Profile konplè nan fòmilasyon sekretèm nan fetis ak perinatal selil souch likid amniotik imen Pati 1

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Résumé:Nou te deja rapòte ke c-KIT plis htaman amniotic-likid ki sòti selil souch yo te jwenn nan echantiyon rès nan woutin Ⅱ trimès dyagnostik prenatal (hAFS fetis) yo doue ak rejeneratif parakrin potansyèl kondwi pro-siviv, anti-fibrotic ak efè proliferatif. gen ka izole tou nan echantiyon dechè klinik twa trimès yo pandan C-seksyon pwograme yo (hAFS perinatal), kidonk ofri yon altènatif ki pi fasil pou jwenn lè yo konpare ak hAFS fetis la. Sepandan, yo konnen ti kras sou pwofil parakrin hAFS perinatal la. Isit la nou bay yon karakterizasyon detaye sou sekretèm total hAFS (sa vle di, totalite faktè parakrin idrosolubl ki pibliye pa selil nan mwayen kondisyone a, hAFS-CM) ak vesik ekstraselilè yo. hAFS-EVs) nan li, ki soti nan Ⅱtrimès fetis-kont III trimès selil perinatal. Fetal- ak perinatal hAFS yo te karakterize ak sijè a ipoksik prekondisyone amelyore potansyèl parakrin yo. Yo te analize fòmilasyon hAFS-CM ak hAFS-EV pou kontni pwoteyin ak chemokine/cytokine, epi yo te envestige kago EV a pa sekans RNA. Fenotip fetal- ak perinatal hAFS, ansanm ak fòmilasyon sekretèm korespondan yo, sipèpoze; ankò, fetis hAFS te montre aktivite fosforilasyon oksidatif frelikè lè yo konpare ak sa yo perinatal. Profilage nan kago parakrin yo te revele kèk diferans dapre etap jèstasyonèl la ak prekondisyon ipoksik. Tou de sous selil yo te bay fòmilasyon anrichi ak faktè enteresan nerotwofik, imunomodulatwa, anti-fibrotik, ak endothelial, e sekretom hAFS fetis la te defini pa yon pwofil pro-vasculogenic, rejeneratif, pro-rezoud, ak anti-aje ki pi pwononse. Ti pwofil RNA te montre anrichisman microRNA nan kago hAFS-EV fetis ak perinatal, ak yon nwayo pro-rezoud ki estab ki eksprime kòm yon siyati molekilè referans. Isit la nou konfime ke hAFS reprezante yon sous atiran nan faktè rejeneratif parakrin; seleksyon an nan fòmilasyon swa fetis oswa perinatal hAFS sekretèm pou terapi parakrin nan lavni yo ta dwe evalye konsidere senaryo espesifik klinik la.

Mo kle:likid amniotic; selil souch; efè parakrin; vesik ekstraselilè; mwayen selil-kondisyone; chemokin; sitokin; pwoteomik; sekans RNA; mikroRNA

