Echinacoside Pwoteje kont 6-Hydroxydopamine-induit disfonksyon mitochondrial ak repons enflamatwa nan PC12 Selil atravè Diminye pwodiksyon ROS

Kontak: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

Yue-Hua Wang,1,2 Zhao-Hong Xuan, 3 Shuo Tian, 1 ak Guan-Hua Du1,2

Maladi Parkinson la (PD) se yon maladi newodegenerative karakterize pa pèt pwogresis nan dopaminerik (DA) neurones nan nigrad la sibstansyèl. Malfonksyònman mitolojik ak repons enflamatwa yo patisipe nan mekanis nan domaj selil nan PD. 6-Hydroxydopamine (6-OHDA), yon analòg dopamine, espesyalman domaj domaj.Echinacoside(ECH) se yon glikoz fenomèn izole ki soti nan tij yo nanSispann salesa, ki montre yon varyete de efè nerotektiv nan syans anvan yo. Etid la prezan te mennen ankèt sou efè li kont 6-OHDA-induit nerotoksik ak mekanis posib nan selil PC12. Rezilta yo te montre ke 6-OHDA redwi vizibilite selil, diminye aktivite oksidasyon-rediksyon, diminye potansyèl mitochondrial potansyèl, ak pwodui mitochondria-medyatè aparèy konpare ak selil PC12 trete. Sepandanekinaotretman siyifikativman atenue chanjman sa yo ki te pwovoke pa 6-OHDA. Epi touekinaotou te kapab siyifikativman soulaje repons enflamatwa yo ki te pwovoke pa 6-OHDA. Plis rechèch te montre saekinaote kapab diminye 6-OHDA-induit pwodiksyon ROS nan selil PC12. Rezilta sa yo sijere ke mekanis nan kache nanekinaokont 6-OHDA-induit nerotoksik petèt enplike nan atann malfonksyònman mitokondrial ak repons enflamatwa pa diminye pwodiksyon ROS.

1. Entwodiksyon

Maladi tranblemanntè (PD)se yon maladi newodejenerative karakterize pa dejenerasyon an dousman pwogresif nan neurones dopamine nan kontra a nigra pars kontra [1]. Malgre ke karaktè yo neurolojik nan PD yo byen dekri, etyoloji a rete toujou endefini. Nòmalman, plizyè obsèvasyon sijere ke malfonksyònman mitokondrial ki enplike nan ajan patojèn la nan PD ak dejenerasyon an nan ewonn dopaminerik [2, 3]. Mitochondria gen anpil anzim redoks ak natirèlman rive enfimite nan fosfò oksidantal jenere espès oksijèn reyaktif (ROS) [4]. Dènyèman, ogmante prèv ki soti nan etid imen ak bèt te sijere ke neuroinflamation se tou yon kontribitè enpòtan nan pèt ewonn nan PD [5].

6-Hydroxydopamine (6-OHDA) se espesifik pou dopaminerik ewonn nan modèl enstrimantal rodent ak nan kèk selil [6-11]. PC12 selil te vin yon modèl selil popilè pou rechèch PD paske liy selil sa a posede anpil karakteristik nan ewonn DAergic. Li te itilize kòm yon modèl vitro pou etid la nan PD ak detèmine efè a nan ajan pwoteksyon ak terapetik. Echinacoside (Figi 1) se yon fenomèn glikoz izole ak pirifye soti nan tij laSispann salesa[12], yon plant parazit natif natal nan nòdwès Lachin, ki se itilize kòm yon mekanis eseye kache nan echinacoside kont 6-OHDA- induitamageinPC12cells.

