CaWRKY30 kontwole pozitivman iminite pwav pa vize CaWRKY40 kont Ralstonia Solanacearum inokulasyon atravè modil jèn ki gen rapò ak defans Pati 2

2.5. CaWRKY30 Transitwa ekspresyon twòp ankouraje lanmò selil ki tankou HR, pwodiksyon H2O2, ak regilasyon transkripsyon jèn makè ki gen rapò ak iminite.

Eksperyans VIGS yo te endike ke CaWRKY30 kontwole pozitivman iminite pwav nan RSI. Eksperyans pase ekspresyon twòp yo te fèt pa enfiltre selil GV3101 ki te pote 35S:00 (EV) oswa 35S: CaWRKY30 nan fèy pwav pou plis validation nan espekilasyon sa a. Nou etidye wòl CaWRKY30 pasajè ekspresyon twòp sou endiksyon lanmò selil ki tankou HR ak akimilasyon H2O2 nan plant pwav. Ekspresyon CaWRKY30 nan plant pwav te etabli pa eksperyans blotting lwès (Figi 5A).

Yo te konfime lanmò selil ki tankou HR ak akimilasyon H2O2 pa ble tripan ak tach DAB, respektivman. Rezilta yo te revele ke pasajè ekspresyon CaWRKY30 te lakòz lanmò selil ki tankou HR ak akimilasyon H2O2 nan fèy pwav ki te manifeste pa pi fonse tach ble tripan ak tach DAB mawon fonse (Figi 5B). Yo te fè konduktivite pou etidye entansite necrosis selilè ki te koze pa ekspresyon twòp CaWRKY30 pasajè, ak rezilta yo te endike ke fèy pwav yo te eksprime CaWRKY30 plis pase iyon te montre plis flit ion nan 24 ak 48 èdtan apre enfiltrasyon Agro an konparezon ak fèy pwav. eksprime vektè vid (Figi 5C). Nivo ekspresyon transkripsyon relatif nan jèn makè ki asosye ak defans tankou CaPR1 ki gen rapò ak ET-biosentèz, CaNPR1 ki gen rapò ak SA, CaABR1 ki reponn ABA, ak jèn makè CaHIR1 ki asosye ak HR yo te detekte pa analiz qRT-PCR.

Rezilta nou yo montre ke transitwa ekspresyon CaWRKY30 nan fèy pwav miyò anplifye akimilasyon transkripsyon nan CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, ak CaHIR1 nan pwav kòm konpare ak transitwa over-eksprime plant vektè pwav vid nan 48 dpi (Figi 5D). Rezilta sa yo montre ke CaWRKY30 aji kòm yon regilatè pozitif nan lanmò selil plant ki sanble ak HR, pwodiksyon H2O2, ak regilasyon transcriptional nan jèn makè ki gen rapò ak iminite.

Figi 5. Transitwa ekspresyon twòp nan CaWRKY30 pwovoke lanmò selil ki tankou HR, akimilasyon H2O2, ak ekspresyon jèn makè ki asosye ak iminite nan fèy pwav. Siksè ekspresyon de CaWRKY30-drapo te konfime pa eksperyans blotting lwès (A), HR-tankou selil-lanmò deklanche pa pasajè ekspresyon de 35S: CaWRKY30, konfime pa deteksyon fenotip, ekspoze anba limyè UV, ak DAB ak Trypan Blue tach nan 48 hpi, respektivman; Ba echèl=50 µm (B), Mezi flit elektwolit (kondiktivite ion) pou estime repons lanmò selil la nan disk fèy pwav nan 24 ak 48 èdtan apre agro-enfiltrasyon, respektivman (C), tès qRT-PCR pou tcheke nivo ekspresyon transcriptional nan jèn makè ki asosye ak iminite, ki gen ladan CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, ak CaHIR1 nan 35S: CaWRKY30 eksprime fèy pwav nan 48 dpi, respektivman (D). Nivo ekspresyon relatif nan jèn makè ki gen rapò ak defans li te ye nan fèy pwav transitwaman eksprime vektè vid la te mete sou "1". Done ki reprezante mwayen ± SE nan kat replike byolojik. Ba erè yo se erè estanda nan mwayen yo. Diferan lèt ki anwo ba yo endike diferans enpòtan nan mitan mwayen yo.

2.6. Entè-Relasyon ant CaWRKY30 ak CaWRKY40

Yo rapòte ke diferan WRKY TFs fòme rezo ansanm epi nou te deja rapòte ke divès manm nan WRKY TFs, sa vle di, CaWRKY6, CaWRKY22, ak CaWRKY40, yo ekspresyon ak fonksyonèl lye youn ak lòt. Se poutèt sa, nou postule ke CaWRKY30 ta ka gen rapò ak lòt manm nan fanmi an WRKY, ki gen ladan CaWRKY40, ki se yon regilatè pozitif nan iminite pwav la kont RSI. Analiz qRT-PCR la te fèt pou plis envestigasyon sou posiblite regilasyon fidbak nan CaWRKY40 pa CaWRKY30, ak etidye modil potansyèl nan CaWRKY30 pa CaWRKY40 transient over-essay oswa pa silans nan CaWRKY40 pa VIGS.

