72 h (f). n=3 echantiyon byolojik endepandan. Done yo reprezante kòm mwayen ± SD, yon sèl-fason analiz divèjans (ANOVA). g Yo te fè analiz sekans RNA Bulk sou selil U87MG nan divès kondisyon. Heatmap montre nivo ekspresyon nan sitoplasm chwazi, manbràn, estrès oksidatif, apoptoz, ak jèn ki gen rapò ak pwopagasyon nan selil glioblastom endike yo. n=2 echantiyon byolojik endepandan. Done Sous yo bay kòm yon dosye Done Sous.

Figi 5|Evalyasyon fonksyonèl nan CAR-neutrophils chaje ak R-SiO2-TPZ nanopartikul lè l sèvi avèk modèl biomimetic glioblastoma (GBM) nan vitro. yon Chema nan modèl timè in vitro nou an nan GBM ak san-sèvo-baryè (BBB), ki konpoze de selil andotelyal sou manbràn nan insert selil ak selil timè nan pati anba a nan menm transwell la. b Yo montre analiz migrasyon Transwell netrofil nan 12 èdtan. Anti-GBM cytotoxicity nan netrofil endike nan 24 h (c) ak 36 h (d) te mezire ak quantifier. Yo te fè analiz ELISA IL-6 ak TNF ki soti nan netrofil endike yo nan 36 èdtan. f Yo montre dezyèm migrasyon diferan netrofil nan 48 h. g Anti-GBM cytotoxicity nan netrofil endike nan 60 h te mezire ak quantifier. h-j Chema nan netrofil-enfiltre twa dimansyon (3D) modèl timè an vitro yo te montre nan (h). Yo te montre imaj fliyoresan reprezantan netrofil enfiltre nan modèl timè 3D yo. Yo te itilize DAPI pou tach nikleyè selil la epi CD45 te itilize pou tach netrofil yo. Ba echèl, 200 μm. Yo te fè triple byolojik poukont yo. j Yo te mezire kapasite korespondan pou touye timè yo nan netrofil ki endike yo epi yo te mezire lè l sèvi avèk yon twous sitotoksisite. Done yo reprezante kòm mwayen ± SD nan senk replike byolojik endepandan, analiz yon sèl-fason nan divèjans (ANOVA). Done Sous yo bay kòm yon dosye Done Sous.

Pandan ke CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs siyifikativman ralanti kwasans timè nan sourit xenograft, diferans lan nan siviv bèt nan gwoup eksperimantal nan CAR-neutrophils, SiO2-TPZ NPs ak CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs se ensiyifyan. (p > 0.05), ki posib akòz lanmò netrofil kout pandan preparasyon selil ak piki. Nou pwochen konsantre sou twa gwoup sa yo epi detèmine si redwi tan preparasyon selil yo ak ogmante dòz nan CAR-neutrophils ak nano dwòg ta fè nenpòt diferans nan siviv bèt (Fig. 7g). Lè yo te administre sistemikman 6 fwa, CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs depase de lòt gwoup yo nan pwolonje lavi sourit ki gen timè (figi 7h), tandiske diferans lan nan siviv bèt nan gwoup CAR-neutrophils ak SiO2-. TPZ NP yo te rete ensiyifyan. Pandan ke yo te obsève yon koub siviv menm jan an nan gwoup R-SiO2- TPZ a ant de etid endepandan bèt sa yo, redwi tan nan izolasyon selil ak preparasyon pou piki soti nan yon total de ~ 4 èdtan a 1 èdtan pandan 4 premye neutrofil yo. dòz yo te mennen nan amelyore siviv bèt nan gwoup CAR-neutrophil anvan jou 32. Kolektivman, done nou yo demontre enpòtans ki genyen nan preparasyon neutrophil ak optimize dòz nan aplikasyon klinik lavni nan terapetik neutrophil.

