Deteksyon ak karakterizasyon nan nanopartikul mineralo-òganik nan ren imen

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

Kalsifikasyon ektopik ki asosye ak divès maladi imen, tankou ateroskleroz, kansè,kwonikrenmaladi, epidyabètmelitus. Malgre ke nanopartikil mineral yo te detekte nan veso sangen kalsifye, nati a ak wòl nan patikil sa yo nan kò imen an rete klè. Isit la nou montre pou premye fwa ke mounrentisi yo jwenn nan etap final lakwonikrenmaladioswa pasyan kansè nan ren gen wonn, patikil mineral multilamellar nan 50 a 1,500 nm, tandiske pa gen okenn patikil yo obsève nan kontwòl ki an sante. Patikil mineral yo jwenn sitou nan matris ekstraselilè ki antoure tubul konvolutè yo, kolekte kanal ak bouk Henle ak nan sitoplasm selil ki delimite tubul yo, epi yo konpoze de fosfat kalsyòm polikristalin ki sanble ak mineral yo jwenn nan zo ak kalsifikasyon ektopik. Larennanopartikul mineral gen plizyè pwoteyin serik ki anpeche kalsifikasyon ektopik nan likid kò, tankou albumin, fetuin-A, ak apolipoprotein A1. Depi nanopartikil mineral-òganik yo jwenn pa sèlman nan depo kalsifye, men tou nan zòn ki pa gen kalsifikasyon mikwoskopik, obsèvasyon nou yo endike ke nanopartikul yo ka reprezante précurseurs nan kalsifikasyon ak wòch ren nan imen.

Kontakte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kalsifikasyon ektopik ki asosye ak ateroskleroz, kansè,kwonikrenmaladi, ak dyabèt melitus1-3. Etid resan yo endike ke ateroskleroz akkwonikrenmaladipasyan ki gen siy kalsifikasyon vaskilè montre ogmante morbidite ak risk mòtalite, ki sijere ke kalsifikasyon ektopik prejidis pou sante moun1,3. Kalsifikasyon endezirab tou obsève nan moun ki aje ak pifò moun ki gen plis pase 60 an montre siy kalsifikasyon vaskilè4. Pou rezon sa yo, dechifre faktè ki pwovoke kalsifikasyon ektopik ak devlope tretman efikas reprezante objektif enpòtan.

Kalsifikasyon ektopik ka defini kòm yon move balans ant inibitè ak pwodiktè nan kalsifikasyon nan kò a. Inibitè kalsifikasyon gen ladan pwoteyin serik tankou albumin, fetuin-A, osteopontin, ak matris GLA pwoteyin osi byen ke ti konpoze tankou pirofosfat, tandiske ipèfosfatemi ak enflamasyon reprezante gwo pwodiktè nan kalsifikasyon5-7. Etid resan yo endike ke pwodiktè kalsifikasyon aktive yon pwosesis selilè ki sanble ak fòmasyon nan zo pandan kalsifikasyon vaskilè7,8. Vezik matris ki sanble ak sa yo ki pwovoke mineralizasyon nan devlope zo yo te detekte tou nan tisi mou kalsifye7-9. Vezik matris sa yo pwobableman lage pa selil vaskilè nan misk lis ki diferansye nan selil osteoblast, ki pwovoke kalsifikasyon7.

Nanopartikil mineral (NP) yo te detekte nan tisi mou ki montre siy kalsifikasyon ektopik. Price et al. te jwenn ke serik la nan rat trete ak swa etidronat la bisfosfonat oswa ak vitamin D pò mineral-pwoteyin konplèks ki gen inhibiteurs yo kalsifikasyon fetuin-A ak matris GLA pwoteyin10,11. Menm jan an tou, Jahnen-Dechent et al. te obsève ke fetuin-A-ki gen konplèks mineral, ki te rele patikil kalsiprotein (CPPs), ta ka detekte nan likid la azitik nan pasyan ki gen peritonit kalsifye12. Yon etid resan pa Bertazzo et al. demontre prezans nan NP mineral nan valv aortik yo ak atè kowonè nan tou de pasyan ateroskleroz ak lafyèv rimatism13. Pandan ke etid sou fòmasyon patikil mineral yo anjeneral konsantre sou sistèm kadyovaskilè imen an, li rete klè si patikil yo ka jwenn nan lòt tisi epi si antite sa yo jwe yon wòl nan sante oswa maladi.

Nou te obsève byen bonè ke mineral-òganik NPS fòme espontaneman nan likid kò imen ak bèt14–28. Yo te dekri NP mineral sa yo okòmansman kòm nanobakteri (NB) epi yo te kwè yo pa sèlman pi piti selil yo sou tè a29, men tou, yon kòz posib transmisib nan anpil maladi, ki gen ladan maladi alzayme a, ateroskleroz, kansè,renwòchfòmasyon, polikistikrenmaladi, ak prostatit30-32. Sepandan, rezilta nou yo te montre ke NB se an reyalite NP mineral ki pa vivan ki imite bakteri komen an tèm de mòfoloji, kwasans, pwopagasyon, ak sub-kilti15,18,22. Posiblite pou patikil mineral ki sanble ak sa yo rele NB yo ka jwenn nan tisi imen epi si patikil sa yo jwe yon wòl nan maladi rete yo dwe egzamine.