CaWRKY40 se yon faktè transkripsyon WRKY ki enplike nan repons plant nan divès kalite estrès byotik ak abiotik. Etid yo montre ke CaWRKY40 pwovoke nan tomat epi li ka amelyore rezistans plant anba tretman sechrès ak ba-tanperati. Anplis de sa, etid la te jwenn tou ke twòp ekspresyon nan CaWRKY40 ka amelyore rezistans nan sechrès nan tomat ak soulaje anpèchman kwasans ki te koze pa estrès sèl, men rezistans nan patojèn bezwen plis etid. Se poutèt sa, CaWRKY40 jwe yon wòl enpòtan nan repons iminitè plant yo epi li gen yon sèten potansyèl pou ogmante sede agrikòl. An menm tan, nou bezwen tou peye atansyon sou iminite nou an. Iminite kò nou an trè enpòtan. Cistanche gen yon efè enpòtan sou amelyore iminite. Cistanche se moun rich nan divès sibstans antioksidan, tankou vitamin C, vitamin C, karotenoid, elatriye engredyan sa yo ka retire radikal gratis, diminye estrès oksidatif, ak amelyore rezistans nan sistèm iminitè a.

Klike sou sipleman cistanche deserticola

Rezilta nou yo te eksprime nivo transkripsyon CaWRKY30 nan fèy pwav ki depase CaWRKY40 tanporèman ogmante nan 24 ak 48 hp an konparezon ak plant ki depase vektè vid (EV) transitwaman (Figi 6A), tandiske nivo transkripsyon CaWRKY40 yo te ogmante nan plant sa yo tanporèman. sou-eksprime CaWRKY30 kòm konpare ak plant tanporèman sou-eksprime EV (Figi 6B). Kontrèman, rezilta nou yo montre ke akimilasyon transkripsyon nan CaWRKY40 te miyò downregulated nan plant Ralstonia ki enfekte CaWRKY30-silans an konparezon ak plant san silans (Figi 6C). Anplis de sa, akimilasyon transkripsyon nan jèn makè iminite li te ye, egzanp, CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, ak CaHIR1 te konplètman oswa pasyèlman siprime nan plant CaWRKY30 silans ki te deklanche pa CaWRK40 (Figi 6D).

Done sa yo endike règleman transkripsyon CaWRKY40 pa CaWRKY30 ak prezans yon bouk regilasyon pozitif ki enplike CaWRKY30 ak CaWRKY40.

Figi 6. Entè-relasyon ant CaWRKY30 ak CaWRKY40. Ekspresyon transkripsyon lev. els nan CaWRKY40 nan fèy pwav yo pase twòp eksprime CaWRKY30 nan yon entèval tan nan 24 ak 48 dpi (A), Nivo ekspresyon transkripsyon nan CaWRKY30 nan fèy pwav yo depase eksprime CaWRKY40 nan yon entèval tan nan 24 ak 48 dpi (B), Analiz gRT-PCR nan nivo ekspresyon transkripsyon CaWRKY40 nan plant pwav CaWRKY30-silans ak san silans nan 48 dpi (C)gRT-PCR tès nan nivo transkripsyon jèn makè ki asosye ak defans nan CaWRKY30-silans ak plant pwav san silans ki depase limit 35S: CaWRKY40-HA ak 35S:00nan 48 hpi (D). Done yo vle di plis SE nan kat replike byolojik. Ba erè yo se erè estanda nan mwayen yo. Diferan lèt ki anlè ba yo montre diferans enpòtan ant mwayen.

2.7. Entè-relasyon ant CaWRY30 ak CaWRKY6, CaWRKY22, ak CaWRKY27

Nan etid anvan nou yo, yo te detekte CaWRKY40 yo dwe asosye ekspresyon ak fonksyonèl ak diferan WRKY TF, tankou CaWRKY6 ak CaWRKY22. Relasyon ki genyen ant CaWRKY30 ak CaWRKY40 endike ke CaWRKY30 posib lye ak diferan WRKY TF ki enplike nan iminite pwav kont RSI. Pou konfime sipozisyon sa a, yo te fè analiz qRT-PCR pou etidye relasyon ki genyen ant CaWRKY30 ak diferan TF WRKY ki te deja rapòte yo patisipe nan iminite pwav kont RSI, tankou CaWRKY6, CaWRKY22, ak CaWRKY27. Rezilta nou yo te endike ke akimilasyon transkripsyon CaWRKY30 te anplifye nan CaWRKY6, CaWRKY22, ak CaWRKY27 tanporèman twòp eksprime plant pwav nan 48 dpi (Figi 7A), pandan y ap akimilasyon transkripsyon nan CaWRKY6, CaWRKY22, ak CaWRKY27 te ogmante tou nan fèy pwav transitwa. CaWRKY30 nan 48 dpi (Figi 7B). Rezilta nou yo nan tès qRT-PCR la vle di ke CaWRKY30 ak CaWRKY6, CaWRKY22, ak CaWRKY27 yo ekspresyon ak fonksyonèl relye.

3. Diskisyon

Pwoteyin WRKY a se youn nan pi gwo fanmi faktè transcription plant (TF). Yo konnen yon gwoup manm fanmi WRKY TF yo, ki rapòte nan Arabidopsis thaliana ak Oryza sativa, yo konnen yo patisipe epi jwe yon pati enpòtan nan règleman iminite plant yo. Yo te rapòte varyasyon fonksyonèl konsiderab nan mitan omològ estriktirèl WRKY yo [17,48], ak fonksyon yo nan WRKY TF nan iminite plant ki pa modèl, tankou pwav, yo pa byen envestige.