Tanpri klike isit la pou konnen plis

1. Entwodiksyon

Medsin rejeneratif dènyèman devlope kòm yon jaden émergentes pou bay restorasyon fonksyonèl nan tisi blese pa mwayen plizyè estrateji. Kòm apwòch jeni tisi yo te siyifikativman avanse nan dènye ane yo, envestigasyon an nan efè parakrin selil souch te koncomitan de pli zan pli entansifye. Yo te montre potansyèl terapetik selil souch transplante yo sitou pa faktè sekrete idrosolubl yo, ki ka òkestre yon mikwo-anviwònman pro-rejeneratif nan tisi lame a pandan y ap deklanche deklanchman mekanis andojèn nan rekiperasyon fonksyonèl [1,2]. Se poutèt sa, selil souch la sekrete tout molekil twofik parakrin ki lage selil yo, osi byen ke vesik ekstraselilè manbràn yo te pwopoze de pli zan pli kòm yon pwodui inovatè terapi terapi pa plizyè etid preklinik endepandan ki vize kadyovaskilè, newolojik, ak/oswa enflamatwa. maladi. An konsekans, selil souch yo ka anvizaje kòm faktori byolojik pou eksplwatasyon sekretèm terapetik yo lè yo ofri tretman rejeneratif ki pare pou itilize ak pa etajè. Lè w aplike yon estrateji konsa ki baze sou selil, men san selil, anpil aspè limite ki asosye ak terapi selil kanonik ka simonte, pandan y ap toujou asire efè benefisye.ki sa ki yon cistancheNan pèspektiv sa a, selil stromal mesenchymal (MSC) yo te teste anpil kòm kandida selil yo? Vreman vre, MSC ak selil tij / progenitor yo te enjenyè ak / oswa ankouraje pa diferan estrateji prekondisyone amelyore kapasite rejeneratif yo ak potansyèl sekretè [3,4] ak yon enterè eksplisit nan enpòtans byolojik la nan vesicles ekstraselilè sekrete yo (EVs).

EV yo se patikil nano-gwosè ki delimite pa yon kouch lipid ak aktivman sekrete pa tout kalite selil. EV yo gen ladan yo piti anpil (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); yo opere kòm transporteur byolojik kritik nan siyal entèselilè lè yo delivre kago molekilè yo soti nan yon selil paran yo nan yon sekouris / sib youn [5,6]. Etandone ke potansyèl spesifik parakrin yo nan egzèse efè benefik konparab ak selil orijin yo, EV selil souch yo te parèt kòm opsyon terapetik atire nan modèl preklinik nan maladi, tankou iskemi, enflamasyon, oswa blesi, jan yo revize anpil nan [{{3]. }}]. Soti nan yon pèspektiv translasyonèl, sou tèt potansyèl modulation selilè, posibilite izolasyon ak renouvèlman pwòp tèt ou ki wo yo se aspè kle nan sous ideyal la nan EVs terapetik ak faktè idrosolubl. Nan yon senaryo konsa, MSC fetis ak perinatal ka ofri yon opsyon enteresan bay potansyèl proliferasyon yo, ak pwofil devlopman frelikè ak karakteristik entèmedyè ant anbriyon ak granmoun somatik ansèyman [10,11]. Fetal MSC ka izole nan anèks siplemantè-anbriyonik pandan gwosès kòm rès echantiyon yo jwenn pandan tès depistaj prenatal (sa vle di, villi koryonik [12-14] ak likid amniotik [15,16]) oswa jwenn kòm pitit pitit perinatal nan nesans, soti nan materyèl dechè klinik (sa vle di, manbràn amniotik ak plasenta [17-21], eleman kòd lonbrit [22-24] ak tèm likid amniotik [25,26]).

Cistanche ka anti-aje

Miyò, selil tij likid amniotik imen (hAFS) yo te make kòm estrateji terapetik pwomèt nan medikaman rejeneratif. epi yo te montre yo se lajman multipotan an vitro ak in vivo [16,27,28], kontribye nan liy lan ematopoyetik apre transplantasyon nan matris [29], ak grefon nan ògàn blese pandan y ap egzèse efè imunomodulateur [26,30] ak aktive. repons reparasyon andojèn, jan yo dekri nèt nan [31]. Ekip nou an ak lòt moun te demontre plis ke hAFS lage yon sekretèm trè rich ak molekil twofik byoaktif ki kapab vize diferan mekanis reparasyon. Faktè parakrin hAFS yo te rapòte bay stimuli pro-siviv ak asouvisman nan enflamasyon [32], bay kardyopwoteksyon kont iskemi pwo-longed [33.34], ak kadyotoksisite [35], ak estimile anjojenèz lokal ak sik selil kardyomyosit re-antre [33.34]. 34,36]. Depi ke pifò nan efè sa yo te montre yo dwe refèksyon pa administrasyon hAFS-EV pou kont li, etid endepandan yo te konsantre sou diseksyon pwofil rejeneratif yo kont diferan orijin patolojik, ki gen ladan blesi nan misk skelèt ak kadyak, maladi ren, artroz, osteyopowoz, enterokolit nekrotizan ak neurodegenerative. modèl [34,37-44].

