Cistanoside A Media P38/MAPK Pathway Pou Enpeche Aktivite Osteoclast

Résumé

BIZON:Cistanoside Agen laefè anti-enflamasyon, antioksidasyon,diminye domaj ren, ak anti-osteyopowoz la, men efè li soudiferansyasyon osteoklast, fonksyon ak mekanis molekilè ki kache rete klè. OBJEKTIF: Pou envestige efè aCistanoside Asouosteoklastdiferansyasyon akresorption zopwovoke pa activator reseptè nan faktè nikleyè kappa-B ligand (RANKL) nan vitro ak mekanis li yo.

METÒD: Yo te jwenn makrofaj mwèl zo nan femoral ak tibya sourit C57BL/6 ki gen yon semèn 4-6-. Yo te egzamine efè sitotoksik Cistanoside A (5, 10, 20, 40, 80, ak 160 μmol/L) sou rantabilite makwofaj mwèl zo yo lè l sèvi avèk twous tès konte selil-8. Tartrate ki reziste asid fosfataz tach te fèt yo obsève efè a nan konsantrasyon diferan nanCistanoside Asou diferansyasyon osteoblast ak konsantrasyon efikas entèvansyon li yo te detèmine. Te gen yon gwoup kontwòl pozitif, Cistanoside A ki ba, mwayen, ak gwo gwoup dòz (40, 80, ak 160 μmol / L). Apre atachman selilè, yo te ajoute 50 ng/mL RANKL pou pwovoke diferansyasyon osteoblast, epi yo te ajoute dòz korespondan Cistanoside A nan gwoup dòz Cistanoside A ki ba, mwayen ak segondè, respektivman. Yo te fè bag F-aktin ak 2-(4-Amidinophenyl)-6-dihydrochloride indolecarbamidine pou detekteefè Cistanoside Asoufòmasyon osteoclasts. Toluidine ble tach nan zo fwotman tranch yo te itilize yo obsève efè yo nan Cistanoside A sou fonksyon an resorption zo nan osteoclasts. Ekspresyon an nan pwoteyin en ak en nan chemen JNK/MAPK la te detekte pa Western blot. Ekspresyon jèn ki gen rapò ak diferansyasyon osteoclast ak fonksyon resorption zo tankou tartrate ki reziste fosfataz asid, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk, ak c-Fos te detekte pa RTqPCR. REZILTA AK KONKLIZYON: Tartrate ki reziste tach fosfataz asid, tach bag F-aktin ak tès twou san fon resorption te montre ke Cistanoside A siyifikativmananpeche diferansyasyon osteoclast RANKL-induitepiresorption zonan yon fason ki depann de dòz konpare ak gwoup kontwòl pozitif la. Rezilta RT-qPCR te montre ke konpare ak gwoup kontwòl pozitif la, tou de gwoup dòz segondè ak ba Cistanoside A te kapab siyifikativman downregulate ekspresyon mRNA nan fosfataz asid tartrate ki reziste, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk ak c-Fos nan yon fason ki depann de dòz la. Rezilta yo nan tès Western blot te montre ke gwoup la dòz segondè nan Cistanoside A siyifikativman inibit ekspresyon an nan pwoteyin p-JNK nan 10, 20, 30 ak 60 minit nan entèvansyon; konpare ak gwoup kontwòl pozitif la, Cistanoside A siyifikativman anpeche ekspresyon pwoteyin Nfatc1 ak c-Fos nan yon fason ki depann de dòz la. Pou konkli, Cistanoside A ta ka anpeche fòmasyon ak resorption zo nan osteoclasts pa diminye nivo a nan pwoteyin p-JNK, anpeche aktivasyon an nan chemen MAPK ak ekspresyon nan jèn kle nan osteoclasts.

Mo kle: Cistanoside A; osteoklast; MAPK; JNK; RANKL; RANK;osteyopowoz la; glikozid feniletanoid

CISTANCHE POU TRAVAY POU ANCHE AKTIVITE OSTEOKLAST

0 Entwodiksyon Entwodiksyon

Etid epidemyolojik yo montre ke kòm popilasyon mondyal la ap grandi ak laj, ensidans la nan maladi osteolitik tankou osteyopowoz ak osteoartriti yo ap ogmante plis [1]. Rechèch aktyèl yo montre ke nan patojèn nan maladi osteolitik, move balans nan resorption zo ak rekonstriksyon zo ki te koze pa aktivasyon twòp nan fonksyon osteoclast ap mennen nan yon rediksyon enpòtan nan volim zo, dansite zo ak mikwostrikti zo. Deteryorasyon danjere, mennen nan ogmante frajilite zo ak ogmante risk pou ka zo kase [2-3]. Se poutèt sa, osteoclasts yo se yon gwo sib selilè pou idantifikasyon ak devlopman nan ajan efikas nan trete maladi osteyopowoz la. Sepandan, kounye a dwòg souvan itilize ki anpeche osteoclasts tankou denosumab (anti-RANKL antikò), bisfosfonat, elatriye gen reyaksyon negatif tankou nefrotoksisite, osteonecrosis, risk pou kansè andometri, ak osteonecrosis nan machwè [4-5]. Se poutèt sa, li se nan gwo siyifikasyon klinik jwenn nouvo dwòg ki ka anpeche aktivite osteoclast.

