Konparezon ant QPCR ak RNA-seq revele defi pou kwantifye ekspresyon HLA Pati 2

Nòmalizasyon

Nou te itilize estimasyon ekspresyon nan transkripsyon pou chak milyon (TPM), ki se nòmalizasyon estanda Salmon pwodui epi ki koresponn ak kantite relatif yon transkripsyon bay nan yon echantiyon. Pou nenpòt jèn yo bay, estimasyon an se tou senpleman sòm TPM pou relve nòt li yo. Nan kèk ka lè nou montre estanda nòmal transfòme estimasyon, nou fè yon ran nòmal transfòmasyon nan done RNAseq yo lè l sèvi avèk pake GenABEL R (Aulchenko et al. 2007), ki anjeneral aplike, pou egzanp, nan modèl lineyè nan kat eQTL (Delaneau). et al. 2017).

Kat QTL se yon metòd pou etidye mekanis regilasyon ekspresyon jèn lè w konpare asosyasyon ant ekspresyon jèn ak polimorfis jèn nan yon popilasyon. Modèl lineyè a se yon metòd kat eQTL ki souvan itilize, ki ka itilize yon modèl regression lineyè pou estime korelasyon ant ekspresyon jèn ak polimorfis jèn.

Sistèm iminitè a se yon sistèm byolojik konplèks ki pwoteje kò a kont enfeksyon ak maladi tankou kansè. Règleman ekspresyon jèn jwe yon wòl enpòtan nan sistèm iminitè a epi li ka afekte devlopman, diferansyasyon ak fonksyon selil iminitè yo.

Se poutèt sa, modèl lineyè kat eQTL ka itilize pou analize relasyon ki genyen ant mekanis regilasyon ekspresyon jèn ak iminite. Pou egzanp, etidye korelasyon ki genyen ant yon jenotip sèten ak ekspresyon de yon jèn kle iminitè nan yon popilasyon ka revele enfliyans nan jenotip sa a nan reglemante ekspresyon jèn iminitè. Rechèch sa yo ka bay enfòmasyon enpòtan pou tretman ak prevansyon maladi iminitè yo. Sa montre enpòtans iminite a, kidonk nou bezwen amelyore iminite nou chak jou. Vyann mens tou gen anti-viris, anti-kansè, ak lòt efè, ki ka ranfòse iminite Kapasite sistèm nan reziste ak amelyore iminite kò a.

Klike sou benefis sante nan cistanche

Li aliyman nan genòm referans la

Pou analiz la nan kouvèti lekti nan jèn HLA rapòte nan Fig. S7, nou aliyen lekti ak referans genòm GRCh38 ak STAR v2.7.3a (Dobin et al. 2013), lè l sèvi avèk Gencode v37 anotasyon jèn. Pou kontwole patipri kat nan jèn HLA, nou plis trete dosye BAM yo ak hlamapper v4.3 (Castelli et al. 2018).

Simulation

Done tè-verite

Pou jenere done simulation, nou te premye kouri Salmon v1.3.0 (Patro et al. 2017) sou echantiyon reyèl #66K00003 pou aprann nivo ekspresyon transkripsyon Gencode v37 yo. Lè sa a, nou itilize pake Polyester (v1.26.0) pou jenere 50 echantiyon sentetik ak nivo ekspresyon ki idantik transcriptome-lajè, eksepte pou HLA-A, -B, ak -C. Nivo ekspresyon jèn sa yo te baze sou 50 moun ki te chwazi owaza nan done reyèl nou an (pou ki nou gen done alèl HLA ki disponib). Pou chak jèn HLA, nou te chwazi izofòm yo ki te reprezante omwen 90 pousan nan ekspresyon total transkripsyon pwoteyin ki kode nan yon kouri Salmon sou seri done reyèl la (ki te lakòz sèlman 1 transkripsyon pou chak jèn) epi nou te pèsonalize sekans transkripsyon yo selon la. HLA alèl yo pote pa chak moun.

Pwosedi sa a te pèmèt nou jenere sentetik 50 moun ak nivo ekspresyon background ki idantik, men ak ekspresyon HLA varyab ak polimorfism HLA bati nan lekti yo simulation.

Pou reflete done reyèl nou yo, yo te simulation trant milyon lekti 126 bp ak yon gwosè fragman vle di 261 bp pou chak moun, lè l sèvi avèk default yo pou lòt paramèt Polyester (egzanp, devyasyon estanda longè fragman an=25 bp, pousantaj erè =0.005, distribisyon inifòm nan lekti, epi pa gen patipri). Polyester pwodui dosye FASTA, ki soti nan ki nou pwodui fichye FASTQ ak yon nòt bon jan kalite konstan (korespondan senbòl "F").

Metrik pou presizyon

TPM yo te kalkile sou simulation konte yo bay longè transkripsyon yo ak gwosè fragman mwayèn nan 261 bp. Rapò "estimasyon TPM/True TPM" itilize pou evalye pèfòmans nan rekipere nivo ekspresyon simulation epi pèmèt nou obsève desann oswa surestimasyon.

