Karakterizasyon Proanthocyanidin natirèl ak alkalin-oksidize nan ekstrè plant pa Ultrahigh-Resolution UHPLC-MS/MS

Pou plis enfòmasyon. kontaktetina.xiang@wecistanche.com

Résumé: Nan etid sa a, nou analize konpozisyon proanthocyanidin (PA) nan 55 ekstrè plant anvan ak apre alkalin.oksidasyonpa ultrawo rezolisyon UHPLC-MS/MS. Nou karakterize estrikti natirèl PA yo an detay epi etidye chanjman sofistike nan estrikti PA modifye yo ak modèl tipik ak modèl reyaksyon nan diferan klas PA akòz oksidasyon. PA natirèl yo te A- ak B-tip PC, PD, ak melanj PC/PD. Anplis de sa, nou detekte PA galoylate. B-type PC yo nan ekstrè plant diferan yo te pito ki estab epi yo te montre pa gen okenn oswa ti modifikasyon akòz laoksidasyon alkalin. Pou kèk echantiyon, nou detekte reyaksyon intramolekilè PC yo ki pwodui lyen etè A-type. A-type PC yo te tou pito ki estab ak okenn modifikasyon oswa ti modifikasyon, men nan kèk plant, fòmasyon nan etè adisyonèl.lyen yote detekte. PA ki gen inite PD yo te pi reyaktif. Apre oksidasyon alkalin, PA sa yo oswa pwodwi oksidasyon yo pa te detekte pa MS ankò menm si UV te toujou detekte yon kalite diferan ak/oswa bos PA ki retade nan 280 nm. Galoylated PA yo te pito ki estab anba oksidasyon alkalin si yo te baze sou PC, men nou te detekte konvèsyon entramolekilè a soti nan B-type a A-type. Galoylated PD yo te pi reyaktif epi yo te reyaji menm jan ak PD ki pa galoylated.

Mo kle: gwo rezolisyon espektometri mas; orbitrap;oksidasyon; tanen; UHPLC-DAD-MS/MS

Klike la a pou aprann plis pwodwi

1. Entwodiksyon

Proanthocyanidins(PAs, sin. tanen kondanse) se oligomè ak polymère ki gen inite monomerik flavan-3-ol (Figi 1). Divèsite estrikti PA yo soti sitou nan modèl idroksidasyon yo, lòd sekans inite flavan-3-ol yo, ak degre polymerization (DP), anplis diferans ki genyen nan stereochimi nan C2 ak C3 ak varyasyon nan kote a. ak stereochimi nan entèrflavonoidlyezon [1]. PA ki pi komen yo se procyanidin (PC) ki gen ladan inite (epi)katechin ak prodelphinidins (PD) ki gen ladan inite (epi)gallocatechin (Figi 1). Estrikti PA yo prezante nan figi a gen lyen C4→C8. Sepandan, PA yo ka lye tou pa lyezon C4 → C6, epi nou pa ka separe de lyen sa yo youn ak lòt pa espektrometri mas.

PAs are the most commonly available subgroup of plant tannins, responsible for nearly 90% of the world's overall market for industrial tannins (>miltip 100-kilo tòn chak ane), epi yo pwodui chimikman ak ekonomikman pi atiran kòm yon bio-polymère [2-5]. Kounye a, se sèlman kèk resous, tankou jape oswa rakbwa wattle, mimoza, quebracho, pye bwadchenn, chestnut, mangrov, sumach, myrobalans, ak tara, yo itilize pou pwodiksyon yo ak sitou pou demand yo nan bwonzaj kwi, diven, mineral. flotasyon, ak endistri perçage lwil oliv, pou prepare adhésifs, anplis nitrisyon bèt [4,6,7]. Sepandan, menm fatra oswa sous-pwodwi nan manyen ak trete fwi, legim, ak resous forè ki soti nan aplikasyon endistriyèl ki endike anwo yo ta ka yon sous potansyèl pou PA natirèl [8-11]. PA yo ta ka tou modifye plis yo nan lòd yo amelyore itilizasyon yo ak byoaktivite [12,13].

Pwopriyete chimik PA yo ka modifye atravè reyaksyon derivatizasyon [12]. Reyaksyon sa yo gen ladan, pou egzanp, O-acylation pa yon reyaksyon ak klori asid oswa anidrid oswa alkilasyon ak alogen alkil. Derivatizasyon modifye pwopriyete fizikochimik PA yo pou aplikasyon komèsyal yo ak teknoloji pou pirifye yo. Sepandan, pou vrèman konprann reyaksyon aktyèl yo k ap pase, plizyè paramèt, tankou reyaktif ak solvang yo itilize, tanperati, pH, ak tan reyaksyon yo bezwen kontwole [12]. Yon fason ki senp epi rapid pou amelyore itilizasyon PA plant yo se oksidasyon yo pou kreye nouvo PA ak estrikti molekilè ki chanje. Menmsi kondisyon reyaksyon oksidasyon yo byen li te ye e yo te sijere diferan mekanis reyaksyon, chanjman estriktirèl korespondan yo se sitou li te ye pou ti PA endividyèl [14-18]. Pa egzanp, reyaksyon oksidasyon ak reyajman diferan flavan-3-ol monomerik ak dimerik yo te diskite avèk elegans deja 30 ane de sa, ki montre ke chimi PA sa yo nan pH alkalin reglemante pa fòmasyon A-ak/oswa. B-bag quinone-methides kòm entèmedyè trè reyaktif ki lakòz reyaksyon yo reyaji ak konvèsyon oksidatif nan B-tip nan A-tip PAs[15]. Olye de sa, konpòtman an nan melanj PA nan ekstrè plant yo pa konnen, e sa a se pi pwobableman akòz difikilte nan analize PA inisyal estriktirèl diferan, ki defye menm pi lwen apre oksidasyon. Nan etid anvan nou an, nou te teste si diferan kalite PA natirèl yo ta ka modifye chimikman pou pwodwi nouvo kalite PA epi etidye efè oksidasyon alkalin ki pa espesifik ki imite pwosesis ekstraksyon alkalin souvan itilize pou fatra jape [19-23] sou. 102 Ekstrè plant ki gen PA [13]. Rezilta yo endike diferan reyativite pou PC yo ak PD yo. Rezilta a sigjere ke PA plant yo ta ka modifye nan pH segondè, ak prezans nan gwoup PD siyifikativman amelyore pwobabilite pou reyaksyon modifikasyon. Wout reyaksyon prensipal la te konkli yo dwe entramolekilè, men pou PA ki rich ak gallovlated, tou de reyaksyon entra- ak entèmolekilè yo te endike [13]. Anplis de sa, lòt etid yo te montre ke oksidasyon nan PA gen ladan tou de reyaksyon entramolekilè ak entèmolekilè [14,15,24,25].