Diskisyon

Netrofil sourit yo te demontre kòm yon konpayi asirans pwisan pou delivre nanomedikaman avèk efikasite nan timè nan sèvo apre operasyon anflame8,9. Toujou, posibilite ak sekirite pou itilize netrofil imen nan livrezon dwòg rete flotant. Gwo kantite netrofil sourit (10 fwa pi wo pase kantite total netrofil sikile nan sourit11) yo itilize nan etid sa yo pou reyalize benefis ki ka geri ou ka plis anpeche tradiksyon klinik yo paske ekstraksyon gwo kantite netrofil nan pasyan kansè yo ka mennen nan neutropeni ak poze. lòt risk. Pou abòde defi sa yo, nou te pwofite pouvwa hPSC ki renouvle pwòp tèt yo nan jwenn netrofil imen de novo san limit29. Nou devlope yon pwisan sistèm livrezon dwòg netrofil-medyatè ak CAR-Engineering29 epi nou itilize enjenyè CAR-neutrophils imen kòm yon nanoportè ak aktivite anti-timè frape. NP SiO2 ki graj travay pi byen pase NP SiO2 lis nan transpòtè CAR-neutrophil, ki konsistan avèk obsèvasyon anvan yo ke neutrophils preferans fagocytose ki graj patojèn mikwòb30. Yo te rapòte netrofil yo ankouraje pwopagasyon ak pwogresyon selil gliyom48. Nou te obsève yon efè pro-timè ki sanble nan netrofil san modifye nan etid bèt nou an, mete aksan sou nesesite nan jeni CCAR oswa lòt modifikasyon nan netrofil asire sekirite yo nan livrezon dwòg ak lòt aplikasyon terapetik. Miyò, livrezon dwòg CAR-netrofil-medyatè nou an depann sèlman sou kapasite natif natal chimyo-attractant GBM, men se pa siyal enflamatwa apre operasyon anplifye yo, ki sijere gwo espesifik ak potansyèl terapetik nan sistèm livrezon dwòg nou an nan eradike gliom pwofondman enfiltre. ki pa ka retire pa operasyon. Depi reseksyon chirijikal ak chimyoterapi/radyoterapi adjuvant yo se entèvansyon prensipal klinik pou GBM12, tretman konbinezon ak CAR neutrophil nanocarriers ak operasyon/radyoterapi ka reyalize pi bon efikasite terapetik epi li vo plis envestigasyon. T ak NK selil-espesifik CAR konstwi yo te lajman itilize amelyore aktivite anti-timè nan selil T ak NK, men CARs neutrophil-espesifik ki amelyore fonksyon anti-timè nan neutrophils pa te dekri. Reseptè iminitè CD4ζ ak CD4 chimerik yo te deja rapòte amelyore sitoliz netrofil kont selil HIVenv-transfekte nan vitro. Toujou, efikasite lysis la te sèlman ~ 10% nan yon rapò efèktè-a-sib (E: T) nan 10:128. Fc RIIA (CD32a) se yon reseptè transmanbràn yon sèl chèn ki ba pou IgG monomerik ki trè eksprime nan netrofil (30,000 a 60,000 molekil/selil31), ak ligasyon li yo pwovoke Fc - fonksyon depandan nan netrofil yo, tankou liberasyon nan kontni granules, mobilizasyon Ca2+, sitotoksisite anti-timè, ak fagositoz49. Bay wòl enpòtan CD32a nan deklanchman ak fonksyon netrofil yo, nou fèt ak teste konstriksyon CAR ki baze sou CD32a. Sepandan, rezilta nou yo te demontre ke CD3ζ medyatè siyifikativman pi bon sitoliz pase CD32a lè yo eksprime nan netrofil hPSC ki sòti, ki ka an pati akòz kopi ki pi wo ITAM yo nan CD3ζ pase CD32a: twa ak yon sèl kopi, respektivman, ak pi wo nivo ekspresyon de. ζ pase sou sifas selil netrofil yo28. Menm jan ak CD32a, Fc RIII (CD16b) se yon lòt reseptè ki ba-affinite pou IgG monomerik epi li eksprime nan yon nivo pi wo pase CD32a sou netrofil31. Pandan ke kwazman nan CD16b sèlman pwovoke Ca2+ mobilizasyon ak degranulasyon, men se pa fagositoz ak sitoliz nan neutrophils28,50, li pral toujou nan enterè nan syans nan lavni fè yon konparezon sistematik sou kapasite yo nan CD3ζ- ak CD16b. -CARs nan deklanche ak amelyore fonksyon anti-timè nan neutrophils.