Pandan ke prèv yo ka sipòte tradiksyon klinik hAFS-EVs pou terapi parakrin nan lavni, li enpòtan pou konsidere ke pi fò nan etid sa yo te sitou envestige potansyèl modulatwa hAFS fetis la te jwenn pandan tès depistaj prenatal Ⅱ trimès Vreman vre, yon pwofil konplè nan sekretèm nan soti nan. perinatal la gen kontrepati (sa vle di, ki soti nan III trimès c-seksyon) pa gen ankò yo te eksplore an detay. Twazyèm trimès perinatal hAFS te montre pwopriyete regilasyon iminitè diferan konpare ak mwen-ak II-trimès yo [26], pandan y ap kenbe potansyèl rejeneratif endothelial enpòtan [25].konbyen cistanche pou pranNòt, rapò ki sot pase a sou mòfoloji eterojèn fetis hAFS[45] te bay nouvo apèsi sou stemness yo ak pwofil ekspresyon jèn yo.bioflavonoidSa a te bay yon nouvo limyè sou valè rejeneratif diferan fraksyon selilè hAFS[46]. Pakonsekan, karakterizasyon konplè sou popilasyon diferan nan hAFS ap atire atansyon aliye. Nou te deja rapòte ke yon eksitasyon ipoksik 24h ak serom-gratis reprezante yon estrateji efikas pou ranfòse potansyèl parakrin nan Ⅱ trimès fetis hAFS [34,35,37]. Piske yo konnen ti kras sou konpozisyon sekretèm nan III trimès hAFS, isit la nou rapòte konparezon konplè Ⅱ kont Ⅲ trimès hAFS ak fraksyon sekretèm yo (ki gen ladan chapo-EV), yo nan lòd yo adrese enfliyans nan etap jèstasyonèl ak selil ipoksik. prekondisyone sou karakteristik selil ak sekretèm.

2. Rezilta

2.1.Perinatal hAFS Prezante yon Korespondan fenotip fèmen ak fetis la genyen

Pa gen okenn diferans estatistik enpòtan yo te apresye nan laj donatè yo ant fetis Il trimès ak perinatal III trimès echantiyon likid amniotic. Fetal c-KIT* hAFS (f-hAFS ki soti nan echantiyon likid amniotik II trimès) ak perinatal c-KIT* hAFS (p-hAFS soti nan III trimès likid amniotic fatra klinik) konfime karakteristik menm jan ak fibroblast ki sanble ak mòfoloji oval-wonn (Figi 1A) ak mesenchymal stromal fenotip (done yo pa montre), jan yo te deja rapòte [16,25]. Tou de f-hAFS ak p-hAFS kiltive nan vitro jiska pasaj 5 te montre nivo neglijab nan senesans soti nan senesans ki asosye aktivasyon {- -galactosidase (SA{- -Gal) nan apeprè 4 pousan nan selil yo (Figi 1B) . Tou de f-hAFS ak p-hAFS prezante yon wo nivo de ko-ekspresyon nan makè mesenchymal CD107a ak CD146, ki te fèk rapòte yo defini yon fenotip trè sekretè [47]. Selil CD107at CD146* yo reprezante majorite popilasyon f-hAFS (apeprè 64 pousan,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Figi 1. Fetal gen ak perinatal gen evalyasyon fenotip. (A) Imaj reprezantan hAFS fetis (f-hAFS, panèl gòch) ak hAFS perinatal (p-hAFS, panèl dwat) kiltive an vitro nan kondisyon estanda; ba echèl: 200 um. (B) Analiz makè senesan beta-galactosidase (SA- -Gal, an ble) atravè cytochemistry tach sou f-hAFS ak p-hAFS apre 5 pasaj nan kilti; imaj reprezantan yo rapòte nan panèl gòch la, ba echèl: 200 um. Pousantaj korespondan -Gal-pozitif selil/jaden rapòte nan graf ki nan panèl dwat la (f-hAFS:4.12±0.58 pousan ak p-hAFS:3.88±2.10 pousan ;p=0.1424,n{ {24}} eksperyans).(C) Iminofenotip hAFS eksprime makè mesenchymal CD146 ak CD107a. Trase sitometri koule reprezantan nan f-hAFS ak p-hAFS (panèl gòch) ak valè korespondan refere yo bay doub pozitif CD107a plis CD146 plis selil; CD107a plis CD146* f-hAFS:63.68±5.82 pousan ,*p=0.016konpare ak rès 36.32±5.82 pousan f-hAFS (Lòt);CD107at CD146 plis p-hAFS:52.07±6.76 pousan. 93±56.76 pousan p-hAFS (Lòt);CD107a plis CD146 plis f-hAFS vs CD107a plis CD146 plis p-hAFS p=0.2403,n=4 eksperyans. Lòt: kantite total ki rete CD107a-CD146~hAFS,CD107a~CD146*hAFS ak CD107at CD146-hAFS. Tout valè yo eksprime kòm mwayen ± sem eksperyans endepandan. SA- -Gal: Senesans ki asosye- -galaktozidaz.