Nan etid sa a, nou devlope yon apwòch nanomateryèl pou detekte ak analize mineral-òganik NP nan moun ki malad.rentisi. Nou montre ke tisi ren ki soti nan fen etap maladi ren kwonik ak pasyan kansè nan ren gen NP mineral multilamellar ki sanble ak patikil mineral biomimetik ki espontaneman presipite nan likid kò an vitro. Rezilta nou yo revele enfòmasyon enpòtan konsènan konpozisyon byochimik, mekanis fòmasyon, ak fonksyon byolojik nan patikil mineral-òganik sa yo epi yo fè limyè sou mekanis kalsifikasyon ektopik ak inisyasyon maladi nan kò imen an.

Rezilta yo

Nou te egzamine tisi ren yo te retire chirijikalman nan pasyan imen ki gen swa maladi ren kwonik nan etap final (n=2) oswa kansè nan ren (n=18; gade Tablo 1; pou echantiyon kansè nan ren, nou te konsantre sou ki pa -pati kansè nan tisi a). Kòm kontwòl ki an sante, nou etidye byopsi ren yo te jwenn nan pasyan ki gen swa chòk oswa ematom men ki pa te gen okenn fonksyon ren nòmal anvan (n=2; Tablo 1).

Tisi ren ki soti nan moun ki an sante yo te montre karakteristik istorik nòmal, epi pa gen okenn kalsifikasyon ektopik yo te obsève apre tach von Kossa (Fig. 1A, B). Nan lòt men an, tisi ren yo te jwenn nan moun ki malad ak tache ak ematoksilin ak eozin (H&E) te montre prèv domaj tisi (Fig. 2A–C, ki endike pa flèch), ak 80 pousan nan tisi malad yo egzamine te montre depo mineralize jan yo revele. pa tach von Kossa (Fig. 1C–T, Fig. 2E,F, kalsifikasyon vizib kòm materyèl nwa endike pa flèch nwa; gade tou Tablo 1). Yo te remake depo kalsifye nan kortèks la ak medul, ki gen ladan espas ekstraselilè ki antoure tubul konvolutif distal yo, tubul konvolutif proximal yo, kanal kolekte ak bouk Henle ansanm ak sitoplasm selil ki delimite tubul yo ak kanal yo (Fig. 1C-T ak Fig. .2E, F). Pa gen okenn kalsifikasyon detekte nan corpuscle nan ren (Fig. 2D).

Pou egzamine nati presipite mineral yo, nou te prepare seksyon ren ultra-mens pou obsèvasyon pa mikwoskopi elektwonik transmisyon (TEM). Nan espesimèn ki gen depo mineral mikwoskopik, yo te detekte patikil mineral oswa granules nan sitoplasm selil epitelyal ren yo, nan matris ekstraselilè ki anba manbràn sousòl la, ak nan lumèn tubul konvolutif proximal ak distal (figi 3A, B, patikil yo elaji). nan panno A1–A4 ak B1–B4). Yo te obsève NP mineral yo tou nan selil ki kouvri bouk Henle ak kanal kolekte (figi 3C, D, elaji nan panno C1, C2, ak D1). Gen kèk patikil yo te jwenn nan vesik intraselilè nan selil ren (figi 3A, panno A1 ak A2). Apwòch mikwoskopi elèktron yo itilize isit la tou te pèmèt nou visualiser enteryè patikil mineral yo; kèk patikil te genyen bag elèktron-dans altène ak kouch limyè, elèktron-lucent (figi 3A, panno A3 ak A4, fig. 3C, panèl C1). Plizyè veso sangen, tankou vasa recta rents (atè dwat yo nan ren), nou ap antoure pa gwo kantite mineral NPs (figi 3D, panèl D1). Se konsa, NP mineral yo te jwenn nan divès kote nan tout tisi ren imen ki montre siy kalsifikasyon ektopik, tandiske pa gen okenn patikil yo te jwenn nan kontwòl yo an sante egzamine.

Patikil mineral yo te jwenn nan tisi ren yo sanble anpil ak NP mineralo-òganik yo dekri ki fòme espontaneman nan likid kò nan etid anvan nou yo15,17 (e ke nou te rele bions24). Pou verifye posibilite sa a, nou te prepare NP mineral òganik (oswa biyon) lè l sèvi avèk yon metòd presipitasyon jan nou te dekri deja15. Metòd sa a konsiste de ajoute iyon presipite tankou kalsyòm ak fosfat nan yon mwayen kilti selil (medyòm Dulbecco a modifye Eagle's oswa DMEM) ki gen yon likid kò tankou yon serom imen (HS), ki te swiv pa enkubasyon nan kondisyon kilti selil (gade Metòd). Patikil yo pwodui nan fason sa a (HS-NPS) yo te swa esferik oswa elipsoid epi yo te montre yon sifas mineral lis oswa kristalin (figi 4A-E), menm jan ak patikil yo dekri pi bonè nan likid kò yo22,23 osi byen ke nan assit imen12 ak atè kalsifye13. Patikil mineral yo te sanble anpil ak NP mineral oswa granules yo obsève nan tisi ren yo an tèm de mòfoloji jeneral yo, estrikti multikouch, ak karakteristik sifas yo (figi 4F-J). Gwosè patikil ki sòti nan HS ak granules ren yo te konparab tou, ki varye ant 50 ak 1,500 nm an dyamèt (figi 4A-E, F-J). Jan yo note sa pi wo a, kèk granules ren yo te antoure pa yon manbràn lipid, pètèt ki reprezante vesik kago entraselilè oswa vesik manbràn ekstraselilè (figi 4H, I, manbràn yo endike pa flèch); estrikti manbràn sa yo te absan nan espesimèn HS-NP prepare nan vitro (figi 4A-E). Obsèvasyon sa yo sijere ke granules ren yo sanble ak NP mineralo-òganik yo reyini nan serom.

Sèvi ak analiz difraksyon elèktron zòn chwazi, nou obsève ke faz mineral nan HS-NPs prepare nan vitro fèt nan yon nanomateryèl polikristalin (figi 4E, inset; remake bag konsantrik yo fèb). Rezilta menm jan an te jwenn pou granules ren (figi 4J, inset) ak pou zo ak kalsifikasyon ektopik jan sa dekri nan etid anvan yo33,35.

Nou etidye konpozisyon chimik HS-NPs ak granules ren lè l sèvi avèk enèji-dispersive X-ray spèktroskopi (EDX). HS-NPs te montre gwo pik kabòn (C), kalsyòm (Ca), oksijèn (O), ak fosfò (P) (Fig. 4K), ki konsistan avèk prezans yon mineral fosfat kalsyòm. Yon pik ki ba nan Silisyòm (Si) te note tou nan HS-NPs (Fig. 4K), pètèt ki reprezante yon konstitiyan patikil minè. Granules ren yo te montre tou pik kabòn, kalsyòm, oksijèn, ak fosfò, ki endike yon mineral fosfat kalsyòm, ansanm ak pik adisyonèl nan Silisyòm ak fè (Fe) (Fig. 4L). Pik iranyòm (U) yo te atribiye nan acetate iranyl yo itilize kòm yon reyaktif kontras pandan preparasyon echantiyon (prezans iranyòm nan kèk echantiyon nan patikil mineral tankou granules ren ak absans li nan tisi kontwòl nan Figi 4M ka atribiye a segondè a. afinite iranyòm pou fosfat, jan yo te rapòte deja35). Kontwòl EDX spectre nan tisi ren ki antoure patikil yo te montre pik kabòn ak oksijèn (figi 4M), sijere ke yo te jwenn kalsyòm ak fosfò sitou nan patikil mineral yo.

Rapò kalsyòm: fosfò (Ca:P) nan HS-NP ak granules ren yo varye de 0.65 a 1.18. Rapò sa yo diferan de valè teyorik 1.67 yo obsève pou idroksiapatit esteyyometrik men yo toujou nan seri yo te wè pi bonè pou fosfat kalsyòm ak kristal apatit yo obsève nan divès degre nan kristalizasyon15. Ansanm, rezilta sa yo konfime ke granules ren yo konpoze de NP fosfat kalsyòm.

Yo te jwenn divès kalite pwoteyin pou anpeche kalsifikasyon ektopik nan yon fason sistemik nan kò a36,37. Anplis de sa, yo kwè korona pwoteyin yo te jwenn sou sifas NP sentetik yo detèmine biodistribusyon ak efè patikil yo sou selil yo nan vivo38,39. Nan lòt men an, konpozisyon an pwoteyin nan NP mineralo-òganik yo te jwenn nan tisi ren imen rete enkonplètman konprann. Nou te jwenn deja ke albumin, fetuin-A, ak apolipoprotein-A1 (apo-A1) reprezante pwoteyin prensipal yo ki kominike avèk NP mineralo-òganik ki te fòme nan likid kò 17,20. Isit la nou te itilize etikèt immunogold pou egzamine prezans ak kote ultrastruktural pwoteyin sa yo nan granules ren yo.

Nou te itilize antikò poliklonal kont albumin serik imen (HSA), fetuin-A nan serik imen (HSF), apo-1A imen, ak HS antye pou egzamine prezans pwoteyin serik nan HS-NP ak granules ren yo. Espesifik antikò poliklonal yo (prepare jan sa dekri pi bonè25) te verifye lè l sèvi avèk Western blotting (figi 5). Chak youn nan antikò poliklonal yo te reyaji pozitivman ak HS-NP yo prepare nan vitro kòm byen ke ak granules mineral yo te jwenn nan tisi ren imen (figi 6A, B, panno A1-A3 ak B1-B3; pwen nwa). Antikò yo te reyaji sitou ak kouch elèktron-dans yo oswa nwayo nwa HS-NPs ak granules ren (figi 6A, B), ki endike ke zòn nwa sa yo ka genyen pi wo nivo pwoteyin konpare ak zòn elèktron-lucent. Kontwòl negatif ki fèt san antikò prensipal pa pwodui okenn reyaksyon (figi 6A, B, panno A4 ak B4, kontwòl). Nou konkli ke granules ren reprezante NP mineralo-òganik ki sanble ak HS-NP ki baze non sèlman sou mòfoloji yo ak konpozisyon mineral yo, men tou sou obligatwa yo nan pi gwo inibitè kalsifikasyon ki prezan nan serom.

Yo te itilize mikwoskòp imunofluoresan akote pou konfime prezans granules mineral ki gen HSA ak HSF nan ren moun ki malad. Sèvi ak teknik sa a, tisi ren moun te montre

tach pozitif pou de pwoteyin yo nan divès zòn, ki gen ladan entèstisyòm ki antoure tubul ren yo ansanm ak sitoplasm selil ki delimite tubul yo (figi 7A, panno A1 ak A2). Agregate pwoteyin ki gen tou de albumin ak fetuin-A yo te remake tou nan zòn sa yo, byenke nan kantite pi ba konpare ak tach nan pwoteyin yo sèl (figi 7A ak panèl A3, fizyone tach nan jòn). Miyò, nou remake ke tach nan pwoteyin detekte pa imunofluorescence byen sipèpoze ak modèl la nan kalsifikasyon ektopik obsève lè l sèvi avèk tach von Kossa (Fig. 7A, B, kalsifikasyon se vizib kòm materyèl nwa endike pa flèch nan B). Rezilta sa yo bay plis sipò pou prezans nan patikil mineralo-òganik nan tisi ren imen yo egzamine.

Diskisyon

Pandan ke yo te fè pwogrè nan konpreyansyon nou genyen sou entèraksyon ki genyen ant NP sentetik ak selil imen, nou konnen konsiderableman mwens sou efè NP mineralo-òganik ki fòme espontaneman nan likid kò. Etid anvan nou yo te montre ke patikil sa yo fòme nan likid byolojik lè konsantrasyon yo nan kalsyòm ak fosfat depase saturation15,16. Nou te obsève tou ke patikil sa yo entènalize pa selil iminitè men ke sèlman gwo patikil pwovoke reyaksyon iminitè pro-enflamatwa23. Sepandan, distribisyon an nan patikil sa yo nan tisi imen ak si yo jwe nenpòt wòl fizyolojik oswa patolojik nan kò a pa te egzamine twò lwen.

Nan etid sa a, nou te detekte pou premye fwa mineralo-òganik NP nan ren pasyan imen ki soufri swa maladi ren fen-etap oswa kansè nan ren. NP mineralo-òganik detekte yo genyen fosfat kalsyòm mal kristalize ki sanble ak mineral zo, osi byen ke albumin, fetuin-A, ak apo-A1 ki aji kòm inibitè kalsifikasyon sistemik nan likid kò. Rezilta nou yo an akò ak rapò anvan yo ki te dekri prezans nan konplèks mineral-pwoteyin nan tisi vaskilè ak likid kò12,13,34,40. Depi patikil ke nou te obsève yo te jwenn nan zòn ki pa gen okenn kalsifikasyon mikwoskopik, obsèvasyon nou yo sijere ke patikil yo ka reprezante précurseurs nan kalsifikasyon ektopik nan tisi imen. Etandone posiblite pou NP mineralo-òganik yo ka piti piti grandi nan gwosè epi sibi yon konvèsyon patikil-a-fim nan kondisyon favorab jan sa dekri nan etid anvan nou yo15,18, obsèvasyon yo prezante isit la sijere ke précurseur mineral yo ka mennen nan fòmasyon nan pi gwo. depo mineral nan vivo, tankou plak Randall ak pyè nan ren.

Obsèvasyon nou yo ke kalsifikasyon ektopik mineral yo ak NP mineralo-òganik yo jwenn nan divès estrikti anatomik nan ren yo ki konsistan avèk rezilta anvan yo nan kalsifikasyon ektopik nan ògàn sa a41. Obsèvasyon Evan et al yo te endike ke mineralizasyon nan ren pasyan ki gen nefrolitiyaz ka kòmanse epi rive sitou nan tisi entèrstisyèl bouk Henle40,42. Otè sa yo obsève ke depo mineral ki fòme nan zòn sa a ka soti nan bò fondamantal nan urothelium la ak mennen nan fòmasyon an nan pyè ren. Obsèvasyon nou yo sijere ke, anplis de bouk Henle yo, lòt zòn ren yo ka genyen NP mineral ki ka evantyèlman evolye pou fòme gwo depo mineral nan ren imen. Nou ap envestige tou posiblite pou NP mineral ki fòme nan sikilasyon san an ka transloke nan tisi ren yo epi pwovoke kalsifikasyon ektopik ak fòmasyon wòch nan ren.

Plizyè granules ren yo detekte nan etid la prezan yo jwenn nan vesik intraselilè oswa ekstraselilè (Fig. 4H, I) ak sa yo sanble ak vesik matris yo montre yo pwovoke kalsifikasyon nan zo ak dan7,8. Nou fèk obsève ke vesik izole nan serom imen ak bèt pwovoke fòmasyon nan NP mineral ak presipite mikwoskopik nan vitro25. Schlieper et al.34 te obsève tou ke patikil mineral yo te jwenn nan atè yo asosye ak estrikti manbràn ak pwopoze ke vesik matris oswa kò apoptotik ka reprezante nucleators nan patikil mineral nan tisi sa yo. Menm jan an tou, Khan et al. rapòte ke depo fosfat kalsyòm yo te jwenn nan ren yo nan pasyan imen ak pyè nan ren idyopatik yo asosye ak fib kolagen an ak vesik matris9. Rezilta sa yo sijere ke NP mineralo-òganik yo detekte nan tisi ren yo ka fòme atravè yon mekanis ki enplike vesik manbràn, yon sitiyasyon ki sanble ak sa yo wè nan atè ateroskleroz 7,8. Nan lòt men an, yon etid resan te montre ke kalsifikasyon ektopik yo te jwenn nan atè tete fanm pa te asosye ak makè selil osteogenic oswa apoptotik43, sijere ke mekanis nan kalsifikasyon ka espesifik nan ògàn oswa kontèks byolojik ki enplike. Anplis de sa, NP mineralo-òganik tankou sa yo ki dekri nan tisi ren imen yo ka fòme tou akòz yon echèk pou kenbe konsantrasyon fizyolojik nan iyon (egzanp, kalsyòm ak fosfat) ak inibitè kalsifikasyon (egzanp, albumin, fetuin-A, ak apo). -A1) nan likid kò imen an.

Rezilta nou yo sijere ke kouch nan elektwon-dans ak nwayo nan mineral-òganik NPs ka gen pi wo nivo nan pwoteyin ak molekil òganik konpare ak zòn yo elèktron-lucent nan patikil yo (Fig. 6A, B). Kouch elèktron-dans sa yo parèt mineralize jan yo wè nati cristalline materyèl sa a anba TEM (gade Fig. 4A-J). Lòt otè, ki gen ladan Ryall41 ak Evan et al.44, te pwopoze ke kouch nan elektwon-lucent ka reprezante mineral pandan y ap kouch elèktron-dans ka koresponn ak molekil òganik. Entèpretasyon sa yo ka akòz omwen an pati nan fason echantiyon yo te trete ak egzamine nan chak etid kòm byen ke nati a nan tisi yo kòmanse itilize yo.

Anplis de sa nan jwe yon wòl nan kalsifikasyon ektopik, patikil mineral-òganik ka pwovoke enflamasyon nan tisi ren yo. Nou te montre dènyèman ke pandan ke NP mineralo-òganik pa pwovoke sekresyon nan pro-enflamatwa interleukin -1 pa makrofaj imen, total mineral ki pi gwo pase 1 μm kapab fè sa23. Yo montre liberasyon interleukin-1 an repons a materyèl kristal yo konte sou aktivasyon konplèks molekilè intraselilè yo rele inflammasomes45–47. Anplis de sa, yo te detekte patikil mineral yo nan ren ki gen timè e kounye a, asosyasyon ki genyen ant kansè ak enflamasyon se byen rekonèt48. Posiblite pou patikil mineral total yo ka aktive yon enflamasome epi kontribye nan devlopman enflamasyon ak kansè nan ren oswa lòt tisi rete yo dwe envestige.

Anplis kalsifikasyon ektopik, granules mineral ki dekri isit la ka patisipe nan lòt pwosesis maladi. Pou egzanp, nou te pwopoze pi bonè ke NP mineral yo ka mare nan divès pwoteyin nan likid kò ak diminye molekil òganik sa yo nan likid kò a20,26. Nan lòt men an, kò imen an ka anpeche fòmasyon ak akimilasyon nan NP mineral nan sikonstans nòmal lè li konte sou prezans nan inibitè kalsifikasyon ak sistèm nan reticuloendothelial (sa vle di, makrofaj). Mineral NP yo ka akimile sèlman yon fwa omeyostaz kalsyòm sistemik oswa lokal yo perturbe ak lè mekanis pwoteksyon yo te echwe nan kò imen an.

Nou pwopoze ke apwòch nan nanomateryèl devlope isit la ka itilize pou etidye fòmasyon NP mineralo-òganik nan tisi bèt ak imen. Pou egzanp, antikò ki leve kont pwoteyin inibitè kalsifikasyon tankou albumin, fetuin-A, ak apo-A1 ka itilize nan konbinezon ak analiz mineral yo detekte ak karakterize fòmasyon nan NP mineralo-òganik nan tisi yo nan modèl bèt yo. Rezilta yo jwenn lè l sèvi avèk apwòch sa a ka aplike nan mezi klinik ki fèt sou likid kò imen yo nan lòd yo idantifye paramèt byolojik ki reflete eta a nan fòmasyon patikil mineral ak kalsifikasyon ektopik nan kò a. Nou espere ke konesans sa a ka mennen nan devlopman nouvo estrateji terapetik pou anpeche ak trete maladi imen ak kondisyon ki asosye ak kalsifikasyon ektopik.

Metòd

Tisi ren yo.Itilizasyon tisi imen ak eksperyans ki fèt nan etid sa a te apwouve pa Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl Chang Gung Memorial Hospital; metòd yo ak eksperyans yo te pote soti an akò ak direktiv yo apwouve. Yo te jwenn konsantman enfòme alekri nan men pasyan yo. Kontwòl tisi ren ki an sante yo te jwenn nan byopsi nan pasyan chòk ak ematom ki pa gen okenn istwa nan maladi ren (n=2); tisi ren yo te jwenn tou nan pasyan kansè nan ren (n=20) ak nan pasyan maladi ren nan etap final (n=2) ki gen ren yo te retire oswa byopsi pandan operasyon transplantasyon (Tablo 1). Pou tisi kansè nan ren, yo te diseke pati ki pa kansè nan tisi a epi analize nan etid prezan an.

Analiz histolojik.Tisi ren yo te monte sou blòk parafin. Blòk yo te seksyone ak tisi yo te chofe sou yon plak cho a 70 degre pou 30min pou retire parafine. Seksyon yo te benyen nan yon solisyon fre nan xylene twa fwa pou 15min konplètman retire parafine ki rete a. Seksyon yo te reyidrate ak 95 pousan, 80 pousan, ak 70 pousan etanòl pou 5min chak fwa. Espesimèn reyidrate yo te lave ak dlo doub distile (ddH2O) pou 5min. Nwayo selil yo te tache ak ematoksilin pou 8min. Yo te retire lank la nan espesimèn yo ak dlo tyèd pou 10 minit. Espesimèn ren yo te rense nan ddH2O epi yo te tranpe 10 fwa nan 95 pousan etanòl. Espesimèn trete etanòl yo te kont-tache ak eozin Y pou 1min. Espesimèn yo te dezidrate ak 95 pousan ak 100 pousan etanòl pou 10min chak fwa, ki te swiv pa yon etap dezidratasyon nan xylene pou 10min. Yo te monte espesimèn final ren dezidrate yo sou glisad vè ak 50 pousan gliserin epi yo te obsève anba yon mikwoskòp limyè ki ekipe ak yon kamera dijital.

Yo te prepare espesimèn deparafinize ak reyidrate jan sa dekri pou tach H&E. Seksyon reyidrate yo te tache ak nitrat ajan (5 pousan), ki te swiv pa ekspoze a limyè UV pou 20min. Solisyon an te lave ak ddH2O pou 15min. Seksyon yo te tache ak thiosulfate sodyòm (5 pousan) pou 5min, ki te swiv pa lave ak ddH2O pou 15min. Seksyon yo te tache ak nikleyè vit wouj (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) pou 5min. Espesimèn tache yo te dezidrate youn apre lòt ak 95 pousan ak 100 pousan etanòl pou 10min chak, anvan dezidratasyon nan xylene pou 10min. Espesimèn ren yo te monte sou glisad vè epi egzamine jan sa dekri pi wo a.

Mikwoskopi elektwonik ak analiz EDX.Echantiyon ren yo te koupe an ti moso mwens pase 1 mm epè lè l sèvi avèk yon mikwoskòp diseksyon LGPS (Olympus, Tokyo, Japon). Tisi yo te fikse ak 2.5 pousan glutaraldehyde ak 1 pousan paraformaldehyde nan 0.1 M tanpon kakodilat nan 4 degre lannwit lan. Echantiyon fiks yo te lave twa fwa ak 0.1 M tanpon kakodilat nan 8 pousan sikwoz (pH 7.2) sou glas pou 10min. Tisi lave yo te enkube nan saline fosfat-tanpon (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) ki gen 1 pousan tetoksid osmyòm ak 1.5 pousan ferosyanid potasyòm pou 2h sou glas. Tisi yo te lave ak ddH2O sou glas 10min twa fwa. Tisi lave yo te tache sou glas ak 1 pousan acetate uranyl nan ddH2O pou 1h, anvan yo lave twa fwa ak ddH2O sou glas. Tisi ren yo te dezidrate ak 30, 50, 70, 80, ak 90 pousan etanòl pou 10 minit chak fwa, eksepte lè etanòl te rive nan 70 pousan, nan ka sa a echantiyon yo te estoke nan 4 degre lannwit lan. Tisi yo te tache ak 1 pousan asid fosfotungstik nan 95 pousan etanòl pou 15min, anvan dezidratasyon ak 95 pousan etanòl pou 5min. Espesimèn yo te benyen nan oksid pwopilèn nan 40, 57, 67, ak 100 pousan nan etanòl pou 10 min chak fwa, ki te swiv pa yon lòt imèsyon nan 100 pousan oksid pwopilèn pou 5 min. Tisi ren yo te enfiltre ak 50, 70, ak 100 pousan Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) pou 1h chak fwa. Eponate 812-echantiyon ren ki entegre yo te prepare pa enkubasyon de fwa nan 100 pousan Eponate. Echantiyon entegre yo te enkube nan yon fou a 60 degre lannwit lan pou pèmèt polimerizasyon résine.

Granules HS-NP lave yo te jwenn jan pi wo a yo te fikse ak glutaraldehyde (2.5 pousan) ak paraformaldehyde (1 pousan) nan ddH2O pou 4h nan 4 degre. Granules fiks yo te lave ak ddH2O twa fwa pou 10min chak fwa. Granules yo te dezidrate ak enkubasyon siksesif nan 30, 50, 70, 80, 90, 95, ak 100 pousan etanòl, pou 10min chak fwa, eksepte lè etanòl te rive nan 70 pousan, nan ki granules yo te estoke nan 4 degre lannwit lan. Lòt solisyon etanòl yo te sèlman mete an kontak ak granules yo pou 10min. Granules dezidrate yo te enfiltre ak mwayen embedding LR blan (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) lè l sèvi avèk diferan rapò etanòl ak mwayen LR (3:1, 1:1, ak 1:3) pou 30min chak. Granules yo te enfiltre ak fre mwayen LR (100 pousan) lannwit lan anvan polymérisation. Granules enfiltre ak mwayen LR yo te enkube nan yon fou nan 60 degre pou 2 jou pou pèmèt résine polymérisation. Blòk nan ren ak HS-NP yo te seksyone yo pwodwi tranch ak yon epesè nan 70-100 nm lè l sèvi avèk yon mikrotom Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, Almay). Seksyon tisi yo te tache ak 4 pousan acetate uranil anvan vizyalizasyon anba yon mikwoskòp elèktron transmisyon JEM 1230 (JEOL, Tokyo, Japon) ki te opere nan 100 kV. Modèl difraksyon elèktron yo te jwenn lè l sèvi avèk menm sistèm nan. Griy Nikèl yo te itilize kòm sipò.

Pou analiz EDX, seksyon mens nan tisi ren yo te tache ak acetate uranyl epi lave ak ddH2O jan pi wo a, ki te swiv pa seche nan yon kabinè elektwonik desiccator. Yo te obsève espesimèn anba yon mikwoskòp elektwonik transmisyon JEM 2100 (JEOL) ki te opere nan 120 kV. EDX spectre yo te jwenn an triple lè l sèvi avèk yon sistèm INCA Enèji EDS (Oxford Instruments, Abingdon, UK). Seksyon mens nan HS-NP yo te obsève san yo pa tach.

Preparasyon nan NP mineralo-òganik.Tout solisyon kòmanse yo te ajiste a pH 7.4 ak esterilize pa filtraj nan 0.2μm manbràn anvan yo itilize. HS te jwenn nan men volontè moun ki an sante lè l sèvi avèk yon teknik veninpuncture konvansyonèl. Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl Linko Chang Gung Memorial Hospital te apwouve itilizasyon likid byolojik imen nan etid sa a epi volontè yo te jwenn konsantman enfòme alekri. HS-NP yo te prepare lè yo ajoute 3 mM CaCl2 ak Na2HPO4 chak nan DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) ki gen 10 pousan HS, ki te swiv pa enkubasyon pou yon semèn nan kondisyon kilti selil (37 degre, 5 pousan CO2, lè imidite). Patikil yo te granules pa santrifujasyon nan 16,000 × g pou 15min nan 4 degre epi lave de fwa ak tanpon HEPES (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) lè l sèvi avèk menm pwosedi santrifujasyon an.

SDS-PAGE ak Western blotting.SDS-PAGE ak analiz Western blot te fè esansyèlman tankou anvan15. Yon ti tan, 0.2 ug (Fig. 5A,D) oswa 1.2 ug (Fig. 5B,C) nan pwoteyin HS, 47 ug (Fig. 5A,B,D) oswa 590ug nan pwoteyin HS-NP (figi 5C), 0.1ug HSA (figi 5A–D), ak 0.6ug (figi 5A, C, D) oswa {{23} }.15ug nan HSF (figi 5B) yo te fonn nan 5 × "tanpon chaje" (0.313 M Tris-HCl pH 6.8, 10 pousan SDS, 0.05 pousan bromophenol ble, 50 pousan gliserin, 12.5 pousan - mercaptoethanol) nan yon konsantrasyon final 1×, anvan chofaj nan 95 degre pou 5min ak separasyon anba kondisyon denaturasyon ak diminye sou yon 10 pousan SDS-PAGE lè l sèvi avèk yon sistèm mini-jèl (Hoefer, Holliston, MA). Kontwòl NP a (yo itilize nan liy 1 nan Fig. 5A-D) konpoze de NP mineral ki te prepare lè yo ajoute 3 mM CaCl2 ak Na2HPO4 chak nan DMEM (volim final 1ml), ki te swiv pa enkubasyon pou yon jou nan kondisyon kilti selil; patikil yo te granules pa santrifujasyon nan 16,000 × g pou 15min, lave de fwa ak tanpon HEPES, epi resuspend nan 50ul nan tanpon HEPES. Yo te trete yon alikòt 20ul nan patikil resuspend pou SDS-PAGE jan pi wo a. Manbràn PVDF yo te bloke pou 1h nan 5 pousan (w/v) lèt degras nan tanperati chanm. Antikò prensipal yo te pwodwi nan kay la jan sa dekri anvan25 yo te itilize nan yon dilution de 1:1, 000 (-apo-A1 ak -HS-NP), 1:3, 000 (-HSF) , oswa 1:6,000 ( -HSA). Yo te itilize antikò segondè kabrit anti-lapen refor peroksidaz-konjige dapre enstriksyon manifakti a bay (Millipore, Billerica, MA). Yo te revele tach yo lè l sèvi avèk chemiluminescence amelyore (Amersham Biosciences, Amersham, UK) ak fim otoradyografik.

Etikèt Immunogold.Yo te prepare echantiyon yo pou obsèvasyon TEM. Blòk HS-NP yo te divize an tranch ki gen mwens pase 70 nm epè. Seksyon echantiyon sou gri yo te bloke ak 1 pousan jelatin pwason (Sigma) nan tanpon 0.1 M HEPES (pH 8.0) pou 25min. Kadriyaj yo te enkube ak antikò prensipal sa yo: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Kontwòl negatif la pa gen okenn antikò prensipal (1 pousan jelatin pwason nan tanpon HEPES). Seksyon enkubate yo te rense ak tanpon HEPES pou 15min. Seksyon rense yo te bloke ak 1 pousan jelatin pwason nan tanpon HEPES pou 20min. Yo te trete espesimèn yo ak segondè 5-nm-lò-konjige kabrit anti-lapen IgG pou 1h. Espesimèn yo te lave ak tanpon HEPES pou 10min, anvan yo lave ak ddH2O pou 10min. Obsèvasyon TEM yo te fèt jan pi wo a.

Mikwoskopi fliyoresan.Glisad tisi ren histolojik ki te prepare tankou pi wo a te bloke ak 1 pousan albumin serik bovin pou 1h nan tanperati chanm. Glisad yo te enkube ak antikò poliklonal prensipal nan yon dilution 1:4, 000. Apre etap lave yo, echantiyon yo te enkube ak antikò segondè kabrit anti-lapen-FITC (492/520nm) ak kabrit anti-lapen-TRITC (550/570nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) nan 1:100 pou 1h. Konplèks yo te lave ak PBST pou 15min. Tach fliyoresan 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) te itilize nan 10 ug/ml pou 15min. Espesimèn tache DAPI yo te dezidrate ak 95 ak 100 pousan etanòl pou 10min chak, ki te swiv pa dezidratasyon nan xylene pou yon lòt 10min. Yo te monte espesimèn ren dezidrate ak mwayen Vectashield fluoresans H-1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) epi yo te obsève anba yon mikwoskòp konfokal (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Almay) ekipe ak yon kamera Spot Flex.

Cistanche tubulosa anpeche maladi ren, klike la a pou jwenn echantiyon an

Referans

1. Giachelli, CM Ektopik kalsifikasyon: rasanble reyalite difisil sou mineralizasyon tisi mou. Am J Pathol 154, 671–675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Kalsifikasyon vaskilè: mekanis ak konsekans klinik. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161-1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Kalsifikasyon nan ateroskleroz. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Modèl ak faktè risk pou ateroskleroz kalsifye sistemik. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331-336 (2004).

5. Ketteler, M. et al. Defisyans nan pwoteyin kalsyòm-regilasyon nan pasyan dyaliz: yon konsèp roman nan kalsifikasyon kadyovaskilè nan uremi. Kidney Int Suppl 84, S84–87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Vize kalsifikasyon vaskilè: ralantisman-up yon sib difisil. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Règleman kalsyòm nan vaskilè lis misk selil ki sòti matris vesik. Tandans Cardiovasc Med 22, 133-137 (2012).

8. Doherty, TM et al. Kalsifikasyon nan ateroskleroz: byoloji zo ak enflamasyon kwonik nan kafou atè yo. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Asosyasyon plak Randall ak fib kolagen an ak vesik manbràn. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Byochimik karakterizasyon nan serom fetuin-mineral konplèks la. J Biol Chem 278, 22153-22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Nivo serom nan konplèks fetuin-mineral korelasyon ak kalsifikasyon atè nan rat la. J Biol Chem 279, 1594-1600 (2004).

12. Heiss, A. et al. Wòl yerarchize fetuin-A ak pwoteyin serom asid nan fòmasyon ak estabilizasyon patikil fosfat kalsyòm. J Biol Chem 283, 14815-14825 (2008).

13. Bertazzo, S. et al. Nano-analitik mikwoskòp elèktron revele apèsi fondamantal sou kalsifikasyon tisi kadyovaskilè imen. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Nanobakteri pretann nan san moun kòm nanopartikil kabonat kalsyòm. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD et al. Nanobakteri sitatif reprezante rès fizyolojik ak kilti pa pwodwi nan omeyostaz kalsyòm nòmal. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD et al. Karakterizasyon nan granulasyon kalsyòm ak apatit nan serom kòm konplèks mineralo-pwoteyin pleomorphic ak kòm précurseur nan nanobakteri putatif. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albumin-mineral konplèks ki sanble ak granules kalsyòm serom ak nanobakteri putatif: demonstrasyon yon konsèp doub anpèchman-ansman. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Rise ak tonbe nan nanobactéries. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Evalyasyon kritik nan serom gamma-iradyasyon itilize kòm feeder nan kilti a ak demonstrasyon nan nanobakteri putative ak nanopartikil kalsifye. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. et al. Analiz pwoteomik konplè nan nanopartikil mineral ki sòti nan likid kò imen ak analize pa likid chromatografi-tandem mas spèktrometri. Anal Biochem 418, 111-125 (2011).