Figi 6|Distribisyon nan vivo nan CAR neutrophil-delivery R-SiO2-TPZ nanoparticules (NPs). yon Schema nan Cy5-ki gen etikèt CAR neutrophil@R-SiO2 NPs ak R-SiO2 NPs yo administre nan venn pou etid in vivo swiv selil. 5 × 105 luciferase (Luci)-eksprime selil U87MG yo te estereyotaktikman anjandre nan forbrain dwat sourit NRG yo. Apre 4 jou, sourit yo te trete nan venn ak PBS, 5 × 106 Cy5-ki make CAR neutrophil@R-SiO2 NPs ak R-SiO2 NPs. b Yo te detèmine biyodistribisyon Cy5+ netrofil Cy5+ ki depann de tan nan tout kò a, nan sèvo, ak lòt ògàn yo, epi yo te detèmine ak quantifye pa imaj fluoresans nan lè yo endike yo. c Byodistribisyon CAR neutrophil@R-SiO2 NPs ak R-SiO2 NPs nan sourit nan 24 èdtan apre piki te analize pa endiktif makonnen plasma-optik emisyon spèktrometri (ICP-OES) ki baze sou eleman Si, ak done yo te eksprime kòm pousantaj la nan dòz enjekte pou chak gram tisi (%ID/g). n=5 echantiyon byolojik endepandan. Done yo reprezante kòm mwayen ± SD. Done Sous yo bay kòm yon dosye Done Sous. d Yo te montre imaj fluoresans reprezantan CD45 ak SiO2 nan ksenograft glioblastom ki endike yo izole nan sourit ki gen timè. Ba echèl, 100 μm. Yo te fè triple byolojik poukont yo.

Figi 7|Nan vivo aktivite anti-timè nan konbinezon CAR-neutrophils ak R-SiO 2- nanopartikul TPZ (NPs) yo te evalye atravè piki nan venn. yon Chema PBS, PB-netrofil, CAR-neutrophils, ak CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs yo administre nan venn pou etid in vivo ki touye timè. 5 × 105 luciferase (Luci)-eksprime selil U87MG yo te estereyotaktikman anjandre nan forbrain dwat sourit NRG yo. Apre 4 jou, sourit yo te trete nan venn ak netrofil endike chak semèn pou yon mwa. Tan-depandan chay timè yo te detèmine (b) ak quantifier (c) pa D 'bioluminescent (BLI) nan jou ki endike yo. Done yo vle di ± SD pou sourit nan (b) (n=5), yon sèl-fason analiz divèjans (ANOVA). d Koub Kaplan-Meier ki montre siviv gwoup eksperimantal ki endike yo (n=5) te montre. Lage imen timè necrosis faktè- (TNF) ak IL-6 nan san an periferik (e) ak pwa kò (f) nan diferan gwoup sourit yo te mezire nan jou ki endike yo. Done yo vle di ± SD, n=5 echantiyon byolojik endepandan. g, h Yo te evalye aktivite anti-timè nan ogmante frekans dòz CAR-neutrophils ak RSiO2-TPZ NPs. g Chema nan CAR-neutrophils yo administre nan venn, R-SiO2-TPZ NPs, ak CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs pou etid in vivo touye timè. h Koub Kaplan-Meier ki montre siviv gwoup eksperimantal endike yo te montre (n=5). Yo te analize koub Kaplan-Meier pa tès log-rank la. Done Sous yo bay kòm yon dosye Done Sous.

