Cistanche Tubulosa Pwoteje Newòn Dopaminèrjik Atravè Règleman Apoptoz ak Faktè Neurotrofik Derivan Selil Glial: An Vivo Ak In Vitro-Ⅰ

ENTWODIKSYON

Maladi Parkinson la (PD) se yon maladi neurodegenerative komen ki rive nan granmoun aje ak manifestasyon patolojik nan pèt newòn dopaminergic nan sibstans nwa a (SN) akòz koripsyon. Se gravite maladi a ki gen rapò ak pèt selil newòn dopamine (DA) nan SN a, ki konsistan avèk opinyon ke pwosesis neurodegenerative la ap pwogrese pandan plizyè ane anvan nenpòt sentòm parèt (Sawle ak Myers, 1993). Nati pwogresif maladi a sijere posiblite enteresan pou entèvansyon terapetik pa bloke pwosesis neurodegenerative ki kache. Rechèch la pou terapi-induit aksyon pisan ak espesifik nan faktè nerotwofik sou siviv newòn DA se poutèt sa nan enterè konsiderab.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOZA POU PWOTEJE NEURON DOPAMINERJIK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Faktè nerotwofik yo se pwoteyin esansyèl, ki gen ladan faktè kwasans nè (NGF), faktè nerotwofik ki sòti nan sèvo (BDNF), ak faktè nerotwofik ki sòti nan selil glial (GDNF), ki ankouraje kwasans nè, devlopman newolojik, konsèy axonal, ak fonksyon newòn. Pami tout faktè nerotwofik ki pwoteje ak ankouraje reparasyon nan newòn dopaminergic, GDNF gen efè ki pi fò (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Yo te montre GDNF posede efè nerotwofik ki pisan sou newòn DA nan vitro (Lin et al., 1993) ak fè egzèsis efè neuroprotective nan vivo. Yo montre ke GDNF sove newòn DA nigral yo soti nan lanmò selil blesi yo apre axotomi chirijikal oswa toksin nan rat (Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) ak pasyèlman tou apre. administrasyon sistemik nanN-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)nan sourit (Tomac et al., 1995). Ogmantasyon ensidans newòn apoptoz ak redwi efè pwoteksyon faktè nerotwofik, ki kapab deklanche pa divès kalite faktè patolojik, kache koripsyon newòn dopaminèrjik (Holden et al., 2006).

C. tubulosa se yon medikaman èrbal ki soti nan plizyè plant nan genus Cistanche. Li se yon pi gwo opsyon terapetik pou sendwòm defisyans ren ki gen rapò ak òmòn androjèn nan medikaman tradisyonèl Chinwa (TCM). Jiska dat, anpil rechèch klinik ak debaz sou C. tubulosa te montre aktivite maladi neurodegenerative. Idantifikasyon preskripsyon TCM ki tonifye ren nan tretman PD ka konsa bay yon tretman klinik altènatif pou PD.Echinacoside (ECH)se yon gwo konpozan byoaktif yo te jwenn nan zèb medsin C. tubulosa. Etid yo montre efè terapetik nan glikozid Cistanche ak ECH,verbascoside(VER), ak icariin (ICA) sou maladi alzayme a (AD), PD, ak lòt pasyan demans vaskilè (Urano and Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) sigjere ke C. tubulosa ekstrè ki genyen ase ECH ak acteoside amelyore malfonksyònman kognitif ki te koze pa A -42 atravè bloke depo amiloid ak ranvèse fonksyon newòn kolinerjik ak ipokanp dopaminergic. Tao et al. (2015) te jwenn saglikozid feniletanoidsoti nan C. tubulosa (Ph Gs-Ct) anpeche èdèm serebral wo-altitid pa diminye ekspresyon pwoteyin ak mRNA nan AQP4 nan tisi nan sèvo nan modèl rat.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT SNACKS AMELYORE MEMWA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Etid anvan yo te montre ke konpoze èrbal Chinwa, ki gen ladan twa engredyan yo nan C. tubulosa, epimedium, ak rhizoma polygonati, soulaje domaj nan newòn dopaminergic ak ogmante nivo nan dopamine pa reglemante ekspresyon an nan faktè nerotwofik (Wu et al., 2013). Kidonk, li poko konnen si efè neuroprotective C. tubulosa-induit yo dire lontan ak nan ki pwen sekou nan newòn nigral DA pa administrasyon GDNF ka peye siyifikatif prezèvasyon nan konpòtman motè ki enpòtan pou sentòm PD bèt yo. Etid sa a te itilize yon resèt TCM kidney-tonifying, C. tubulosa nanopowder, ki te resevwa yon patant nasyonal (nimewo patant: 2011103028541) nan Lachin e li te deja montre yon sèten efè terapetik nan PD. Etid la prezan, Se poutèt sa, te fèt pou egzamine efè neuroprotective ak rejeneratif tretman C. tubulosa ak mennen ankèt sou apoptoz sou selil MES23.5 yo ak rat konpòtman definitif, ak règleman GDNF, jan yo mezire pa yon batri tès sib. .