Karakterizasyon an detay ak konpreyansyon nan PA natirèl ak oksidize se yon defi, men dènye pwogrè nan ultra-wo pèfòmans likid chromatografik tandem mas spectrometric (UHPLC-MS/MS) instrumentation ak analizeur mas rezolisyon segondè yo te pèmèt karakterizasyon nan anpil PA plant diferan. [18,26-28]. Analizè mas popilè yo pou karakterizasyon PA yo te orbitrap [27,28] ak quadrupole.

time-of-flight(OTOF)[29,30] akòz pwopriyete wo rezolisyon yo, ki pèmèt detèminasyon mas egzak yo ak fòmil molekilè ki koresponn nan PA etidye nan ekstrè plant yo. PA yo jwenn nan lanati anjeneral genyen yon melanj de diferan oligo-ak estrikti polymère, ki bay anpil iyon chaje nan ionizasyon electrospray, elaji seri mas yo itilize [30-32]. Anplis de sa, PA yo gen byen koni modèl fragmantasyon karakteristik, ki ka itilize pou idantifikasyon yo: sa yo enkli klivaj kinon-metid (QM), fisyon bag heterocyclic (HRF), ak retro-Diels-Alder (RDA) fraksyon [27, 31-33]. Modèl yo menm fwagmantasyon yo anjeneral prezan pou tou de A-tip ak B-tip PA, ak valè m/z yo obsève pou PA-tip A ki gen yon sèl lyezon etè diferan pa 2 Da ak PA korespondan B-tip [26,{{ 19}}].

Nan etid sa a, nou itilize UHPLC konbine avèk espektrometri mas tandem ultra-wo rezolisyon pou (a) etidye estrikti natirèl PA yo nan 55 echantiyon plant ki rich ak PA an detay, (b) pou wè chanjman sofistike nan estrikti PA modifye yo apre. oksidasyon ayeryen an nan kondisyon alkalin ak (c) yo rekonèt modèl yo tipik ak modèl nan reyaksyon nan diferan klas PA akòz oksidasyon an.

2. Rezilta ak Diskisyon

Nou te chwazi 55 echantiyon plant ki rich ak PA ki genyen melanj enteresan men konplèks nan PA natirèl ki baze sou etid anvan nou an [13]. Echantiyon plant sa yo te menm jan an oksidasyon pa oksidasyon ayeryen nan kondisyon alkalin tankou nan [13] ak apre oksidasyon an, PA yo te menm plis konplèks. PA natirèl ak modifye sa yo te etidye isit la pa UHPLC-DAD ki konekte ak ultrawo rezolisyon Q-orbitrap MS/MS yo nan lòd yo detekte chanjman yo sofistike nan estrikti PA. Yo te idantifye PA yo dapre iyon ki chaje pa yo ak/oswa miltipliye ak mas egzak korespondan yo ak fòmil molekilè yo. Analiz yo te pote soti nan ranvèse-faz LC, ak Se poutèt sa, oligomerik ak polymère PA yo te sitou prezan kòm bos ki pako rezoud nan chromatogram yo UV nan 280 nm, wè ekstrè nan fèy nan Ruprechtia salicifolia nan Figi 2A pou yon egzanp. Nan chromatogram iyon total la, ionizasyon lòt konpoze fenolik te pi entansif pase PA yo, ak Se poutèt sa, bos PA a pa t 'konsa aparan (Figi 2B). Sepandan, presizyon nan orbitrap fè entèpretasyon rezilta MS yo pi fasil kòm modèl izotopik nan iyon miltipliye chaje yo byen defini, epi yo ka detekte sipèpoze posib nan pik yo, konsa pèmèt detèminasyon an nan mas egzak yo ak fòmil molekilè nan diferan oligo-. ak PA polymère. Pa egzanp, galloylated(epi)catechin nan m/z 441, galloylated dimeric PCat m/z729, ak galloylated trimeric PC nan m/z 1017 montre pik byen separe nan extrait ion chromatograms (EICs) nan Figi 2C-E, epi yo ka fasil detekte baze sou UV ak mas spectre yo, ki gen ladan mas egzak ak fòmil molekilè ki koresponn lan. Rezilta yo te jwenn isit la te konsistan avèk rezilta anvan MS/MS te jwenn, ki montre ke fèy Ruprechtia salicifolia te genyen 24 mg/g PA, nan ki sèlman 3 pousan te PA ki gen PD, kèk nan yo te galoylated, epi yo te jwenn mDP a. yo dwe 7 [13].