Grafik

Nou prepare tout konplo yo nan atik sa a lè l sèvi avèk pake ggplot2 v3.3.2 (Wickham 2016) nan R.

Rezilta yo

Presizyon nan quantifikasyon RNA-seq HLA

Etandone absans yon metòd ki ka konsidere kòm estanda lò eksperimantal pou quantifikasyon ekspresyon HLA soti nan done RNA-seq, nou te evalye okòmansman presizyon nan metòd quantifikasyon RNA-seq pou HLA lè l sèvi avèk done simulation kote nivo ekspresyon vre yo konnen depi yo te pwodwi. nan yon òdinatè pou imite eksperyans reyèl. Sa a te fè yo chwazi pi bon apwòch enfòmatik pami metòd ki baze sou RNA-seq, sa ki pèmèt yon kontras ki vin apre ak apwòch ki pa RNA-seq.

Nou simulation yon eksperyans RNA-seq pou 50 moun ki itilize pakè Polyester (Frazee et al. 2015). Moun sa yo sentetik yo gen menm nivo ekspresyon pou tout jèn nan genòm nan, eksepte pou HLA-A, -B, ak -C, pou ki nou varye nivo ekspresyon yo. Nou menm tou nou pèsonalize sekans transkripsyon HLA ki gen anote ki soti nan Gencode v37 pou prezante vrè varyasyon jenetik yo obsève nan moun ki te chwazi owaza nan yon seri done 96 moun (ki te genotip HLA pa sekans Sanger jan sa dekri anba a). Transkripsyon pèsonalize ki te lakòz yo te gen yon idantite sekans medyàn ak yon referans ki pi gran pase 95 pousan pou tout loki HLA.

Nou te konpare estimasyon ekspresyon HLA yo te jwenn pa de metòd byoenfòmatik: (1) "Ref transcriptome," ki itilize Salmon (Patro et al. 2017) pou aliman lekti ak referans estanda transcriptome, quantifier abondans transkripsyon ak (2) "Personalize," ki itilize tou Salmon, men kat yo li nan transkripsyon HLA pèsonalize, ki reflete jenotip HLA moun nan (Fig. 1). Apwòch "pèsonalize" la pwolonje estrateji anvan nou an (Aguiar et al. 2019) lè l sèvi avèk yon transkripsyon pèsonalize, olye ke yon sèl sekans kodaj kanonik pou chak alèl ke moun nan pote.

"Ref transcriptome" metòd la souzèstime nivo ekspresyon, an patikilye pou alèl ki gen yon pi gwo pwopòsyon diferans sekans konsènan genomic referans (figi 1). Sa a espere depi yon pi gwo pousantaj dezakò ant lekti ak referans a enpak negatif aliyman (Brandt et al. 2015). Apwòch sa a tou surestime ekspresyon HLA-C pou kèk moun, yon konsekans li nan HLA-B yo te trase nan transkripsyon referans HLA-C yo (Fig. S1). Apwòch "pèsonalize" la, nan lòt men an, kontwole patipri kat la epi reyalize presizyon optimal.

Malgre ke simulation nou an bay rezilta ankourajan konsènan quantification nan ekspresyon HLA lè l sèvi avèk RNAseq, nou dwe konsidere kèk opozisyon. Nou modifye sekans izofòm yo anote dapre alèl HLA moun yo lè l sèvi avèk yon seri izofòm sèl pou tout alèl nan yon jèn HLA bay yo. Sekans sa yo te itilize tou de nan simulation nan lekti kòm byen ke nan quantification nan ekspresyon; konsa, nou espere pi bon presizyon. Nan yon senaryo reyèl, diferan alèl HLA ta ka asosye ak izofòm diferan. Pita nan papye sa a, nou diskite sou yon egzanp espesifik ke nou obsève pou HLA-A, ki konsistan avèk ipotèz la ke sèten izoform yo eksklizif nan alèl espesifik. Sepandan, bay nou sitou enterese nan estimasyon ekspresyon nivo jèn ak nivo alèl HLA, nou espere ke sekans pèsonalize reprezante yon amelyorasyon sou yon sèl transcriptom referans lè nou redwi patipri kat.

Estimasyon ekspresyon HLA apati done reyèl RNA-seq

Nou te fè estimasyon ekspresyon sou done transcriptom antye RNA-seq pou 96 moun, pou ki qPCR pou HLAA, -B, ak -C, ak nivo ekspresyon sifas HLA-C yo te deja estime (Kulkarni et al. 2013; Ramsuran et al. 2015, 2017), epi yo ka itilize pou konpare ak rezilta RNAseq yo (gade Fig. S2 pou analiz QC sou done RNA-seq).