MATERYÈL AK METÒD

Materyèl, reyaktif, ak ekipman

C. tubulosa te achte nan men Beijing Tong Ren Tang Group, Co, Ltd., Beijing, Lachin. ECH, VER, ak ICA te soti nan Enstiti Nasyonal pou Kontwòl Manje ak Dwòg, Lachin. Liy selil newòn MES23.5 dopaminergic la se te yon kado nan men Pwofesè Biao Chen, Laboratwa nerobyoloji, Capital Medical University, Beijing, Lachin. Yo te achte senkant sourit gason C57BL/6 (ki peze 20-25 g chak) nan Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (nimewo lisans: SCXK 2012-0002), Shanghai, Lachin.

MPP +, MTT, ak glutamin yo te achte nan men Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA); DMEM/F12 medyòm ak serom fetal bovine te achte nan men Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA); ak estanda MPTP, DA ak estanda asid homovanillik (HVA) te achte nan men Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). -aktin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF fanmi reseptè alfa (GFR 1) ak antikò Ret yo te achte nan men Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA); 3,3'-diaminobenzidine (DAB) tach reyaktif twous te achte nan Fuzhou Maixin Biotech., Ltd (Fujian, Lachin); ak twous preparasyon echantiyon jèl SDS-PAGE, twous deteksyon ultrasensitive améliorée chemiluminescence (ECL) ak tès asid bicinchoninic (BCA) te achte nan men Beyotime Institute of Biotechnology (Beijing, Lachin).

Etid sa a te itilize enstriman sa yo: ELX800 microplate reader (Bio Tek Winooski, VT, USA); CO2 enkibatè (Heraeus, Hanau, Almay); Gel DOC 2000 jèl sistèm analiz imaj, selil elektwoforèz ak tank elektwoforèz (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); Analizè pwoteyin DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); 5417R gwo vitès frijidè santrifujeur (Eppendorf, Hamburg, Almay); SXQM doub moulen boul planèt (Changsha, Tencan Powder Technology Co, Ltd, Hunan, Lachin); MM400 mixer moulen (Retsch GmbH, Haan, Almay); Agilent 1200 segondè-pèfòmans likid kromatografi (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); Elektwoforèz PowerPac Basic, PowerPac Basic transmembrane transfè sistèm, Universal Hood II chemiluminescence imager, S1000 Thermal Cycler RNA transkripsyon ranvèse sistèm (Bio-Rad); Motic Med 6.0 tisi ak selil analiz sistèm (Motic Lachin Group, Co., Ltd, Xiamen, Lachin).

Preparasyon pouC. tubulosaNanopoud

C. tubulosa te peze, Lè sa a, pirifye ak dezidrate. Apre pulverizasyon konvansyonèl yo, yo te pase poud amann C. tubulosa nan yon 200-swa may epi li seche nan friz. Yo te itilize yon vakyòm tanperati-kontwole ak gwo enèji boul moulen pou prepare C. tubulosa nanopowder la. Premyèman, anvan tout koreksyon C. tubulosa nanopowder te mete nan yon tank vakyòm boul-fraisage ki te chaje ak carbure fanm k'ap pile voye boul. Rapò ki genyen ant voye boul yo fanm k'ap pile ak C. tubulosa nanopowder varye ant 15:1 ak 5:1. Pou jwenn yon poud amann, vitès ak dire moulen boul gwo enèji yo te fikse a 300 rpm ak 20 min, respektivman. Te poud amann lan peze pou pwosesis nan nanokal materyèl ak trete nan moulen mixer a ak yon frekans nan 25 / s ak osilasyon nan 20s pou twa repetisyon. PBS te itilize pou fonn ak prepare yon solisyon stock 25 mg / mL, ki te swiv pa 30 min nan ultrasonication, otoklav, epi finalman depo nan -20 ◦C.