2.1.B-Type PC yo nan Premye Ekstrè Plant ki pa Okside

Yo te detekte PC B-kalite nan ekstrè plant yo ki baze sou iyon molekilè chaje yo sèl ak miltipliye anplis de modèl fragmantasyon karakteristik yo. Pou egzanp, PC nan Begonia bower yo se "Nigra" ekstrè ekspoze yon seri distenk [MH] iyon ki separe pa 288 Da soti nan m/z289 a m/z 1729 ki koresponn ak B-tip PC soti nan monomè nan hexamer ak nan [M{{ 6}}H]' iyon separe pa 144 Da soti nan m/z 1008 rive nan m/z 1296 korespondan pou PC kalite B soti nan heptamers rive nonamers (Tablo S1). Spectre mas yo nan PC monomerik, sa vle di, flavan-3-ols catechin ak epicatechin, te montre yon iyon fragman karakteristik nan m/z 245 jan yo te rapòte deja [3132,36].

An jeneral, MS/MS nan B-type PC dimers te montre modèl fragmantasyon karakteristik yo ki bay iyon nan m/z 287 ak 289(QM clivage), m/z 425, ak 407(RDA fwagmantasyon ak eliminasyon dlo sekans) ak m. /z 451 (HRF; Figi 3). Fragmantasyon RDA yo konsidere kòm modèl fwagmantasyon ki pi enpòtan pou karakterizasyon B-type PC dimers epi yo te panse fragmantasyon an sou inite ekstansyon an enèjik pi favorab paske li pwodui iyon fragman ak yon pi gwo sistèm π-πhyperconjugated pase a. Fragmantasyon RDA sou inite tèminal la [31-33].

2.2.A-Type PC nan Premye Ekstrè Plant ki pa Okside yo

Prezans A-tip PA nan ekstrè plant inisyal yo te konfime pa modèl fragmantasyon karakteristik yo ki sanble ak PAs B-tip. Kòm egzanp, yo montre wout fragmantasyon karakteristik yo ak done MS/MS nan PC dim ak trimer ki gen yon sèl lyezon A-type ak diskite an detay (Figi 4 ak 5). Fragmantasyon an nan A-type PC dimer la pwodui kat iyon fragman (Figi 4). Fragmantasyon RDA nan inite tèminal la te pwodwi yon ion nan m/z 423, ki konfime prezans nan yon lyen kalite A [26,34,35]. Anplis de sa, nou sijere ke fwagmantasyon RDA nan inite ekstansyon an ak pèt sekans dlo a ta ka pwodui ion nan m/z 407. Iyon an nan m/z 449 se pwodiksyon HRF, sa vle di, rezilta pèt la nan inite phloroglucinol [26]. Iyon yo nan m/z 285 ak 289 koresponn ak klivaj QM. Menm jan an tou, A-type PC trimer te montre yon iyon molekilè nan m/z 863 ak iyon fragman karakteristik nan MS/MS nan m/z 711.693.573.559,451,411 ak 289 jan Sui et al.(2016) te rapòte. )[26]. Fragmantasyon RDA nan A-type PC trimer a te pwodwi yon ion nan m/z 711, ki ankò konfime prezans nan A-type lyezon dapre etid anvan an [26] ak sijesyon ke A-type lyen an ta ka ant de ekstansyon. inite yo. Nou sijere ke ion nan m/z 693 koresponn ak pèt sekans dlo a epi li sipòte pozisyon nan lyen kalite A, jan yo montre nan Figi 5. Anplis de sa, nou sijere ke RDA adisyonèl nan bag C heterocyclic nan la. inite terminal flavan-3-ol montre ion nan m/z559. Iyon sa a te minè nan etid nou yo. Iyon yo nan m/z573 ak 289 te koresponn ak klivaj QM nan kosyon ki pi ba entè flavanoid [26]. Nou te detekte iyon tou nan m/z 575 ak 287. Nou pwopoze ke iyon yo nan m/z 451 ak 411 ta ka koresponn ak HRF nan bag C heterocyclic nan inite flavan-3-l mitan an ki sipòte kote a. A-type lyen ant inite ekstansyon yo dapre Figi 5.

2.3.Modifikasyon B-Type PC nan ekstrè plant akòz oksidasyon alkalin

Apre oksidasyon an, PC B-kalite nan ekstrè plant diferan yo te modifye yon fason diferan. Kèk nan echantiyon yo te montre pa gen okenn oswa ti modifikasyon; gade Figi 6A, B, pou egzanp, pou pi kout B-kalite oligomè PC nan ekstrè fèy Begonia bower yo se "Nigra" anvan ak apre oksidasyon. Lè sa yo kalite ekstrè plant yo te soksid, spectre total mas nan ekstrè plant inisyal ak oksidize yo te menm jan an. Sepandan, ti diferans yo te detekte nan done an detay mas spectrometric. Pa egzanp, PC dimer nan m/z 577 te akonpaye ak m/z575, ak PC trimer nan m/z865 ak m/z 863, respektivman. Lè kantite PC yo te ba anvan oksidasyon an, apre oksidasyon an siyal yo prèske disparèt nan spectre mas yo, allusion ke yo te konvèti yo pa idantifye oswa degrade akòz oksidasyon an. Fenomèn sa a te obsève, pou egzanp, pou ekstrè fèy yo nan Combretum Indicum ak Euphorbia characias ki gen kantite ki ba nan kèk oligomè PC kout ak sipòte pa done yo anvan MS / MS ki te montre ke kontni an PA diminye soti nan 4 mg / mL a 1 mg. / mL ak 7 mg / mL a 1 mg / mL, respektivman, akòz oksidasyon an [13]. Fenomèn sa a ta ka gen rapò ak kondisyon eksperimantal yo itilize, sa vle di yo te pi grav lè kontni PA inisyal la te ba. Nan kèk echantiyon, yon pati nan B-tip PC yo te modifye plis, gade Figi 6C, D, pou egzanp, pou pi kout B-tip PColigomers nan ekstrè nan feyè nan Cyperus owoaii anvan ak apre oksidasyon. Lè sa yo kalite ekstrè plant yo te soksid, diferans vizib yo te detekte nan spectre yo mas total ki montre diferans nan mas nan 2 Da an konparezon ak premye PC yo (Figi 6C, D, Tablo S2).