Nou prezante tou isit la yon platfòm livrezon dwòg hPSC modilè ak versatile ki ka re-enjenieri ak branche alavni pou sipòte lòt efò ki baze sou netrofil pou trete lòt maladi imen. Premyèman, jeni CAR pi aksesib nan hPSCs pase nan selil T iminitè prensipal yo ak netrofil yo. Li mande sèlman yon sèl koreksyon genòm pou reyalize ekspresyon ki estab ak omojèn nan divès CARs29. Anplis CLTX machin yo, nou menm tou nou konstwi liy hPSC ki estab ki eksprime yon inivèsèl anti-fluorescein (FITC) 51 oswa anti-PD-L1 CAR52, tou de nan yo ta ka ekipe yo jwenn inivèsèl solid timè-sib nanocarrier CAR-neutrophils. Lòt modifikasyon jenetik, tankou fibwoz ki vize CARs anti-FAP53, kapab tou fèt pou dirije nanoportè netrofil yo pou trete maladi dejeneratif fatal, ki gen ladan chòk nan sèvo ak fibwoz kadyak. Anplis de sa, hPSCs ki eksprime CAR yo ta ka fasilman adapte tou pou pwodui selil CAR-T oswa CAR-NK29, ak konbinezon imunoterapi sa yo ak nanocarriers CAR-neutrophil ka reyalize pi bon benefis terapetik anti-timè. Finalman, sistèm nanomedikaman ki reponn bioinspired timè glutatyon (GSH) nou an se yon platfòm modilè ak versatile pou chaje dwòg chimyoterapi oswa radyo-aktif pwomèt nan CAR-neutrophils pou livrezon dwòg vize, jan sa montre nan klinik TMZ, JNJ64619187, ak pro-dwòg TPZ. Etid nan lavni sou tès lòt nanopartikul yo ka bay optimize chaj dwòg nan netrofil epi reyalize maksimòm efikasite terapetik nan vivo.