2.2.Fetal hAFS Montre yon Metabolis diferan de hAFS perinatal

Pou evalye si etap jèstasyonèl la ka enfliyanse metabolis mitokondriyo, yo te analize f-hAFS ak p-hAFS nan kondisyon kilti estanda nan vitro pa analiz byochimik. Evalyasyon metabolis aerobic te montre ke pousantaj konsomasyon oksijèn (OCR) ak sentèz ATP te pi ba nan f-hAFS ki gen rapò ak p-hAFS, tou de lè yo te ankouraje ak piruvat plis malat (P/M;***p).<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3.Ipoksik Prekondisyone pa afekte fetis- ak perinatal gen Viabilite ak soutni aktivite sekretè yo

Yo nan lòd yo defini fòmilasyon sekretèm hAFS, selil yo te kiltive nan kondisyon san serom pou evite nenpòt kontaminasyon nan FBS. Nou te deja montre ke 24 èdtan san serom (SF) ak 1 pousan kondisyon kilti ipoksik O2 pa t 'siyifikativman chanje viabilite nan Ⅱtrimester fetal hAFS (f-espwa), pandan ke yo sipòte liberasyon an nan faktè rejeneratif parakrin nan mwayen selil-kondisyone yo. (hAFS-CM) ak nan vesik ekstraselilè (hAFS. EVs) [34,35,37,49]. Isit la, anplis pwofil fraksyon sekretèm p-hAFS yo pou premye fwa, nou evalye si p-te prezante konpòtman menm jan an anba menm rejim prekondisyone, lè l sèvi avèk kondisyon kilti normoxic kòm kontwòl la. Yo te analize viabilite f-hAFS ak p-hAFS apre 24 èdtan nan anviwònman sa yo: kondisyon normoxic (20 pousan O2) nan kontwòl konplè (Ctrl) mwayen kilti (Ctrlf-hAFSnormo ak Ctrl p-hAFSnormo), yon kondisyon normoxic nan mwayen SF. (SF f-hAFSnormo ak SF p-hAFSnormo), kondisyon ipoksik (1 pousan O2) nan mwayen kontwòl konplè (Ctrlf-gen ipo ak Ctrl p-hAFSnypo), ak kondisyon ipoksik nan mwayen SF (SF f-gen ipo ak SF p -gen hypo, Figi 3A). Nou konfime ke f-has viabilite pa te chanje nan tou de kondisyon Ctrl ak SF ak anba eksitasyon ipoksik, ak plis pase 80 pousan (jiska prèske 88 pousan) nan selil total yo pa afekte. Selil apoptotik bonè ak an reta varye ant ca. 13 pousan a 18 pousan nan kondisyon SF, san okenn enpòtans estatistik enpòtan. Menm jan an tou, perinatal gen viabilite te nan ranje a nan 80-92 pousan, ak selil apoptotik bonè ak an reta reprezante jiska 18 pousan nan kondisyon SF. p-hAFS te majinalman enfliyanse sèlman anba kondisyon yo konbine ipoksik ak