2. Materyèl ak metòd

2.1. Materyèl. Echinacoside te jwenn nan Enstiti Nasyonal pou Manje ak Kontwòl Dwòg (Beijing, Lachin). RPMI-1640 ak sewòm bovine fetis yo te jwenn nan Gibco

(Grand Island, NY, USA). 6-OHDA, MTT, 2,7-dichlorodidrodydrofluorescein dyacet, propidium iodide (PI), ak resazurin yo te achte nan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Twous biolumines atravè biyolojik la te jwenn nan Promega (Madison, USA). 5,5,6,6 -6,6 -Tetrachloro-1,3,3-tèm radyo benzimidazolyl kabokyan iodide (JC-1) te jwenn twous te jwenn nan Beyotime Enstiti Biyoteknoloji (Ayiti, Jiangsu, Lachin). Cytochrome C ELISA twous ak substra fliyojèn Ac-DVD-AMC yo te jwenn nan Envitrogen (Carlsbad, CA, USA). IL-1 ak twous ELISA yo te jwenn nan Boster Bio-enjenyè konpayi limite (Wuhan, Lachin). Spectramax M5 lektè microplate te achte nan konpayi an Aparèy Molekilè (Sunnyvale, CA, USA).

2.2. Kilti selil ak Tretman. Selil PC12 yo te grandi nan RPMI-1640 konplete ak 10% sewòm cheval ak 5% sewòm bovine fetal. Kondisyon yo te konsève nan 37 ∘C nan yon atmosfè imid ki gen 5% CO2 [19]. Selil yo te plake nan 96-byen plak nan yon dansite de 2 × 105 selil / mL. Apre 80% konfli, selil yo te preinki ak konsantrasyon diferan nan echinacoside nan yon seri-gratis RPMI-1640 mwayen pou 1 h. Lè sa a, 6-OHDA te ajoute nan byen yo nan yon konsantrasyon final nan 100 M ak enkyete pou yon lòt apre tretman, chanjman mòfolojik yo te obsève anba yon mikwoskòp. Selil te evalye pa MTT aza [19]. Yon ti tan, apre tretman an, MTT nan konsantrasyon final la nan 0.5 mg / mL te ajoute nan chak byen ak enkukib pou 4 h nan 37 ∘C.

2.3.Morphological Chanjman ak Viabilite Azi nan selil PC12. Apre tretman an, chanjman mòfolojik yo te obsève anba yon mikwoskòp. Selil te evalye pa MTT aza [19]. Yon ti tan, apre tretman an, MTT nan konsantrasyon final la nan 0.5 mg / mL te ajoute nan chak byen ak enkukib pou 4 h nan 37 ∘C. Lè sa a, supernatant la te retire ak pwodwi a fòma te fonn nan 100 L dimethyl sulfoxide ak brase pou 15 min sou yon plak mikwo-òganis ak absòbe a te li nan 570 nm lè l sèvi avèk yon Spectramax M5 microplate lektè. Prèv ki baze sou konplemantè ak altènatif medikaman

2.4. Intracellular ATP Nivo Assay. Nivo atravè selilè ATP te mezire ak yon twous atravè atak biyolojik selon enstriksyon manifakti a. Luminescence te kontwole sou yon lektè mikwo-òganis nan mòd nan luminesans swiv adisyon a nan 100 Luciferin ak luciferase [20].

2.5. Mezi nan Mitochondria Oksidasyon-Rediksyon pa Resazurin. Apre tretman an, rezourne nan dènye trasyon 5 M te ajoute nan byen ak entansite fliyò te egzamine nan yon eksitasyon de 530 nm ak yon emisyon de 590 nm [21].

2.6. Mezi nan Mitochondrial len potansyèl pa JC-1. Potansyèl mitokondrial la te mezire lè l sèvi avèk twous la JC-1 atake dapre enstriksyon manifakti a. Apre tretman an, mwayen kilti a te retire ak chaje ak solisyon JC-1 pou 15 min nan 37 ∘C nan fènwa. Entansite fliyoresans nan rapò wouj / vèt te detèmine nan yon eksitasyon de 490 nm ak emisyon nan 530 nm (vèt monomesan fliyoresan) ak 590 nm (wouj fluorescent), respektivman [22].