Bay pi gwo presizyon nan apwòch pèsonalize nan simulation la, nou konpare metòd sa a nan estimasyon ekspresyon ki baze sou RNA-seq ak sa ki nan lòt apwòch ki pa RNA-seq, men nou bay rezilta yo pou apwòch referans ki baze sou transcriptom nan "Enfòmasyon siplemantè. " Nou pèsonalize sekans transkripsyon yo bay jenotip HLA endividyèl yo jwenn pa sekans Sanger. Nou te kouri HLApers (Aguiar et al. 2019) ak Kourami (Lee and Kingsford 2018) pou dedwi alèl dirèkteman nan done RNA-seq yo epi konfime apèl Sanger yo (gade "Materyèl ak metòd").

Estimasyon ekspresyon nan nivo jèn yo montre ke HLA-B gen ekspresyon ki pi wo nan mitan HLA loci nan dataset nou an, ki te swiv pa HLA-C ak HLA-A (Fig. 2A). Òdonans sa a konsistan avèk seri done san antye GTEx (GTEx Consortium 2020) ak yon metòd RNAseq HLA-capture anvan yo te aplike nan PBMCs (Yamamoto et al. 2020). Sepandan, modèl sa a diferan de sa wè pa Boegel et al (2018), ki te obsève nivo menm jan an atravè jèn lè l sèvi avèk yon estrateji diferan pou fè fas ak kat lekti nan plizyè loci, ki ka kontribye nan mank distenksyon atravè loci an tèm de nivo ekspresyon. ). Etid nan lavni yo pral gen pou toumante apa kontribisyon nan diferans ki genyen nan metodoloji oswa konpozisyon selil-kalite diferans sa yo.

Konpare RNA-seq ak qPCR sou done reyèl

Apre sa, nou konpare estimasyon ekspresyon RNA-seq ak sa yo jwenn ak qPCR (Fig. 2B). Malgre ke korelasyon ki genyen ant ekspresyon RNA-seq ak qPCR te estatistik enpòtan pou tout jèn (p=0.024, 0.002, 0.000000016, pou HLA-A, -B, ak -C, respektivman; Tès Spearman pou asosyasyon pozitif), grandè korelasyon yo te modès pou HLA-A ak -B, ak pi wo pou -C. Itilizasyon yon referans pèsonalize pou RNA-seq modèst ogmante korelasyon an ak qPCR konpare ak yon referans estanda (Fig. S3). Sa a dakò ak obsèvasyon anvan nou yo ke estimasyon ekspresyon nan nivo jèn yo pa sibstansyèlman diferan ant referans ki baze sou genòm oswa apwòch pèsonalize pou jèn HLA klas I (Aguiar et al. 2019), ak benefis prensipal la nan apwòch pèsonalize yo se estimasyon yo nan la. Nivo alèl HLA, ke nou eksplore anba a. Itilizasyon koreksyon patipri nan Salmon (GC patipri, patipri sekans espesifik, ak patipri pozisyon espesifik) amelyore korelasyon an ak qPCR, ak pi gwo enpak pou HLA-B (konpare Fig. 2B ak S4, pou done korije ak san korije, respektivman).

Konpare nivo mRNA ak ekspresyon sifas yo

Paske ekspresyon RNA a enfòmatif sou premye etap siyal selil yo ak repons a stimuli, analize relasyon li ak fenotip molekilè en (tankou ekspresyon pwoteyin sou sifas selil la) ka ede nou konprann wòl règleman pòs-transkripsyon ak post-tradiksyon sou ekspresyon HLA. Diferans ant RNA ak abondans pwoteyin yo espere paske yo sijè a mòd diferan nan règleman yo. Efè teknik yo ka entwodui diferans tou paske teknik RNA ak pwoteyin diferan epi yo afekte pa kalite erè ki pa korel (Li and Biggin 2015; Kaur et al. 2017; Carey et al. 2019). Anplis de sa, nan ka etid nou an, ekspresyon jèn yo te mezire sou PBMC total, tandiske ekspresyon pwoteyin yo te mezire sou selil CD3 plis klase. Avèk diferans sa a nan tèt ou, nou mezire degre nan ki pwoteyin HLA sou sifas selil la ka prevwa pa ekspresyon mRNA. Analiz sa a te fèt sèlman pou HLA-C paske li se sèl kote ki genyen yon antikò ki ka mare tout alèl ak afinite egal. Enteresan, te gen yon gwo korelasyon ant mRNA ak ekspresyon pwoteyin pou HLAC, ak yon korelasyon yon ti kras pi wo pou RNA-seq (Fig. 2C).