Li se byen li te ye ke oksidasyon an nan polifenol o-dihydroxy, sa vle di, bag B catechol nan PC yo, tipikman bay o-quinones ak yon diferans mas nan 2 Da. An reyalite, nou remake ke kalite oksidasyon sa a ka rive tou nan analiz mas spectrometric. Ka gen siyal minè nan spectre mas yo ki gen valè m/z 2 Da pi piti pase valè m/z PC yo ki koresponn ak oksidasyon posib oswa fòmasyon fòm kinon PC yo pandan ionizasyon an (done yo pa pibliye). Li posib ke isit la nan oksidasyon a alkalin, polifenol o-dihydroxy fòme premye o-quinones yo. Sepandan, 0-fòm kinon ki fòme yo enstab epi pwobableman byen vit reyaji pi lwen. Youn nan rezilta posib yo ta ka konvèsyon oksidatif B-kalite PC yo nan PC A-kalite, jan yo te deja rapòte nan literati a [15]. Transfòmasyon B-tip PC yo nan PC-A-tip enplike nan retire oksidatif nan ion idrid la nan C2 nan C-bag la kòm yon premye etap: kondisyon debaz dominan yo pwovoke oksidasyon nan fonksyonalite o-dihydroxy nan B-bag la. nan yon o-quinone, ki imedyatman sèvi kòm yonoksidanpou konvèsyon B-tip procyanidin dimer nan A-tip youn [15](Figi 7). Mekanis kinon metid sa a te pwouve tou nan diferan tanperati, pH, ak kondisyon katalitik [37], pa oksidasyon radikal lè l sèvi avèk 1,1-diphenyl-2-radikal pikrylhydrazil nan kondisyon net [38] ak pa lakaz ( EC1.10.3.2) [39].

Lè nou etidye PC yo modifye ak diferans mas 2 Da nan ekstrè oksidize yo ak pwodiksyon yo jwenn pa MS/MS, yo te konkli yo sanble ak PC A-type ak iyon fragman yo (jan yo diskite pi wo a nan Seksyon 2.2), montre modèl fragmantasyon karakteristik yo ki bay iyon nan m / z 285 ak 289 (QM klivaj), m / z 423 (RDA fwagmantasyon) ak m / z449 (HRF). Kòm yon egzanp, nou montre konvèsyon nan B-tip PC dimers yo nan feyè ekstrè Microgramma Moritani nan dimè PC A-tip nan Figi 8.ki pa oksidizeekstrè, nou te detekte kat B-type PC dimers ak m/z valè 577 (Figi 8A) men pa gen A-type PC dimers ak m/z valè 575 (Figi 8B). Ti pik yo nan EIC a nan m/z575 koresponn prezimableman ak oksidasyon B-type PC nan sous iyon an kòm tan yo retansyon yo se egzakteman menm jan ak PC-kalite B. Nan ekstrè oksidize a, nou te detekte sèlman tras premye B-tip PC yo nan m/z 577 (Figi 8C), men olye de sa, nou detekte pik entansif nan tan retansyon pita ki koresponn ak A-type PC nan m/z 575 (Figi 8D).Tik pik yo nan EIC a nan m/z577 ki gen menm tan retansyon yo koresponn ak siyal izotopik m/z 575 la. Li dwe remake ke etid sa a te kalitatif, sa vle di ke abondans iyon yo pa kapab. konpare kòm sa yo. Anplis de sa, li dwe remake ke konvèsyon an nan B-tip PC nan A-tip PC pa t 'toujou konplè tankou nan egzanp sa a e ke tout B-tip PC yo pa te konvèti nan A-tip PC; apeprè estime abondans yo nan iyon yo nan A-tip ak B-kalite oligomè PC yo te egal. Nan lòt men an, nan kèk echantiyon, nou detekte plis diferans nan 2 Da; pou egzanp, PC heptamer nan m/z 2017 ta ka akonpaye ak iyon nan m/z2015 ak 2013, allusion nan fòmasyon nan youn ak de lyen A-type, respektivman.

Menm si konvèsyon B-tip PC yo nan A-tip te sanble yo dwe mekanis reyaksyon prensipal la, nou pa ka konplètman eskli lòt reyaksyon modifikasyon. PA yo te prezan kòm melanj konplèks nan ekstrè inisyal ki pa oksidize yo, ak melanj sa yo te menm plis konplèks apre oksidasyon alkalin nan pwodwi yon kantite lajan menmen nan MS done. Pou egzanp, etid anvan yo sou oksidasyon baz katalize ak reyaksyon reyaji nan PA yo te montre ke PC dimers ka konvèse nan diferan pwodwi nan C-bag isomerization, ki gen ladan tetrahydroxypyranochromenes, ke yo rele tou phlorotannins [15]. Pwodwi sa yo ta montre valè m/z ki sanble anpil nan 577 men diferan tan retansyon nan LC ak diferan modèl fwagmantasyon nan MS. Baze sou EIC yo nan m/z 577, nou pa t 'detekte rearanjman kalite sa a nan kondisyon reyaksyon yo itilize yo. Reyajman yo ak ouvèti C-bag heterocyclic la ta ka pwodui lòt pwodwi tou atravè regio-izomerization, epimerization, oswa 13-aryl migrasyon [15]. Epimerizasyon an te sitou ki gen rapò ak pwosesis fabrikasyon epi, pou egzanp, tanperati ki wo ki gen rapò ak torréfaction nan kakawo mennen nan pèt flavan-3-ol, men tou, nan epimerizasyon nan monomè flavan-3-ol, dimè. , ak trimers [40]. Anplis de sa, li te rapòte ke polifenol oksidaz nan vyann fwi bannann te lakòz epimerizasyon (-)-epigallocatechin nan (-)-gallocatechin [41]. Nou te gade posib epimerizasyon flavan-3-ols lè l sèvi avèk EIC nan m/z289, epi an jeneral, nou pa t detekte epimerizasyon enpòtan ki te koze pa oksidasyon alkalin yo te itilize a. Sepandan, nou pa ka konplètman eskli epimerizasyon an kòm nou detekte pi gwo kantite (plis)-catechin an relasyon ak (-)-epicatechin nan ekstrè oksidize nan flè chou Pavonia pase nan ekstrè inisyal ki pa oksidize (Figi S1). Li dwe remake tou ke ekstrè oksidize yo te netralize anvan UHPLC-MS/MS la, ki ka lakòz reyaksyon redox. Nan fòm oksidize yo, kinon yo se elektwofil ki ka reyaji ak dlo nukleofil ki prezan, e sa ka tou senpleman rezilta nan reyaksyon an rediksyon ki bay PC B-kalite, ki ta ka tou eksplike poukisa kèk nan PC yo B-tip te sanble yo pa afekte.

2.4.Modifikasyon A-Type PC nan ekstrè plant akòz oksidasyon alkalin

A-type PC nan ekstrè plant diferan te reyaji yon fason diferan akòz oksidasyon a alkalin. Kèk nan echantiyon yo te montre pa gen okenn oswa ti modifikasyon. Lè sa yo kalite ekstrè plant yo te sibi oksidasyon alkalin, pa gen okenn diferans enpòtan yo te detekte nan spectre yo mas total (pa egzanp, gade Tablo S3 pou iyon yo pi gwo yo obsève nan ekstrè nan fèy nan Aglaonema commutatum var. maculatum anvan ak apre oksidasyon). Sepandan, ti diferans yo ta ka detekte nan done espektwometrik mas detaye yo ki gen diferans mas nan 2 Da ak allusion ke lyen adisyonèl A-kalite etè yo ka fòme. Fenomèn sa a te pi evidan pou kèk nan echantiyon yo ak A-type PC; PC A-tip sa yo te remake yo fòme lyen adisyonèl A-type etè akòz oksidasyon alkalin nan (Figi 9). Lè sa yo kalite ekstrè plant yo te soksid, diferans distenk yo te detekte nan spectre yo mas total ki montre diferans nan mas nan 2 Da an konparezon ak premye PC yo. [MH]-ion nan m/z 863 koresponn pou yon trimer PC ki gen yon lyezon etè kalite A ak ion ki nan m/z 861 pou yon trimer PC ki gen de lyen etè (Figi 9A). ). Menm jan an tou, PC tetramerik ki gen youn, de ak twa lyen etè yo te detekte pa [M -H]-ions yo nan m/z 1151, 1149, ak 1147, respektivman (Figi 9B). , de, ak twa lyezon etè yo te detekte pa [M -H]- iyon yo nan m/z 1439, 1437, ak 1435 ak nan m/z 1727, 1725, ak 1723, respektivman (Figi 9C, D; sepandan, la [M -2H]{2-ion nan m/z 861 nan yon PC hexamer te klèman plis abondan pase [MH]-ion nan m/z 1723 e se poutèt sa, yo montre nan la. figi).

Fòmasyon an nan lyen adisyonèl A-type tou afekte tan yo retansyon nan oligomè sa yo. Nimewo a nan lyen Etè adisyonèl te sanble nan yon sèten mezi ogmante kòm degre yo nan polimerizasyon nan PC yo ogmante, ki espere ke gen plis pozisyon pou lyezon adisyonèl yo. Sepandan, li dwe remake tou ke ka gen siyal minè ak diferans lan mas nan 2 Da ki koresponn ak oksidasyon an posib oswa fòmasyon nan fòm kinon PC yo pandan ionizasyon an, jan yo diskite pi wo a. Pik sa yo vizib tou nan spectre mas yo nan Figi 9 anvan pik prensipal yo ki koresponn ak PC yo. Abondans iyon yo, fòm modèl izotopik yo, ak iyon fragman karakteristik MS/MS te jwenn nan te konfime obsèvasyon lòt lyen etè A-type. Li enpòtan tou pou sonje ke reyaksyon entramolekilè sa yo obsève pa t 'sanble afekte degre an mwayèn nan polymérisation kòm pi wo oligomè yo oswa polymère PA yo pa te detekte nan ekstrè yo oksidize an konparezon ak ekstrè ki pa oksidize. Mouls and Fulcrand (2012) [14] sipòte obsèvasyon an.

2.5.Plant Ekstrè ak PA ki gen tou de sou-inite PC ak PD ak modifikasyon yo akòz oksidasyon akalin.