CaWRKY30, yon jèn gwoup Ill WRKY, te karakterize fonksyonèl nan etid aktyèl la. Rezilta yo sijere ke CaWRKY30 kontwole pozitivman iminite pwav kont RSl, epi li se yon eleman enpòtan nan entènèt la WRKY ki gen ladan CaWRKY6, CaWRKY22CaWRKY27, ak CaWRKY40. Entanglement CaWRKY30 nan iminite pwav la andose pa eleman cis ki reponn a patojèn, ki gen ladan eleman TGA, bwat TGACG-motivIATC, bwat TATA, ak bwat W ki prezan nan rejyon pwomotè CaWRKY30. Sipozisyon sa a te konsistan avèk regilasyon nivo transkripsyon CaWRKY30 apre yo te fin bay ETH, ABA, ak SA [49,50].

Depi ke jèn ki te deklanche pa ekspoze a yon sèten faktè estrès yo te souvan konnen yo patisipe nan repons a estrès sa a [51], nou te espekile ke CaWRKY30 ta ka kontwole pozitivman iminite pwav la nan RSI. Espekilasyon sa a te sipòte pa done yo nan silans nan CaWRKY30 pa VIGS, ak pa CaWRKY30 tanporè tès ekspresyon twòp. Sa a iminite redwi akòz pèt fonksyon CaWRKY30 te akonpaye pa kwasans anplifye nan RSI ak downregulation nan jèn makè ki gen rapò ak iminite tankou SA-depandan CaPR1 (52CaNPR1 [53], JA ki gen rapò CaDEF1 (54], ABA-asosye CaABR1 [55). ], ak HR-asosye CaHIR1 (561. Nan lòt men an, HR-tankou lanmò selil ak HO, sekresyon yo te deklanche pa pase ekspresyon an twòp nan CaWRKY30 akonpaye pa transcriptional upregulation nan iminite ki gen rapò ak jèn makè tankou CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, andCaHIR1.Sa a sijere wòl CaWRKY30 kòm yon regilatè pozitif nan lanmò selil ki tankou HR ak iminite pwav kont RSI. Menm jan an tou, li te obsève nan etid anvan yo ke AtWRKY30, yon homolog nan CaWRKY30 nan Arabidopsis, kontwole pozitivman im plant yo. -munitv kont ensiste biotik ak abiotik 157.581.Sa a ka sijere ke CaWRKY30 se upregulated sou enfeksyon Ralstonia, ki mennen nan diminye vilnerabilite nan pwav nan enfeksyon patojèn bakteri.

Phytohormones tankou ET, ABA, ak SA yo se molekil siyal esansyèl ki enplike nan repons plant yo nan atak patojèn ak estrès wo-tanperati. Sa yo patisipe tou nan diafonis ant repons plant yo nan estrès byotik ak abyotik [59]. SA a ankouraje rezistans kont patojèn biotwofik, pandan y ap ET jwe yon wòl enpòtan anpil nan iminite plant yo kont patojèn nekrotwofik [60]. Anjeneral, sentèz SA, ET, ak JA makonnen ak iminite PAMP-triggered (PTI) oswa effector-triggered-immunity (ETI). Fitoormon sa yo ka jwe wòl yo tou de sinèrjetik ak antagonistik ki baze sou konsantrasyon yo pandan siyal defans [61]. Yon asosyasyon sinèrji ant twa eleman siyal sa yo te detekte nan PTI, tandiske yon asosyasyon konpansatwa yo te detekte nan ETI [62]. CaWRKY30 a te toujou ap pwovoke pa phytohormones apwovizyone exogenously. Li te ye SA, ET, ak ABA-depandan jèn makè ki gen rapò ak iminite tankou CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, ak CaABR1 yo te downregulated pa silans nan CaWRK30; sepandan, yo te upregulated pa pasajè ekspresyon sou CaWRKY30 nan plant pwav, ki montre ke CaWRKY30 patisipe nan siyal defans sinèrjetik medyatè pa SA, ET, ak ABA, ki mennen nan PTI.

Analiz nan tout genòm te montre patisipasyon plizyè WRKY TF nan iminite plant [63-65]. Pa etid jenomik fonksyonèl, WRKY1 [66], -11 [67], -17 [67], -18 [68], -22 [69], {{13} } [70], -28 [71], -33 [72], -38 [73], -40 [68], -45 [74], -46 [75], -53 [76], -54 [75], -60 [68], -62 [77], -70 [75], ak -75 [78] yo te fonksyonèl karakterize nan iminite Arabidopsis, reglemante iminite pozitivman oswa negatif. Yo te sijere WRKY TF sa yo pou fè aranjman pou tèt yo nan yon sit entènèt transkripsyon WRKY, ki gen ladan plis ve ak -ve bouk fidbak ak modil feed-forward [12]. Sepandan, konfigirasyon rezo WRKY sa yo rete mal konprann.