Kontwòl Kalite Konpozan Aktif nanC. tubulosapa HPLC

ECH ak VER te genyen elisyon gradyan ak silica octadecylsilan-bonded kòm filler, metanol kòm faz mobil A, ak 0.1% solisyon asid fòmik kòm faz mobil B. Longèdonn deteksyon an te 330 nm. ICA a te genyen elisyon gradyan ak silica octadecylsilan-bonded kòm filler ak acetonitrile-dlo (30:70) kòm faz mobil la. Longèdonn deteksyon an te 270 nm. Yo te mezire echantiyon, kontwòl ak kontwòl negatif kòm 10 µL chak pou tès la.

Kilti Selil ak MTT Assay pou Mezire Viabilite MPP+-Selil trete

Selil MES23.5 yo te vaksinen ak 5% serom ti towo bèf fetis la, 1% glutamin, 2% 50× solisyon Sato a, ak mwayen DMEM/F12 ak 2% penisilin/streptomycin. Yo te enkube a 37 ◦C nan yon enkibatè 5% CO2 ak imidite satire. Selil yo te izole ak pase ak 0.25% trypsin ak sispansyon selil la te rekòlte nan faz kwasans logaritmik la. Selil izole ak yon dansite 1 × 105 yo te simen nan plak byen 96-polylysine-kouvwi, ki te swiv pa adisyon nan konsantrasyon final diferan (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 ak 800 µmol/L). ) nan MPP + medya yo. Selil MES23.5 ki te enkube ak mwayen kilti nòmal pou 24 èdtan ak 48 èdtan yo te itilize kòm kontwòl negatif nan eksperyans yo in vitro. Selil ki soti nan gwoup tretman diferan yo te enkube ak reyaktif MTT pou 4 èdtan. Apre sa, solisyon an nan pwi yo te jete epi yo te ajoute 150 µL DMSO epi osile pou 10 min. Absorbans chak echantiyon nan yon longèdonn 570 nm te mezire lè l sèvi avèk yon lektè mikroplat otomatik. Pousantaj nan viabilite selil (%)=vle di absorpsyon nan gwoup la eksperimantal / vle di absorpsyon nan gwoup la kontwòl negatif × 100%.

Yo te ajoute konsantrasyon enpòtan nan mwayen MPP+ pou tretman 24-èdtan nan selil MES23.5 lè l sèvi avèk menm apwòch ak kilti in vitro. Apre tretman an, solisyon an nan pi a te jete. Medya ki gen diferan konsantrasyon (10, 50, 100, 200, 250, 500, ak 1000 µg/mL) nan C. tubulosa nanopowder te ajoute nan selil MES23.5 yo nan diferan pwi epi kite yo enkubate pou 24 èdtan ak 48 èdtan. Selil MES23.5 yo ki te enkube ak mwayen kilti nòmal pou 24 èdtan ak 48 èdtan yo te itilize kòm kontwòl negatif. Selil MES23.5 yo ki te enkube ak mwayen MPP + yo te itilize kòm veyikil la. Mezi yo te fè an triple pou chak echantiyon. Yo te mezire absorpsyon nan gwoup tretman ak kontwòl korespondan yo pou kalkile viabilite selil yo.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT ANTI FATIG PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ekspresyon TH mezire pa imunositochimi

