Dekouvèt nouvo inibitè STING ki baze sou estrikti sourit STING agonist DMXAA

Résumé:

Pwoteyin stimulator-of-interferon-gene (STING) ki enplike nan iminite natirèl. DMXAA dwòg la (5,6-dimethylxanthenon-4-asid acetic) te pwouve ke li se yon pisan murin-STING (mSTING) agonist men li te gen ti efè sou moun-STING (hSTING). Nan papye sa a, nou tire sou konparezon diferan estrikti kristal ak analiz relasyon entèraksyon pwoteyin-ligand pou riske ipotèz ke konsepsyon dwòg variants DMXAA yo gen potansyèl pou konvèti agonist STING an inhibiteur. Ki baze sou dekouvèt anvan nou an nan de analog DMXAA, 3 ak 4 (tou de ta ka mare nan STING), nou estriktirèl optimize yo ak sentèz nouvo dérivés, respektivman. Nan tès obligatwa, nou te jwenn konpoze 11 ak 27 ki reprezante lyan STING ki te siperyè estrikti orijinal yo epi diskite sou relasyon estrikti-aktivite yo. Tout konpoze sib yo te inaktif nan tès selilè pou tès depistaj aktivite agonis STING. Satisfè, nou idantifye 11 ak 27 kòm inibitè STING ak aktivite mikromolar nan tou de chemen hSTING ak mSTING. Anplis de sa, 11 ak 27 anpeche endiksyon entèferon ak sitokin enflamatwa aktive pa 20 3 0 -cGAMP san yo pa aparan sitotoksisite. Konklizyon sa yo kraze panse rijid ke DMXAA bay baz estriktirèl espesyalman pou agonist STING ak ouvè plis posiblite pou devlope nouvo agonist STING oswa inhibiteur.

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Mo kle:

STING; DMXAA; selektivite espès; STING agonist; STING inibitè

1. Entwodiksyon

Stimulator-of-interferon-gene (STING) se yon molekil siyal esansyèl pou iminite intrinsèque, sitou medyatè cytoplasmic DNA-induit repons iminitè natirèl [1]. Lè reseptè ADN cyclic guanosine-adenosine phosphate synthase (cGAS) detekte ADN intraselilè doub-chèn, cGAS katalize sentèz 2 0,30 -cGAMP (Figi 1), yon dinukleotid siklik (CDN) ki kapab. dirèkteman lye ak aktive STING sou retikul andoplasmik la [2-4]. Apre deklanchman, STING fòme total ki rekrite en nan TANK-binding kinase 1 (TBK1) ak mare entèferon faktè regilasyon 3 (IRF3), ki fosforil IRF3, aktive dimè IRF3 nan nwayo a, pwovoke ekspresyon entèferon tip I (IFN) ak inisye. yon repons iminitè entèferon [1]. Anpil etid yo montre ke STING patisipe nan patojèn nan plizyè maladi e ke eksitasyon STING pwovoke repons iminitè efikas nan enfeksyon patojèn ak kansè; sepandan, echèk nan modile siyal enflamatwa kwonik mennen nan maladi otoiminitè ak enflamatwa [5-8]. Akòz wòl fondamantal STING nan règleman iminite natirèl la, yon gwo kantite ekip yo te kòmanse devlope agonist STING oswa inhibiteur.

Figi 1. Reprezantan STING modulators

Rechèch sou agonist STING premye jenerasyon konsantre sou modifikasyon estriktirèl nan analogu CDN pou kontourne kèk limit nan CDN andojèn, tankou pèmeyabilite manbràn pòv ak sansiblite nan idroliz pa fosfataz [9,10]. Ti molekil STING agonist 5,6-dimethylxanthenon-4-asid acetic (DMXAA), ki te montre pwomès terapetik kont timè solid nan modèl sourit, te kapab kontrekare dezavantaj yo nan dérivés CDN [11]. Sepandan, dwòg la echwe nan esè klinik imen [12]. Li se plis afime ke DMXAA selektivman mare nan murin STING (mSTING) olye ke nan imen STING (hSTING) [13,14], ki anpeche potansyèl la terapetik nan DMXAA nan imen. 10-Carboxymethyl-9-acridinone (CMA) se yon lòt agonist STING reprezantatif ki espesifik pou murin yo itilize kòm yon endiktè IFN kalite I ki pisan pou terapi antiviral nan kòmansman ane 1970 yo [15]. Se poutèt sa, selektivite espès se yon faktè enpòtan anpil nan devlopman ti molekil STING agonist yo. Agonist hSTING roman-skelèt sibstansyèl te pote nan vi pa efò yo san pran souf nan chèchè, ki gen ladan diABZI, SR717, MSA02, ak lòt moun [16-19].

benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè

Ogmante prèv montre ke ipèaktivasyon STING asosye ak maladi otoenflamatwa ak otoiminitè. Li nesesè pou limite deklanchman twòp nan chemen siyal STING la, ki mete aksan sou valè potansyèl inhibiteurs STING yo. Kontrèman ak agonist STING, devlopman inibitè STING se toujou nan anfans li, sepandan, e pa gen okenn kandida dwòg ki te antre nan etid klinik ankò. Inibitè STING li te ye yo gen ladan de kalite konpoze: antagonist konpetitif (SN-011 ak Merck-18) ak inibitè kovalan (H151) [20-22]. Inibitè kovalan STING yo idantifye pi bonè yo kominike avèk Cys88/91 oswa Cys91 ki sitiye nan domèn transmembran N-terminal STING deyò pòch CDN-obligatwa a [22]. Dènyèman, de ekip te rapòte siksesif de kalite estriktirèl antagonis STING ki okipe pòch obligatwa 20 3 0 -cGAMP la pou anpeche aktivasyon 20 3 0 -cGAMP, sa ki sijere yon efè doub bò nan pòch obligatwa CDN la [20 ,21].

Isit la, nou bay yon nouvo pèspektiv. Nou sijere ke pòch anba a kote DMXAA ak CMA yo sitiye fasilite devlopman nan inibitè STING ki baze sou min done gwo twou san fon nou yo ak konparezon nan enfòmasyon an estrikti ko-kristal nan pwoteyin STING yo idantifye. Etid anvan nou an te rapòte yon seri analogue CMA ak DMXAA epi yo te idantifye konpoze 3 ak 4 ki mare ak hSTING men ak pisans selilè fèb [23] (Figi 2).

Figi 2. Estrikti chimik konpoze 3 ak 4 ak done sou aktivite byolojik yo. Valè EC50 nan konpoze 1-4 yo te mezire pa selil repòtè STING yo, epi IC50 obligatwa yo te mezire pa twous obligatwa konpetisyon STING yo.

Nan papye sa a, konsènan konsepsyon inibitè STING yo dekouvri ajan obligatwa ki pi pisan ak plis kontak nan pòch anba a, nou te fè optimize estriktirèl pou 3 ak 4, respektivman. Apre sa, nou te fè yon etid SAR ki baze sou konpetisyon-obligatwa essais. Nan evalyasyon byoaktivite, konpoze 11 ak 27 yo te aji kòm lyan gwo spectre epi yo te montre nivo micromolar nan aktivite inhibitor STING nan plizyè selil rapòte. An tèm de estrikti debakadè, de molekil konpoze 11 kenbe hSTING nan yon konfòmasyon "ouvè" inaktif, kidonk konpetitivman anpeche andojèn 20 3 0 -cGAMP obligatwa, ki se menm jan ak estrikti nan kristal Merck-18 ak estrikti nan debakadè. nan SN-011 [20,21].

2. Rezilta

2.1. Estrateji konsepsyon de dérivés DMXAA kòm inibitè STING

2.1.1. Idantifikasyon sit konsepsyon pou STING inhibiteurs lè w konpare diferan estrikti kristal

Apo-pwoteyin nan domèn STING ligand obligatwa (LBD) kristalize kòm yon dimè simetrik nan ki pa ligand la, ki te pwouve ke yo pa te koze pa filtraj la jèl ak analiz ultracentrifugasyon analyse [24-26]. Dimère STING la adopte yon konformasyon ki tankou papiyon ak sit ligand ligand pozisyone nan koòdone ant de monomè yo. Premyèman, papye sa a egzamine mekanis enfrastrikti ak aktivasyon pwoteyin hSTING ak mSTING, konpare diferans ki genyen ant yo, osi byen ke revele kèk Sur curieux. Pou estrikti apo a, konfòmasyon natirèl tou de pwoteyin yo montre ke mSTING a pi konsantre pase hSTING a (Figi 3). Shih et al. te anplwaye simulation dinamik molekilè (MD) pou etidye diferans ki genyen ant hSTING ak mSTING, ki montre ke hSTING pwefere yon konfòmasyon ouvè-inaktif, ak mSTING pwefere yon konfòmasyon fèmen-aktif menm san yon ligand mare [27].