Ekspresyon nan nivo alèl HLA

Jèn HLA genyen eleman regilasyon ki asosye ak transkripsyon konstititif ak transkripsyon dinamik aktive (René et al. 2016). Kòm yon rezilta, ekspresyon HLA varye atravè tisi epi yo ka modile pa rezo regilasyon ki deklanche pa diferan estimilis (Anderson 2018; Carey et al. 2019). Gen plis enterè nan konprann si wi ou non alèl HLA diferan yo asosye ak diferan nivo ekspresyon fondamantal ak pwogram regilasyon (Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020), epi si varyasyon sa a kontribye nan fenotip maladi oswa rezilta transplantasyon (Petersdorf et al. 2019). al. 2014, 2015; René et al. 2016; Bettens et al. 2022; Johansson et al. 2022). Se poutèt sa, estimasyon ekspresyon HLA nivo alèl pou qPCR ak RNA-seq yo te konpare. Paske alèl endividyèl yo souvan byen ra nan seri done a, nou gwoupe yo pa liy alèl (sa vle di, gwoup alèl ki filogenetikman defini pa relasyon an nan ekson) (Elsner et al. 2002).

Nou klase liyaj dapre nivo ekspresyon yo ki baze sou tou de done RNA-seq ak qPCR epi evalye konkordans klasman yo atravè metòd (Fig. 3). Apwòch pèsonalize RNA-seq nou an bay dirèkteman estimasyon nivo alèl, paske se sekans alèl HLA yo itilize pou endis aliyman yo, kidonk nou te bay lòd liy alèl dapre nivo ekspresyon medyàn yo. Paske estimasyon ekspresyon qPCR nou yo nan nivo jèn epi yo pa bay dirèkteman estimasyon nivo alèl, nou te bay lòd alèl liy selon efè yo nan yon modèl lineyè nivo ekspresyon ki eksplike pa jenotip HLA (gade Ramsuran et al. 2015). Nan Fig. 3, valè ekspresyon yo trase de fwa pou chak nivo pou chak alèl nan moun nan, ak pou qPCR, li se tou senpleman ekspresyon nan nivo jèn trase de fwa, reflete prezans nan de alèl.

Òdone estimasyon ekspresyon yo pi sanble ant RNA-seq ak qPCR pou HLA-C pase pou -A ak -B (mwayèn diferans lòd absoli, kote diferans lòd refere a diferans ki obsève nan pozisyon nan yon lòd klase nan valè ekspresyon. , ant RNA-seq ak qPCR quantification, nan 2.3 pou HLA-C, 3.1 pou -A, ak 3.9 pou -B), apre yon modèl menm jan an nan yon akò ak ekspresyon nan nivo jèn, pou ki nou jwenn korelasyon ki pi wo a. ant RNA-seq ak qPCR pou HLA-C.

Pami liyaj ki gen pi gwo diferans ant RNA-seq ak qPCR se A*11. Nou mezire ekspresyon sifas sou yon sous-ansanm eterozigòt pou A * 03 oswa A * 11 lè l sèvi avèk yon antikò ki gen menm afinite pou tou de liy epi obsève ke qPCR korelasyon pi solid ak ekspresyon sifas selil de alotip sa yo pase RNA-seq (Fig. S5). Apre sa, nou prezante yon evalyasyon pi vaste nan lòd alèl atravè konparezon ak etid anvan ekspresyon HLA mRNA.

Pandan ke gen enterè nan konpare diferans ekspresyon nan mitan alèl HLA, divès etid montre ke varyasyon nan ekspresyon nan yon alèl oswa liy alèl souvan byen wo, ak diferans ki genyen ant alèl nan ran diferan yo souvan piti epi ki pa enpòtan. Kòm yon konsekans, li ka ireyèl pou atann antretyen nan ran atravè alèl miltip, epi li ka pi bon pou konpare estimasyon ekspresyon pou alèl nan ekstrèm ekspresyon yo.

Pou done RNA-seq nou yo, nou konpare estimasyon nou yo ak sa yo ki soti nan de apwòch RNA-seq HLA ki te pwepare anvan yo sou PBMC yo. Gen yon bon konkordans jeneral ak Yamamoto et al. (2020), kote A * 24, A * 02, C * 04, ak C * 06 yo eksprime anpil, ak A * 03, C * 03, ak B * 15 yo eksprime nan nivo ki ba, byenke nou wè tou diferans sa yo. kòm pou B * 35, ki ta dakò plis ak done qPCR nou an. Lè nou konpare done RNA-seq nou yo ak Johansson et al. (2021), sepandan, nou wè anpil plis diferans, byenke yo gen anpil ti echantiyon pou anpil liy.

Nou menm tou nou konpare rezilta nou yo ak sa yo ki soti nan de syans qPCR anvan ki te aplike primè alèl espesifik. Bettens et al. (2014) te itilize primè alèl-espesifik pou kèk liy HLAC epi yo te wè C * 04 ak C * 06 kòm trè eksprime, tandiske C * 07 ak C * 03 yo te eksprime nan nivo ki ba, an konkordans ak sa nou genyen pou tou de RNA-seq. ak qPCR. René et al. (2015) aplike primè alèl-espesifik pou HLA-A, epi obsève A * 02 (segondè) ak A * 29 (ba) nan ekstrèm ekspresyon yo, ki dakò plis ak rezilta RNAseq nou an pase qPCR nou an; sepandan, nou wè anpil diferans nan lòt liy alelik

Nan kèk ka, nou ka evalye tou akò ak etid fonksyonèl. Pou egzanp, analiz anvan yo nan sit obligatwa faktè transkripsyon (TFBS) ak aktivite pwomotè (revize nan Anderson 2018), ak etid sou règleman miRNA (Kulkarni et al. 2011), montre ke C * 03 ak C * 07 yo fèb eksprime alèl, ki dakò ak obsèvasyon nou yo pou tou de RNA-seq ak qPCR.

Sous potansyèl pou diferans

Apre sa, nou te envestige si pwosesis echantiyon yo itilize pou RNA-seq te kapab kontribye nan diferans ki genyen ant estimasyon ekspresyon yo te jwenn ak qPCR ak RNA-seq.

Yon enkyetid espesifik se kantite tan echantiyon yo te estoke nan yon frizè -80 degre (apeprè 4 ane ant qPCR ak RNA-seq tès), osi byen ke lòt etap espesifik nan eksperyans RNA-seq la, ki gen ladan deglase echantiyon yo. Pou adrese sa a, nou te fè yon dezyèm eksperyans RNAseq sou san fre rale soti nan 11 moun, ki se yon sou-ansanm nan 96 yo analize nan etid sa a, epi nou konpare estimasyon yo ekspresyon ant pwen yo de fwa. Menm si dezyèm tès sa a pote tou de diferans teknik ak byolojik konsènan premye eksperyans RNA-seq (figi S6A ak B), korelasyon transcriptome-lajè nan estimasyon ekspresyon ant pwen tan yo wo (figi S6C).

Malgre ke evalye korelasyon ak 11 moun ka fè bwi, korelasyon nan jèn HLA yo se yo ki pami pi gwo korelasyon jèn ki gen bon konprann ant de echantiyon yo (figi S6D ak F). Nou menm tou nou kalkile rapò alèl andedan-endividyèl, ki se rapò ekspresyon ant de alèl HLA yon moun eterozigòt, epi konpare yo ant pwen tan yo. Korelasyon an te pi gran pase 0.94 pou HLA-A, -B, ak -C (Fig. S6E). Se poutèt sa, nou pa wè okenn prèv ki montre yon gwo kontribisyon nan degradasyon RNA yo eksplike korelasyon ki ba ant RNA-seq ak qPCR nan echantiyon orijinal nou an.

Yon lòt kontribisyon posib nan diferans ki genyen ant RNA-seq ak qPCR se ke alèl HLA espesifik ka gen plis patipri nan yon metòd oswa lòt la, nan ka sa a moun ki pote alèl sa yo ta kontribye nan gwo diferans. Pou egzanp, pou moun ki pote A * 03, oswa pou omozigòt pou C * 07, gen yon relasyon negatif ant qPCR ak RNA-seq (Fig. 4A).

Yon lòt sous diferans ki genyen ant metòd yo ta ka soti nan lefèt ke, nan apwòch RNA-seq nou an, nou pèrsonalize tout transkripsyon annote Gencode pou chak alèl HLA; sepandan, vrè divèsite transkripsyon ak asosyasyon li yo ak alèl HLA espesifik yo pa byen konprann. Pou egzanp, Kulkarni et al. (2017) te montre ke A * 01 ak A * 11 pwodui pi kout 3′-UTR. Pou envestige si nou ka repwodui finansman sa a nan done RNA-seq nou an, nou te trase lekti yo nan jenom referans la epi nou te korije pou kat patipri nan jèn HLA ak yon hla-mapper (Castelli et al. 2018). Vreman vre, pou moun ki pote A * 01 oswa A * 11, kouvèti li a nan 3′-UTR nan HLA-A montre yon gout byen file nan ~ 120 bp anvan fen jèn anote (Fig. S7).

Paske valè transkripsyon pou chak milyon (TPM) yo kalkile an konsiderasyon longè referans la, lè w sèvi ak yon referans ki pi long pase transkripsyon vre a mennen nan yon souzèstimasyon nan ekspresyon. Nou te eseye kontwole posiblite pou transkripsyon ki pi kout sa yo lè nou enkli yon vèsyon chak transkripsyon HLA-A ak yon 3′-UTR ki pi kout nan endèks nou an pou aliyman li. Sepandan, nou pa jwenn okenn prèv ekspresyon nan izofòm ki pi kout (figi S8), petèt paske izofòm ki pi kout sa yo genyen nan izofòm longè nòmal yo, epi aplikasyon Salmon a bay tout lekti nan izofòm ki pi gwo a. Enteresan, ekspresyon nan nivo isoform revele yon izoform ak yon pi long 5′-UTR eksklizif nan A * 11, ki kontribye yon gwo pwopòsyon nan ekspresyon total pou alèl sa a (Fig. S8).

Nou te teste tou yon nòmalizasyon estimasyon ekspresyon nou yo, kote nou ajiste longè lekti yo bay kouvèti lekti a ki sipòte yon tèminal proximal oswa distal 3′-UTR (mwayèn pondéré longè transkripsyon lè l sèvi avèk kouvèti lekti kòm pwa). Malgre ke nou obsève yon pwogrè ki rive jiska 20 pousan nan nivo ekspresyon pou moun ki pote A * 01 ak / oswa A * 11, nou wè sèlman yon ti amelyorasyon nan korelasyon an ak qPCR apre ajisteman sa a (soti nan rho =0. 20 nan Fig. 2 rive nan rho=0.24 nan Fig. 4B).

A * 01 ak A * 11 se pami alèl yo ki gen pi gwo diferans ran ant RNA-seq ak qPCR (Fig. 3), ak yon reprezantasyon enpafè nan transkripsyon ki asosye yo nan anotasyon an ka prezante patipri nan estimasyon RNA-seq nou an.

Finalman, metòd nòmalizasyon yo itilize pou jwenn estimasyon final ekspresyon nan done anvan tout koreksyon qPCR yo kapab tou yon sous diferans ant estimasyon qPCR ak RNA-see. Egzamen PCR quantitative pou jèn HLA Klas I anjeneral anplifye rejyon ki nan ekson 1 a 4, epi nòmalizasyon pa ekspresyon yon jèn nan kay tankou B2M (2-mikroglobulin) anjeneral fèt (tankou sa te fèt nan etid prezan an). ). Rezon ki fè pwosedi sa a se ke si nivo ekspresyon yo estandadize pa yon referans ki estab ki eksprime, estimasyon yo pou diferan moun yo mete sou menm echèl la, kidonk pèmèt pou konparezon atravè moun.

B2M kode pou chèn limyè a nan molekil HLA Klas I, epi li posib ke jèn B2M ak HLA klas I gen kèk kowòdinasyon ekspresyon, paske yo pataje achitekti pwomotè ki sanble (Kobayashi ak van den Elsen 2{{1{{12} }}}12; Vijayan et al. 2019), epi yo ka kontwole pa faktè transkripsyon pataje (pa egzanp, NLRC5/CITA pwovoke ekspresyon tou de HLA klas I ak B2M nan liy selil Jurkat (Meissner et al. al. 2{{20}}10). Nòmalizasyon ekspresyon jèn HLA pa valè ki gen rapò ka prezante patipri nan estimasyon qPCR nou an, espesyalman pou HLA-B, pou ki nou wè yon gwo korelasyon ak ekspresyon B2M (Fig. 4C) Echèl yon varyab pa yon varyab diferan men ki gen rapò ka prezante perturbation lè yo pote valè ekstrèm nan mitan distribisyon an epi redwi divèjans, ki konsistan avèk ipotèz sa a, koyefisyan varyasyon pou done qPCR yo se 0.61 ak 0.50 pou HLA-A ak -C, respektivman, men desann nan 0.17 pou HLA-B (tankou yon konparezon, CV pou done RNA-seq yo se 0.20, 0.14, ak 0.29 pou HLA-A, -B, ak -C. , respektivman). Sepandan, lè l sèvi avèk menm konsepsyon qPCR la, Ramsuran et al. (2017) nòmalize ekspresyon HLA-B pa swa B2M, GAPDH, 18 s, ak jèn b-Actin, epi li obsève rezilta trè konsistan, ki pa sipòte yon enpak nan nòmalizasyon B2M nan estimasyon qPCR yo.

Diskisyon

Estimasyon serye nan ekspresyon transkripsyon HLA ka kontribye nan divès kesyon rechèch, e byenke rezilta maladi yo souvan eksplore nan kontèks varyasyon kodaj HLA, nivo ekspresyon yo kapab tou eksplike varyasyon nan rezilta klinik yo (revize nan Dendrou et al. 2018; ak nan Johansson et al. 2022). Nivo ekspresyon yo genyen tou potansyèl pou enfòme desizyon lè w ap planifye transplantasyon selil souch ematopoyetik; pou egzanp, si yon match pafè pa disponib nan seleksyon pou donatè alojenik, li parèt benefisye chwazi moun ki pa matche ak alèl ekspresyon ki ba (Petersdorf et al. 2014, 2015). Estimasyon serye ekspresyon transkripsyon yo ka ede tou nan idantifikasyon eQTLs ki kache kontwòl ekspresyon HLA yo, ki ta ka entegre nan rezilta GWAS, lè yo mande si frape yo konnen nan rejyon MHC kowenside ak eQTL pou jèn HLA yo (gade, egzanp, Tablo S6 nan Aguiar et al. 2019). Plis jeneralman, estimasyon amelyore ekspresyon transkripsyon HLA yo pral ede nou konprann achitekti jenetik règleman HLA yo, idantifye kontribisyon relatif variantes cis-aji (sa vle di, moun ki nan katye jèn HLA yo kontwole) ak variants tranzaksyon (sa yo ki nan byen lwen). kote jenomik, ki gen ladan sou lòt kwomozòm). Sa a pral bay enfòmasyon konsènan degre nan varyasyon nan ekspresyon HLA se yon pwopriyete alèl espesifik kont yon karakteristik entè-endividyèl endepandan de idantite alèl (gade Bettens et al. 2022).

Teknik PCR quantitative yo te pèmèt nou dekouvri asosyasyon ant ekspresyon HLA ak fenotip maladi. Plis dènyèman, RNA-seq te vin metòd chwa pou evalye ekspresyon jèn nan gwo seri done transcriptom nan diferan popilasyon yo. Lè yo kapab ekstrè enfòmasyon egzat pou ekspresyon HLA nan done sa yo se yon defi enpòtan, ak anpil metòd yo te pwopoze pou reyalize objektif sa a. Sepandan, nan ki nivo rezilta yo soti nan analiz RNA-seq dakò ak sa yo akimile lè w sèvi ak qPCR se kounye a enkoni. Malgre ke metòd sa yo vize menm fenotip molekilè (abondans RNA), yo diferan anpil nan teknik eksperimantal yo itilize, fòm analize ak nòmalize done yo, pwosedi bioenfòmatik, ak prejije yo sijè a.

Dapre konesans nou, etid anvan yo konpare HLAtailored RNA-seq apwòch ak qPCR enkli ti echantiyon. Pou egzanp, Johansson et al. (2021) valide RNA-seq ki vize HLA yo ak qPCR sou sèlman 5 echantiyon nan HLA-C, finansman yon koyefisyan korelasyon Pearson nan 0.9, ki pa t enpòtan (p=0.08) .

Nan etid prezan an, nou te konpare kantite PCR ak RNA-seq estimasyon ekspresyon pou jèn HLA klas I klasik HLA-A, -B, ak -C nan yon seri matche 96 moun. Nou te jwenn korelasyon modès men enpòtan nan ekspresyon sou yon echantiyon 96 moun. Etandone mank de yon estanda lò ak ki konpare estimasyon sa yo, erè estimasyon ak prejije ki asosye ak tou de metòd yo ka kontribye nan rezilta jeneral la.

Nou te eksplore efè divès faktè ki ka eksplike korelasyon ki ba ant estimasyon RNA-seq ak qPCR, tankou estimasyon pòv ekspresyon pou alèl HLA espesifik ak nòmalizasyon pa yon jèn sèl menaj nan qPCR. Rezilta nou yo pa ka jeneralize nan chak konsepsyon qPCR oswa tiyo RNA-seq, pou ki gen yon gran varyete apwòch diferan. Sepandan, nan konesans nou, sa a se premye konparezon dirèk ant qPCR ak RNA-seq pou estimasyon ekspresyon HLA.

Etid nou an sijere zòn ki bezwen amelyorasyon nan detèminasyon ekspresyon transkripsyon HLA. Konparezon ant RNA-seq ak qPCR, pou egzanp, ta dwe anplwaye pwosesis inifòm nan echantiyon yo atravè metòd (pa egzanp, menm pwotokòl izolasyon RNA, tan depo/dekonjle, entegrite RNA) pou limite diferans atifisyèl ki asosye ak metòd sa yo. Kat lekti kout nan jenom referans sèl oswa transcriptomes jenere prejije, ak estrateji ki kat lekti kontablite pou polimòfis HLA yo nesesè. Etandone ke gen plizyè estrateji pou akonpli sa (Boegel et al. 2012; Lee et al. 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020; Darby et al. 2020), li pral kle pou konpare a. presizyon relatif nan apwòch sa yo.

Genyen tou yon bezwen pou devlope metòd ki byen konte pou varyasyon izoform, pa sèlman bay yon lòt kouch enfòmasyon, men tou estimasyon ekspresyon pi egzak, paske nòmalizasyon nan konte lekti pa yon longè transkripsyon kòrèk se yon sous potansyèl erè. Nan kontèks sa a, done ki long li, ki dirèkteman jenere enfòmasyon konplè transkripsyon, kapab yon zouti pwisan (Cornaby et al. 2022). Finalman, varyasyon nimewo kopi, yon karakteristik li te ye pou sèten loci HLA (egzanp, DRB), ta dwe konsidere tou lè yo quantifier nivo ekspresyon.

Rekonesans

Nou remèsye Tatiana Torres (University of São Paulo), Yang Luo (Harvard Medical School), ak manm yo nan Joint Biology Consortium nan Boston, pou diskisyon itil yo.

Kontribisyon otè

Diogo Meyer, Mary Carrington, Richard M. Single, ak Vitor RC Aguiar kontribye nan konsepsyon ak konsepsyon etid la. Maureen P. Martin, Veron Ramsuran, Smita Kulkarni, Arman Bashirova, Danillo G. Augusto ak Mary Carrington te fè preparasyon materyèl, koleksyon done ak eksperyans. Vitor RC Aguiar, Erick Castelli, Richard M. Single, Maria Gutierrez-Arcelus ak Diogo Meyer te fè analiz done yo. Vitor RC Aguiar ak Diogo Meyer te ekri maniskri a. Tout otè li, fè kontribisyon, epi apwouve maniskri final la.

Finansman

Ajans Finansman São Paulo (FAPESP, http://www.fapesp. br/en/) te bay finansman DM (2012/18010-0 ak 2013/22007-7) ak VRCA (2014/{{). 5}} ak 2016/24734-1). Enstiti Nasyonal Sante, USA te bay finansman DM (NIH R01 GM075091), ki te sipòte yon pati nan postdoc VRCA. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científco e Tecnológico (CNPq) ak Ministè Sante, Brezil te bay finansman pou eksperyans RNA-seq yo ak vizit vwayaj rechèch yo, nan kad yon pwopozisyon konjwen US-Brezil yo te bay MC ak DM (470043/{{13} }). NIH/NIAID R01AI157850 sipòte SK. Konsèy Rechèch Medikal Sid Afriken (SAMRC) te finanse VR ak lajan Depatman Syans ak Teknoloji (DST); epi tou sipòte an pati atravè Rezo Afriken Sub-Saharan pou Ekselans Rechèch TB/VIH (SANTHE), yon Inisyativ DELTAS Lafrik (Bond # DEL-15-006) pa AAS.

Pwojè sa a te finanse an antye oswa an pati ak lajan federal ki soti nan laboratwa nasyonal Frederick pou rechèch kansè, anba Kontra No. HHSN261200800001E. Kontni piblikasyon sa a pa nesesèman reflete opinyon oswa politik Depatman Sante ak Sèvis Imen, ni mansyone non komès, pwodwi komèsyal, oswa òganizasyon vle di andòsman pa Gouvènman Ameriken an. Rechèch sa a te sipòte an pati pa Pwogram Rechèch Entramural NIH, Frederick National Lab, Sant pou Rechèch Kansè.

Done disponiblite

Done RNA-seq yo prezante nan piblikasyon aktyèl la yo te depoze nan epi yo disponib nan baz done dbGaP anba adhésion dbGaP phs003177.v1.p1.

Referans

1. Aguiar VRC, César J, Delaneau O, et al (2019) Estimasyon ekspresyon ak kat eQTL pou jèn HLA ak yon tiyo pèsonalize. PLoS Genet 15:e1008091.

2. Alcina A, Abad-Grau MDM, Fedetz M et al (2012) Variant risk sklewoz miltip HLA-DRB1 * 1501 asosye ak ekspresyon segondè nan jèn DRB1 nan diferan popilasyon imen. PLoS One 7:e29819.

3. Anderson SK (2018) Evolisyon molekilè nan eleman ki kontwole ekspresyon HLA-C: Adaptasyon nan yon wòl kòm yon ligand reseptè imunoglobulin ki sanble ak selil asasen ki kontwole fonksyon selil asasen natirèl. HLA 92:271–278.

4. Apps R, Meng Z, Del Prete GQ et al (2015) Nivo ekspresyon relatif HLA klas-I pwoteyin nan selil nòmal ak selil ki enfekte VIH. J Immunol 194:3594–3600.

5. Apps R, Qi Y, Carlson JM, et al (2013) Enfliyans nivo ekspresyon HLA-C sou kontwòl VIH. Syans 340:87–91.

6. Arshad N, Laurent-Rolle M, Ahmed WS et al (2023) SARS-CoV -2 pwoteyin akseswar ORF7a ak ORF3a itilize mekanis diferan pou kontwole ekspresyon sifas MHC-I. Proc Natl Acad Sci USA 120:e2208525120.

7. Aulchenko YS, Ripke S, Isaacs A, van Duijn CM (2007) GenABEL: yon bibliyotèk R pou analiz asosyasyon genomic-lajè. Bioinformatics 23:1294–1296.

8. Bachtel ND, Umviligihozo G, Pickering S, et al (2018) HLA-C downregulation pa VIH -1 adapte ak jenotip HLA lame. PLoS Pathog 14:e1007257.

9. Bettens F, Brunet L, Tiercy JM (2014) High-allelic varyability in HLA-C mRNA expression: Association with HLA-extended haplotypes. Genes Immun 15:176–181.

10. Bettens F, Ongen H, Rey G et al (2022) Règleman ekspresyon HLA klas I pa varyasyon jèn ki pa kode. PLoS Genet 18:e1010212

11.Boegel S, Bukur T, Castle JC, Sahin U (2018) Nan Silico Typing nan Alèl HLA klasik ak ki pa klasik soti nan Standard RNA-Seq Reads. Metòd Mol Biol 1802:177–191.

For more information:1950477648nn@gmail.com