Diferansasyon ak fonksyon resorption zo nan osteoclasts yo sitou reglemante pa de molekil siyal, makrofaj koloni-stimulan faktè ak activator reseptè nan faktè nikleyè κB ligand (RANKL) [6]. Reseptè 1 faktè koloni-estimulasyon (c-fms) sou manbràn selilè precurseur osteoclast la mare ak faktè makwofaj koloni-estimulasyon epi li ankouraje ekspresyon activateur reseptè faktè nikleyè kappa B (RANK). RANKL ak RANK obligatwa sou sifas selil la aktive faktè transkripsyon tankou faktè nikleyè κB, JNK, p38, ak JNK, ki an vire aktive faktè transcription c-Fos, faktè nikleyè nan selil T aktive c1 (Nfatc1), elatriye nan la. nwayo, aktive destriksyon nan selil precurseur Zo yo fòme selil miltinucleated epi evantyèlman diferansye nan osteoklast [7-9].

Cistanche deserticolase youn nan materyèl ki pi souvan itilize Chinwa medsin nan pratik klinik. Li se tij chèch chèch ak fèy kal nan Cistanche deserticola oswa Cistanche tuberosum nan plant Orobanchiaceae [10]. Medikaman tradisyonèl kwè ke Cistanche deserticola se cho nan lanati, dous ak sale nan gou, epi li retounen nan ren yo ak meridyen gwo trip. Li gen efè nourisan Yang nan ren, ranplir sans ak san, idrate trip yo ak laksatif, epi li itilize pou trete enpotans, lakòz, misk ak zo ki te koze pa ensifizan Yang nan ren ak sans ak defisi san. Maladi tankou feblès yo nan liy ak metòd tretman tonik fwa ak ren yo itilize nan medikaman tradisyonèl pou trete maladi osteolitik. Etid farmakolojik yo montre ke prensipal engredyan aktif nan Cistanche deserticola se glikozid phenylethanoid, ki gen bon sekirite ak fonksyon medsin vaste [11]. Cistanoside A (Fòmil molekilè: C36H48O20) se yon konpoze natirèl phenylethanol glikozid izole ak pirifye nan medikaman tradisyonèl Chinwa Cistanche deserticola. Li gen efè anti-enflamatwa, antioksidan ak anti-timè [12-14]. Etid yo montre ke Cistanche deserticola A ka diminye nivo c-Fos nan selil prensipal sourit ak blesi egi nan fwa etanòl-induit [15]. Lòt etid yo te montre ke Cistanche A ka amelyore paramèt estriktirèl zo trabekulèr nan sourit osteyopowoz ovariectomized atravè chemen an RANKL / TNF reseptè-asosye faktè 6 (TRAF6) [16]. Sepandan, gen yon mank de plis rechèch sou efè Cistancheside A sou diferansyasyon osteoclast ak mekanis molekilè potansyèl yo. Etid sa a gen pou objaktif pou eksplore efè Cistancheside A sou diferansyasyon osteoclast ak fonksyon resorption zo nan vitro ak mekanis molekilè potansyèl yo, yo nan lòd yo chèche konnen nouvo dwòg potansyèl anpeche diferansyasyon osteoclastic.

1 Materyèl ak metòd Materyèl ak metòd

1.1 Konsepsyon

Pou eksperyans nan selil vitro, yo te fè tès t ak ANOVA yon sèl-fason.

1.2 Tan ak kote

Konplete soti desanm 2022 rive desanm 2023 nan laboratwa reparasyon zo ak tisi mou nan Dezyèm Lopital Shanxi Medical University.

1.3 Materyèl

1.3.1 Bèt eksperimantal

SPF klas 4-semèn C57BL/6 sourit, gason oswa fi, yo te achte nan Sant Eksperimantal Animal nan Shanxi Medical University, nimewo lisans pwodiksyon: SCXK (Jin) 2019-0004. Sourit eksperimantal yo te kenbe nan yon anviwònman estanda: tanperati chanm 26 degre, imidite apeprè 55%, ekspoze limyè pou 12 èdtan pa jou, mouvman gratis, ak manje poukont yo. Pwotokòl eksperimantal la te apwouve pa Komite Eksperimantal byennèt bèt ak etik nan Dezyèm Lopital Shanxi Medical University (Apwobasyon No .: DW2023031).