Lè mare nan 20, 30 -cGAMP, tranzisyon konformasyon hSTING a soti nan louvri (apo-pwoteyin, distans lateral ~ 57 Å) nan fèmen (cGAMP-bound pwoteyin, distans lateral ~ 40 Å), tandiske opoze a. se vre pou mSTING (29 Å a 40 Å). Estrikti apo-hSTING diferan anpil ak apo-mSTING, men estrikti STING yo konplike ak 20,30 -cGAMP sipèpoze. DMXAA, CMA, ak cGAMP se agonist STING ak divès echafodaj estriktirèl, men konfòmasyon aktivasyon yo lè yo mare pwoteyin mSTING yo tou esansyèlman menm bagay la (Figi 3). Senaryo ki dekri pi wo a temwaye ke mekanis eksitasyon hSTING ak mSTING yo divèjan anpil; konformasyon yo aktive pa STING yo, sepandan, relativman konstan, endepandan de selektivite espès ak kalite zo rèl do agonist (pandan ke yo limite a agonist STING ki pote chanjman konformasyon). Komèsan pòch obligatwa nan konplèks kristal diferan yo jeneralman konvèjan (~ 300 Å3, Table S1), ki se plis prèv nan estabilite nan konfòmasyon nan aktivasyon pwoteyin STING.

Figi 3. Konparezon estrikti kristal STING apo- ak konpoze-bound. Pwoteyin mSTING la se ble (distans teste ak liy wouj), kòd PDB: 4KC0 (apo), 4LOJ (bound-cGAMP), 4LOL (bound-DMXAA), ak 4JC5 (bound-CMA)

Dezyèmman, ki baze sou konklizyon ki anwo yo nan estabilite konformasyon aktivasyon, nou sipèpoze estrikti ko-kristal nan cGAMP, DMXAA, CMA, SR717, ak MSA02, ki se agonist STING fèmen-konformasyon, yo eksplore pozisyon nan diferan agonist estriktirèl yo nan la. STING sit obligatwa pwoteyin. Pòch pwoteyin lan ka divize an de rejyon: pòch anba a ak pòch anwo a, apre distribisyon agonist STING nan pòch pwoteyin lan (Figi 4a). Eksepte pou mSTING agonist DMXAA ak CMA yo te antyèman nan pòch anba a, lòt agonist yo ta ka aktive chemen an hSTING ak kouche nan rejyon an anwo a. Lè sa a, nou te trase entèraksyon senk agonist STING yo ak résidus asid amine ki mare nan pwoteyin STING (nan 5 Å nan ligand la; Figi S1), ki montre ke asid amine prensipal yo enkli R238, Y167, R232, S162, T263, ak T267. (mSTING nimewo sekans rezidi ki koresponn lan mwens youn). Matche résidus yo sekans nan pòch yo te montre ke T267, T263, ak S162 kouche nan pòch anba a; pòch anlè a gen R238, R232, ak Y167 (Figi 4b). Jan nou te rapòte, R238, Y167, ak R232 yo esansyèl pou agonist obligatwa nan STING, espesyalman R238 (pwoteyin nan mSTING koresponn ak R237), mitasyon an ki ta lakòz yon pèt konplè nan estabilizasyon (ligand obligatwa) [28-30]. Che et al. tou revele ke R238 nan rezidi kle domine obligatwa nan DMXAA, ak mitasyon yo pwen (S162A / E260I) ka amelyore entèraksyon an nan R238 ak DMXAA pa simulation MD [31].

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity

【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Pou okipe pòch pwoteyin mSTING la, DMXAA oswa CMA te adopte yon mòd obligatwa inik kote de agonist ti molekil mare nan yon sèl homodimer mSTING. DMXAA yo byen fèm monte nan pòch anba a pa lyezon idwojèn ant gwoup keto a ak chèn bò T266 (hSTING koresponn ak 267), pandan y ap gwoup carboxylate la reyaji ak chenn bò R237 ak T262 (Figi 5a). Entèraksyon DMXAA ak R237 (sèl asid amine kle nan pòch anwo a) enpòtan anpil pou aktivite mSTING. Yon detay souvan neglije se ke DMXAA ka sèlman aji sou R237 nan pwoteyin monomerik simetrik, pou egzanp, DMXAA (molekil A) ki afekte R237B (Figi 5a). Paske DMXAA chita nan pati anba a, distans ki genyen ant molekil A ak R237B se 3.06 Å, pandan y ap distans R237A pi gran pase 5 Å (Figi 5b). Benefisye nan pòch ki pi kontra enfòmèl ant pwoteyin mSTING la, DMXAA kominike san efò ak R237 nan monomère mSTING simetrik men pa gen okenn fason pou DMXAA asosye ak nenpòt nan R238 nan pwoteyin apo-hSTING konformasyon louvri (Figi 3). Pakonsekan, pozisyon pòch DMXAA afekte eksitasyon wout hSTING la. Dènyèman, Merck, enspire pa rapò a obligatwa 2: 1 nan DMXAA, te dekouvri antagonis STING ki kapab okipe pòch la obligatwa [21]. Konplèks kristal Merck 18 ak pwoteyin hSTING montre ke konpoze an sitou sitiye anba pòch pwoteyin lan epi reyaji ak S162, T263, ak T267, tout nan yo ki matche ak pwopriyete yo nan DMXAA (Figi 5c). Apati sa a, ipotèz yo te pwodwi: pòch anwo a se yon kavite ekselan pou desine agonist STING; pòch anba a se yon nich ki pi apwopriye pou inibitè, ak estrikti DMXAA oswa CMA se optimize yo gen potansyèl la yo vin yon antagonist STING.

Figi 4. Divizyon sit STING yo ak distribisyon ak asid amine kle yo. (a) Kote de rejyon nan monomè STING. Pòch anba a gen koulè magenta ak pòch anwo a vèt. Kòd PDB pou konplèks kristal ki sipèpoze yo se jan sa a: 4LOH (cGAMP, vèt), 6UKV (MSA-02, jòn), 6XNP (SR717, zoranj), 4LOL (DMXAA, magenta), ak 4JC5 (CMA, koulè wouj violèt). (b) Distribisyon kle asid amine nan rejyon anlè ak anba yo. Résidus ki nan pòch anba a yo montre nan magenta, ak sa yo vèt yo nan rejyon an tèt la.

Figi 5. Konplèks kristal DMXAA ak Merck 18. (a) Kontak entèmolekilè nan konplèks DMXAA ak mSTING. DMXAA mare yo montre nan koulè gri, ak souinite STING endividyèl yo nan dimè simetrik yo montre an vèt ak koulè wouj violèt. Sipèskripsyon A ak B yo endike monomè pwoteyin oswa idantite ligand endividyèl yo. (b) Distans ant kle résidus R237A ak R237B, respektivman, ak DMXAA (molekil A). R237A pou carboxyl DMXAA se 6.02 Å, R237B pou carboxyl DMXAA se 3.06 Å. (c) Crystal estrikti Merck 18 mare ak pwoteyin hSTING (PDB 6MXE) ak detay sou kontak entèmolekilè li yo. Ligan ki mare yo montre nan koulè gri, ak souinite STING endividyèl yo nan dimè simetrik yo montre an vèt ak koulè wouj violèt. Sipèskripsyon A ak B yo endike monomè pwoteyin oswa idantite ligand endividyèl yo

Figi 6. Rechèch baz ak otspo optimize nou yo pou DMXAA ak CMA dérivés. (a) Sipèpozisyon estrikti DMXAA mare nan mSTING (PDB: 4LOL, montre kòm ble fonse) ak estrikti DMXAA mare nan hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, montre kòm zoranj). (b) Detay sou DMXAA ki mare ak hSTING mutation (PDB: 4QXR). Bwat liy tire yo reprezante sit modifikasyon potansyèl yo. Résidus amine yo montre nan vèt yo se rezidi mitasyon (S162A/Q266I).

Nou te jwenn ke enkapasite DMXAA pou aktive chemen hosting la te gen rapò ak kote DMXAA nan pòch anba a (dapre Seksyon 2.1.1), ki te ban nou tou lide konsepsyon inibitè STING: ogmante kontak dérivés DMXAA. ak rejyon anba a atravè modifikasyon estriktirèl kenbe STING nan yon konfòmasyon ki pa aktive. S162 ak Q266 kouche kòmsadwa nan pati anba a nan sit la obligatwa, kidonk DMXAA yo ka byen pozisyone an kontak dirèk ak tou de, fasilite eksplorasyon nan efè a nan asid amine pòch anba sou ligand. Analiz relasyon estrikti-aktivite (SARs) te revele ke 5,6-dimethyl moety la ak C7-methoxy pozisyon an te enpòtan anpil pou aktivite byolojik 3 ak 4. Jan yo montre nan Figi 6b, 5 la. ,6-gwoup dimethyl te kreye entèraksyon idrofob ak plizyè asid amine nan pòch anba a; akòz pwoksimite pozisyon C7 DMXAA ak asid amine Q266, modifikasyon metoksid ki koresponn lan pèmèt 3 ak 4 mare ak hosting. Se poutèt sa, élaboration estriktirèl nou yo sipoze bloke 5,6-dimethyl ak C7 methoxy, ak konsepsyon de dérivés roman konsantre sou modifye gwoup polè a nan pozisyon C1/C2 (ki afekte S162) ak chanje gwoup asid karboksilik la ( pwolonje divèsite estriktirèl). Nou te fèt ak sentèz yon seri dérivés lè l sèvi avèk konpoze 3 ak 4 kòm echafodaj, konsa valide konjekti inhibitor pwopoze nou an.