Pandan ke nou te demontre konsèp ki ka geri ou nan itilize CAR-netrofil yo espesyalman ak efikasite bay chimyo-dwòg nan timè nan sèvo atravè BBB, gen kèk limit nan etid sa a. Premyèman, 4-jou inokulasyon selil timè ka pa ase pou etabli timè ki imite senaryo klinik la pou envestigasyon terapetik, epi travay nan lavni ak diferan peryòd vaksinasyon timè nesesè pou rezime diferan etap devlopman glioblastom ak repons terapetik nan diferan. pasyan54,55. Dezyèmman, sourit iminodefisyan nou itilize isit la manke iminite adaptasyon, ak lòt modèl preklinik ak yon sistèm iminitè entak, tankou chen bèt kay ak glioma56 espontane, yo bezwen pi byen evalye sekirite ak efikasite nan CAR-neutrophils pwodwi nan vitro. Patikilyèman, pwofil toksisite ki pa sib nan CAR-neutrophils avèk oswa san yo pa chaje nano dwòg nan bèt enfuze, ki gen ladan sendwòm lage cytokine, nerotoksisite, ak toksisite sou-sib nan timè yo obsève nan selil CAR-T57, malgre lavi a kout. nan netrofil. Pandan ke apwòch posib, tankou jeni hPSCs58–61 donatè inivèsèl hypoimmunogenic ak bibliyotèk hPSC leukocyte imen (HLA)-homozygous hPSC62, yo disponib fasilman pou evite risk potansyèl maladi grèf kont lame (GvHD), modèl bèt preklinik ak yon yo toujou bezwen sistèm iminitè entak pou evalye potansyèl translasyonèl nan terapi netrofil nou yo. Finalman, limite anti-timè cytotoxicity ak ekstansyon nan lavi bèt nan CAR-neutrophil nanodrug terapetik yo te obsève. Se poutèt sa, eksplorasyon nan lavni nan dwòg chimyoterapi ki pi efikas oswa radiosensitizers, ak terapi konbinezon ak CAR-T klasik ak reseksyon chirijikal esansyèl pou reyalize maksimòm efikasite anti-timè nan terapi CAR-neutrophil. Pou egzanp, yon etid resan sou konsepsyon ki baze sou mekanis te mennen nan yon dwòg ki pi efikas KL-50 ki genyen batay rezistans akeri jan yo obsève nan klinik dwòg TMZ63 epi ki ka konsa enkòpore nan platfòm modilè CAR-neutrophil nanomedikaman nou an pou yon potansyèl. pi bon efikasite terapetik. Pwolonje lavi etajè netrofil yo a 5 jou atravè CLON-G (caspases-lysosomal membrane permeabilization-oxidant-necroptosis inhibition more granulocyte colony-stimulating factor64) tretman ak / oswa lè l sèvi avèk yon alontèm kontwole sistèm lage dwòg nan CAR-neutrophils ka tou. reyalize soutni nan vivo anti-timè efikasite apre apoptoz netrofil. Ansanm, rezilta nou yo montre klèman ke R-SiO2-TPZ chaje CAR-neutrophils te kapab soutni fenotip N1 anti-timè a ak efikasman touye selil timè yo anba divès kondisyon nich timè-tankou nan vitro. Fonksyonèl CAR-neutrophils ta ka pwodwi tou nan gwo kantite nan Enjenieri hPSC yo jisteman delivre timè nan mikro-anviwònman-reponn nano dwòg yo vize GBM nan vivo, ki mennen nan yon chimyoimmunotherapy konbinatory ak aktivite solid ak espesifik anti-GBM ak livrezon minimòm off-sib dwòg ki. lavi pwolonje nan sourit ki gen timè.

Referans

1. Yang F. et al. Imunoterapi sinèrji nan glioblastom pa vize doub IL-6 ak CD40. Nat. Komin. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. Eta aktyèl imunoterapi pou glioblastom. Nat. Rev Clin. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. et al. Akouchman intratumoral IL-12 pèmèt iminoterapi selil CAR-T nan yon modèl pre-klinik nan glioblastom. Nat. Komin. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrophils kòm émergentes objektif terapetik. Nat. Rev Drug Discov. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP Neutrophils kòm yon sib ki ka geri ou ak zouti pou terapi kansè. Lavi Sci. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Meta-analiz livrezon nanopartikul nan timè lè l sèvi avèk yon modèl fizyolojik ki baze sou farmakokinetik ak apwòch simulation. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. Analiz de livrezon nanopartikul nan timè. Nat. Rev Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. et al. Livrezon dwòg antikansè ki soti nan netrofil pou repwesyon repetisyon gliyom malfezan apre operasyon. Nat. Nanotechnol. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. et al. Suivi D 'MR nan enflamasyon-aktivab enjenyè netrofil pou terapi vize nan gliom trete chirijikal. Nat. Komin. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. Photosensitization priming nan microenvironments timè amelyore livrezon nan nanotherapeutics atravè enfiltrasyon netrofil. Adv. Mater. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Terapi kansè: trafik netrofil nan nanomedikaman kansè. Nat. Nanotechnol. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL Wòl netrofil nan gliom ak metastaz nan sèvo. Devan. Imunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. et al. Polarizasyon fenotip neutrofil ki asosye ak timè pa TGF-beta: "N1" kont "N2" TAN. Selil kansè (2009).