SF; vre, pandan ke prekondisyone pa t enfliyanse siviv selil lè p-hAFS yo te kiltive nan yon mwayen konplè, kondisyon SF ki koresponn lan te montre yon ogmantasyon pa ca. 4-pliye (* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Figi 2. Karakterizasyon metabolik fetal- ak perinatalhAFS. (A) To konsomasyon oksijèn (OCR), sentèz ATP atravè F1-F.ATP sentaz, ak rapò P/O nan f-have and-have nan prezans piruvat plis malat (P/M) oswa succinate. (Succ);***p=0.0005,**p{=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche OstraliKonparezon pousantaj anpèchman OCR ak sentèz ATP nan f-ak-hAFS akòz inibitè ki endike anwo yo rapòte nan panèl ki pi ba a B. Pou eksperyans OCR: hAFS plis Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Lè sa a, nou evalye pwodiksyon an nan fraksyon sekretèm yo jwenn nan f-hAFS kont p-hAFS ki baze sou anrichisman pwoteyin. Total la gen sekretèm, kòm tout faktè parakrin selil yo sekrete, se isit la reprezante pa hAFS-CM la. Konsantrasyon nan pwoteyin nan f-hAFS-CM ak p-hAFS-CM nan mwayen SF apre prekondisyone selil ipoksik vs kontwòl kondisyon normoxic kòm debaz (savwa, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo, ak p -hAFS-CMHypo,) te evalye pa tès BCA ak mezire dapre 10§ selil yo.sistanchRezilta akeri yo sijere ke f-has-CM ak p-hAFS-CM te montre yon tandans egal-ego pozitif nan anrichisman pwoteyin apre priming ipoksik (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 selil degre;p-hAFS-CMNypo∶182.30±29.71 ug/1{0 selil degre) sou tokay normoxic yo (f-hAFS-CMnormo:105.50±19.89 ug/10 degre selil; p- hAFS-CMhypoi 91.12±24.39 ug/10 degre selil) Menm jan an tou, konsantrasyon pwoteyin sifas hAFS-EVs te mezire nan f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo, ak p-hAFS-EVShypo. EVs te montre sede konparab lè yo jwenn nan f-hAFS oswa p-hAFS. Kòm pou fòmilasyon hAFS-CM, yon tandans pozitif nan ogmantasyon nan kontni pwoteyin sou f-hAFS-EVs ak p-hAFS. EV yo te apresye apre eksitasyon ipoksik sou la. korespondan kondisyon normoxic （f-hAFS-EVSHypo∶2.03±0.67 ug/10 degre selil ak p-hAFS-EVSHypo∶1.85±0.47 ug/10 degre selil; f-have-EVsnormo∶1.28±0.36ug cellules/10.36ug -hAFS-EVsnormo∶1.19±0.31 ug/10 degre selil, Figi 3C).