Anpil nan echantiyon yo genyen PA ak inite (epi)katechin ak (epi)gallocatechin, sa vle di, PA yo te melanj PC/PD. Sò a nan melanj PC / PD sa yo akòz modifikasyon an atravè oksidasyon alkalin te diferan an konparezon ak PC yo. Melanj PC/PD yo te detekte klèman nan ekstrè plant yo anvan oksidasyon an tou de pa UV ak MS; gade, pou egzanp, ti oligomè PA yo nan ekstrè fèy inisyal Podocarpus macrophyllus (Figi 10A ak Tablo S4). Apre oksidasyon an, PA modifye yo te toujou detekte pa UVat 280 nm kòm yon kalite diferan ak/oswa bos reta (Figi S2), men MS pa te detekte yo ankò, gade, pou egzanp, oligomè PA ki manke yo nan fèy oksidasyon an. ekstrè nan Podocarpus microphallus (Figi 10B ak Tablo S4). Nou pa t 'ni detekte okenn lòt siyal ki ta ka koresponn ak modifye PC / PD melanj ni ak pwodwi degradasyon posib yo. Pou egzanp, pou dimè PC a nan m/z 577, nou ta ka detekte korespondan A-type PC dimer nan m/z 575 nan ekstrè oksidize a, men menm jan obsèvasyon diferan pa t 'kapab fèt pou PC/PD dimers oswa trimers (Figi 10B). Rezon ki fè pèt PC/PD oligomè detektab nan ESI-MS kapab, pou egzanp, reyaksyon entèmolekilè ant PA [13-15,24,25]. Reyaksyon entèmolekilè yo konnen ki lakòz fòmasyon PA modifye pa koneksyon an nan de chenn oligomerik distenk, epi tipikman, yo mennen nan yon ogmantasyon nan degre mwayèn nan polimerizasyon [14]. Pou egzanp, Vernhet et al. (2014) te remake pa ti-ang X-ray dispèsyon eksperyans ke si PA yo soksid nan solisyon konsantre, PA modifye yo se polymère segondè ak chenn long lineyè oswa branch [25]. Pli lwen oksidasyon ka mennen tou nan sikilasyon ant A ak B bag nan diferan PA [24]. Anplis de sa, li te note ke nouvo lyezon ak estrikti sa yo rezistan a klivaj asid katalize, ak Se poutèt sa, ogmantasyon nan degre an mwayèn nan polymerization ka estime sèlman pa metòd ki pa depolymerizing [14,24. Sepandan, rezilta nou yo te montre ke PA modifye sa yo pa detekte anba kondisyon estanda ESI-MS yo itilize pou PA (Figi 10). Nan etid anvan nou an, nou te itilize yon metòd ki baze sou siveyans reyaksyon chwazi pa trip quadrupole pou detekte PA yo nan echantiyon ki pa oksidize ak oksidize epi nou remake ke konpozisyon subunit la chanje akòz oksidasyon alkalin lan, kidonk metòd la pa t kapab detekte ankò. PA yo modifye [13]. Rezilta MS-wo rezolisyon prezan yo sipòte obsèvasyon anvan nou yo pa trip quadrupole ke PA modifye yo nan ekstrè oksidize yo pi konplèks pase PA inisyal yo nan ekstrè ki pa oksidize yo e ke yo pa detekte nan menm kondisyon UPLC-MS/MS. [13].

Metòd yo itilize pou oksidasyon PA yo nan literati yo pito diferan de metòd nou an, ak Se poutèt sa, rezilta yo ka pa dirèkteman konparab [14,24,25]. Nan etid anvan yo, oksidasyon an te fèt nan dlo asidifye ak asid trifluoroacetic nan pH 3.5 yo nan lòd yo imite pH diven an, ak oksidasyon aktyèl la te jwenn pa brase echantiyon an nan prezans lè pandan plizyè jou [14,24, 25]. Nou itilize oksidasyon alkalin pa tanpon kabonat nan pH 10 sèlman pou yon èdtan.

Pifò nan ekstrè plant yo enplike PA ak tou de PC ak PDsubunits, epi sèlman nan de echantiyon, PA yo ta ka konsidere prèske PD pi. De echantiyon sa yo te ekstrè Callisia gentlei varelegans ak Pellaea ooata. Yo te detekte PD kalite B yo nan Callisia dou var. Elegans ekstrè anvan oksidasyon an; gade, pou egzanp, ti oligomè PD yo nan Tablo S5, men apre oksidasyon an, MS pa detekte PD sa yo ankò. Nou pa t 'ni detekte nenpòt lòt siyal ki ta ka koresponn ak PD yo modifye ni ak pwodwi degradasyon posib yo. Sepandan, kèk nan PA modifye yo te toujou detekte pa UV nan 280 nm kòm yon bos pi ba ak reta (Figi S3). Enteresan, anvan oksidasyon an, yo te detekte PD trimerik A-type nan ekstrè done Pellaea a, epi apre oksidasyon an, siyal sa yo te toujou prezan, men entansite yo te pi ba anpil.

pa MS epi, anplis, valè m/z ki koresponn ak fòmasyon anplis A-type lyen nan PD trimers yo te detekte menm jan ak A-type PC (Tablo S6). Sa a ka endike ke anplis de reyaksyon entèmolekilè yo obsève pou PD homo-ak etewojèn B-kalite, PD-kalite A ta ka gen menm reyaksyon entramolekilè ki te detekte pou PC A-tip.

2.6. Galoulated PA nan ekstrè plant ak modifikasyon yo akòz oksidasyon alkalin

Kèk nan plant yo te genyen PA galoylated. Prezans PC yo, PD, ak PC/PD nan ekstrè plant yo te konfime pa modèl fragmantasyon karakteristik yo. An jeneral, fwagmantasyon PA gallovlated nan analiz MS te fèt menm jan an atravè RDA., HRF, ak mekanis QM jan yo te diskite pi wo a [31-33]. Kòm yon egzanp, chemen an fragmantasyon karakteristik ak done MS/MS nan yon dimè PC galloylated nan ekstrè nan fèy Ruprechtia salicifolia yo montre epi diskite an detay (Figi 11). Pozisyon gwoup galloyl la se sèlman indicatif, epi li ta ka tache ak nenpòt lòt gwoup idroksil gratis nan inite tèminal la. Iyon nan m/z603 se pwodiksyon HRF. Iyon yo nan m/z 287 ak 441 koresponn ak klivaj QM. Anplis de sa, nou te detekte klivaj gwoup galloyl la ki te lakòz ion ki koresponn ak PC dimer nan m/z577 ak fwagmantasyon RDA ki vin apre ak yon ion nan m/z425 ak plis klivaj dlo ak yon ion nan m/z 407. HRF nan m/z 577 te pwodwi iyon fragman nan m/z 451. Anplis de sa, nou te detekte iyon ti fragman nan m/z 109,123, ak 125, ki koresponn ak bag aromat yo. PA galloylated yo te kapab genyen plizyè gwoup galloyl nan estrikti yo (Tablo S7).

Diferan PA galloylated yo te konpòte yon fason diferan pandan oksidasyon ayeryen an nan kondisyon alkalin. Galoylated PC yo te pito ki estab epi yo te reyaji menm jan ak PC ki pa galoylated. Pou egzanp, pa gen okenn chanjman remakab detekte pou PC yo galloylated ki gen yon gwoup galloyl nan estrikti yo nan ekstrè nan fèy oksidize nan Nepenthes maxima (Tablo S7). Sepandan, li dwe remake ke entansite iyon yo pou PC galloylated yo ki gen de oswa plis gwoup galloyl yo te pi ba nan ekstrè oksidize Nepenthes maxima ak, pou egzanp, pentamè PC galloylated yo ak plizyè gwoup galye yo pa te detekte ankò (Tablo S7). Valè nonb antye relatif m/z pou kèk PC galloylated yo sanble ak valè m/z pou PC/PDs e, se poutèt sa, MS a rezolisyon ultrawo obligatwa. Pou egzanp, m/z 881 koresponn ak yon PA trimerik ki gen de PC ak yon inite PD (C4sH3; O19, mcalculated 882.20074) ak yon dimè PC galloylated ki gen de gwoup galloyl (C44H34O20, mcalculated, 882.16435 kèk echantiyon). tankou nan ekstrè nan fèy oksidize nan Coccoloba uvifera, PC galloylated yo te konvèti nan PC galloylated A-type akòz oksidasyon, menm si PA yo galloylated nan ekstrè inisyal la te sanble yo sanble ak sa yo ki nan Nepenthes maxima. Pou egzanp, dimè PC atribye ba ki gen yon gwoup galloyl epi ki montre yon iyon m/z 729 (Tablo S7) te estab pandan oksidasyon alkalin nan ekstrè fèy Nepenthes maxima men an pati modifye nan ekstrè fèy Coccoloba ugifera ki montre iyon tou de nan m. /z 727 ak 729. Ansyen iyon an te koresponn ak yon PCdimer galloylated A-type (m/z727.13148, C37H2O16) e li te montre karakteristik MS/MS fragman sipòte A-type linkage: m/z601(HRF pwodwi m/z). 727),575(A-type PCdimer), 557 (klivaj dlo nan m/z575),449 (HRF nan m/z575, gade figi 4),423 (RDA nan m/z 575, gade figi 4),285 (QM nan m/z575, gade figi 4), 169 (asid galik), 125 (gade figi 11) ak 109 (gade figi 11). Youn nan rezon ki fè diferans sa yo nan PA ki sanble ant ekstrè plant yo ta ka lòt konpoze ki prezan nan ekstrè yo epi ki afekte reyaksyon PA yo.

Melanj PC/PD galloylated ak PD yo te reyaktif ak modifye menm jan ak melanj PC/PD ki pa galoylated ak PD yo. Apre oksidasyon, PA sa yo pa te detekte pa MS menm si yo te toujou vizib nan UV nan 280 nm. Nou pa t 'detekte okenn lòt siyal ki ta ka koresponn ak PA modifye sa yo ni ak pwodwi degradasyon posib yo. Nan yon sèl echantiyon, sètadi nan fèy akasya karroo, PD yo modifye galloylated ak nongalloylated pa te detekte pa UV nan 280 nm tou.

Nan etid anvan nou an [13], kote PA nan ekstrè ki pa oksidize ak oksidize yo te analize pa metòd siveyans reyaksyon chwazi, nou remake ke yo te detekte yon bos galloyl klè ak metòd MS / MS galloyl espesifik nan echantiyon oksidize yo, men fòm nan. nan bos la te chanje ak deplase kòmsadwa nan bos la obsève nan chromatogram UV la. PA gallovlated orijinal yo te modifye nan yon fason ke galloylgroup la te kapab toujou detekte ak metòd siveyans reyaksyon chwazi [13]. Etid anvan yo sou (-)-epigallocatechin galat ak (-)-epigallocatechin te montre ke trihydroxyphenyl B-bag la se sit prensipal la nan aksyon pou oksidasyon e ke pa gen okenn pwodwi detekte ki soti nan oksidasyon nan galoyl la [42]. Sepandan, kondisyon reyaksyon yo itilize yo ak pwodwi oksidasyon yo jwenn yo te jistis diferan an konparezon ak etid nou an kòm oksidasyon an te fèt ak radikal peroksil ki te pwodwi pa thermolysis nan inisyatè azo 2,2'-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile) [42].

Anplis de PA galloylated, de echantiyon, sètadi Cephalotaxus harringtomia subsp. feyè drupaceous ak fèy Laurus nobilis te sanble yo genyen PC glikozile ki gen yon sèl inite sik tache ak yon estrikti PC. Gen kèk nan glycosylated B-tip PC sa yo te remake konvèti nan glycosylated A-type PC pandan oksidasyon alkalin la san klivaj inite sik la. Anplis de sa, yo te detekte fòmasyon nan lyen etè adisyonèl nan A-type PC yo.

3. Materyèl ak Metòd

Koleksyon materyèl plant yo, pwosesis yo, ak ekstraksyon, anplis de oksidasyon nan pH 1{{10}}, te fèt jan yo te rapòte anvan [13]. Premye etid la te genyen 102 echantiyon, nou analize yon lòt 55 echantiyon (Tablo S8). Pou oksidasyon ayeryen an, yo te soksid 20μLof chak ekstrè ak 18{{40}}uL pH 1{{60}}tanpon pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Oksidasyon te sispann lè yo ajoute 100 uL nan 0.6 pousan akeuz HCOOH. Anplis de sa, 280 μLof dlo te ajoute nan 20 μL nan inisyal la ki pa oksidize anvan analiz la yo nan lòd yo jwenn volim nan fen 300 uL pou tou de echantiyon ki pa oksidize ak oksidize. Analiz mas espektwometrik ultrawo rezolisyon an te fèt pa yon UPLC-DAD-ESI-QOrbitrap-MS/MS. Enstriman an konsiste de yon sistèm Acquity UPLC (Waters Corp., Milford, MA, USA) makonnen ak yon espektwomèt mas quadrupole-Orbitrap (QExactiveTM, Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen, Almay). Kolòn yo te itilize a se yon kolòn Acquity UPLC BEH Phenyl (2.1 × 100 mm, 1.7 um, Waters Corp., Wexford, Iland). Eliyan yo te A= asetonitrile ak B=0.1 pousan HCOOH. Yo te itilize yon pousantaj koule 0.5 mLmin-1, epi pwofil elisyon an te jan sa a:0-0. 5 min,0.1 pousan A nan B (izokratik);0.5-5 min,0.1-30 pousan A nan B (gradyan lineyè);5-6min,30 pousan {{44} } pousan A nan B(lineyè gradyan);6-6.1 min, 35-90 pousan A nan B (lineyè gradyan); 6.1-9.5 min, lave kolòn ak re-ekilib. Volim piki a te 5μL. Done UV （λ=190-500nm) ak MS yo te anrejistre pandan analiz la. Iyonizasyon negatif yo te itilize nan yon sous ESI chofe ak yon vòltaj espre nan -3.0 kV, gaz djenn (N2) pousantaj koule nan 60, to koule gaz oksilyè (N2) nan 20, pousantaj koule gaz bale nan 0, tanperati kapilè a nan plis 380 degre ak nan-sous kolizyon-induced dissociation (CID) nan 30 eV. Pou MS eskanè konplè, ranje mas orbitrap la te m/z150-2250, rezolisyon 35,000, ak kontwòl otomatik 3×10*. Pou analiz MS/MS, sètadi dd-MS2(TopN), paramèt yo te sa ki annapre yo: TopN 3; Enèji kolizyon nòmalize etap 20, 50, ak 80 eV, rezolisyon an 17,500, ak kontwòl otomatik 1 × 105. Kalibrasyon an te fèt pa Pierce ESI Negative Ion Calibration Solution (Thermo Fisher Scentific Inc., Waltham, MA, USA). Done yo te trete ak lojisyèl Thermo Xcalibur Oral Browser (Version 3.0.63, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Kòm echantiyon oksidize yo te jwenn lè l sèvi avèk tanpon kabonat sodyòm (pH 10), sodyòm te fòme iyon grap ak asid fòmik pandan analiz UHPLC-MS/MS. Se poutèt sa, nan kòmansman chak chromatogram iyon total nan echantiyon oksidize, yo te detekte yon gwo pik nan grap fòma sodyòm (Tablo S9). Modèl la te fasil detekte epi li pa afekte analiz PA yo. MS / MS iyon fragman nan ti oligomè PA yo prezante nan Tablo S10.

4. Konklizyon

Nan etid sa a, nou analize konpozisyon PA nan 55 ekstrè plant anvan ak apre oksidasyon alkalin pa ultrahigh-rezolisyon UHPLC-MS/MS (Table S8). Estrikti PA natirèl yo te genyen PC, PD, ak PC/PDmixtures A-ak B-tip anplis de sa yo atribye ba yo. Konpozisyon PA yo te konplèks, ak MS ultrawo rezolisyon yo te bezwen pou mezire mas egzak yo ak fòmil molekilè ki koresponn nan divès PA yo. B-tip PC nan ekstrè plant diferan yo te pito ki estab epi yo pa montre okenn modifikasyon oswa ti kras akòz oksidasyon alkalin la. Pou kèk echantiyon, nou detekte reyaksyon intramolekilè PC yo ki pwodui lyen etè A-type. A-type PC yo te pito estab tou san okenn modifikasyon oswa ti modifikasyon, men, nan kèk plant, yo te detekte fòmasyon nan lyen etè adisyonèl. Ekstrè plant ki gen inite PD nan PA (swa PD pi oswa melanj PC/PD) te pi reyaktif. Apre oksidasyon alkalin, PA sa yo oswa pwodwi oksidasyon yo pa te detekte pa MS, menmsi yon diferan kalite ak / oswa reta PA bos te toujou detekte pa UV nan 280nm. Reyaksyon entèmolekilè ant PA yo pwobableman modifye PA sa yo pou yo pa detekte yo anba kondisyon estanda ESI-MS yo. Etid anvan yo te montre ke PA modifye sa yo pa ka etidye swa pa metòd degradasyon. Se poutèt sa, yon nouvo metòd analyse ta dwe bezwen pou idantifikasyon yo ak karakterizasyon yo. PA Galoylated yo te relativman estab anba oksidasyon alkalin si yo te baze sou PC, men lyen etè adisyonèl yo te fòme sipòte konvèsyon nan PAs galloylated B-tip nan PA galloylated A-tip. PA ki gen de oswa plis gwoup galloyl yo te pi reyaktif pase sa yo ki gen yon sèl gwoup. Melanj Gallovlated PC / PD ak PD yo te pi reyaktif epi yo te reyaji menm jan ak sa yo ki pa galloylated. Sepandan, li ta dwe remake ke reyaksyon yo entra- ak entèmolekilè pa t 'esklizyon, ak reyaksyon sa yo ka rive ansanm. Anplis de sa, matris plant la ak lòt konpoze prezan afekte entèraksyon sa yo.