2.7. Quantifikasyon nan Cytochrome C lage. Nivo cytosolic cytochrome C yo te mezire lè l sèvi avèk yon twous ELISA dapre enstriksyon manifakti a [23]. Yon ti tan, apre tretman an, selil yo te bay manti ak santrifujeur nan 1000 g pou 15 minit, ak Lè sa a, supernatant la te ranmase kòm yon fraksyon cytoplasmic ak itilize pou mezi lage cytochrome C.

2.8. Detèminasyon nan Aktivite Kaspas-3. Kaspase-3 aktivite te fèt dapre referans yo ak modifikasyon [24]. Yon ti tan apre tretman an, lysis la te dechaje byen epi swiv pa santrifugasyon nan 12 000 g pou 10 min. Kaspase-3 aktivite te teste nan sa ki lakòz sipèmaten direksyon pa mezire pwoteyole pwoteyolitik la nan substra ac-DVD-AMC ak yon vag eksitasyon nan 380 nm ak yon vag emisyon nan 460 nm.

2.9. Koule Cytometry Assay nan PC12 selil yo. Apre tretman, selil yo te tripsinize, lave de fwa ak PBS, santrifujeur nan 1000 r / min pou 5 min, ak Lè sa a, fiks ak 70% ethanol lannwit lan nan 4∘C. Selil yo te santrifye ak lave de fwa ak PBS, respekte nan PBS (ki gen 50 g / mL RNaseA), tache ak PI nan konsantrasyon final la nan 10 M pou 30 min nan tanperati chanm nan fènwa a, epi li nan yon sitiyasyon koule nan 488 nm eksitasyon [10].

2.10. Mezi nan IL-1 ak IL-6 Nivo pa ELISA Assay. Mwayen selil PC12 kiltirèl yo te ranmase apre tretman an, ak konsantrasyon IL-1 ak IL-6 konsantrasyon yo te mezire pa twous ELISA ki disponib dapre pwotokòl manifakti a.

2.11. Detèminasyon nan Intracellar Oksijèn Espès Oksijèn. Apre enkubasyon ak 6-OHDA, selil yo te chaje ak 10M H2DCFH-DA pou 30 min nan 37 ∘C nan fènwa a. Entansite fliyoresans DCF te mezire nan yon eksitasyon

Prèv ki baze sou konplemantè ak altènatif vag medsin nan 495 nm ak emisyon vag nan 530 nm sou yon lektè mikwop [25].

2.12. Analiz estatistik. Tout done yo eksprime kòm vle di ± analiz Estatistik nan rezilta yo te pote soti nan yon sèl-fason analiz de divèjans (ANOVA), ki te swiv pa-tès. Siyifikasyon estatistik te aksepte nan<>

3. Rezilta yo

3.1. Efèktivasyon ChinacosideonMorphologyand Cell Viabilityin PC12 selil ki domaje pa 6-OHDA. Jan sa montre nan Figi 2 (A), vizibilite nan selil PC12 pa te gen okenn diferans siyifikatif nan konsantrasyon an nan 0.1∼10 M nan tretman ekinaoside pou

24 h. Jan yo montre sa nan Figi 2 (B), nan 24 h nan tretman ak 6-OHDA pou kont li, majorite nan selil PC12 yo te sibi chanjman mòfolojik tankou manbràn kraze ak selil retresi. Tretman ak echinacoside pwoteje selil yo soti nan 6-OHDA domaj. MTT te montre ke tretman nan selil PC12 ak 6-OHDA pou kont li rezilta nan yon apeprè 25% rediksyon nan siviv selil nan 24 h, Lè nou kontwole cotretment ak 0.1 M, 1 M, ak 10 M ekonomi te montre yon rediksyon nan 6-OHDA-medyatè cytotoxicity (tout< 0.01,="" figure="">

3.2. Efè Echinacoside sou Mitochondria Disfonksyon pwosedi pa 6-OHDA nan selil PC12. Nivo selilè ATP yo te siyifikativman diminye apre 24 hcubation ak 100MM 6-OHDA, Lè nou kontwole cotretment ak 1 Mand 10 M nan echinacoside soulaje 6-OHDA-medyatè ATP diminye chanjman anabolik nan selil PC12 yo. Rezilta yo te montre ke cotretment ak 1 Mand 10 M nan echinacoside te kapab siyifikativman atenue mitochondria oksidasyon-rediksyon aktivite ki pwovoke pa 6-OHDA (tou de (tou de< 0.05="" and="" figure="">

Jan sa montre nan Figi 3 (c), tretman ak 100 M nan 6- OHDA pou 24 h rezilta nan yon diminisyon siyifikatif nan potansyèl mitokondrial potansyèl konpare ak gwoup la trete (< 0.01).="" however,="" the="" decrease="" of="" mitochondrial="" membrane="" potential="" induced="" by="" 6-ohda="" was="" significantly="" attenuated="" by="" cotreatment="" with="" 0.1="" m,="" 1="" m,="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" (all=""><>

3.3. Anti-Mitochondria-Medyatè Apoptosis nan Echinacoside nan PC12 selil kont 6-OHDA Neurotoxicity. Rezilta yo te montre ke ekspozisyon 6-OHDA te lakòz yon ogmantasyon nan cytochrome C pa 167% sou gwoup la ki pa trete (< 0.01).="" echinacoside="" at="" the="" dose="" of="" 0.1="" m,="" 1="" m,="" and="" 10m="" could="" significantly="" reduce="" the="" cytochrome="" c="" release="" into="" cytosol="" induced="" by="" 6-ohda="" (="">< 0.05,="">< 0.01,="" and="">< 0.01,resp.;="" figure="">

Aktivite Kaspas-3 te ogmante pa apeprè 3.3-pliye konpare ak gwoup la trete apre 6-OHDA ekspoze (< 0.01).="" in="" contrast,="" cotreatment="" with="" 1="" m="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" showed="" a="" significant="" decrease="" in="" caspase-3="" activity="" compared="" with="" 6-ohda-treated="" cells,="" respectively="" (both="">< 0.05="" and="" figure="" 4(b)).pi="" is="" membrane="" permeability="" and="" is="" generally="" excluded="" from="" viable="" cells.="" so="" it="" is="" commonly="" used="" for="" identifying="" dead="" cells="" in="" a="" population.="" the="" results="" showed="" that="" the="" apoptosis="" rate="" was="" significantly="" increased="" following="" 24="" h="" incubations="" with="" 100="" m="" 6-ohda,="" whereas="" cotreatment="" with="" 1="" and="" 10="" m="" echinacoside="" significantly="" reduced="" 6-ohda-induced="" apoptosis="" (="">< 0.05,="">< 0.01,resp.,="" figure="">

3.4. Efè anti-enflamatwa nan Echinacoside nan PC12 selil pwovoke pa 6-OHDA. Rezilta yo te montre ke 6-OHDA ekspoze a 6-OHDA ekspoze a ogmanteinininil-1 nivo konpare ak gwoup ki pa trete (< 0.05;="" figure="" 4(a)).="" however,="" 10="" m="" of="" echinacoside="" could="" significantly="" reduce="" il-1="" release="" induced="" by="" 6-ohda="" (="">< 0.05;="" figure="">

Nivo IL-6 te tou siyifikativman ogmante konpare ak gwoup trete (< 0.01).="" however,="" cotreatment="" with="" 0.1,="" 1,="" and="" 10="" m="" of="" echinacoside="" all="" significantly="" decreased="" il-6="" release="" compared="" with="" 6-ohda-treated="" cells="" (both="">< 0.05="" and="" figure="">

3.5. Efè ECH sou ROS Pwodiksyon pwodiksyon pwodiksyon pa 6-OHDA nan selil PC12. Selil yo trete ak 6-OHDA te montre yon ogmantasyon siyifikatif (apeprè 1.4-pliye) nan ROS intracellular ros konpare ak selil ki pa trete (.< 0.01).="" this="" increase="" was="" significantly="" attenuated="" by="" coincubation="" with="" 0.1,="" 1,="" and="" 10="" m="" echinacoside="" (="">< 0.05,="">< 0.01,and="">< 0.01,resp.;="" figure="">

4. Diskisyon

Echinacoside se youn nan konstitiyan prensipal yo nan fenomèn glikozif ekstrè soti nan yon echinao pi popilè tradisyonèl rapòte gen anti-apoptotic ak pwopriyete nerotektiv nan maladi newodegenerative [18]. Nan etid vivo rapòte ke echinacoside te gen efè nerotektiv ak amelyorasyon konpòtman nan modèl la sourit nan MPTP- pwovoke domaj ewonn dominikèn, pandan y ap plis envestigasyon revele ke echinacoside pwovoke degre nan kapase-3 ak kapase-8 deklanchman nan MPP +-induit apoptosis nan serebelyon granule [16]. Yon lòt nan etid vivo rapòte efè nerotektiv nan ekonomi sou echinacoside sou ewonn yo striatal dopaminerik ki blese pa 6-OHDA [17]. Sepandan, mekanis yo selilè ak molekilè ki anba aksyon sa yo pa konplètman konprann, espesyalman pou enfliyans yo sou fonksyon mitorik ak repons enflamasyon. Se konsa, etid aktyèl nou an envestige efè yo nan echinacoside sou fonksyon mitokondrial ak repons enflamasyon elimine mekanis li yo kont PD. Rezilta yo premyeman te montre ke ekonomi siyifikativman soulaje 6-OHDA-pwovoke nerotoksik nan selil PC12 nan pwoteje fonksyon mitokondrial ak anti-enflamasyon.

Malfonksyònman mitolojik depi lontan te enplike nan lanmò a nan ewonn nigwostrial dopaminerik nan maladi Parkin- pitit gason an ak modèl eksperimantal li yo [26]. Mitochondria yo pwofondman patisipe nan pwodiksyon espès oksijèn reyaktif (ROS) nan transpòtè yo elektwonik nan chèn respiratwa a nan maladi newodegenerative [27]. Yon gran varyete ROS yo pwodwi nan kou a nan metabolis la nòmal nan sistèm byolojik, men akimilasyon yo pi lwen pase la

kantite lajan obligatwa ka potansyèlman domaje lipid, pwoteyin, ak asik nikleyik.

6-OHDA, yon analòg katecholamine, lakòz dejenerasyon espesifik nan substantia nigra ewonn. Nerotoksik ki pwovoke pa 6-OHDA se, an pati, akòz pwodiksyon ros [28-32].

OHDA mennen nan lanmò ewonn pa afekte fonksyon mitokondri, ki gen ladan abòdab nan pwodiksyon ATP, twoub nan ROS metabolis, ak endiksyon an nan aparèy [10, 33, 34]. Nan etid la prezan, rezilta nou yo tou demontre ke 6-OHDA domaje mitokondrial fonksyon oksidantal-rediksyon, diminye potansyèl mitokondrial len, pwovoke mitokondri-medyatè apoptosis, ak ogmante pwodiksyon ROS nan selil PC12.

Resazurin se yon endikatè fliyoresan ki se entèmedyè sèlman ant rediksyon final nan oksijèn molekilè ak oksijèn cytochrome. Se poutèt sa, potansyèl la oksidantal-rediksyon nan rezazurin pèmèt chèn respiratwa a fonksyone tou pre fini, ki pral bay yon endikasyon pi egzat ak sansib nan fonksyon mitodonal. JC-1 se yon sonbrasyon len potansyèl-sansib ki lokalize nan manbràn mitokondrial la kote li fòme swa monometri (vèt) oswa total (wouj) ki baze sou potansyèl mitokondrial. Se konsa, rezazurin ak JC-1 yo gen zouti analyse valab pou egzamine fonksyon mitokondrial [35]. Etid la prezan endike ke diminye nan aktivite mitokondrial oksidasyon-rediksyon ak potansyèl mitokondrial ka jwe wòl enpòtan nan 6-OHDA- pwovoke nerotoksikoloji dopaminiken. Rezilta nou an te montre tou mitokondrial aktivite oksidantif-rediksyon ak potansyèl mitokondrial potansyèl. Rezilta sa yo bay ke amelyorasyon nan malfonksyònman mitokondrial ka yon pi bon fason pou ralanti nerodegenerasyon dopaminerik souvan ki asosye ak PD.

Li se jeneralman aksepte ke selil ki pwovoke pa 6 - OHDA medyatè pa malfonksyònman mitochondrial, karakterize pa cytochrome C lage, ak kaspase-3 deklanchman [36]. Yon estimilis apoptotik deklannche liberasyon an nan cytochrome C soti nan mitochondria a nan cytosol kote li Lè sa a, aktive kapase-3 ak lòt ka en. Nan etid la kounye a, rezilta yo te montre ke selil PC12 yo ekspoze a 100 M nan 6-OHDA amelyore cytochrome C lage ak kapasite depann de sitokwom cytochrome C lage ak kapasite- 3 aktivasyon. Rezilta sa yo sijere ke echinacoside te kapab anpeche mitokondri-medyatè pa diminye cytochrome C lage soti nan mitokondri nan cytosol ak kapasite-3 deklanchman.

Enflamasyon se yon karakteristik neuropathologie nan sèvo Parkinsonian ak tou nan modèl eksperimantal nan maladi a. Estrateji ki ka geri nan diminye enflamasyon ak anpeche pwodiksyon an nan faktè enflamatwa sa a ka yon estrateji pwomèt nerotektiv pou tretman an nan maladi Parkinson la ak kondisyon ki gen rapò [37]. Plizyè etid tou fèt nan likid serebral la ak pandan analiz postmòt nan pasyan Parkinsonian devwale nivo ogmante nan cytokines, tankou interleukin-1 (IL-1) ak interleukin-6 (IL-6), sijere deklanchman an nan apwòch ki gen rapò ak apwòch ki gen rapò ak 38, 39]. Nan etid la kounye a, rezilta yo te ale nan 100 Mof6-OHDAinduced IL-1 ak IL-6 lage nan selil PC12 yo. Sepandan, tretman ak echinacoside te kapab dòz-depann de anpeche IL-1 ak IL-6 lage pwovoke pa 6-OHDA. Rezilta yo sijere ke diminye repons enflamatwa yo tou patisipe nan mekanis yo nan ekonomi kont 6-OHDA-induit nerotoksik.

An konklizyon, rezilta rechèch sa a te montre ke ekinacoside te kapab bloke 6-OHDA-induit nerotoksik nan selil PC12, ak mekanis yo ka ki gen rapò ak pwoteksyon mitodonal ak anti-enflamasyon atravè diminye pwodiksyon ROS. Enfòmasyon travay sa a pral itil pou elimine mekanis echinacoside pou anti-PD. Li konkli ke echinacoside ka yon opsyon ki ka geri ou pou prevansyon ak tretman PD.

Konfli enterè yo

Otè yo te deklare pa gen okenn konfli nan enterè

Rekonesans

Travay sa a te sipòte pa sibvansyon ki soti nan Fondasyon Nasyonal Syans Natirèl nan Lachin (81473383) ak Syans Nasyonal ak Teknoloji Gwo Pwojè (2012ZX091031-078; 2013ZX09103-001-008; ak 2013ZX09102106).