2.4.Fetal-ak perinatal hAFS Release EVs ak mòfoloji analòg ak distribisyon gwosè

Analiz mòfolojik pa mikwoskospi elektwonik transmisyon (TEM) ogmante pwofesyon EV-sekretè segondè nan tou de f-hAFS ak p-hAFS (Figi 4). Nou plis envestige gwosè ak zòn nan f-hAFS-EVs ak p-hAFS-EVs (Figi 4B) apre prekondisyone ipoksik konpare ak debaz normoxic. Fetal- ak perinatal te lage EVs etewojèn nan gwosè, nan ranje a nan 40-250 nm, kidonk ki gen ladan tou de exosomes/ti EVs ak mikwo-vesikul/koule vesik. Gwosè mwayèn EVs/jaden nan diferan gwoup yo te konparab, fetal hAFS-EVs mezire 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97.10±10.10 nm) ak perinatal yo mezire 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94.60±19.53 nm; p-hAFS-EVShypo:76.43±4.86 nm, Figi 4B, panèl gòch). Kòm pou sede a, hAFS ankouraje anba ipoksi te montre yon tandans pozitif nan ogmantasyon kantite ti EVs, byenke ogmantasyon sa a pa t 'estatistik enpòtan. f-hAFS-EVStypo mezire 40-70 nm ki te prèske de fwa ke konpare ak tokay normoxic yo. Perinatal-has-EVSHypo ki mezire 40-70 nm, 70-100 nm ak 100-130 nm te prèske twa kantite sa yo jwenn nan kilti normoxic (Figi 4B).

Nanopartikil Suivi analiz (NTA) te montre yon kantite ki wo nan patikil nan tou de preparasyon f-hAFS-EV ak p-hAFS-EV, epi konfime ogmantasyon nan EVs nan echantiyon ipoksik yo, jan yo obsève tou nan analiz anvan yo (f-hAFS- EVsnormo:182±0.1{0'patikil/10 selil degre; f-have-EVshypo: 3.30±0.22×10 degre patikil/10 degre selil ;p-hAFS-EVsnormo:2.43±0.80×10 degre patikil/10 degre selil;p-hAFS-EVshypo:3.05±0.62×10 degre patikil/10 degre selil, Figi 4C).

Figi 4. Karakterizasyon mòfolojik fetal- ak perinatal gen-EVs. (A) Imaj reprezantatif nan mikwoskòp elèktron transmisyon (TEM) nan f-hAFS ak p-hAFS (anwo ak pi ba panèl gòch, respektivman, ak flèch nwa ki endike kò milti-vesikulèr intracytoplasmic ak ti EVs / exosomes nan yo), ak nan f -hAFS-EVs ak p-hAFS-EVs (anwo ak pi ba dwat panèl, respektivman) lage nan kondisyon san serom ak anba normoxic kont ipoksik prekondisyone (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; ak f-hAFS-EVshypo, respektivman), ba echèl: 200 nm. (B) Panèl gòch: TEM analiz distribisyon gwosè hAFS-EVs; panèl dwat: distribisyon nimewo f-hAFS-EVs ak p-hAFS-EVs pou chak gwosè entèval jaden yo te konsidere soti nan 40 nm jiska 250 nm; valè yo eksprime kòm mwayèn±sem nan n=3 eksperyans endepandan. (C) analiz Suivi nanopartikul pou gwosè hAFS ak distribisyon. Panèl gòch: imaj reprezantan pwodiksyon grafik la; panèl dwat: konsantrasyon hAFS-EVs mezire kòm 10 degre patikil pou chak 10 degre selil sekrete; nm: nanomèt; mL: mililit.

2.5. Karakterizasyon Pwoteomik Fetal vs Perinatal hAFS En Diferans nan Konpozisyon Sekretom yo Daprè Laj Jestasyonèl ak Prekondisyone Ipoksik

Karakterizasyon pwoteomik nan tou de fòmilasyon sekretè f-hAFS ak p-hAFS te fèt pa mwayen yon platfòm ki pa gen etikèt sou gè, ki baze sou kouple nan chromatografi likid nano ak espektrometri mas-wo rezolisyon (nLC-HRMS). Karant-uit pwofil pwoteomik yo te akeri pa analiz la kopi nan twa replike byolojik nan hAFS-CM ak gen-EVs soti nan f-hAFS ak p-hAFS sibi prekondisyon selil ipoksik konpare ak kondisyon an normoxic kòm yon kontwòl. Yo te idantifye yon total de 4179 gwoup pwoteyin distenk ak omwen yon peptide inik ak pwa molekilè ki sòti nan 2 a 3900 kDa ak pwen izoelektrik soti nan 3.6 a 13. Yo te obsève yon ekspresyon mwayèn pwoteyin ki pi wo nan hAFS-EVs lè yo konpare ak hAFS-CM. . Te aliyman nan tout lis pwoteyin yo jwenn te pote soti sou baz pwoteyin idantifye yo. Pou chak kondisyon eksperimantal, yo te kreye yon lis inik nòmalize ak mwayèn [50] valè matche ak spectre peptide (PSMs) atribiye nan pwoteyin yo, ki reprezante kantite spectre mas yo asiyen nan chak ak endirèkteman reprezante abondans yo nan echantiyon yo. Yo rapòte lis konplè pwoteyin yo idantifye nan fòmilasyon hAFS-CM ak have-EV nan Tablo S1.