14. Blaisdell, A. et al. Neutrofil yo opoze kanserojèn epitelyal matris atravè debrideman selil timè ipoksik yo. Cancer Cell 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. et al. Soulajman nan ipoksi timè debouche potansyèl la tumorisid nan netrofil yo. J. Clin. Envesti 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et al. Netrofil polimorfonukleyè imen rekonèt epi touye selil kansè yo. Oncoimmunology 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. et al. Divèsite netrofil ak plastisit nan pwogresyon timè ak terapi. Nat. Rev. Cancer 20, 485–503 (2020).

18. Li X. et al. Pwogrè rechèch sou selil souch gliyom nan mikroanviwònman iminitè gliyom. Devan. Pharmacol. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Mikwo anviwònman iminitè nan gliom. Laboratwa. Investig. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. et al. Plastisite selil timè, eterojenite, ak rezistans nan nich mikwo-anviwònman enpòtan nan gliom. Nat. Komin. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP et al. Emerging imunoterapi pou gliyom malfezan: Soti nan imunogenomics nan terapi selilè. Neuro. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. Feroptoz netrofil pwovoke ankouraje necrosis timè nan pwogresyon glioblastom. Nat. Komin. 11, (2020).

23. Sagiv, JY et al. Divèsite fenotip ak plastisit nan sikile subpopulations netrofil nan kansè. Rep. selil 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS Selil asasen natirèl ki sòti nan iPSC imen ki fèt ak reseptè antijèn chimerik amelyore aktivite anti-timè. Cell Stem Cell 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB et al. Selil CAR T ki sible Interleukin-13 mutan ki gen gwo afinite amelyore livrezon nan nanopartikil fliyoresan biodégradables ki ka klike sou glioblastom. Bioact. Mater. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. et al. Yon nouvo sistèm livrezon ligand ki pa-invasive visualized ak terapetik eksplwate biomarker IL13R 2 timè-restriksyon. Neuro. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. et al. Chlorotoxin-dirije selil CAR T pou vize espesifik ak efikas nan glioblastom. Sci. Transl. Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR et al. Sitoliz antijèn espesifik pa neutrofil ak selil NK ki eksprime reseptè iminitè chimerik ki gen domèn siyal zeta oswa gamma. J. Immunol. 161, 375–384 (1998).

29. Chang, Y. et al. Jeni chimerik netrofil reseptè antijèn ki soti nan selil souch pluripotan imen pou imunoterapi kansè vize. Rep. Selilè 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. Neutrophils preferansyèlman fagocytose patikil long opòtinite pou vize selektif nan maladi enflamatwa egi. Sci. Adv. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Ekspresyon, wòl, ak règleman nan reseptè netrofil Fc. Devan. Imunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. et al. Enpòtans fc reseptè-chèn ITAM Tyrosines nan aktivasyon netrofil ak atrit otoiminitè nan vivo. Devan. Imunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Wòl netrofil Fc RIIa (CD32) ak Fc RIIIb (CD16) fòm polimòfik nan fagositoz nan bakteri IgG1- ak IgG3-opsonize ak eritrosit imen. Transfus. Med. Rev. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Reseptè netrofil imen Fc kòmanse epi jwe wòl espesyalize ki pa redondants nan maladi enflamatwa antikò medyatè. Iminite. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. et al. Chimikman defini jenerasyon nan andotelyòm emojèn imen ak selil ematopoyetik definitif progenitor. Biomaterials 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS et al. Efektif ak rapid jenerasyon netrofil fonksyonèl soti nan selil souch pluripotent pwovoke lè l sèvi avèk ETV2-mRNA modifye. Rep. Selil Stem 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. et al. Wòl ipoksi nan mikroanvironman timè ak devlopman selil souch kansè: yon apwòch roman pou devlope tretman. Cancer Cell Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. et al. Enpak mikwo-anviwònman timè ipoksik ak plastisit selil timè sou ekspresyon pòs iminitè yo. Kansè Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Wòl pwoteyin-tirozin kinaz Syk nan siyal estrès oksidatif nan selil B yo. Antioksidan Redox siyal. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. et al. ROS ak ROS-medyatè siyal selilè. Oksidat. Med. Selil. Lonjevite. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. et al. Yon chemen deklanchman Ras ki depann de fosforilasyon Syk nan pwoteyin kinaz C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ SYK tyrosine kinase: Yon jwè enpòtan nan divès fonksyon byolojik. Nat. Rev Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. et al. Yon nanokonpoze timè-mikwo-anviwònman-reponn pou gaz ilfid idwojèn ak terapi dinamik anzim trimodal-enhanced. Adv. Mater. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: Mekanis de activation NADPH oksidaz ak rezistans bakteri. Devan. Selil. Enfekte. Microbiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. et al. Neutrophils pèmèt livrezon lipozom lokal ak ki pa pwogrese nan misk skelèt anflame ak kè ischemik. Adv. Mater. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ et al. Rezime apwobasyon FDA: tocilizumab pou tretman chimerik antijèn reseptè T selil-induit sendwòm lage cytokine grav oswa ki menase lavi. Onkolojist 23, 943-947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Sendwòm lage cytokine ak nerotoksisite ki asosye nan imunoterapi kansè. Nat. Rev Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. et al. Neutrophils ankouraje fenotip glioma malfezan nan S100A4. Clin. Kansè Res. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. Selil-espesifik, aktivasyon-depandan règleman nan neutrophil CD32A ligand-obligatwa fonksyon. San https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Cytotoxicity medyatè pa reseptè Fc imen pou IgG. Imunol. Jodi a. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG et al. Règleman nan CAR T selil-medyatè cytokine lage sendwòm-tankou toksisite lè l sèvi avèk adaptè ki ba pwa molekilè. Nat. Komin. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. et al. Yon reseptè antijèn chimerik roman ki gen yon domèn siyal JAK-STAT medyatè efè antitumoral siperyè. Nat. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. et al. Vize fibwoz kadyak ak selil T enjenyè. Lanati. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. et al. ErbB2/HER2-selil NK espesifik pou terapi vize nan glioblastom. J. Natl. Cancer Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. et al. Selil CAR T pou timè nan sèvo: Leson yo aprann ak wout ki devan yo. Imunol. Rev. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB et al. Done sekirite ak siviv pwovizwa apre administrasyon entrakranyen M032, yon onkolitik HSV-1 ki eksprime IL-12, nan chen bèt kay ki gen gliom detanzantan. Neurosurg. Konsantre 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV Dènye pwogrè ak dekouvèt nan mekanis ak fonksyon selil CAR T yo. Nat. Rev. Kansè 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. et al. Jenerasyon selil T hypoimmunogenic ki soti nan selil souch pluripotent alojenik moun ki enjenieri jenetikman. Nat. Biomed. Eng. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. et al. Dérivés hypoimmunogenic nan selil souch pluripotent pwovoke evade rejè iminitè nan benefisyè alojenik totalman iminokonpetan. Nat. Biotechnol. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. et al. Jenerasyon selil souch pluripotent imen ipomunojèn. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW et al. HLA DR Genome koreksyon ak TALENs nan iPSC imen pwodui selil dendritik iminitè toleran yo. Selil souch Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. et al. MHC matche amelyore engraftment nan newòn ki sòti nan iPSC nan primat ki pa imen. Nat. Komin. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. et al. Konsepsyon ajan ki baze sou mekanis ki vize gliom ki reziste dwòg. Sci. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. et al. Vize plizyè chemen lanmò selil pwolonje lavi etajè a epi prezève fonksyon netrofil imen ak sourit pou transfizyon. Sci. Transl. Med. 13, (2021).

65. Chang Y. et al. Endikatè fliyoresan pou rapò kontinyèl ak liy espesifik nan faz sik selil yo nan selil souch pluripotan imen. Biotechnol. Bioeng. bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. et al. Chimikman defini jenerasyon imen definitif selil tij ematopoyetik ak progenitor. STAR Pwotok. 4, 101953 (2023).