1.3.2 Reyaktif ak dwòg

Cistancheside A (pite 98%, CAS 93236-42-1) te achte nan men Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; serom fetis bovin ak mwayen kilti MEM ki gen anpil glikoz te achte nan men HyClone Company nan Etazini; trypsin-EDTA solisyon dijesyon 0.25%, solisyon liz globil wouj nan san, 1 × PBS, melanj penisilin-streptomycin (×100), solisyon tach ble toluidin (1/100, metòd borate), phalloidin ki gen etikèt sou rodamin. bag

Peptide (Cat. No. CA1610) ak DAPI tach (pare pou itilize) yo te achte nan men Beijing Solebao Technology Co, Ltd, ak sourit recombinant makrofaj koloni-stimulan faktè ak sourit recombinant timè necrosis faktè ligand superfamily RANKL te achte nan men Beijing Ze Xiyuan Biotechnologie co, Ltd.; Yo te achte twous CCK-8 nan men Konpayi MCE Ozetazini, yo te achte twous tach fosfataz asid tartarte (TRAP) nan men Sigma-Aldrich Company of the United States, RNAiso Plus, Premix type reverse transcription Reagents, TB Green® Fast qPCR Mix,

Prime Script TM RT Master Mix ak Trizol te achte nan men Takara Company nan Etazini; dendritic selil-espesifik transmembrane pwoteyin (DC-STAMP), TRAP, CTSK, c-Fos, NFATc-1 espesifik PCR Primers yo te achte nan men Sangon Bioengineering (Shanghai) Co., Ltd.; -aktin antikò, c-Fos antikò, Nfatc1 antikò, JNK antikò ak p-JNK antikò, m-IgG Fc BP-HRP te achte nan Santa Cruz, USA.

Biotechnologie Corporation.

1.4.6 Eksperyans resorption zo pou teste kapasite resorption zo osteoclasts

Yo te simen makrofaj mwèl zo nan yon plak 96-byen ak tranch zo bovins esterilize yo te plase davans nan yon dansite 7×103/pi. 100 μL medyòm kilti te ajoute nan chak pi epi divize an gwoup kontwòl pozitif ak Cistanche A ki ba-dòz. gwoup (40 μmol / L) ak Cistancheside Yon gwoup dòz segondè (160 μmol / L), chak gwoup te ekipe ak 5 twou miltip, nan ki 3 twou miltip yo te mete ak tranch zo bovine, ak lòt 2 twou miltip yo te itilize. pou obsève ekspresyon makwofaj mwèl zo yo. Adezif ak fòmasyon osteoclast. Apre selil yo respekte, gwoup la kontwòl pozitif ak sistanch

RANKL nan 50 ng/mL te ajoute nan tout gwoup yo pwovoke diferansyasyon osteoclast. Gwoup Cistancheside A ki ba ak gwo dòz yo te ajoute ak 40 μmol / L oswa 160 μmol / L Cistancheside A respektivman pou entèvansyon, epi yo te chanje mwayen an chak 48 èdtan. Apre kiltive pou 14 jou, retire tranch zo bovins yo, lave tranch zo yo de fwa ak PBS, ajoute 70% alkòl izopropilik ak netwayaj ultrasons gwo pouvwa pou 15 minit pou lave selil ki rete yo, ajoute toluidine ble (1%, fonn). nan dlo) solisyon lank, ak tach nan tanperati chanm pou 2 segonn. Apre 1 minit, rense fragman zo yo ak dlo doub distile pou retire koloran rezidyèl yo. Yo te obsève tranch zo ki tache yo ak foto lè l sèvi avèk yon stereomikwoskòp, epi yo te konte zòn nan nan zo resorption lacunae lè l sèvi avèk lojisyèl Image J.

1.4.7 RT-PCR

Pou detekte fonksyon resorption zo entraselilè ak ekspresyon jèn ki gen rapò ak osteoklast yo, yo te simen makrofaj mwèl zo nan yon plak 6-byen nan 1.5 × 105/pi, epi yo te ajoute 100 μL mwayen kilti nan chak pi, ak divize an gwoup kontwòl pozitif, Cistanche A gwoup dòz ki ba (40 μmol / L) ak Cistancheside A gwoup dòz segondè (160 μmol / L). Tou de gwoup kontwòl pozitif la ak gwoup Cistancheside A yo te ajoute ak 50 ng/mL RANKL inducer.