2.2. Chimi

Preparasyon tout konpoze entèmedyè ak sib yo dekri nan Scheme 1. 1-metoksi-2,3-dimetil-4-nitrobenzèn (5) ak 2-asid bromobenzoik ( 7) yo te disponib nan komès. Okòmansman, 1-metoksi-2,3-dimetil-4-nitrobenzèn te konvèti nan 4-metoksi- 2,3-dimetilanilin (6) atravè rediksyon ak poud fè. Lè sa a, 6 ak 7 yo te sibi reyaksyon Ullmann ak kabonat potasyòm ak kataliz pa kwiv ak kwiv (I) oksid nan N, N-dimethylformamide bay entèmedyè ki koresponn lan 8. Reyaksyon kondansasyon entramolekilè nan 8 te fèt ak reyaktif Eaton a peye entèmedyè. 2-metoksi-3,4-dimethylacridin-9(10H)-yon (9). Ranplasman 9 ki vin apre a te fèt ak bromoacetate etil, epi pèt 1 ekivalan HBr te bay etil 2-(2-metoxy-3,4-dimethyl-9- oxoacridin-10(9H)-il)acetate (10). Finalman, acetate etil nan 10 te idrolize nan asid karboksilik pa idroksid sodyòm ki bay 2-(2-metoksi-3,4- dimethyl-9-oxoacridin-10 (9H)-il)asid acetic (11).

Scheme 1. a. EtOH, Fe, NH4Cl; b. DMF, Cu, Cu2O, K2CO3; c. reyaktif Eaton a; d. BrCH2COOC2H5, NaH; e. NaOH; f. CCl3CH(OH)2, NH2OH; g. H2SO4; h. EtOH, H2O2, NaOH.

Pou sentèz ki vin apre a plis konpoze sib, nou dwe premye sentèz konpoze 2-amino-5-methoxy-3,4-dimethylbenzoic asid (14). 6 te reyaji ak idrat chloral ak idroksilamin, fòme asetamid ak idroksiamino, ak entèmedyè (E)-2-(hydroxylamine)-N-(4-methoxy{-2,3-dimethylphenyl). )acetamid (12). Reyaksyon Beckmann ki vin apre a nan hydroxyamino nan 12 te fèt ak asid silfirik pou peye laktam dérivés 13. Finalman, entèmedyè 13 te idrolize ak oksijene idwojèn ak idroksid sodyòm nan solisyon etanòl ki bay 14. Sèvi ak 14 kòm materyèl la kòmanse pou reyaksyon an, nou plis sentèz yon seri 8-metoksi-9,10-dimethyl-6Hpyrrolo[3,2,1-de]acridine-1,6( 2H)-dyon dérivés ak substituants nan R1 ak R2. Okòmansman, 14 ak 15-19 te sibi reyaksyon Ullmann ak kabonat potasyòm ak kataliz pa kòb kwiv mete ak oksid kwiv (I) nan N, N-dimethylformamide bay entèmedyè korespondan 20-24. Reyaksyon kondansasyon entramolekilè 20-24 yo te fèt ak reyaktif Eaton pou bay 8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,{{46} }de]akridin-1,6(2H)- dérivés dyon (25–29). Menm jan an tou, lè nou itilize 14 kòm materyèl demaraj pou reyaksyon an, nou te fè plis sentèz yon seri 7-metoksi-5,6-dimethyl-9-oxo-9,{{ 59}}dihydroacridine-4- asid carboxylic dérivés ak substituants nan R. Okòmansman, 14 ak 7 oswa 30 yo te sibi reyaksyon Ullmann ak kabonat potasyòm ak kataliz pa kwiv ak oksid kwiv (I) nan N, N-dimethylformamide bay entèmedyè korespondan 31 ak 32. Reyaksyon kondansasyon entramolekilè 31 ak 32 yo te fèt ak reyaktif Eaton pou bay 7-metoxy-5,6-dimethyl-9-oxo-9 ,10-dihydroacridine-4-dérivés asid carboxylic (33,34). Kidonk, nou te fèt, sentèz, ak tès depistaj 16 analòg akridon, ki gen estrikti yo rezime nan Tablo 1.

Tablo 1. Estrikti nouvo analogue etid prezan an.

2.3. Potans obligatwa nouvo konpoze ak STING ak SAR yo

Pousyans obligatwa nouvo konpoze ak STING ak SAR yo Pou konfime dirèkteman efikasite modifikasyon estriktirèl la, nou premye analize tout konpoze sentèz yo pa tès deplasman cGAMP. Anplis selektivite espès, gen senk varyant STING ki polimòfik nan imen, R232 (WT, 58% nan popilasyon an), HAQ (20%), H232 (13%), AQ (7%), ak Q ( 2%) [32]. Pakonsekan, nou itilize twous tès konpetisyon komèsyal yo pa teknoloji omojèn fliyoresans ki rezoud tan (HTRF) pou teste puisans byochimik nouvo konpoze sou mSTING ak divès kalite isoform hSTING (WT, H232, ak AQ) epi konpare yo ak kontwòl la. Kòm antisipe, konpoze kontwòl 1-4 yo tout te mare nan mSTING; soti nan ekran an hSTING, konpoze 3 ak 4 te gen valè IC50 nan nivo mikromolar.

Tablo 2. Rezilta konpoze ak divès kalite isoform hSTING ak tès obligatwa konpetisyon mSTING.

Premyèman, ki baze sou konpoze 3, yo te prezante yon atòm alojene oswa yon gwoup metoksid nan sit C1/C2 (Tablo 1). Konpoze 27, kòm derive pi bon nan konpoze 3 (pozisyon C1 ranplase ak F), gen pi bon aktivite jeneral pase konpoze 3 (aktivite mikromolar yon sèl chif nan tout tès byochimik, Tablo 2). Konpoze 25 R1-modifye a gen yon efè lyezon lajè men li pa aktif menm jan ak vèsyon F-ranplase oswa san ranplasman an. Konpare ak konpoze 3, konpoze yo (26, 28, ak 29) ak gwoup C2-sit entwodwi yo tout te montre diferan degre diminisyon nan afinite lyezon, espesyalman konpoze 29. Dezyèmman, kenbe zo rèl do konpoze 4 la epi ranplase. atòm alojèn nan kont sit C1/C2, nou jwenn konpoze 35-38 (Tablo 1). Konpoze sa yo te inaktif nan tout kat tès deplasman nan konsantrasyon jiska 100 µM, ki montre ke sibstitisyon ak yon atòm alojene nan sit C1/C2 pa tolere. Lè sa a, nou te vire gwoup la acetate sou konpoze 4 nan yon gwoup carboxyl (33) ak prezante metoksid nan sit la C2 (34). Malerezman, chanjman sa a te yon echèk paske tou de konpoze yo te rete inaktif. Aprann nan echèk nou an, nou plis eksplore SAR yo nan dérivés konpoze 4 yo pa deplase gwoup la acetate nan pozisyon N la epi kite pozisyon yo C1 / C2 san modifye. Konpoze 11 montre obligatwa nan yon pakèt varyant STING, tout ak IC50s anba a 20 µM; aktivite a siperyè konpoze 4 ak konparab ak konpoze 27. Anplis de sa, konpoze 9 (pa gen okenn gwoup karboksil nan sit N la) ak konpoze 10 (N-acetate etil) se precurseur sentetik nan konpoze 11 ki pa ka mare nan STING, endirèkteman demontre. enpòtans gwoup asid karboksilik la.

2.4. Evalyasyon Byolojik selilè

2.4.1. Depistaj in vitro nan nouvo analog ak aktivite agonis STING

Nou te teste sistematikman tout konpoze pou aktivite agonist STING lè l sèvi avèk liy selil repòtè 293T hSTING-WT, 293T-mSTING ak THP1-KO-STING (ki bay pa Invivo Gen). Sèvi ak selil 293T-hSTING-R232 ak selil 293T-mSTING, nou te montre deklanchman chemen IRF la kòm yon mezi endirèk nan endiksyon IFN tip I nan siveyans aktivite sekretè anbriyon alkalin fosfataz (SEAP), kontribye nan etid nou an sou selektivite espès la. konpoze. Selil THP1-KO-STING yo te pwodwi nan THP1-selil doub pa knockout ki estab nan jèn STING la, epi nou te anplwaye selil THP1-KO-STING pou konfime si konpoze an montre fonksyon an. nan STING-depandan endiksyon cytokine. Nou te konpare aktivite agonist STING nan tout dérivés sible yo ak sa ki nan agonist referans pou murin (DMXAA) ak imen (20,30 -cGAMP) STING. Etonan, pa youn nan konpoze sentèz yo te kapab aktive swa hSTING oswa mSTING chemen yo (konsantrasyon maksimòm nan 200 µM), ki se seryezman enkonsistan ak rezilta yo nan tès yo obligatwa. Se poutèt sa, ajan obligatwa STING nou yo ka gen modèl obligatwa potansyèl kòm nouvo antagonis STING.