Lè C. tubulosa nanopowder te nan 100, 200, ak 250 µg/ml, pousantaj siviv selil la ogmante anpil (Figi 2G). Kidonk, nan eksperyans ki vin apre yo, nou teste twa konsantrasyon yo: gwoup dòz ki ba, dòz mwayen, ak gwoup dòz segondè. Yo te teste twa replikasyon pou chak gwoup C. tubulosa. Yo te mete kouvèti esterilize, ki kouvri ak polilizin nan plak 6-byen yo. Apre sa, 5 × 104 selil yo te simen nan chak pi ak enkubasyon pou 24 èdtan. Mwayen fre konvansyonèl yo te ranplase nan gwoup kontwòl nòmal la epi yo te ranplase yon konsantrasyon final 100 µmol/L MPP+ nan gwoup tretman ki rete yo pou enkube pou 24 èdtan. Medya fre konvansyonèl yo te ranplase nan gwoup kontwòl nòmal ak machin yo, epi konsantrasyon final 100, 200, ak 250 µg/mL C. tubulosa nanopowder yo te enkube ak selil yo pou 24 èdtan nan dòz ki ba, modere ak segondè. C. gwoup tretman tubulosa, respektivman. Selil MES23.5 yo nan diferan gwoup yo te lave twa fwa nan PBS pou retire supernatant la epi yo te fikse plis nan paraformaldeyid 4% pou 15 min. Apre yo fin lave ak PBS, selil yo te enkube ak yon bloke peroksidaz nan 37 ◦ C pou 30 min ak Lè sa a, lave ankò ak PBS. Yo te itilize yon solisyon 0.2% Triton X-100 pou pèmeabilizasyon selilè pou 10 minit, ki te swiv pa lave ak PBS. Yo te ajoute serom kabrit nòmal nan chak echantiyon epi enkube nan tanperati chanm pou 30 minit. Lè sa a, yo te retire serom kabrit nòmal la epi yo te ajoute antikò prensipal la dilye 1:400 nan PBS nan chak echantiyon epi yo te enkube nan 4 ◦C lannwit lan. Selil yo nan gwoup kontwòl negatif yo te enkube ak PBS nan 4◦C lannwit lan. Apre yo fin lave ak PBS, selil yo te enkube ak antikò segondè ki make biotin nan chanm imidite a nan 37 ◦ C pou 20 min. Lè sa a, chak echantiyon yo te lave nan PBS epi make ak refor peroksidaz-streptavidin konjige (solisyon k ap travay C) nan 37 ◦ C pou 20 min. Apre yo fin lave ak PBS, selil yo te tache ak reyaktif DAB nan fè nwa a pou apeprè 1-10 minit epi yo te kontwole devlopman nan yon koulè mawon anba mikwoskopi limyè. Lè sa a, chak echantiyon yo te lave de fwa nan dlo distile pou 1-2 min ak nwayo yo te counterstained ak solisyon ematoksilin pou 0.5-1 min. Apre byen rense chak echantiyon nan dlo, selil yo te benyen nan 1% alkòl asid idroklorik pou diferansyasyon ak 1% amonyak akeuz, ki te swiv pa byen lave selil yo nan dlo. Lè sa a, selil ki soti nan chak echantiyon yo te dezidrate nan 70% etanòl pou 2 min, 80% etanòl pou 2 min, 90% etanòl pou 2 min de fwa, 95% etanòl pou 2 min de fwa, ak 100% etanòl pou 2 min de fwa. Lè sa a, selil yo te benyen nan solisyon xylene pou 2 min de fwa epi monte sou yon glise vè ak rezin net. Anba mikwoskospi limyè, chak echantiyon te sibi kaptire imaj ak seleksyon owaza nan 5-10 jaden vizyèl efikas pou detèmine ekspresyon de pwoteyin chwazi nan newòn dopaminergic ki endike pa entansite patikil mawon yo ak semi-quantifier kontni an pwoteyin pa valè mwayèn gri li yo. .