Nan etid anvan yo, nou te dekouvri ke CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, ak CaWRKY40 se regilatè pozitif nan iminite pwav nan RSI [9,44,45], pandan y ap CaWRKY58 se yon regilatè negatif [46]. Etid aktyèl la dedwi ke CaWRKY30 aji kòm yon regilatè pozitif nan lanmò selil HR ki sanble ak pwav, ak repons pwav nan enfeksyon R. solanacearum. Nivo ekspresyon transkripsyon CaWRKY30 yo te ogmante sou ekspresyon pasajè CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, ak CaWRKY40. Okontrè, CaWRKY30 pasajè ekspresyon twòp regilasyon akimilasyon transkripsyon CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, ak CaWRKY40, sijere prezans rezo WRKY TFs ak plis fidbak bouk pami CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, ak CaWRKY40. Menm jan ak plis senk bouk fidbak yo sipoze patisipe nan iminite plant yo [47]. Menm sòt de plis ve fidbak bouk te prezan nan mitan CaWRKY40 ak CaWRKY6, CaWRKY40 ak CabZIP63, CaWRKY40 ak CaCDPK15. Nan etid anvan yo, CaWRKY6 [44] ak CabZIP63 [16] tou yo te detekte yo dwe patisipe dirèkteman ak transcriptionally nan règleman an nan ekspresyon CaWRKY40 kont RSI. Kenbe nan gade rezilta sa yo, li ka sijere ke CaWRKY40 ta ka kowòdone pa divès kalite TF. An konklizyon, ekspresyon CaWRKY40 reglemante pa CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY30, ak CabZIP63 sou RSI, ak ekspresyon CaWRKY40 reglemante pa CaWRKY6, ak CabZIP63, men se pa CaWRKY30 nan pwav apre ekspoze a tanperati ki wo.

4. Materyèl ak Metòd

4.1. Materyèl Plant ak Kondisyon Kwasans

Grenn pwav cultivar 'Mexi' ak Nicotiana benthamiana yo te jwenn nan Ayub Agriculture Research Institute, Faisalabad, Pakistan. Grenn pwav ak N. benthamiana yo te plante nan po plastik ki te gen melanj tè [sfèy bab panyòl ak pèrlit; 2/1 (v/v)] epi kenbe nan yon chanm kwasans nan kondisyon kontwole, sa vle di, 25 ◦C tanperati, 60-70 µmol foton m−2 s -1 entansite limyè ak 70 pousan imidite relatif anba 16 h limyè/8 h fotoperyòd nwa.

4.2. Jenerasyon vektè

Teknik pòtay-klonaj la te anplwaye pou jenere vektè. Pou konstwi vektè satelit, CaWRKY30 ORF plen longè (avèk kodon tèminal oswa san kodon tèminal) te klonaj nan vektè antre pDONR207 lè l sèvi avèk yon reyaksyon BP. Apre sa, konstriksyon sa a te transfere nan vektè destinasyon pMDC83, CD3687 (HA-tag), CD3688 (Flag-tag), ak Pk7WG2 pa fè reyaksyon LR pou jenere vektè pou lokalizasyon sub-selilè ak ekspresyon, respektivman.

Pou konstriksyon vektè pou VIGS, yo te chwazi 364 bps fragman nan 30 -rejyon ki pa tradui (UTR) CaWRKY30 epi yo te konfime espesifikasyon an pa BLAST kont sekans genòm nan baz done CM334 (http://peppergenome.snu. ac.kr/ (aksè sou 29 oktòb 2021)) ak Zunla-1 (http://peppersequence.genomics.cn/page/species/blast. jsp (aksè sou 29 oktòb 2021)). Apre sa, yo te fè reyaksyon BP pou klonaj fragman sa a nan pDONR207/201, apre yo fin te transfere konstriksyon sa a nan vektè PYL279 lè yo te fè yon reyaksyon LR.

4.3. Kwasans patojèn ak pwosedi vaksinasyon yo

Nou izole yon souch virulan konpatib nan R. solanacearum soti nan plant pwav enfekte pa Ralstonia soti nan Dera Ghazi Khan, Pakistan. Metòd klori tetrazolyom lan te itilize pou pirifye tisi vaskilè anlè tè exudates plant ki enfekte patojèn yo [9,45]. R. solanacearum izole a te kiltive nan mwayen SPA nan yon shaker kontwòl tèrmo (200 g pòmdetè, 20 g sikwoz, 3 g ekstrè vyann bèf, 5 g triptòn, ak 1 L H2O doub distile) nan 200 rpm ak 28 ◦C pou lannwit lan. Apre sa, souch kiltive R. solanacearum yo te santrifuje a 6500 pm ak 28 ◦C pou 10 min. Likid supernatant apre santrifijasyon yo te vide deyò, epi granules nan pati anba tib santrifij la te dilye nan esterilize 10 mM MgCl2 solisyon. Dansite selil bakteri yo te ajiste a 108 cfu ml-1 (OD 600=0.8).

Pou etidye efè RSI sou nivo transkripsyon CaWRKY30 ak sou rezistans plant pwav nan atak R. solanacearum, yo te enfiltre tèt twazyèm fèy plant pwav ak 10 µL solisyon R. solanacearum pa yon sereng san zegwi. Echantiyon fèy trete patojèn yo te rekòlte nan pwen tan espesifik pou eksperyans tach istochimik (egzanp, tach DAB oswa tach ble trypan), konduktiviti elektrik, cfu, ak ekstraksyon RNA pou plis eksperyans. Pou eksperyans nan fenotip nan plant CaWRKY30-silans ak san silans, rasin yo te blese lè l sèvi avèk yon baton vè ak enfiltre ak konpatib virulan R. solanacearum. Plant yo te kenbe nan yon chanm kwasans nan kondisyon kontwòl nan 28 ± 2 ◦C tanperati, 60-70 µmol foton m-2 s -1 entansite limyè, 70 pousan imidite relatif, ak anba yon 16-hlight/{{12 }}h fotoperyòd nwa apre vaksinasyon R. solanacearum. Foto fenotip la te kaptire apre RSI nan entèval tan espesifik.

4.4. Aplikasyon fèy nan Phytohormones

Pou etidye efè phytohormones, plant pwav ki an sante yo te flite ak 100 µM ETH, 100 µM ABA, ak 1 mM SA nan kat etap fèy. Mock (kontwòl) plant yo te trete ak esteril ddH2O. Echantiyon trete ak fitoormon yo te kolekte nan pwen tan vle pou fè ekstraksyon RNA ak plis etid.

4.5. Egzamen lokalizasyon Sub-selilè CaWRKY30

Selil Agrobacterium ki gen 35S: CaWRKY30-GFP oswa 35S: GFP (kontwòl) yo te kiltive lannwit lan nan yon mwayen LB ki gen antibyotik korespondan. Medya kiltive yo te santrifuje nan 6500 rpm, yo te vide supernatant likid, epi yo te granules ki anba a dilye nan yon mwayen endiksyon (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5.7, ak 150 µM acetosyringone), epi li te mete sou OD{{ 10}}.8. Agrobacterium ki gen 35S: CaWRKY30-GFP ak 35S: GFP yo te enjekte nan fèy N. benthamiana lè l sèvi avèk yon sereng san yon zegwi. Metòd ki te dekri anvan an te itilize pou fè 4,6-diamidino-2-fenilindol tach (DAPI) [9]. Nan 48 hpt, GFP ak DAPI siyal fliyoresan yo te obsève, ak foto yo te kaptire pa yon mikwoskòp konfokal optik lazè (TCS SP8, Leica, Solms, Almay), ak yon longèdonn eksitasyon nan 488 nm ak yon emisyon band-pas 505-530 nm. filtre.

4.6. Tach istochimik

Tach istochimik (Trypan ble ak 3, 30 -diaminobenzidine) te fèt jan sa dekri deja [9,11,79]. Pou fè tès tach ble tripan, fèy pwav yo te bouyi nan solisyon ble tripan (10 mL asid laktik, 10 mL gliserin, 10 mL fenol, 40 mL etanòl, 10 mL ddH2O, ak 1 mL tripan ble) pou 30 min. Apre sa, fèy yo te kenbe nan tanperati chanm pou 8 èdtan, plonje nan yon solisyon nan idrat kloral (2.5 g nan idrat kloral ki fonn nan 1 mL nan dlo distile), ak de-tache nan bouyi pou 30 min. Solisyon idrat chloral la te chanje plizyè fwa pou diminye background nan, ak Lè sa a, echantiyon yo te monte nan 70 pousan gliserin. Fèy yo te mete nan 1 mg / mL nan solisyon DAB lannwit lan pou tès DAB tach. Fèy DAB-tache yo te bouyi nan asid laktik: glycerol: etanòl absoli [1:1:3 (v/v/v)] ak Lè sa a, de-tache nan etanòl absoli lannwit lan [80]. Foto yo nan fèy ble trypan ak DAB-tache yo te pran ak yon kamera ak pa yon mikwoskòp limyè (Leica, Wetzlar, Almay).

4.7. Silans CaWRKY30 atravè silans jèn viris la (VIGS)

Yo te dekri yon sistèm silansman jèn tabak (TRV) ki baze sou viris ki te dekri deja pou silans CaWRKY30 nan plant pwav [47,81,82]. Agrobacterium GV3101 ki gen PYL192, PYL279-CaWRKY30, PYL279, ak PYL279-PDS (OD600=0.8) konstwi yo te melanje nan yon rapò 1:1. Yon sereng san zegwi te enfiltre melanj sa a nan 2-kotiledon plant pwav ki gen yon semèn. Plant yo enfiltre yo te enkube nan yon chanm kwasans pou 56 èdtan anba fè nwa nan 16 ◦C tanperati ak 45 pousan imidite relatif, epi yo te deplase nan yon chanm kwasans nan kondisyon kontwole nan 25 ± 2 ◦C, 60-70 µmol foton m-2. s −1, ak imidite relatif 70 pousan anba yon fotoperyòd 16 h limyè/8 h fè nwa.

4.8. CaWRKY30 Transient Over-Expression nan fèy pwav

Selil Agrobacterium GV3101 ki gen CaWRKY30-Flag ak EV yo te kiltive nan mwayen LB nan yon shaker tèrmo kontwòl, ki gen antibyotik ki koresponn lannwit lan ak OD600=1.0. Apre sa, Agrobacterium GV3101 sa yo te santrifuje nan 6000 pm ak 28 ◦C pou 10 min. Apre santrifugasyon, yo te retire supernatant likid la epi yo te dilye granul solid ki anba a nan OD 600=0.8 nan yon mwayen endiksyon (10 mM MES, pH5.4, 10 mM MgCl2, 200 µM acetosyringone). Melanj sa a te enfiltre nan fèy pa yon sereng san yon zegwi. Yo te obsève fèy sa yo tanporèman twòp eksprime pou lanmò selil ki tankou HR, oswa echantiyon yo te kolekte pou fè eksperyans DAB ak trypan ble tach, ak pou izolasyon RNA pou plis eksperyans.

4.9. Ekstraksyon RNA ak RT-PCR an tan reyèl

Metòd reyaktif TRIzol (Invitrogen) te itilize pou ekstrè RNA total ki soti nan echantiyon fèy nan plant pwav trete ak nan plant mock. Apre sa, Prime Script RT-PCR twous (TaKaRa, Dalian, Lachin) te itilize pou ranvèse transkri RNA ekstrè. Yo te pote analiz qRT-PCR an tan reyèl pou etidye nivo transkripsyon relatif jèn makè sible yo. Pwosesis done yo te fè dapre metòd ki te dekri deja [45,82], ak primè espesifik (Tablo Siplemantè S3), lè l sèvi avèk enstriksyon manifakti a pou sistèm PCR an tan reyèl Bio-Rad (Bio-Rad, Foster City, CA, USA) ak SYBR premix Ex Taq II sistèm (TaKaRa pafè tan reyèl).

4.10. Estimasyon konduktiviti ELEKTRIK

Kondiktif elektrik (yon flit) te kalkile lè l sèvi avèk metòd ki dekri deja ak ti chanjman [44,83]. Sis plak fèy (4 mm nan lajè) yo te jwenn lè l sèvi avèk yon trou trou. Disk yo te lave twa fwa ak esterilize ddH2O epi enkubate enstantane nan 10 mL ddH2O. Apre sa, disk fèy sa yo te kenbe nan yon dousman souke (60 rpm) nan tanperati chanm pou 1 èdtan. Yo te itilize yon mèt konduktiviti (Mettler Toledo 326 Mettler, Zurich, Swis) pou anrejistre done sou konduktiviti elektrik.

4.11. Blotting iminitè

Yo te itilize yon pwosedi tanpon ekstraksyon pwoteyin ki dekri deja pou ekstrè pwoteyin ki soti nan fèy pwav [3]. Pwoteyin ekstrè a te enkube lannwit lan ak antiHA agarose nan 4 ◦C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Yo te itilize krak mayetik pou kolekte pèl epi lave twa fwa ak salin tanpon Tris (TBS) ak tween 20 (0.05 pousan). Pwoteyin ki elimine yo te obsève lè l sèvi avèk imuno-blotting ak anti-HA-peroksidaz (Abcam, Cambridge, UK).

5. Konklizyon

An konklizyon, nou se nan opinyon ke CaWRKY30 transcriptionally aktive iminite nan pwav kont RSI. Silans CaWRKY30 pa VIGS redwi iminite plant pwav yo nan enfeksyon patojèn bakteri, tandiske pasajè ekspresyon de CaWRKY30 pwovoke rezistans nan R. solanacearum. Ansanm, fòmasyon yon bouk fidbak pozitif ak fonksyon li an paralèl ak lòt TF se prèv ase nan aktivasyon li anba estrès byotik. Anplis de sa, nou pwopoze jenerasyon plant pwav transjenik CaWRKY30 ki estab ak pwoteyin sib CaWRKY30 pou byen eksplike wòl jèn sa a kont patojèn bakteri ak tou nan divès chemen metabolik.

Kontribisyon otè:

Konsepyalizasyon, AH, MIK, MA, BSA, ZL ak ATKZ; Done curation, AH, MIK ak AME-S.; Analiz fòmèl, ZL ak SF; Akizisyon finansman, AH, MIK, MAAA, MA, BSA, AME-S. ak ATKZ; Administrasyon pwojè, AH ak MIK; Resous, AH; Validasyon, SM; Vizyalizasyon, SM ak SF; Redaksyon—Bouyon orijinal, AH ak MIK; Redaksyon—revizyon ak koreksyon, IRN, MAAA, MA, BSA, AME-S., ZL, SF ak ATKZ Tout otè yo te li epi dakò ak vèsyon ki te pibliye maniskri a.

Finansman:

Otè prensipal la gen anpil obligasyon anvè Komisyon Edikasyon siperyè nan Pakistan pou asistans finansye pou akonpli etid sa a anba sibvansyon SRGP No. 21-2651/SRGP/HRD/HEC/2020. Travay aktyèl la te finanse pa Taif University Researchers Supporting Project Number (TURSP2020/245), Taif University, Taif, Arabi Saoudit. Etid la te sipòte tou pa Pwojè Fon Devlopman nan Inivèsite Fujian Agrikilti ak forè (CXZX2018114, CXZX2020008A, ak CXZX2019024G).

Deklarasyon Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl: Pa aplikab.

Deklarasyon Konsantman Enfòme: Pa aplikab.

Deklarasyon Disponibilite Done: Tout done yo nan maniskri a ak Fichye Siplemantè li yo.4

Konfli enterè: Otè yo pa deklare okenn konfli enterè.

Referans

1. Arif, M.; Atta, S.; Bashir, MA; Khan, MI; Hussain, A.; Shahjahan, M.; Alwahibi, MS; Elshikh, MS Enpak tan aplikasyon FosetylAluminium sou repwesyon Karnal bunt ak retounen ekonomik nan ble pen (Triticum aestivum L.). PLoS ONE 2021, 16, e0244931.

2. Khalofah, A.; Khan, MI; Arif, M.; Hussain, A.; Ullah, R.; Irfan, M.; Mahpara, S.; Shah, RU; Ansari, MJ; Kintl, A. Deep plasman nan angrè nitwojèn amelyore sede, efikasite itilizasyon nitwojèn ak retounen ekonomik nan diri amann transplantasyon. PLoS ONE 2021, 16, e0247529. [CrossRef] [PubMed]

3. Noman, A.; Hussain, A.; Adnan, M.; Khan, MI; Ashraf, MF; Zainab, M.; Khan, KA; Ghramh, HA; Li, S. Yon nouvo faktè transcription MYB CaPHL8 bay endikasyon sou evolisyon iminite pwav kont patojèn nan tè a. Mikwòb. Pathog. 2019, 137, 103758. [CrossRef] [PubMed]

4. Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Zaynab, M.; Aqeel, M.; Anwar, M.; Ashraf, MF; Liu, Z.; Raza, A.; Mahpara, S. Règleman molekilè nan pwav iminite natirèl ak tolerans estrès: Yon BECA de WRKY TFs. Mikwòb. Pathog. 2019, 135, 103610. [CrossRef] [PubMed]

5. Reboledo, G.; Agorio, Ad; Vignale, L.; Batista-García, RA; de León, IP Transcriptional Profiling revele repons defans plant konsève ak espès espesifik pandan entèraksyon Physcomitrium patens ak Botrytis cinerea. Plant Mol. Biol. 2021, 1–21. [CrossRef]

6. Aerts, N.; Mendes, Deputy; van Wees, SC Plizyè nivo crosstalk nan rezo òmòn ki reglemante defans plant yo. Plant J. 2021, 105, 489–504. [CrossRef] [PubMed]

7. Liu, Z.; Shi, L.; Weng, Y.; Zou, H.; Li, X.; Yang, S.; Qiu, S.; Huang, X.; Huang, J.; Hussain, A. ChiIV3 aji kòm yon sib roman nan WRKY40 medyatè iminite pwav kont enfeksyon Ralstonia solanacearum. Mol. Plant-Mikwòb Entèaksyon. 2019, 32, 1121–1133. [CrossRef] [PubMed]

8. ul Haq, MI; Maqbool, MM; Ali, A.; Farooq, S.; Khan, S.; Saddiq, MS; Khan, KA; Ali, S.; Khan, MI; Hussain, A. Optimize jeyometri plante pou lòj-Ejipsyen trèfl intercropping sistèm nan yon klima semi-arid sub-tropikal. PLoS ONE 2020, 15, e0233171.

9. Hussain, A.; Li, X.; Weng, Y.; Liu, Z.; Ashraf, MF; Noman, A.; Yang, S.; Ifnan, M.; Qiu, S.; Yang, Y. CaWRKY22 aji kòm yon regilatè pozitif nan repons pwav nan Ralstonia solanacearum pa konstitye rezo ak CaWRKY6, CaWRKY27, CaWRKY40, ak CaWRKY58. Ent. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1426. [CrossRef] [PubMed]

10. Mukhtar, MS; Liu, X.; Somssich, IE Elicide wòl WRKY27 nan esterilite gason nan Arabidopsis. Siyal Plant. Konpòtman. 2018, 13, e1363945. [CrossRef] [PubMed]

11. Khan, MI; Zhang, Y.; Liu, Z.; Hu, J.; Liu, C.; Yang, S.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Noman, A.; Shen, L. CaWRKY40b nan pwav aji kòm yon regilatè negatif an repons a Ralstonia solanacearum pa modil dirèkteman jèn defans ki gen ladan CaWRKY40. Ent. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1403. [CrossRef] [PubMed]

12. Eulgem, T.; Somssich, IE Rezo faktè transkripsyon WRKY nan siyal defans. Curr. Opinyon. Plant Biol. 2007, 10, 366–371. [CrossRef] [PubMed]

13. Bakshi, M.; Oelmüller, R. WRKY faktè transcription: Jack of many trades in plants. Siyal Plant. Konpòtman. 2014, 9, e27700. [CrossRef] [PubMed]

14. Xu, Y.-P.; Xu, H.; Wang, B.; Su, X.-D. Estrikti kristal nan faktè transcription WRKY N-tèminal ak konplèks ADN. Pwoteyin selil 2020, 11, 208–213. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, X.; Li, C.; Wang, H.; Guo, Z. WRKY faktè transcription: Evolisyon, obligatwa, ak aksyon. Fitopatòl. Res. 2019, 1, 13. [CrossRef]

16. Shen, L.; Liu, Z.; Yang, S.; Yang, T.; Liang, J.; Wen, J.; Liu, Y.; Li, J.; Shi, L.; Tang, Q. Pepper CabZIP63 aji kòm yon regilatè pozitif pandan Ralstonia solanacearum oswa defi tanperati ki wo-wo imidite nan yon bouk fidbak pozitif ak CaWRKY40. J. Exp. bot. 2016, 67, 2439–2451. [CrossRef] [PubMed]

17. Schluttenhofer, C.; Yuan, L. Règleman nan metabolis espesyalize pa faktè transcription WRKY. Plant Physiol. 2015, 167, 295–306. [CrossRef] [PubMed]

18. Jiang, J.; Ma, S.; Wi, N.; Jiang, M.; Cao, J.; Zhang, J. WRKY faktè transcription nan repons plant nan estrès. J. Integr. Plant Biol. 2017, 59, 86–101. [CrossRef]

19. Yu, K.; Pieterse, CM; Bakker, PA; Berendsen, RL Mikwòb benefisye ale anba tè nan iminite rasin yo. Plant Cell Environ. 2019, 42, 2860–2870. [CrossRef]

20. Noman, A.; Liu, Z.; Yang, S.; Shen, L.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; Li, S. Ekspresyon ak evalyasyon fonksyonèl nan CaZNF830 pandan repons pwav nan Ralstonia solanacearum oswa tanperati ki wo ak imidite. Mikwòb. Pathog. 2018, 118, 336–346. [CrossRef] [PubMed]

21. Noman, A.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; Liu, Z.; Li, S. CabZIP53 vize pa CaWRKY40 epi li aji kòm yon regilatè pozitif nan defans pwav kont Ralstonia solanacearum ak thermotolerance. Anviwònman. Eksp. bot. 2019, 159, 138–148. [CrossRef]

22. Ashraf, MF; Yang, S.; Wu, R.; Wang, Y.; Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Liu, Z.; Qiu, A.; Guan, D.; et al. Capsicum annuum HsfB2a kontwole pozitivman repons pou enfeksyon Ralstonia solanacearum oswa gwo tanperati ak imidite segondè ki fòme kaskad transkripsyonèl ak CaWRKY6 ak CaWRKY40. Selil Plant Physiol. 2018, 59, 2608–2623. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, L.; Dossa, K.; Ou, J.; Zhang, Y.; Li, D.; Zhou, R.; Yu, J.; Wei, X.; Zhu, X.; Jiang, S.; et al. Sekans transkriptòm tanporèl wo rezolisyon debouche ERF ak WRKY kòm jwè prensipal yo nan rezo regilasyon ki kache repons wowoli a dlo ak rekiperasyon. Genomics 2021, 113, 276–290. [CrossRef]

24. Yang, X.; Zhou, Z.; Fu, M.; Han, M.; Liu, Z.; Zhu, C.; Wang, L.; Zheng, J.; Liao, Y.; Zhang, W.; et al. Idantifikasyon transcriptome-lajè nan jèn fanmi WRKY ak pwofil ekspresyon yo nan direksyon asid salisilik nan Camellia japonica. Siyal Plant. Konpòtman. 2021, 16, 1844508. [CrossRef] [PubMed]

25. Pervez, M.; Babar, M.; Iqbal, J.; Hasnain, M.; Abbas, S.; Shah, S.; Ashraf, M. Nan analiz estriktirèl ak fonksyonèl Silico nan jèn Wrky1 ak Wrky3 nan rekòt sereyal yo chwazi yo. J. Anim. Plant Sci.-JAPS 2021, 31, 322–341.

26. Liu, Z.-Q.; Liu, Y.-Y.; Shi, L.-P.; Yang, S.; Shen, L.; Yu, H.-X.; Wang, R.-Z.; Wen, J.-Y.; Tang, Q.; Hussain, A.; et al. SGT1 obligatwa nan repons defans pwav PcINF1/SRC2-1-pwovoke lè li kominike avèk SRC2-1. Sci. Rep. 2016, 6, 21651. [CrossRef] [PubMed]

27. Srinivasan, K. Aktivite byolojik nan pwav wouj (Capsicum annuum) ak Prensip pike li yo Capsaicin: yon revizyon. Kritik. Rev Manje Sci. Noutr. 2016, 56, 1488–1500. [CrossRef] [PubMed]

28. Liu, Z.; Shi, L.; Yang, S.; Lin, Y.; Weng, Y.; Li, X.; Hussain, A.; Noman, A.; Li, S. Fonksyonèl ak pwomotè analiz de ChiIV3, yon Chitinase nan plant pwav, an repons a Phytophthora capsici enfeksyon. Ent. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1661. [CrossRef] [PubMed]

29. Ali, M.; Luo, D.-X.; Khan, A.; Haq, SU; Gai, W.-X.; Zhang, H.-X.; Cheng, G.-X.; Muhammad, mwen; Gong, Z.-H. Klasifikasyon ak analiz Genome-Wide nan Chitin-Binding Pwoteyin Gene Family nan Pepper (Capsicum annuum L.) ak Règleman transkripsyon Phytophthora capsici, Estrès Abiotic, ak aplikasyon ormon. Ent. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2216. [CrossRef] [PubMed]

30. Noman, A.; Liu, Z.; Aqeel, M.; Zainab, M.; Khan, MI; Hussain, A.; Ashraf, MF; Li, X.; Weng, Y.; Li, S. Faktè transcription domèn leucine debaz zip: Vanguards yo nan iminite plant. Biotechnol. Lett. 2017, 39, 1779–1791. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com