2.4.2. Depistaj in vitro nan STING Binders ak Aktivite STING Inhibitor

Premyèman, nou te fè eksperyans anvan: avèk inibitè kovalan H151 1 µM kòm yon referans pozitif, nou eksplore nivo inhibiteur li yo nan liy selil repòtè mSTING ak hSTING ansanm ak diferan konsantrasyon 20 3 0 -cGAMP pou detèmine kondisyon optimal yo. pou tès depistaj inibitè a (gade Seksyon 4.2.3 pou detay pwotokòl). Dezyèmman, nou te okòmansman tès depistaj pisans inhibition nouvo konpoze yo pa tretman ak metòd pre-eksperimantal nan yon konsantrasyon 100 µM. Nou te jwenn ke gwo spectre STING-obligatwa konpoze 11 ak 27 ekspoze ekselan anpèchman nan tou de murin ak selil STING repòtè imen, ak konpoze 3 ak 4 ak lòt konpoze yo pa efikas. Twazyèmman, nou mete gradyan konsantrasyon pou konpoze 11 ak 27 pou teste tou de valè IC50 epi konpare yo ak H151. Konpoze 11 ak 27 yo te aktif nan konsantrasyon mikromolar ki anpeche 20 3 0 -cGAMP-induit ekspresyon IFN nan tou de chemen hSTING ak mSTING.

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Avèk valè IC50, konpoze 11 (hSTING 19.93 µM ak mSTING 15.47 µM) depase konpoze 27 (hSTING 38.75 µM ak mSTING 30.81 µM) (Figi 7a). An konparezon, valè IC50 H-151 nan selil 293T-hSTING ak 293T-mSTING yo te 1.04 ak 0.82 µM (Figi 7a), ki endike ke inhibiteur kovalan H-151 montre yon pi bon efè inhibition sou STING. -siyal depandan nan tès selil ki baze sou. Pou plis konfime pwopriyete inhibitor konpoze 11 ak 27, nou te anplwaye yon lòt THP-1 liy selil repòtè monosit imen THP1-Dual-hSTING-R232, ki itilize yon sistèm doub repòtè pou rapòte sou aktivasyon IRF. kòm yon mezi endirèk nan kalite I IFN endiksyon ak sou aktivasyon NF-κB kòm yon mezi endirèk nan endiksyon proinflammatory cytokine. Apre eksitasyon liy selil repòtè THP-1 ak 20,30 -cGAMP, nou te ajoute inibitè STING ak konsantrasyon apwopriye pou anpeche endiksyon I IFN ak sitokin proenflamatwa. Kòm antisipe, konpoze 11, 27, ak H151 siyifikativman anpéché STING-deklanche IRF ak deklanchman chemen NF-κB (Figi 7b). Anplis de sa, pou eskli efè sitotoksisite konpoze yo sou aktivite inhibition, nou itilize twous CellTiter-Glo pou analize aktivite selilè. Sa ki kontan, konpoze 11 ak 27 pa te montre okenn prèv sitotoksisite nan selil 293T ak THP-1 pa tès viabilite selil lè yo te ajoute nan konsantrasyon (5 a 100 µM) ki anpeche STING, kontrèman ak H151, ki te deja montre sitotoksisite enpòtan nan 10 µM (Figi 7c). Etid sa yo idantifye konpoze 11 ak 27 kòm inibitè STING modere, kraze sansiblite espès yo ak anpeche IRF ak NF-κB doub chemen san yo pa aparan sitotoksisite.

2.5. Yo te envestige baz estriktirèl Aktivite Konpoze 11 la pa Docking

Mekanis nan antagonist STING konpetitif se okipe sit la obligatwa ak deranje konfòmasyon deklanchman pwoteyin STING la [20,21]. Espesifik nan hSTING, antagonis yo kite dimer hSTING nan yon konfòmasyon "ouvè". Nou itilize Docking Glide la pou detèmine entèraksyon ant STING CTD imen (PDB ID kòd 6MXE) ak pi bon konpoze aktif 11. Nan estrikti debakadè a, de konpoze 11 yo pasyèlman paralèl youn ak lòt epi yo kouche nan pati anba a nan fann nan. dimer la hSTING (Figi 8a), bloke hSTING nan yon konfòmasyon inaktif ouvè (Figi S2). Konpoze 11 pwodui entèraksyon sitou idrofob, ak estrikti tricyclic ligand la ki pèmèt plis kontak ak koòdone nan pòch anba a. Menm jan ak DMXAA oswa CMA, gwoup carboxyl la fòme yon kosyon idwojèn ak chèn bò T263, pandan y ap gwoup keto fòme yon kosyon idwojèn ak chèn bò T267. Methoxy a nan pozisyon C2 reyaji intimman ak S162, sa ki lakòz vwazinaj ligand-ligand youn ak lòt. Substituants bis-methyl yo pa sèlman jenere entèraksyon ligand-ligand, men tou yo fasilman sitiye nan papòt la nan pòch anwo a, ki anpeche obligatwa nan agonist natirèl STING nan résidus kle (Figi 8b).

Figi 7. Broad-spectre STING-liants 11 ak 27 se antagonis STING. (a) Estrikti chimik konpoze 11 ak 27, ak aktivite inhibitor STING inhibiteurs kont tou de m- ak h- STING chemen. Selil 293T (mSTING oswa hSTING), pretrete ak diferan konsantrasyon konpoze yo te ankouraje pa 20,30 -cGAMP; anpèchman nan aktivite a chemen IRF te endirèkteman mezire pa valè dansite optik (OD). Yo te mete koub inhibitor ki depann de dòz la pou kalkile IC50konpoze yo. (b) Konpoze 11 ak 27 ka anpeche deklanchman hSTING doub wout yo. Liy selil repòtè THP1-hSTING-R232 yo te ankouraje ak 20,30 -cGAMP, epi trete ak konpoze yo, anpeche endiksyon IFN- (evalyasyon aktivite a pa inite limyè relatif (RLU) Lucia luciferase). ) ak proinflammatory cytokine endiksyon (siveyans aktivite a nan SEAP mezire pa valè OD). (c) Nouvo analogue montre sitotoksisite ki ba an konparezon ak inibitè kovalan an. 293T (oswa THP-1 selil) yo te enkube ak konsantrasyon inibitè yo endike pou peryòd tan ki endike yo. Vitabilite selil yo te mezire pa twous CellTiter-Glo. Done yo montre yo se mwayèn nan twa eksperyans endepandan. NS (pa gen okenn enpòtan) p > 0.05, *** p < 0.001. valè p yo te kalkile pa yon tès t de-tailed.

Figi 8. Estrikti Docking nan konpoze 11 mare ak pwoteyin STING. (a) Mòd Liaison nan konpoze 11. Ligand mare yo montre nan koulè gri, ak sou-inite STING endividyèl yo nan dimè simetrik yo montre an vèt ak koulè wouj violèt. Nan pòch obligatwa monomè STING la, anba a gen koulè magenta ak tèt la vèt. (b) Kontak entèmolekilè konpoze 11 yo mare ak STING. Konpoze 11 ak asid amine STING kontakte yo montre kòm yon modèl baton. Kontak entèmolekilè ak lyezon idwojèn yo montre ak yon liy tirè jòn. Sipèskripsyon A ak B yo endike monomè pwoteyin oswa idantite ligand endividyèl yo.

3. Diskisyon

Nan limyè de rapò yo vaste sou mekanis ak estrikti kristal nan STING, nou gen opòtinite pou eksplike pwoblèm nan syantifik poukisa DMXAA pa posede aktivite agonis STING imen. Nan etid sa a, lè nou konpare plizyè estrikti kristal STING, nou jwenn kèk rezilta enteresan: 1. Konfòmasyon deklanchman STING la estab; 2. Gen diferan mekanis aktivasyon pou hSTING ak mSTING; 3. DMXAA ak CMA yo nan pati anba a nan sit la obligatwa distenge yo soti nan lòt agonist. Etandone diferan mekanis aktivasyon mSTING ak hSTING, agonist mSTING DMXAA oswa CMA ki sitiye nan pòch anba a pa ka egzèse yon aktivasyon nan hSTING paske apo-hSTING gen yon pi gwo kavite obligatwa anpeche ligand nan asosye ak R238.

Gao et al. rapòte ke mitasyon sèl (G230I, S162A, ak Q266I) dote hSTING ak menm sansiblite DMXAA ak mSTING [33]. Simulasyon MD te revele ke chèn bò G230I mitasyon rejyon kouvèti a ase pou fòme yon baryè esterik pou anpeche eskresyon DMXAA, tandiske DMXAA fasilman sòti nan hSTING WT [27]. Ki baze sou modifikasyon estriktirèl ki koresponn ak mitasyon pwen hSTING (S162A/Q266I) nan sit obligatwa a, sibstansyèl DMXAA ak CMA analòg yo te disponib men pa gen okenn agonist ki pisan hSTING. Rezon ki fè dèyè sa a ta ka ke diferans estriktirèl sibtil ant hSTING "natirèl" ak "mutasyon" ta ka jwe yon wòl enpòtan nan pwosesis rekonesans la. Atravè simulation MD, Che et al. te twouve ke hSTINGs ki pa natirèlman mitasyon yo deranje mouvman kowòdone molekil dlo yo epi chanje kantite dlo ki te ekspilse sou ligand ligand, ki pi fezab pou retabli deklanchman DMXAA nan hSTING [31].