Pousantaj apoptoz nan selil MES23.5 mezire pa sikometri koule

Selil aderan yo te lave yon fwa ak PBS. Pou izolasyon selil yo, yo te ajoute yon kantite apwopriye nan solisyon tripsin san EDTA nan tanperati chanm epi yo te pipete solisyon an dousman pou pèmèt selil aderan yo detache. Lè sa a, yo te ajoute yon mwayen kilti selil pou sispann tripsinizasyon an. Yo te transfere melanj lan nan yon nouvo tib santrifujeur ak Lè sa a, santrifuje pou 5 min nan 1500 rpm kolekte selil yo izole. Apre yo fin jete sipènatant la, yo te repoze ti grenn selil la dousman lè l sèvi avèk PBS, epi yo te konte selil yo. Apeprè 1 × 105 a 5 × 105 selil resuspend yo te santrifuje pou 5 min nan 1500 rpm epi yo te jete supernatant la. Yo te ajoute senk mikrolit solisyon obligatwa Annexin V-FITC nan granules selil la pou dousman resuspend selil yo. Yon lòt 5 µL nan Annexin V-FITC te ajoute ak melanje byen. Yo te itilize senk mikrolit solisyon yòd propidium pou tach selil lè yo enkubasyon nan tanperati chanm pou 10 minit yon ti tan anvan sikometri koule a.

Western blot analiz pouan vitro

Selil yo te divize an yon gwoup nòmal, MPP + gwoup tretman, ki ba-dòzC. tubulosagwoup tretman, gwoup tretman C. tubulosa dòz modere, ak gwoup tretman C. tubulosa gwo dòz. Ekspresyon Bcl2 ak Bax yo te mezire nan chak. Yo te itilize yon total de 1 × 105 selil pou chak pi nan 6-plak la byen pou modèl ak tretman nan chak gwoup anvan rekòlte selil yo. Yo te ajoute yon lisat melanje, ki gen tanpon RIPA, inibitè pwoteaz, ak inibitè fosfataz, pou liz selil yo pou 30 minit sou glas. Apre santrifujasyon, yo te itilize supernatant la pou analiz pwoteyin. Pwoteyin total la te mezire lè l sèvi avèk yon tès BCA epi separe pa 10% SDS-PAGE. Pwoteyin ki separe yo te transfere nan yon manbràn ak enkubasyon ak yon tanpon ekreme-bloke lèt 5% nan tanperati chanm pou 2 èdtan. Lè sa a, manbràn nan enkube nan antikò prensipal (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0.11 mg/ml, 1:200 dilution) nan 4◦C lannwit lan. Apre yon etap lave, yo te enkube manbràn nan nan yon antikò segondè (0.5 mg / ml, 1:5000 dilution) nan 4 ◦ C pou 1 èdtan ak Lè sa a, nan pwomotè ECL pou 2 minit pou devlopman konvansyonèl yo. Kantite Yon lojisyèl te itilize pou analiz semi-kantitatif ekspresyon pwoteyin.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU ANTI FATIG PWOTEJE FWA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Modèl bèt eksperimantal ak administrasyon dwòg

Senkant espesifik-patojèn-gratis 8-semèn sourit gason gason yo te owaza divize an senk gwoup: yon gwoup nòmal, gwoup tretman MPTP (Veyikil), ki ba-dòz C. tubulosa gwoup tretman, modere-dòz C. tubulosa tretman. gwoup, ak gwo dòz C. tubulosa gwoup tretman. Bèt yo te loje nan 20-22◦C ak aksè gratis nan manje ak dlo. Sourit yo nan gwoup nòmal la te enjekte intraperitoneally ak yon volim egal nan saline nòmal pandan sèt jou youn apre lòt. Sourit yo nan lòt gwoup tretman yo te enjekte intraperitoneally ak MPTP (30 mg/kg/d) pandan sèt jou youn apre lòt pou etabli machin yo.

Pandan modèl PD, sourit yo nan gwoup tretman C. tubulosa ki ba-dòz, modere-dòz ak gwo-dòz yo te administre intragastrik volim klinik ekivalan 4 g/kg/d, 8 g/kg/d, ak 16 g/ kg/dC. tubulosa nanopowder, respektivman, pou 14 jou youn apre lòt. Sourit yo nan gwoup kontwòl ak veyikil yo te administre entragastrik volim ekivalan saline nòmal pou 14 jou youn apre lòt. Tout pwosedi eksperimantal yo te apwouve pa Komite Etik nan Fujian University of TCM epi yo te fèt dapre prensip entènasyonal yo aksepte pou itilizasyon ak swen bèt laboratwa. Tout efò yo te fè pou minimize soufrans bèt nan etid sa a.