Pou pwovoke diferansyasyon osteoclast, yo te ajoute 40 μmol / L oswa 160 μmol / L nan Cistancheside A nan gwoup ki ba ak gwo dòz Cistancheside A respektivman pou entèvansyon. Yo te chanje mwayen an chak 48 èdtan. Obsèvasyon te fèt anba yon mikwoskòp Envèse twa oswa kat jou apre endiksyon. Yo te obsève anba mikwoskòp ke makrofaj mwèl zo te jis fusion. Ajoute TRIzol nan selil liz, ajoute klowofò, mete sou glas pou 10 minit, epi aspire melanj lan.

Nan 1.5 mL tib EP, ajoute 200 μL klowofòm nan chak tib, souke pou 15 s, Lè sa a, kite kanpe sou glas pou 15 min, santrifuje a 4 degre, 12 000 r/min pou 10 min, pran supernatant la, ajoute. yon kantite egal alkòl izopropilik, epi mete yo sou glas. Kite kanpe pou 10 minit, jete supernatant la, santrifije a 4 degre nan 120,000 r/min, lave ak solisyon etanòl 75% ak yon fraksyon volim nan dlo esteril san anzim, epi sèk nan lè a pou jwenn total RNA. Sèvi ak twous transkripsyon ranvèse Prime ScriptTMRT Master melanje pou konfigirasyon yon sistèm 20 μL pou transkripsyon ranvèse pou fè sentèz cDNA. Lè sa a, konfigirasyon sistèm travay PCR la dapre enstriksyon twous yo epi fè deteksyon nan yon enstriman PCR quantitative fluoresans. Kondisyon reyaksyon PCR yo te: pre-denaturasyon nan 95 degre pou 5 min; denaturasyon nan 95 degre pou 10 s, annealing ak ekstansyon nan 60 degre pou 30 s, yon total de 40 sik. Yo montre sekans premye a nan Tablo 1.

Apre yo fin ajoute senp -MEN mwayen ak grangou pou 3 èdtan, gwoup Cistancheside A te ajoute tou ak 160 μmol/L Cistancheside A pou entèvansyon. Apre fen grangou, yo te ajoute 100 ng/mL RANKL nan chak gwoup pou eksitasyon. Tan eksitasyon yo te 0, 10, 20, 30, ak 60 min respektivman. Apre tan eksitasyon an te fini, yo te jete mwayen kilti a epi lave twa fwa ak 1 × PBS pre-refwadi. Pwoteyin ekstrè yo te itilize pou detekte ekspresyon p-JNK, JNK ak -actin pwoteyin.

Apre ekstraksyon pwoteyin lan fini, sèvi ak elèktroforèz jèl pou separe pwoteyin lan epi transfere li nan yon manbràn PVDF. Ajoute 5% albumin serom bovin (BSA) pou bloke nan 4 degre pou 1 èdtan. Jete solisyon an bloke, lave manbràn nan 3 fwa ak tanpon TBST, epi ajoute antikò prensipal. (Nfatc1 antikò 1: 1000, c-Fos antikò 1: 1000, p-JNK antikò 1: 1000, JNK antikò 1: 1000, -actin antikò 1: 1000), enkube a 4 degre pou 14-16 h, lave manbràn an 3 fwa ak tanpon TBST, ajoute antikò segondè (m-IgG Fc BP-HRP, rapò dilution 1:5000), enkube nan tanperati chanm pou 2 èdtan, ajoute solisyon fliyoresan apre lave, epi devlope anba sistèm nan D 'jèl, Imaj. Laboratwa Lojisyèl la analize valè gri bann yo jwenn, epi sèvi ak -actin kòm referans entèn pou kalkile ekspresyon relatif pwoteyin sib la.

1.5 Endikatè obsèvasyon prensipal yo

① Rezilta yo nan diferansyasyon osteoclast RANKL-induit apre entèvansyon Cistancheside A; ② Fòmasyon bag aktin sou sifas osteoclast ak chanjman nan fonksyon resorption zo osteoclast apre entèvansyon Cistancheside A; ③ Kle a nan osteoclast apre Cistancheside A entèvansyon ekspresyon jèn; ④ Ekspresyon nan pwoteyin en nan chemen an JNK / mitogen-aktive pwoteyin kinaz (MAPK) ak pwoteyin p-JNK apre entèvansyon Cistancheside A.

1.6 Analiz estatistik

Lojisyèl GraphPad Prism 9 te itilize pou analiz estatistik ak desen. Tout done yo te eksprime kòm x-±s. Yo te chwazi tès t ak analiz yon sèl-fason nan divèjans pou konparezon ant gwoup yo. P < 0.05 te defini kòm yon diferans enpòtan. Metòd estatistik atik sa a te devlope pa Depatman Estatistik Shanxi Medical University.

Revizyon lakay.