Ankouraje pa dekouvèt etid la nan inhibiteurs STING nan sit la obligatwa anba [21], nou riske anvizaje ke DMXAA, ki sitiye nan menm rejyon an, gen potansyèl la yo dwe transfòme nan nouvo inibitè STING. Nan yon etid anvan, nou fusion estrikti yo nan DMXAA ak CMA ak modifikasyon estriktirèl sibtil ak siksè dekouvri 3 ak 4 ki ta ka mare nan hSTING, men aktivite agonis fèb STING yo pa matche ak puisans obligatwa yo. Nan papye sa a, lide konsepsyon an se amelyore plis kontak DMXAA analòg ak pòch anba a pou reziste konpetitivman lyen 20,30 -cGAMP, kidonk nou fèt ak sentèz estrikti optimize nan konpoze 3 ak 4.

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Premye etap tès depistaj la se te teste aktivite byochimik la lè l sèvi avèk twous obligatwa plizyè varyant STING pou karakterize puisans obligatwa dérivés roman yo. Rezilta yo nan tès yo obligatwa pwouve bonite nan direksyon konsepsyon nou yo; nou idantifye 11 ak 27 kòm lyan STING gwo spectre (siperyè a 3 ak 4) epi nou te diskite sou SAR yo. Pou analogue konpoze 3 yo, modifikasyon yo nan pozisyon C1 yo te amelyore siyifikativman obligatwa a ak divès kalite STING, pandan y ap konpoze C2-modifye yo pa te gen okenn efè. Sepandan, konpoze 4 pa te byen tolere pou modifikasyon estriktirèl nan C1 / C2. Apre demenaje pozisyon asid karboksilik la (C4 rive N), nou jwenn pi bon lyan STING 11 la epi nou detèmine ke gwoup asid karboksilik la te esansyèl pou aktivite. Apre sa, nou te fè tès depistaj tout konpoze pou aktivite nan nivo selilè lè l sèvi avèk twa liy selil repòtè yo, e pa youn nan konpoze sib yo te aktif. Lè sa a, nou te etabli yon metòd tès depistaj pou inibitè STING ak rescreened tout nouvo analòg. STING ajan obligatwa 11 ak 27 ekspoze aktivite inhibitor mikromolar, ak done ki konparab ak tès la obligatwa konpetitif. Inibitè kovalan H151 la te montre yon ti kras pi bon aktivite inhibiteur STING pase 11 ak 27 nan vitro. Anplis de sa, nou plis valide ke 11 ak 27 ka efektivman anpeche 20, 30 -cGAMP-induit aktivasyon nan STING doub chemen. Sa ki pi enpresyonan, 11 ak 27 kenbe yon wo nivo viabilite selil nan gwo konsantrasyon, ki pa posib ak H151. Sitotoksisite se yon pwoblèm komen ak inibitè kovalan ak limite aplikasyon an nan H151.

Pa analiz debakadè, nou te akeri insight sou baz estriktirèl nan pi bon aktivite aktif konpoze 11. Konpoze 11 okipe pòch anba a parfe, kenbe hSTING nan yon konfòmasyon inaktif louvri epi konsa konpetitif anpeche 20, 30 -cGAMP obligatwa. Estrikti bag tricyclic akridin se kle nan jenere entèraksyon idrofob, ak gwoup asid karboksilik ak moyete ketonn ancrage konpoze an nan pati anba a nan pòch la. Nou espekile ke methoxy a pwodui asosyasyon entim ak S162 a, rale konfòmasyon an pwoteyin fèmen majinal men li pa ase yo vire l 'nan yon konfòmasyon agonis. Estrikti bis-methyl la kreye yon sit-bloke espasyal ki amelyore entèraksyon ligand-ligand ak anpeche antre agonist nan pòch anwo a. Kounye a, pa gen okenn estrikti ko-kristal rapòte nan mSTING ak antagonis STING, kidonk nou pa ka eksplike mekanis nan aksyon nan konpoze 11 ak mSTING lè l sèvi avèk yon apwòch debakadè. Sepandan, nou konjekti ke gen de posiblite: youn se ke prensip la aji se ki idantik ak sa yo ki nan hSTING; lòt la se ke konpoze 11 kenbe mSTING nan yon konfòmasyon apo ki pi total epi 20,30 -cGAMP pa ka antre nan pòch la pou egzèse efè agonistik la. An rezime, optimize estriktirèl sibtil nou yo nan agonist STING ki pi fèb yo te ranvèse fonksyon byolojik la avèk siksè pou dekouvri inibitè STING yo. Konklizyon sa yo montre konpleksite pòch obligatwa STING yo epi yo bay nouvo lide rechèch pou devlopman dwòg STING agonist oswa inhibiteur.

4. Materyèl ak Metòd

4.1. Chimi

Solvang ak reyaktif yo itilize nan sentèz la te jwenn nan Beijing Innochem Syans ak Teknoloji co, Ltd (Beijing, Lachin). Estrikti pwodwi yo te idantifye pa espektroskopi 1H ak 13C-NMR (JNM-ECA -400, Japon). Pwa molekilè pwodwi yo te mezire pa gwo rezolisyon mas spectrometri (HRMS) ak electrospray ionization (ESI) kòm mòd ionizasyon (Agilent 1260-G6230A, Almay). NMR ak mas spectre nan konpoze yo bay nan Materyèl siplemantè yo. Nou te sentetize ak idantifye konpoze 35–38; tanpri al gade nan atik ki te rapòte deja pou plis detay [23].

{{0}}({2-metoksi-3,4-dimethyl-9-oxoacridin{-10 (9H)-il)acetate (1{ {25}}): Nan yon solisyon 4-metoksi{{10}},3-dimetilanilin (6) (0.97 g, 6.4 mmol) ak 2-asid bromo-benzoik (7) (1.29 g, 6.4 mmol) nan DMF (6 mL) nan tanperati chanm, nou vin ajoute an poud Cu (0.0 5 g), Cu2O ({{60}}.05 g) ak K2CO3 ({{186}}.71 g, 5.1 mmol). Yo te chofe melanj reyaksyon an nan 110 ◦C pou 12 èdtan. Lè yo retire solvang yo anba yon vakyòm, rezidi a te fonn nan solisyon 1 N NaOH (25 mL). Pwodwi brit la te jwenn nan presipitasyon sou asidifikasyon nan filtrate la ak konk. HCl. Apre siye, yo te ajoute pwodwi brit nan reyaktif Eaton a (5 mL) nan tanperati chanm, epi yo te chofe melanj lan a 90 ◦C pou 1 èdtan. Te melanj reyaksyon an refwadi tonbe nan solisyon akeuz NaHCO3 satire. Te presipite a filtre pou kolekte pwodwi ki graj la. Pirifikasyon nan rezidi a pa kwomatografi kolòn jèl silica bay 9, yon solid jòn pal (0.61 g, 37.7% sede). Yon solisyon NaH (1.43 mmol) ak 9 (0.33 g, 1.3 mmol) nan DMF (5 mL) nan tanperati chanm yo te brase pou 1 èdtan epi apre sa refwadi a 5-7 ◦C. Bromoacetate etil la (0.43 g, 2.6 mmol) te ajoute nan melanj ki kapab lakòz la ak kontinyèlman brase nan tanperati chanm pou 20 èdtan. Apre yo te fin reyaksyon an (TLC), yo te vide melanj reyaksyon an nan dlo glas (15 mL). Presipitè ki kapab lakòz yo te filtre, seche, ak Lè sa a, ekstrè ak klowofòm. Evaporasyon sòlvan an te bay yon ester brit ki te pirifye pa rekristalizasyon pou bay 10, yon solid jòn (0.33 g, 76% sede). 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.30 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.08 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.75-7.67 (m , 1H), 7.57–7.50 (m, 1H), 7.48 (s, 1H), 5.02 (s, 2H), 4.22 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H) , 2.77 (s, 3H), 2.34 (s, 3H), 1.21 (t, J=7.1 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 169.25, 157.87, 155.96, 147.46, 146.72, 135.46, 132.15, 130.17, 129.52.8, 129.52.8, 129.52.18, 129.52. 9.46, 95.26, 72.06, 61.28, 56.06, 14.59 , 14.34, 13.77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ kalkile pou C20H21NO4: 339,3910 jwenn: 340,1546. 2-({2-metoksi{-3,{4-dimethyl-9-oxoacridin{-10(9H)-il)asid acetic (11): Yon solisyon nan 10 (0.37 g, 1.1 mmol) ak NaOH (0.05 g, 1.3 mmol) nan etanòl (20 mL) ak dlo (2 mL) te chofe a 60 ◦C pou 1 èdtan. Lè yo retire solvang yo, rezidi ki te lakòz yo te fonn nan dlo epi filtre. Apre netralizasyon filtraj la ak konk. HCl, melanj lan te filtre yo ka resevwa solid la brit, imedyatman rekristalize pa metanol bay 11, yon poud jòn pal (0.29 g, 85.7% sede). 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 10.51 (s, 1H), 8.33 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.04 (d, J=8.5 Hz, 1H) ), 7.69 (s, 1H), 7.67–7.62 (m, 1H), 7.45 (t, J=6.8 Hz, 1H), 4.52 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 2.75 (s, 3H), 2,31 (s, 3H). 13C RMN (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 159.04, 155.63, 147.47, 146.64, 134.86, 131.52, 129.56, 128.98, 125.215.15, 125.215.15, 125.15.15 1.77, 96.02, 74.81, 55.69, 14.42, 13.33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ kalkile pou C18H17NO4: 311,3370 jwenn: 312,1229.

{{0}}kloro-8-metoksi{-9,10-dimetil-6H-pirolo [3,2,1-de]akridin{ {9}},6(2H)-dyon (25): Pou yon solisyon 6-carboxy-4-metoxy-2,3-dimethylbenzenaminium (14) (1.3 g, 6.4 mmol) ak 2-(2-bromo{-4-chlorophenyl)acetic asid (15) (1.6 g, 6.4 mmol) nan DMF (6 mL) nan tanperati chanm, nou imedyatman ajoute Cu an poud. (0.05 g), Cu2O (0.{05 g) ak K2CO3 (0.71 g, 5.1 mmol). Te melanj reyaksyon an chofe a 110 ◦C pou 12 èdtan. Lè yo retire solvang yo anba yon vakyòm, rezidi a te fonn nan solisyon 1 N NaOH (25 mL). Pwodwi brit la te jwenn nan presipitasyon sou asidifikasyon nan filtrate la ak konk. HCl. Apre siye, yo te ajoute pwodwi brit nan reyaktif Eaton a (5 mL) nan tanperati chanm, epi yo te chofe melanj lan a 90 ◦C pou 1 èdtan. Te melanj reyaksyon an refwadi tonbe nan solisyon akeuz NaHCO3 satire. Te presipite a filtre pou kolekte pwodwi ki graj la. Pirifikasyon nan rezidi a pa kwomatografi kolòn jèl silica bay 25, yon solid jòn (0.80 g, 38.6% sede). 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.17 (d, J =8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.86 (d, J=6.9 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.78 (s, 2H), 2.49 (s, 3H), 2.27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ kalkile pou C18H14ClNO3: 327,7640 jwenn: 328,0734. 4-klor-8-metoksi{-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,1-de]akridin-1 ,6(2H)-dyon (26): sentèz konpoze sa a te sanble ak 25. 15 te ranplase ak 2-(2-bromo-5-chlorofenil)asid acetic (16). Nou jwenn 0.82 g 26 kòm yon solid jòn pal ak yon sede 38.7%. 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 7.73 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.64 (s, 2H), 2.36 (s, 2H), 3H), 2,13 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ kalkile pou C18H14ClNO3: 327,7640 jwenn: 328,0734.

{{0}}fluoro-8-metoksi{-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,1-de]akridin{ {9}},6(2H)-dyon (27): sentèz konpoze sa a te sanble ak 25. Yo te ranplase 15 ak asid 2-(2-bromo-4-fluorofenil)acetic. (17). Nou jwenn yon solid jòn fon 27 ak 0.84 g (42.1% sede). 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.21 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.23 (d, J {{39} }.5 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.81 (s, 2H), 2.53 (s, 3H), 2.30 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ kalkile pou C18H14FNO3: 311.3124 jwenn: 312.1030. 4-fluoro-8-metoksi{-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,1-de]akridin-1 ,6(2H)-dyon (28): sentèz konpoze sa a te sanble ak 25. Yo te ranplase 15 ak 2-(2-bromo{-5-fluorofenil)asid acetic (18). Yo te jwenn 0.81 g fon jòn solid (40.5% sede). 1H RMN (400 MHz, DMSOD6) δ 7.86 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.77 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,26 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ kalkile pou C18H14FNO3: 311.3124 jwenn: 312.1030.

4,8-dimethoxy-9,10-dimethyl-6H-pyrrolo[3,2,1-de]acridine-1,6(2H )-dyon (29): sentèz konpoze sa a te sanble ak 25. 15 te ranplase ak 2-(2-bromo-5-metoksifenil)asid acetic (19). {{20}}.73 g solid jòn te bay ak yon sede 35.2%. 1H RMN (400 MHz, DMSO D6) δ 7.93 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.81 ( s, 3H), 3.67 (s, 2H), 2.44 (s, 3H), 2.28 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ kalkile pou C19H17NO4: 323.3480 jwenn: 324.1230. 7-metoksi-5,6-dimethyl-9-oxo-9,{10-dihydroacridine-4-asid karboksilik (33): Pou yon solisyon 6-carboxy-4-metoksi{-2,3-dimethylbenzenaminium (14) (1.30 g, 6.4 mmol) ak 2-bromo-benzoic asid (7) (1.29 g, 6.4 mmol) nan DMF (6 mL) nan tanperati chanm, nou imedyatman te ajoute poud Cu (0.05 g), Cu2O (0.05 g) ak K2CO3 (0.71 g, 5.1 mmol). Te melanj reyaksyon an chofe a 110 ◦C pou 12 èdtan. Lè yo retire solvang yo anba yon vakyòm, rezidi a te fonn nan solisyon 1 N NaOH (25 mL). Pwodwi brit la te jwenn nan presipitasyon sou asidifikasyon nan filtrate la ak konk. HCl. Apre siye, yo te ajoute pwodwi brit nan reyaktif Eaton a (5 mL) nan tanperati chanm, epi yo te chofe melanj lan a 90 ◦C pou 1 èdtan. Te melanj reyaksyon an refwadi tonbe nan solisyon akeuz NaHCO3 satire. Te presipite a filtre pou kolekte pwodwi ki graj la. Pirifikasyon rezidi a pa kwomatografi kolòn jèl silica bay 33, yon solid jòn pal (1.00 g, 52.7% sede). 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 13.00 (s, 1H), 10.28 (s, 1H), 8.01 (d, J=9.7 Hz, 1H), 7.69 (d) , J=8.5 Hz, 1H), 7.48 (t, J=9.0 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 3.67 (s, 3H), 2.32 (s, 3H). ), 2,10 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ kalkile pou C17H15NO4: 297,3100 jwenn: 298,1073. 2,7-dimethoxy-5,{6-dimethyl-9-oxo{-9,{10-dihydroacridine-4-asid karboksilik (34): sentèz konpoze sa a te sanble ak 33. 7 la te ranplase ak 2-bromo-5- asid methoxybenzoic (30). Solid jòn la te bay 1.05 g ak yon sede 50.2%. 1H RMN (400 MHz, DMSO-D6) δ 12.96 (s, 1H), 10.45 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 3.84 (s, 1H), 3H), 3.81 (s, 3H), 2.48 (s, 3H), 2.27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ kalkile pou C18H17NO5: 327,3360 jwenn: 328,1179.

4.2. Esè byolojik

Twous obligatwa sourit STING, twous obligatwa imen STING WT, twous obligatwa imen AQ STING, ak twous obligatwa H232 STING imen yo te achte nan men Cisbio. Selil 293T mSTING (ISG/KI-IFNb), selil 293T hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb), selil THP1-KI-hSTING-R232, selil THP1-KO-STING yo te achte nan men Invivogen. Selil 293T mSTING ak selil 293T hSTING-R232 yo te kiltive lè l sèvi avèk DMEM (Gibco, Waltham, MA, USA), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 4.5 g / L glikoz (Sigma- Aldrich), 10% FBS (Gibco), Pen-Strep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen, San Diego, CA, USA), ak konplete ak antibyotik selektif (Invivogen). ) blasticidin (10 µM), hygromycin (100 µM) ak zeocin (100 µM). Selil THP1-KO-STING ak selil THP1-KI-hSTING-R232 yo te kiltive lè l sèvi avèk RPMI-1640 (Gibco), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich), 25 mM HEPES (Sigma-Aldrich), 10% chalè-inaktive FBS (Gibco), PenStrep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen), ak complétée ak antibyotik selektif (Invivogen) blasticidin ( 10 µM) ak zeocin (100 µM). QUANTI-Blue solisyon, QUANTI-Luc, 20,30 -cGAMP te achte nan men Invivogen. H151 te jwenn nan Beijing Innochem Syans ak Teknoloji co, Ltd (Beijing, Lachin). CellTiter-Glo luminesan selil viabilite tès twous te jwenn nan Promega.

4.2.1. HTRF STING Obligatwa Essay konpetitif

Dapre enstriksyon yo nan twous obligatwa STING yo, solisyon sa yo te siksesif ajoute nan chak pi nan 384-plak la byen: 5 µL nan konpoze deteksyon yo oswa 2 0,30 -cGAMP (kontwòl pozitif). ) ak diferan konsantrasyon oswa diluan (kontwòl negatif); 5 µL pwoteyin imen STING 6His-tagged (yo te ajoute pi bon kontwòl negatif nan tanpon deteksyon); 10 µL STING ligand d2 ak Anti 6His-Tb3+ solisyon travay premelanje. Apre sele plak la ak enkubasyon nan tanperati chanm pou 3 èdtan, yo te li valè fliyoresan yo nan 665 nm ak 620 nm. Yo te itilize rapò de entansite fliyoresans yo (665 nm/620 nm) pou estime puisans obligatwa konpoze yo. Valè IC50 (50% konsantrasyon inhibitory) yo te kalkile lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism la.

4.2.2. Tès selilè pou tès depistaj konpoze pou aktivite agonistik la

Yo te distribye kantite 180 µL selil 293T mSTING, selil 293T hSTING-R232, ak sispansyon selil THP1-KOSTING nan 96-plak ki byen plat ak yon dansite ~50,000 selil. /well (293T) oswa ~100,000 selil/pi (THP1). Yo te ajoute yon kantite 20 µL swa salin oswa yon solisyon saline nan yon konpoze tès, oswa 20,30 -cGAMP kòm referans pozitif, epi selil yo te enkube a 37 ◦C ak 5% CO2 pou 48 èdtan. Answit, yo te ajoute yon kantite 20 µL supernatant nan yon plak anba plat 96-pi, epi 180 µL solisyon QUANTI-Blue nan chak pi. Plak la te enkube a 37 ◦C pou 3 èdtan, epi yo te detèmine nivo SEAP (aktivite chemen IRF la) lè l sèvi avèk yon espektwofotomèt nan 620-655 nm.

4.2.3. Tès selilè pou tès depistaj konpoze pou aktivite inhibition

Pre-eksperyans: 180 µL selil 293T mSTING, selil 293T hSTING-R232 (~50,000 selil/pi) yo te ankouraje pou 48 èdtan nan 37 ◦C nan yon 5% CO2 enkibatè ak 10 µL 20, 30 -cGAMP (3.125 µM, 6.25 µM) ak 10 µL H151 (1.0 µM) ). Answit, yo te ajoute yon kantite 20 µL supernatant nan yon plak anba plat 96-pi, epi 180 µL solisyon QUANTI-Blue nan chak pi. Plak la te enkube a 37 ◦C pou 3 èdtan, epi yo te detèmine nivo SEAP (aktivite chemen IRF la) lè l sèvi avèk yon espektwofotomèt nan 620-655 nm. Yo te distribye 180 µL selil 293T mSTING, sispansyon selil 293T hSTING-R232 yo te distribye nan 96-plak byen plat ak yon dansite ~50,000 selil/pi. Yon kantite 10 µL 2 0,30 -cGAMP (3.125 µM) ak konpoze 11 oswa konpoze 27 (0.78 µM, 1.56 µM, 3.13 µM, 6.25 µM, 12.5 µM, 25 µM, 25 µM, 25 µM, 25 µM, 25 µM µM) oswa H151 (0.08 µM, 0.16 µM, 0.31 µM, 0.63 µM, 1.25 µM, 2.5 µM, 5 µM) yo te ajoute, epi selil yo te enkube nan 37 ◦C ak 5% CO2 pou 48 h. Answit, yo te ajoute yon kantite 20 µL supernatant nan yon plak anba plat 96-pi, epi 180 µL solisyon QUANTI-Blue nan chak pi. Plak la te enkube a 37 ◦C pou 3 èdtan, epi yo te detèmine nivo SEAP (aktivite chemen IRF la) lè l sèvi avèk yon espektwofotomèt nan 620-655 nm. Valè IC50 yo te kalkile pa lojisyèl GraphPad.

4.2.4. Selilè Essay pou Anpèchman STING Doub Pathways

Yo te distribye 180 µL sispansyon selil THP1-KI-hSTING-R232 nan 96-plak plat ki gen yon dansite ~100,000 selil/pi. Yo te ajoute yon kantite 10 µL 20,30 -cGAMP ak 10 µL konpoze 11 (20 µM) oswa konpoze 27 (33 µM) oswa H151 (2 µM), epi selil yo te enkube a 37 ◦C ak 5% CO2 pou 24 h. Apre sa, yo te ajoute yon kantite supernatant nan yon plak 96-byen blan (opak), ki te swiv pa solisyon QUANTI-Luc oswa QUANTI-Blue nan chak pi, epi yo te li nivo luminesans oswa nivo SEAP dapre enstriksyon manifakti a. Sa a pèmèt etid la similtane nan IFN faktè regilasyon (IRF) chemen an, pa evalye aktivite a nan Lucia luciferase ak chemen an NF-κB, pa kontwole aktivite a nan SEAP.

4.2.5. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay

Vitabilite selil yo te mezire pa CellTiter-Glo luminesan selil viabilite tès twous dapre enstriksyon manifakti a. Yon ti tan, selil yo te enkube ak twa konsantrasyon diferan (5 µM, 10 µM, 100 µM) nan konpoze 11 konpoze 27, oswa H-151 pou 48 èdtan. Yo te ajoute 100 µL reyaktif CellTiter-Glo nan yon plak analiz 96-byen pou 10 minit, epi yo te anrejistre luminesans.

4.3. Docking molekilè nan konpoze 11

Estrikti kristal konplèks STING (PDB ID: 6MXE) te pran nan yon antre nan Bank Done Pwoteyin epi yo te itilize kòm pwen depa. Pwoteyin te prepare lè l sèvi avèk preparasyon Pwoteyin Maestro a epi divize an chèn A ak chèn B. Nou te pwodwi yon sit obligatwa nan LBD nan monomè STING ki baze sou ligand orijinal la (Merck-18) lè l sèvi avèk Receptor Grid Generation. Nou te itilize presizyon SP Glide-docking pou pati molekilè debakadè a, sa ki pèmèt konpoze 11 jenere 20 poze. Nou finalman te pwodwi 16 konformasyon mare (tout nan pòch anba a) epi teste enèji a obligatwa gratis nan konplèks yo lè l sèvi avèk modil Prime MM-GBSA nan lojisyèl Schrödinger la. Anplis de sa, ki baze sou nòt debakadè a, nòt modèl glise, ak nòt MMGBSA dG Bind, nou te chwazi konfòmasyon optimal ki bay nòt premye nan de epi ki klase twazyèm nan yon sèl (wè nan Tablo S2). Finalman, nou fusionné pi bon konformasyon chèn A ak B pou jwenn estrikti debakadè konplè a.

Referans

1. Abe, T.; Harashima, A.; Xia, T.; Konno, H.; Konno, K.; Morales, A.; Ahn, J.; Gutman, D.; Barber, GN STING Rekonesans ADN sitoplasmik ankouraje defans selilè. Mol. Cell 2013, 50, 5–15. [CrossRef]

2. Wu, J.; Solèy, L.; Chen, X.; Du, F.; Shi, H.; Chen, C.; Chen, ZJ Cyclic GMP-AMP se yon dezyèm mesaje andojèn nan siyal iminitè natirèl pa ADN Cytosolic. Syans 2013, 339, 826–830. [CrossRef]

3. Abe, T.; Barber, GN Cytosolic-ADN-medyatè, STING-depandan Proinflammatory Gene Enduction Necessite Kanonik NF-κB Aktivasyon nan TBK1. J. Virol. 2014, 88, 5328–5341. [CrossRef]

4. Cai, X.; Chiu, Y.-H.; Chen, ZJ Chemen cGAS-cGAMP-STING nan deteksyon ak siyal ADN Cytosolic. Mol. Cell 2014, 54, 289–296. [CrossRef] [PubMed]

5. Gao, D.; Li, T.; Li, X.-D.; Chen, X.; Li, Q.-Z.; Wight-Carter, M.; Chen, ZJ Aktivasyon siklik GMP-AMP synthase pa pwòp tèt ou-ADN lakòz maladi otoiminitè. Pwosedi. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, E5699–E5705. [CrossRef] [PubMed]

6. Li, TJ; Cheng, H.; Yuan, H.; Xu, QM; Shu, C.; Zhang, YF; Xu, P.; Tan, J.; Rui, Y.; Li, PJSR Aktivite Antitumoral nan cGAMP atravè Stimulasyon nan cGAS-cGAMP-STING-IRF3 Medyatè Repons iminitè innati. Sci. Rep. 2016, 6, 19049. [CrossRef] [PubMed]

7. Motwani, M.; Pesiridis, S.; Fitzgerald, KA deteksyon ADN pa chemen cGAS-STING nan sante ak maladi. Nat. Rev Genet. 2019, 20, 657–674. [CrossRef]

8. Zhang, H.; Ou menm, QD; Xu, XL Vize Stimulator nan entèferon jèn (STING): Yon pèspektiv Chimi medsin. J. Med. Chem. 2020, 63, 3785–3816. [CrossRef]

9. Gao, J.; Tao, J.; Liang, W.; Zhao, M.; Du, X.; Cui, S.; Duan, H.; Kan, B.; Su, X.; Jiang, Z. Idantifikasyon ak karakterizasyon fosfodiesteraz ki espesyalman degrade 30 3 0 -cyclic GMP-AMP. Selil Res. 2015, 25, 539–550. [CrossRef] [PubMed]

10. Corrales, L.; McWhirter, SM; Dubensky, TW; Gajewski, TF Chemen STING lame a nan koòdone kansè ak iminite. J. Clin. Investig. 2016, 126, 2404–2411. [CrossRef] [PubMed]

11. Baguley, BC; Ching, LM DMXAA: Yon ajan anti-vaskilè ak repons lame miltip. Ent. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2002, 54, 1503–1511. [CrossRef]

12. Lara, PN; Douillard, J.-Y.; Nakagawa, K.; von Pawel, J.; McKeage, MJ; Albert, mwen; Losonczy, G.; Reck, M.; Heo, D.-S.; Fanatik, X.; et al. Esè owaza Faz III Kontwole Plasebo sou Carboplatin ak Paclitaxel Avèk oswa San Ajan deranje Vadimezan (ASA404) nan kansè nan poumon ki pa ti selil avanse. J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965–2971. [CrossRef]

13. Conlon, J.; Burdette, DL; Sharma, S.; Bhat, N.; Thompson, M.; Jiang, Z.; Rathinam, VAK; relijyeu, B.; Jin, T.; Xiao, TS; et al. Sourit, men se pa moun STING, mare ak siyal an repons a vaskilè deranje Ajan 5, 6-Dimethylxanthenone-4-Asid Acetic. J. Immunol. 2013, 190, 5216–5225. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, S.; Li, L.; Maliga, Z.; Yin, Q.; Wu, H.; Mitchison, TJ Flavonoid antikansè yo se agonist STING ki seleksyone sourit. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1396–1401. [CrossRef] [PubMed]

15. Cavlar, T.; Deimling, T.; Ablasser, A.; Hopfner, K.-P.; Hornung, V. Espès-espesifik deteksyon nan antiviral ti-molekil konpoze CMA pa STING. EMBO J. 2013, 32, 1440–1450. [CrossRef]

16. Ramanjulu, JM; Pesiridis, GS; Yang, J.; Concha, N.; Singhaus, R.; Zhang, S.-Y.; Tran, J.-L.; Moore, P.; Lehmann, S.; Eberl, HC; et al. Konsepsyon amido benzimidazol STING agonist reseptè ak aktivite sistemik. Nature 2018, 564, 439–443. [CrossRef] [PubMed]

17. Chin, EN; Yu, C.; Vartabedian, VF; Jia, Y.; Kumar, M.; Gamo, AM; Vernier, W.; Ali, SH; Kissai, M.; Lazar, DC; et al. Aktivite antitumoral yon mimetik cGAMP ki pa nikleotid aktive STING sistemik. Syans 2020, 369, 993–999.

18. Pan, BS; Perera, SA; Piesvaux, JA; Presland, JP; Schroeder, GK; Cumming, JN; Trotter, BW; Altman, MD; Buevich, AV; Lajan Kach, B.; et al. Yon agonist STING ki pa nukleotid ki disponib oralman ak aktivite antitumoral. Syans 2020, 369, eaba6098. [CrossRef] [PubMed]

19. Sali, TM; Pryke, KM; Jinu, A.; Andre, L.; Iris, A.; Rebecca, B.; Staverosky, JA; Smith, JL; Ahmed, AS; Lisi, AJPP Karakterizasyon yon Agonist STING Nouvo Espesifik Moun ki Pwovoke Aktivite Antiviral Kont Alfaviris Emerjans. PloS Pathog. 2015, 11, e1005324. [CrossRef] [PubMed]

20. Hong, Z.; Mei, J.; Li, C.; Bai, G.; Maimaiti, M.; Hu, H.; Yu, W.; Solèy, L.; Zhang, L.; Cheng, D.; et al. Inibitè STING yo vize pòch obligatwa dinukleotid siklik la. Pwosedi. Natl. Acad. Sci. USA 2021, 118, e2105465118. [CrossRef] [PubMed]

21. Siu, T.; Altman, MD; Baltus, GA; Childers, M.; Ellis, JM; Gunaydin, H.; Hatch, H.; Ho, T.; Jewell, J.; Lacey, BM; et al. Dekouvèt yon nouvo ligand konpetitif cGAMP nan fòm inaktif STING. ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 92–97. [CrossRef] [PubMed]

22. Haag, SM; Gulen, MF; Reymond, L.; Gibelin, A.; Abrami, L.; Decout, A.; Heymann, M.; van der Goot, FG; Turcatti, G.; Behrendt, R.; et al. Vize STING ak inibitè ti molekil kovalan. Nature 2018, 559, 269–273. [CrossRef]

23. Hou, S.; Lan, X.-J.; Li, W.; Yan, X.-L.; Chang, J.-J.; Yang, X.-H.; Solèy, W.; Xiao, J.-H.; Li, S. Konsepsyon, sentèz ak evalyasyon byolojik nan analogue akridon kòm agonist reseptè STING roman. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103556. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, S.; Chante, X.; Wang, Y.; Ru, H.; Shaw, N.; Jiang, Y.; Niu, F.; Zhu, Y.; Qiu, W.; Parvatiyar, K.; et al. Analiz estriktirèl Pwoteyin adaptè STING la revele yon entèfas Dimer idrofob ak mòd siklik di-GMP Liaison. Iminite 2012, 36, 1073–1086. [CrossRef] [PubMed]

25. Shu, C.; Yi, G.; Watts, T.; Kao, CC; Li, P. Estrikti nan STING mare nan siklik di-GMP revele mekanis nan rekonesans siklik dinukleotid pa sistèm iminitè a. Nat. Estrikti. Mol. Biol. 2012, 19, 722–724. [CrossRef]

26. Huang, Y.-H.; Liu, X.-Y.; Du, X.-X.; Jiang, Z.-F.; Su, X.-D. Baz la estriktirèl pou deteksyon an ak obligatwa nan siklik di-GMP pa STING. Nat. Estrikti. Mol. Biol. 2012, 19, 728–730. [CrossRef]

27. Shih, AY; Damm-Ganamet, KL; Mirzadegan, T. Diferans estriktirèl dinamik ant STING imen ak sourit mennen nan sansiblite diferan nan DMXAA. Biophys. J. 2018, 114, 32–39. [CrossRef]

28. Gao, P.; Ascano, M.; Zillinger, T.; Wang, W.; Dai, P.; Serganov, AA; Gaffney, BL; Shuman, S.; Jones, RA; Deng, L.; et al. Analiz estrikti-fonksyon nan aktivasyon STING pa c [G (20,50 ) pA (30,50 ) p] ak vize pa antiviral DMXAA. Cell 2013, 154, 748–762. [CrossRef] [PubMed]

29. Zhang, C.; Shang, G.; Gui, X.; Zhang, X.; Bai, X.; Chen, ZJN Baz estriktirèl nan STING obligatwa ak fosforilasyon pa TBK1. Nature 2019, 567, 394–398. [CrossRef]

30. Vavrina, Z.; Gutten, O.; Smola, M.; Zavrèl, M.; Aliakbar Tehrani, Z.; Charvát, V.; Kožíšek, M.; Boura, E.; Birkuš, G.; Rulíšek, L. Entèraksyon Pwoteyin-Ligand nan Sit Obligatwa STING Sonde pa Mitasyon Rasyonèl ki Konsine Single-Pwen: Eksperyans ak Teyori. Byochimik 2021, 60, 607-620. [CrossRef] [PubMed]

31. Che, X.; Du, X.-X.; Cai, X.; Zhang, J.; Xie, WJ; Long, ZR; Wi, Z.-Y.; Zhang, H.; Yang, L.; Su, X.-D.; et al. Selibatè mitasyon yo chanje rezo korelasyon estriktirèl konplèks DMXAA-Human STING la. J. Fizik. Chem. B 2017, 121, 2073–2082. [CrossRef] [PubMed]

32. Diner, EJ; Burdette, DL; Wilson, SC; Monroe, KM; Kellenberger, CA; Hyodo, M.; Hayakawa, Y.; Hammond, MC; Vance, RE Inate Immune DNA Sensor cGAS Pwodui yon Dinukleotid siklik ki pa canonical ki aktive STING imen. Rep. selil 2013, 3, 1355–1361. [CrossRef] [PubMed]

33. Gao, P.; Zillinger, T.; Wang, W.; Ascano, M.; Dai, P.; Hartmann, G.; Tuschl, T.; Deng, L.; Barchet, W.; Patel, DJ Binding-Pocket ak sibstitisyon Lid-Rejyon rann moun STING sansib a DMXAA Dwòg Espesyal la. Rep. selil 2014, 8, 1668–1676. [CrossRef] [PubMed]

34. Hwang, J.; Kang, T.; Lee, J.; Choi, B.-S.; Han, S. Konsepsyon, sentèz, ak evalyasyon byolojik nan C7-fonctionalized dérivés DMXAA kòm potansyèl agonist imen-STING. òg. Biomol. Chem. 2019, 17, 1869–1874. [CrossRef] [PubMed]