Aplikasyon an nan analiz diskriminan lineyè (LDA[51]) sou lis mèt sa a pèmèt fè ekstraksyon nan pwoteyin estatistik enpòtan (Fratio Greater than or equal to 4.5 and** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 nan fòmilasyon hAFS-CM ak gen-EV konsidere separeman. Pandan ke apeprè 69.5 pousan ak 69.9 pousan nan pwoteyin yo te pataje nan mitan hAFS-EVs ak hAFS-CM kondisyon respektivman, kontni ki rete a parèt eksklizif nan pwopòsyon diferan, sòti nan 3.7 pousan a 13.4 pousan, nan mitan fòmilasyon yo.

Pou egzamine kantite chanjman pwoteomik yo, yo te fè yon analiz diferans ki pa gen etikèt sou lè l sèvi avèk lojisyèl MAProMa ki fèt lakay yo epi aplike de algoritm, DAve (Mwayèn Diferans) ak DCI (Endèks Konfyans Diferans, ki reprezante rapò ak konfyans nan ekspresyon diferans). respektivman), sou PSM yo nan chak pwoteyin sèl ant de tèm yo konpare. Sèvi ak filtè sevè pou DAve ak DCI pou maksimize konfyans nan idantifikasyon ak konsidere pwoteyin ki gen yon varyasyon ki pi gran pase yon chanjman pli nan 1.5, konparezon par nan f-hAFS-CM kont p-hAFS-CM ak nan f-hAFS-EVs kont. p-hAFS-EV yo te fèt selon etap jèstasyonèl selil yo. Yon total de 58 ak 109 pwoteyin yo te jwenn diferan eksprime nan pi wo a gen-CM ak gen-EV konpatiman, respektivman, (Figi S1B, C pou detay chwazi ak Tablo S2-S3 nan fòm pwolonje). Pami sa yo, 30 pwoteyin te lakòz moute-reglemante nan f-hAFS-CM ak 28 yo te moute-reglemante nan p-hAFS-CM (Figi S1B); menm jan an tou, 44 pwoteyin distenk te lakòz upregulated nan f-have-EVs ak 65 yo te moute-reglemante nan p-hAFS-EVs (Figi S1C). Miyò, pwoteyin ki te lakòz moute-reglemante nan f-have yo dwe konsidere kòm down-reglemante nan p-has ak vis vèrsa.

valè yo rapòte; gade Tablo S2 pou lis konplè ak paramèt detaye pwoteyin rapòte yo. (C) analiz anrichisman pwosesis byolojik nan pwoteyin idantifye ak yon frekans nan omwen 2 nan fetis hAFS-CM (panèl gòch) ak perinatal gen-CM (panèl dwat) dapre selil ipoksik prekondisyone. Dapre zouti FunRich, tèm ontoloji jèn yo montre nan tablo ba ki rapòte pousantaj jèn ki anrichi pou chak kategori (bawoz woz pou-have-CMnormo, ba koulè wouj violèt pou f-hAFS-CMhypor ba limyè ble pou p-hAFS-CMnormo, ak boul ble pou p-hAFS-CMhypo).achte cistancheSèlman tèm ontoloji jèn ki gen Bonferroni korije ak*p<0.05 are="">

Atik sa a extrait de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms