Efè Sargassum Thunbergii ekstrè sou blanchiman po ak anti-rid atravè anpèchman TRP-1 ak MMPs.

Kontakte: ali.ma@wecistanche.com

Da-Hye Gam 1, Jae-Hyun Park 1, Ji-Woo Hong 1, Seong-Jin Jeon 1, Jun-Hee Kim 1 ak Jin-Woo Kim 1,2,*

Résumé: Sargassum thunbergiite tradisyonèlman itilize kòm yon materyèl manjab ak medsin nan peyi oryantal yo. Sepandan, lapo-blanchimanepianti-ridefè S. thunbergii poko te envestige. Etid sa a te fèt pou etabli pi bon kondisyon ekstraksyon pou pwodiksyon konpoze byoaktif ak aktivite antioksidan ak efè blanchiman po ak anti-rid lè l sèvi avèk ekstraksyon èd ultrason (UAE) nan S. thunbergii. Tan ekstraksyon (5.30~18.7 min), tanperati ekstraksyon (22.4 ~ 79.6 ◦C), ak konsantrasyon etanòl (0.{0~99.5 pousan), ki se varyab prensipal yo nan UAE yo, yo te optimize lè l sèvi avèk yon konsepsyon konpoze santral. Ekwasyon kwadratikregresyon yo te derive baze sou done eksperimantal epi yo te montre yon koyefisyan detèminasyon wo (R2 > 0.85), ki montre konvnab pou prediksyon. Kondisyon optimal UAE pou maksimize tout varyab depandan yo, ki gen ladan aktivite radikal scavenging (RSA), aktivite tyrosinaseinhibitory (TIA), ak aktivite inhibitory collagenase (CIA), te idantifye kòm yon tan ekstraksyon nan 12.0 min, yon tanperati ekstraksyon nan 65.2 ◦C, ak etanòl. nan 53.5 pousan. Nan kondisyon sa yo, RSA, TIA, ak CIA nan ekstrè S. thunbergii te 86.5 pousan, 88.3 pousan, ak 91.4 pousan, respektivman. Nou konfime tou ekstrè S. thunbergii te gen efè inhibitor sou ekspresyon mRNA nan pwoteyin ki gen rapò ak tirozinaz-1, metaloproteinaz matris-1, ak metaloproteinaz matris-9, ki se jenès prensipal sentèz melanin ak idroliz kolagen an. . Likid chromatografi-tandem mas spectrometrywas itilize yo idantifye konpoze prensipal yo fenolik nan ekstrè S. thunbergii, ak asid kafeik te idantifye kòm yon gwo pik, ki demontre ke engredyan ki gen gwo valè-te ajoute akpo-blanchimanepianti-ridefè yo ka pwodwi nan S. thunbergii ak itilize pou devlope materyèl kosmetik.

Mo kle: S. thunbergii; optimize;po-blanchiman; anti-rid; TRP-1; MMP-1; MMP-9

Klike sou benefis ekstrè cistanche pou blanchi po

1. Entwodiksyon

Melanogenesis se yon pwosesis fizyolojik ki mennen nan sentèz pigman melanin [1]. Melanin se yon pigman nwa oswa mawon ki sekrete nan melanosit yo prezan nan kouch fondamantal epidèm la epi li detèmine po a, je, ak koulè cheve [2].Sepandan, jenerasyon twòp nan pigman melanin ka mennen nan maladi ipèpigmantasyon ki gen rapò, tankou malfezan. melanom [3]. Tirozinaz, anzim prensipal la nan chemen biosentèz themelanin, ankouraje idroksilation L-tirozin nan L-DOPA (L-3,{4-dihydroxyphenylalanine) ak Lè sa a, ankouraje oksidasyon nan L-DOPA nan dopachrome ak dopaquinone, ki sentèz melanin atravè pwosesis otooksidasyon pa pwoteyin ki gen rapò ak tirozinaz (TRP-1 ak 2) atravè plizyè etap [4–6]. Jiska dat, metòd pou anpeche fòmasyon melanin pa anpeche pwoteyin ki gen rapò ak tirozinaz yo te lajman itilize nan endistri kosmetik pou devlopman ajan blanchi po [7,8]. Sepandan, asid kojik, asid azelaik, ak idrokinon, konvansyonèl yo itilizepo-blanchimanengredyan yo, yo te rapòte yo pwovoke alèji kòm byen ke lakòz toksisite po ak kansè [9]. Se poutèt sa, pwodwi yon ajan blanchiman ki pi an sekirite, ki pi efikas ki baze sou engredyan natirèl yo konsidere kòm enperatif [10].

Kolagen se yon pwoteyin matris ekstraselilè (ECM) ki pwoteje po a nan bay li fòs ak tansyon; li ede tou retade pwosesis la aje pa anpeche ondilasyon ak pèt imidite. ECM ka dekonpoze pa matris metaloproteinases (MMPs) [11]. MMP-1, souvan ke yo rekonèt kòm kolagenaz, dekonpoze pasyèlman kolagen an tip 1 ki fè po a, tandiske MMP-9, ke yo rekonèt kòm jelatinaz, anplis depolymerize kolagenhydrolyzed pa MMP-1 [12]. Anplis de sa, Li te rapòte ke estrès oksidatif pwovoke pa espès oksijèn reyaktif (ROS) akselere sentèz la nan anzim sa yo, ki mennen nan degradasyon nan ECM ak, finalman, fòmasyon rid [13]. Se poutèt sa, li nesesè jwenn engredyan natirèl ki ka anpeche ekspresyon TRP ak MMPs epi ki gen antioksidan ki ka retire espès oksijèn reyaktif pou anpeche aje po a lè yo diminye pigmantasyon ak ondilasyon nan po a [14]. Dènyèman, kòm engredyan yo fonksyonèl pou pwodui kosmetik yo te devlope sitou nan plant tè, limit yo te kòmanse leve nan eksplore nouvo espès ak yon rezèv ki estab nan engredyan natirèl [15]. Se poutèt sa, enterè ak demann pou engredyan natirèl ki sòti nan plant maren yo te ogmante, epi yo te idantifye yon varyete nouvo engredyan nan resous maren [16].

Sargassum thunbergiise yon espès makroalg mawon ki fè pati fanmi gulfweed e ki natif natal nan kòt Kore ak Lachin [17]. Li rekonèt kòm yon polisyon marin ki lakòz domaj nan alg ak fèm pwason lè yo diminye oksijèn ki fonn [18]. Kèk ladan yo itilize kòm dwòg anthelmintic nan terapi tradisyonèl oswa kòm konpòs [19].Sepandan, yo te idantifye yon engredyan antikansè nan li ekstrè an 1995; depi lè sa a, li te atire atansyon kòm yon makroalg ki gen yon gwo potansyèl pou itilize nan fabrikasyon nouvo konpoze bioaktif [20]. Ekstraksyon konpoze bioaktif lè l sèvi avèk pwosesis konvansyonèl yo, ki gen ladan ekspilsyon mekanik, ekstraksyon sipèkritik, ekstraksyon mikwo ond, ak ekstraksyon ultra-wo presyon, yo asosye ak limit tankou bezwen itilize sòlvan depase, pwodiksyon ekstraksyon ki ba, ak gwo konsomasyon enèji [21]. Devlope nouvo metòd ekstraksyon se youn nan pi gwo defi nan inovasyon teknolojik pou sekirize konpoze bioaktif nan makroalg [22]. Pami pwosesis ekstraksyon konvansyonèl yo, ekstraksyon ki ede ultrason (UAE) se patikilyèman atire akòz senplisite li yo, pri ekipman ki ba, pwodiksyon ekstraksyon segondè soti nan matris diferan, konsomasyon enèji ki ba, yon kantite lajan pi ba nan sòlvan ki nesesè, ak mwens tan [23]. Yo konnen UAE yo enplike onn son wo-frekans 20-100 kHz [24]. Sede ekstraksyon an amelyore lè ltrason, epi sa a se atribiye a dezòd tisi plant yo, rediksyon nan gwosè patikil, ak ogmante transfè mas ekstrè nan sòlvan ki te koze pa efondreman nan bul yo ki te pwodwi pa kavitasyon acoustic repete [25,26] . Akòz avantaj sa yo, UAE rekonèt kòm yon pwosesis ki pa chè, renouvlab ak efikas ki lajman itilize nan endistri manje a pou ekstrè engredyan fonksyonèl nan byomass tèrès ak akwatik [27].

Kidonk, nan etid sa a, nou te aplike UAE pou fè ekstraksyon byoaktif nan S. thunbergii e nou te tire pi bon kondisyon UAE ki pèmèt ekstraksyon maksimòm antioksidan yo ak tou.po-blanchimanak engredyan anti-rid lè l sèvi avèk optimize estatistik ki baze sou, ak divès efè inhibition nan TRP-1, MMP-1, ak MMP-9ekspresyon jèn pa ekstrè S. thunbergii yo te evalye pou verifye po a. -blanchiman akanti-ridefè konpoze bioaktif ki sòti ak konfime posiblite pou itilize ekstrè S. thunbergii kòm yon engredyan kosmetik fonksyonèl.

extrait cistanche

2. Rezilta ak Diskisyon

2.1. Konsepsyon Eksperyans lan

Fikse modèl la enpòtan anpil pou entèprete presizyon nan metodoloji sifas repons (RSM) modèl matematik pou predi aktivite a scavenging radikal (RSA), aktivite inhibition tirosinaz (TIA), ak aktivite inhibitory kolagenaz (CIA) nan.S. thunbergiiekstrè. Konsepsyon santral konpoze (CCD) RSM se yon metòd konsepsyon eksperimantal ki analize estatistikman sifas repons ki pwodui poukont oswa pa entèraksyon de varyab endepandan ki afekte repons yo. CCD a gen avantaj nan yon fason efikas estime koub lè l sèvi avèk pwen sant la ak plizyè pwen axial pou predi kondisyon optimal yo [28–30]. Nan etid sa a, CCD te aplike pou predi pi bon kondisyon UAE pou maksimize repons yo, tankou RSA, TIA, ak CIA, nan S. thunbergiiextract. 5 nivo yo (-, −1, 0, 1, ) yo te kode, epi yo te fè 17 eksperimantal kòm yon baz sou CCD (Tablo 1). Ki baze sou etid anvan nou yo, 3 kle endepandan varyab, ki gen ladan tan ekstraksyon (5.30 ~ 18.7 min), tanperati ekstraksyon (22.4 ~ 79.6 ◦C), ak konsantrasyon etanòl (0 ~ 99.5 pousan), yo te chwazi pou jwenn nivo maksimòm varyab depandan. [31]. Nan devlopman modèl retou kwadratik la, yo te kode varyab eksperimantal yo dapre ekwasyon sa a.

xi {{0}} (Xi − X0)/∆X (1)

kote xi se valè kode varyab Xi a; X0 se valè X nan pwen sant la, epi ∆X se valè chanjman etap la.

Valè eksperimantal pou 17 kondisyon ki gen diferans nan tan ekstraksyon, tanperati ekstraksyon, ak konsantrasyon etanòl yo montre nan Tablo 2.

2.2. Efè Kondisyon UAE sou RSA

Dapre kondisyon yo 17 aplike nan ekstraksyon nanS. thunbergiilè l sèvi avèk UAE, RSA te 2.37 ~ 89.9 pousan, ak valè maksimòm nan 12.0 tan ekstraksyon min, 51.0 ◦C tanperati ekstraksyon, ak 50.{{11} } pousan konsantrasyon etanòl ak valè minimòm nan 12.0 tan ekstraksyon min, 51.0 ◦C tanperati ekstraksyon, ak 99.5 pousan konsantrasyon etanòl; sa a endike ke konsantrasyon etanòl la te gen pi gwo efè sou RSA (Tablo 2). Jan lojisyèl Design-Expert te sigjere, yo te chwazi yon ekwasyon retou kwadratik e yo te mete l pou tout twa varyab ak repons endepandan yo. An tèm de valè kode, repons yo prevwa pou RSA, TIA, ak CIA yo ta ka eksprime lè l sèvi avèk ekwasyon regresyon kwadratik atravè analiz regresyon miltip (Tablo 3). Koefisyan modèl CCD yo te valide lè l sèvi avèk analiz divèjans (ANOVA) pou varyab repons modèl kwadratikregresyon ki rezime nan Tablo 4. Si koyefisyan detèminasyon an (R2), ki reprezante akò ant valè eksperimantal ak valè prevwa a, se tou pre 1, sa vle di. bonte akseptab nan anfòm [32]. R2 nan ekwasyon regresyon kwadratik la pou predi kondisyon optimal UAE ak RSA te 0.8554, ki tabli pi gwo pase oswa egal a 85.5 pousan nan valè prevwa ki kapab lakòz yo ka konplètman eksplike, kidonk rekonèt konvnab ekwasyon an retou kwadratik (Tablo 3).

Yo te detèmine siyifikasyon chak varyab modèl lè l sèvi avèk valè p; yon p-valè<0.05 indicates="" significance="" whereas="" a="" p-value="" of="">0.05 endike ensiyifikasyon sou theRSA [33]. Rezilta ANOVA yo nan etid optimize a te endike ke modèl la te siyifikatif (p=0.0283), ki te mwens pase nivo siyifikasyon yo mete, ki endike ke siyifikatif te rekonèt nan 5 pousan. Se poutèt sa, rezilta yo endike ke modèl yo te kapab byen predi RSA, TIA, ak CIA nan ekstrè S. thunbergii lè varyab endepandan yo te nan chenn yo montre isit la. Lè nou tcheke siyifikasyon chak varyab endepandan, nou jwenn konsantrasyon etanòl la te gen plis efè sou RSA (p=0.0025), tandiske efè tan ekstraksyon (p=0.7418) ak tanperati (p=0}.=0.1622)te ensiyifyan (Tablo 4).

Pou evalye efè chak varyab endepandan sou varyab depandan an, nou eksprime chanjman nan RSA dapre tan ekstraksyon, tanperati ekstraksyon, ak konsantrasyon etanòl kòm yon konplo perturbation (Figi 1A).

Kontinwe, valè ki pi wo a te parèt nan 14.1 min nan tan ekstraksyon ak thedecreased; valè maksimòm lan te konfime nan 60.7 ◦C ak 46.2 pousan pou extractiontemperature ak etanòl konsantrasyon, respektivman. Sepandan, lè w ap gade pousantaj chanjman nan RSA akòz entèraksyon ki genyen ant varyab lè l sèvi avèk koub sifas repons ki genyen twa dimansyon, chanjman nan tan ekstraksyon ak tanperati a te gen ti efè sou RSA, alòske konsantrasyon etanòl la te gen yon efè enpòtan (Figi 2A, B)

Sa a te sanble ak rezilta etid Kim et al. idantifye efè a nan konsantrasyon sòlvan sou RSA a nan Gynostemma pentaphyllum ekstrè [34]. RSA te gen tandans ogmante nan yon maksimòm ak Lè sa a, diminye ak konsantrasyon nan etanòl, ki montre valè maksimòm nan 48.1 pousan nan konsantrasyon etanòl. Chanjman polarite solisyon ekstraksyon an akòz melanje dlo distile ak etanòl mennen nan yon ogmantasyon nan efè antioksidan G. pentaphyllum ak S. thunbergii ekstrè. Anplis de sa, sa a konsistan avèk rezilta yo rapòte ke konpoze bioaktif dlo-idrosolubl ki te pwodwi pa ekstraksyon dlo cho soti nan alg montre mwens aktivite antioksidan e ke ekstrè ki sèvi ak 50 pousan etanòl te montre pi gwo aktivite antioksidan, sijere ke itilizasyon yon sòlvan binè (dlo ak etanòl) ki pwodui konpoze bioaktif se benefisye nan ogmante pwodiksyon ekstraksyon [35,36].

2.3. Efè Kondisyon UAE sou TIA

TIA a nanS. thunbergiiEkstrè dapre 17 kondisyon UAE aplike nan eksperyans la montre nan Tablo 2. Yo te idantifye valè maksimòm TIA a 92.6 pousan nan 12.0 min, 79.6 degre, ak 50.{{13} } pousan ak valè minimòm 55.3 pousan te prevwa a 12.0 min, 51.0 degre , ak 0.{{20}} pousan nan ekstraksyon tan, tanperati ekstraksyon, ak konsantrasyon etanòl, respektivman. Kontinwe, tanperati ekstraksyon ak konsantrasyon etanòl yo te konfime gen yon efè enpòtan sou TIA. Sou baz rezilta eksperimantal yo, nou te tire yon ekwasyon retou kwadratik lè l sèvi avèk CCD epi nou te itilize li pou predi kondisyon optimal UAE yo (Tablo 3). R2 a te 0.8591, ki endike yon 85.91 pousan matche ant valè yo nan modèl la prevwa ak done eksperimantal ak vle di ke ekwasyon an retou kwadratik te apwopriye pou prediksyon TIA. Pou repons yo nan RSA, TIA, ak CIA, modèl yo te trè enpòtan lè kalkile F-valè yo te pi gran pase valè F-tabulated la ak valè yo pwobabilite yo te ba (p <0.001); sa="" a="" endike="" ke="" tèm="" endividyèl="" yo="" nan="" chak="" modèl="" repons="" yo="" te="" enpòtan="" an="" tèm="" de="" efè="" a="" entèraksyon="" [37].="" anova="" te="" aplike="" pou="" evalye="" estatistik="" efè="" enpòtan="" ekwasyon="" retou="" kwadratik="" la.="" modèl="" eksperimantal="" la="" te="" enpòtan="" (p="0.0262)," ki="" endike="" yon="" nivo="" siyifikasyon="" nan="" 5="" pousan="" (tablo="">

Lè nou vizyalize pousantaj chanjman TIA ak chanjman nan yon sèl varyab lè fikse valè lòt varyab, varyasyon TIA akòz konsantrasyon etanòl te pi gwo, ak yon maksimòm TIA yo te jwenn nan 76.8 pousan konsantrasyon etanòl (Figi 1B). Yo vizyalize entèraksyon varyab endepandan yo lè l sèvi avèk koub sifas repons ki genyen twa dimansyon lè yo chanje de varyab ansanm (Figi 3).

Kòm tanperati ekstraksyon an ak tan ogmante, TIA ogmante okòmansman; sepandan, ranje varyasyon an pa gwo, kidonk nou rekonfime ke efè entèaktif nan tanperati ekstraksyon ak tan pa enpòtan, jan yo detèmine lè l sèvi avèk ANOVA (Figi 3A). Kontrèman, TIA ogmante ak diminye ankò ak konsantrasyon etanòl, ak maksimòm TIA prevwa yo dwe nan 75.6 pousan konsantrasyon etanòl (Figi 3B). Rezilta sa a se ki konsistan avèk sa yo ki nan etid la pa Park, et al., ki te montre ke 70 ~ 80 pousan konsantrasyon etanòl mennen nan yon TIA ki pi wo pase dlo nan ekstraksyon nan konpoze bioaktif soti nan ekstrè diri sovaj [38]. Etid sa a te rapòte ke konsantrasyon etanòl se te yon gwo varyab nan TIA e li gen tandans varye nan pwopòsyon ak konsantrasyon etanòl la.

2.4. Efè Kondisyon UAE sou CIA

Lè nou mezire CIA a nan chak nan 17 kondisyon, nou te jwenn ke valè maksimòm CIA a te 92.3 pousan nan 16.0 min, 63.0 degre, ak 80.{{ 12}} pousan ak minimòm CIA a te 48.1 pousan nan 12.0 min, 51.0 degre, ak 0.{0 pousan nan tan ekstraksyon, tanperati ekstraksyon, ak konsantrasyon etanòl, respektivman (Tablo 2). Ekwasyon retou kwadratik la ki te pwodwi dapre tan ekstraksyon, tanperati, ak konsantrasyon etanòl te gen yon R2 nan 0.9237, sa ki vle di ke varyasyon echantiyon an nan 92.37 pousan te atribiye a varyab endepandan yo, epi sèlman 7.63 pousan nan varyasyon total yo pa t 'kapab eksplike pa a. modèl (Tablo 3). Sa a endike yon bon degre nan korelasyon ant valè yo prevwa ak eksperimantal nan CIA a epi rekonèt konvnab li nan predi modèl eksperimantal la [39]. ANOVA te demontre siyifikasyon estatistik (p=0.0037) anba yon nivo siyifikasyon 1 pousan epi konfime ke tanperati ekstraksyon (p=0.0030) ak konsantrasyon etanòl (p=0.0006) pami tèm lineyè yo te varyab endepandan ki te afekte anpil CIA (Tablo 4).

Pou evalye efè chak varyab endepandan sou CIA, nou konpare CIA ak chanjman nan yon varyab lè l sèvi avèk yon konplo perturbation (Figi 1C). Kòm varyab endepandan an te ogmante, CIA okòmansman ogmante nan valè a maksimòm, epi yo te jwenn konsantrasyon nan etanòl ki pi enfliyan. Koub sifas repons ki genyen twa dimansyon reprezante chanjman CIA akòz efè entèaktif varyab endepandan, ki te gen tandans ogmante ak diminye ak tan ekstraksyon ak konsantrasyon etanòl. CIA ogmante ak ogmante tan ekstraksyon ak konsantrasyon etanòl, ki montre maksimòm CIA a nan 12.1 min nan tan ekstraksyon ak 73.6 pousan konsantrasyon etanòl. Chanjman yo nan CIA ak tanperati ekstraksyon ak konsantrasyon etanòl nan yon tan ekstraksyon konstan tou te gen tandans yo dwe menm bagay la tou; sepandan, varyasyon yo nan CIA ak konsantrasyon etanòl yo te konfime yo dwe pi enpòtan (Figi 4B).

Valè maksimòm CIA te prevwa pa CCD te 93.8 pousan ak yon tan ekstraksyon nan 14.5 min, tanperati ekstraksyon nan 65.1 ◦C, ak yon konsantrasyon etanòl nan 69.3 pousan. Sa a te plis pase de fwa pi wo pase 39.4 pousan ak 40.3 pousan nan CIA pou te vèt ak blan teahot-dlo ekstrè yo te jwenn nan yon etid anvan [40]. An konklizyon, laS. thunbergiiekstrè te konsidere kòm kapab itilize kòm yon engredyan kosmetik fonksyonèl diminye ondilasyon, paske li anpeche aktivite kolagenaz.

2.5. Optimizasyon Pwosesis UAE la

Pou idantifye kondisyon optimal UAE pou fè ekstraksyon nanpo-blanchimanak anti-rid konpoze bioaktif soti nan S. thunbergii ekstrè, nou te jwenn yon pwen optimal formaximizing varyab depandan yo pa sipèpoze sifas repons endividyèl yo ofRSA, TIA, ak CIA (Figi 5).

Lè ranje varyab endepandan yo te limite a yon tan ekstraksyon nan 5.3 0 ~ 18.7 min, tanperati ekstraksyon nan 22.4 ~ 79.6 ◦C, ak konsantrasyon etanòl nan 0 ~ 99.5 pousan, kondisyon optimalUAE te prevwa. yo dwe 12.0 min tan ekstraksyon, 65.2 ◦C tanperati ekstraksyon, ak 53.5 pousan konsantrasyon etanòl. Kondisyon UAE pi bon an te derive baze sou kritè pou minimize tan ekstraksyon paske yon tan kout pwosesis benefisye nan diminye depans pwosesis yo. Anba kondisyon optimal UAE ki sòti, 86.5 pousan, 88.3 pousan, ak 91.4 pousan nan RSA, TIA, ak CIA, respektivman, te prevwa. Nan etid anvan yo, Yuan et al. rapòte ke kondisyon yo pi bon pou fè ekstraksyon konpoze bioaktif soti nan S. thunbergii yo te jan sa a: yon likid ak solid rapò 120 mL / g, yon tan ekstraksyon nan 210 min, ak yon extractiontemperature nan 97 ◦C [41]. Pandan ke Yuan et al. optimize kondisyon yo ekstraksyon dlo cho pou fè ekstraksyon nan konpoze bioaktif, nan etid la prezan, kondisyon yo UAE pou ekstraksyon nan konpoze bioaktif yo te optimize. Se poutèt sa, kondisyon UAE anba tan kout ekstraksyon ak tanperati ki ba yo te pwouve yo dwe yon pwosesis ekstraksyon efikas pou konpoze bioaktif konpare ak pwosesis anvan yo ekstraksyon dlo cho.

Pou verifye rezilta yo, yo te fè yon eksperyans konfimasyon ak twa kopi nan kondisyon pi bon jan modèl CCD a prevwa. Lè yo te evalye valè eksperimantal RSA, TIA, ak CIA nan kondisyon pi bon an, yo te 88.9 pousan ± 3.11 pousan, 85.1 pousan ± 2.76 pousan, ak 89.7 pousan ± 4.09 pousan, respektivman, epi yo te montre yon akò fò ak valè modèl prediksyon yo (p > 0.05). Se poutèt sa, valè eksperimantal yo te nan bon akò ak valè yo prevwa, ki pwouve fyab nan rezilta optimize UAE yo.

2.6. Ekspresyon mRNA TRP-1, MMP-1, ak MMP-9

TRP-1 fonksyone kòm 5,6-dihydroxyindole-2-oksidaz asid carboxylic, ke yo rekonèt kòm kòz prensipal pigmantasyon po ki aji pa eksitasyon tirozinaz ak eumelaninsenthesis nan selil epitelyal [42]. Kontrèman, MMP-1 ak MMP{-9 kraze kolagen tip 1, ki fè 90 pousan nan kouch po a, kidonk lakòz degradasyon kolagen an, pèt elastisite, ak aje po [43].

Nan etid sa a,S. thunbergiiekstrè yo te pwodwi lè l sèvi avèk kondisyon optimal UAE etabli atravè yon optimize ki baze sou estatistik, epi yo te teste ekstrè a sou liy selil B{{{0}}F0 pou evalye.po-blanchimanepianti-ridpwopriyete yo lè w konpare nivo ekspresyon RNA TRP{{0}}, MMP-1, ak MMP-9. Nivo ekspresyon TRP-1, yon jèn prensipal ki gen rapò ak sentèz melanin, yo te jwenn ki depann de konsantrasyon nan S. thunbergii ekstrè ak siyifikativman diminye apre tretman ak 1 ak 2 mg / mL nan ekstrè konpare ak gwoup kontwòl la (p <0.05) (figi="">

Nou te jwenn tou ekspresyon MMP{{{{10}}}} ak MMP{-9 diminye pwopòsyonèlman ak konsantrasyon ekstrè S. thunbergii (Figi 6B, C). Patikilyèman, nivo ekspresyon MMP-1 ak MMP-9 yo te inibe pa 58.6 pousan ak 78.8 pousan, respektivman, nan gwoup la te trete ak 2 mg/mL nan ekstrè S. thunbergii konpare ak gwoup kontwòl yo (p < 0.05).="" apati="" rezilta="" ki="" anwo="" yo,="" li="" te="" konfime="" ke="" ekstrè="" s.="" thunbergii="" ki="" pwodui="" anba="" kondisyon="" uae="" optimal="" yo="" ka="" efektivman="" anpeche="" ekspresyon="" mrna="" trp-1,="" mmp-1,="" ak="" mmp-9="" inb16-.="" liy="" selil="" f0,="" kidonk="" anpeche="" pwodiksyon="" melanin="" ak="" dekonpozisyon="" kolagen="">

2.7. Idantifikasyon asid kafeyik nan ekstrè S. thunbergii

Nan yon eksperyans anvan, kondisyon UAE pou maksimize antioxydant, po blanchiment, akanti-ridefè S. thunbergii ekstrè yo te optimize; sepandan, plis etid yo te nesesè yo eksplore engredyan yo byoaktif nan ekstrè a. Se poutèt sa, konpoze fenolik soti nanS. thunbergiiekstrè yo te idantifye lè l sèvi avèk likid chromatografi-tandem mas spèktrometri (LC-MS/MS), kòm teknoloji sa a pèmèt idantifikasyon egzat nan konpoze fenolik ak karakterizasyon estriktirèl ak deteksyon nan ti molekil nan sous natirèl. Idantifikasyon pik yo te baze sou retentiontime (RT), iyon précurseur, ak iyon fragman ki gen rapò ak estanda yo. Nan LC-MS / MSsystem la, asid kafeyik la te montre yon pik nan 1.95 min nan RT (Figi 7).

Nan mòd negatif-ion, m/z 179.10 ion la, ki te montre youn nan de pik iyon yo nan spectre mas mas, koresponn ak fòmil molekilè asid kafeyik ak separeda fragment ion nan m/z 135.56. Anjeneral, apre kolizyon-induit dissociation, phenoliccompounds pwodui yon iyon fragman karakterize pa pèt CO2 (44 Da) nan gwoup asid carboxylic. Akòz pèt sa a, klivaj ki vin apre 44-Da CO2 soti nan theion nan m/z 179.10 te bay ion nan m/z 135.56. Asid kafeyik se yon konpoze fenolik C{6-C3 ki pwodui nan fenilalanin oswa tirozin plant yo atravè chemen shikimate nan metabolis segondè epi li se yon reprezantan klas asid sinamik (oswa fenilpropanoid). Li antre nan rejim imen an atravè plizyè legim ak fwi [44]. Nan dènye ane yo, anpil etid te montre ke konsomasyon nan asid kafeyik gen anpil benefis sante akòz pwopriyete yo antioksidan ki ede anpeche divès maladi ki asosye ak estrès oksidatif [45]. Kidonk, etid sa a sou konpoze fenolik trè itil epi li ka jwe yon wòl enpòtan nan pwosesis kontwòl kalite ak eksplorasyon nan lavni S. thunbergiias yon engredyan akpo-blanchimanepianti-ridpwopriyete yo.

3. Materyèl ak Metòd

3.1. Materyèl ak reyaktif

S. thunbergiiyo te ranmase nan kòt sid Jeju Island, Kore di, nan mwa Oktòb 2019 yo te achte nan Para Jeju (Jeju, Kore di). Anvan eksperyans lan, S. thunbergii te poud anba 0.42 mm lè l sèvi avèk yon moulen (HMF-3000S, Hanil Co., Wonju, Kore) epi estoke nan yon frijidè nan -5 ◦C. Etanòl pou fè ekstraksyon sòlvan te achte nan men SamchunChemical Co (95.0 v/v pousan, Pyungtaek, Kore di). Ascorbic asid (vitamin C), arbutin, andkojic asid itilize kòm estanda pou tès kontwòl yo te achte nan men Sigma-Aldrich Co., Ltd.(St. Louis, MO, USA). Tout lòt pwodwi chimik yo te itilize nan eksperyans sa a te analyse klas.

3.2. Pwosesis UAE

Yo te mete poud sèk echantiyon an (1 g) nan yon veso presyon (XF100, AntonPaar Co., Ltd., Graz, Otrich) ak 10 mL sòlvan an. epi melanje lè l sèvi avèk yon mixer toubiyon (VM-10, Daihan sci. Co., Wonju, Kore) pou 1 min. Echantiyon sa yo te ekstrè anba 17 kondisyon endividyèl UAE ki sòti nan CCD ak yon tan ekstraksyon nan 5.30 ~ 18.7 min, tanperati ekstraksyon nan 22.4 ~ 79.6 ◦C, ak konsantrasyon etanòl nan 0.0 ~ 99.5 pousan. UAE te fè lè l sèvi avèk yon aparèy ultrason (SD-D250H, Sungdong Co., Seoul, Kore di) ak yon pouvwa elektrik 200 W ak yon frekans 40 kHz ekipe ak yon revèy dijital ak kontwolè tanperati. Apre ekstraksyon, sipènatant la te separe a 10,000 rpm pou 10 minit lè l sèvi avèk yon santrifijeur (1236R, Labogene Co., Daejeon, Kore di). Lè sa a, solisyon an te filtre nan yon filtè disk seluloz acetate ak porosite 0.45 µm epi yo itilize pou analiz RSA, TIA, ak CIA (Figi 8).

3.3. Eksperyans Design

Lojisyèl Design-Expert (Ver. 8.0, Stat-Ease, Minneapolis, MN, USA) te itilize pou maksimize ekstraksyon konpoze bioaktif nanS. thunbergiiatravè optimize kondisyon UAE lè l sèvi avèk CCD. Kòm varyab endepandan, varyab kle ki gen ladan tan ekstraksyon (X1), tanperati ekstraksyon (X2), ak konsantrasyon etanòl (X3) yo te chwazi, epi yo te kode nan 5 (-1.68, -1, 0, 1, 1.68) nivo. , jan yo montre nan Tablo 1. RSA, TIA, ak CIA yo te mete kòm varyab depandan ki afekte pa gwo varyab endepandan. Yo te jwenn valè eksperimantal anba 17 kondisyon ki te pwodwi pa CCD a, epi yo te mezire korelasyon chak varyab endepandan ak depandan lè l sèvi avèk yon ekwasyon kwadratikregresyon. [46]. Yo te itilize ekwasyon retou kwadratik sa a pou kalkile valè varyab depandan yo dapre chanjman nan varyab endepandan yo:

Y = β0 + k ∑ i = 1 βiXi + k ∑ i = 1 βiiX 2 i + k ∑ i>1 ijXiXj(2)

kote Y reprezante varyab depandan yo (RSA, TIA, CIA), 0 se yon koyefisyan konstan, epi k se yon varyab tès. i, ii, ak ij se koyefisyan regresyon pou tèm lineyè, kwadratik, ak entèraksyon, respektivman.

Pou evalye modèl la prevwa sou varyab endepandan an, yo te fè yon analiz de divèjans (ANOVA) ak yon nivo konfyans 95 pousan pou evalye efè chak varyab ki gen ladan tanperati ekstraksyon, tan, ak konsantrasyon etanòl. Anplis de sa, yo te itilize koyefisyan an retou (R2), valè p nan modèl la, pou detèmine kondisyon fizik modèl la [47].

3.4. Esè Radical Scavenging Aktivite (RSA).

Efè antioksidan nanS. thunbergiiekstrè yo te evalye ki baze sou scavengingactivity yo sou 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich) radikal gratis lè l sèvi avèk yon analiz DPPH modifye [48]. Solisyon stock la te prepare nan fonn 0.1 M DPPH ak metanol epi answit estoke nan tanperati chanm. Solisyon DPPH dilye ak methanol te prepare pou jwenn yon absòbe 1.0 ± 0.{02 nan 517 nm lè l sèvi avèk yon UV-visspectrophotometer (Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Kore di) . Yon aliquot 1.25 mL nan solisyon DPPH te melanje ak 0.25 mL nan dilye S. thunbergii ekstrè (50-500 mg / mL) epi yo te pèmèt yo kanpe nan tanperati chanm nan fè nwa a pou 20 min. Chanjman absorpsyon an te kontwole nan 517 nm, epi yo te kalkile RSA a lè l sèvi avèk fòmil sa a:

RSA (pousan)={1 −Abs (echantiyon) / Abs (kontwòl)} × 100 (3)

kote Abs (kontwòl) se absòbe kontwòl la ak Abs (echantiyon) se absorpsyon ekstrè a. Yo te itilize menm konsantrasyon asid ascorbic (50-500 mg/mL) kòm yon kontwòl pozitif.

3.5. Tirozinaz Inhibitory Aktivite (TIA) Essay

Yo te mezire TIA a dapre metòd ki te rapòte pa Yagi [49]. Melanj reyaksyon an te genyen 0.4 mL nan tanpon fosfat sodyòm (67 mM, pH 6.8), 0.2 mL nan 10 mM3,{{10}} dihydroxy phenylalanine (L-DOPA, Sigma-Aldrich), 0.2 mL nan tirozinaz djondjon (125 inite / mL, Sigma-Aldrich), ak 0.2 mL nan solisyon ekstrè. Reyaksyon an te pote soti nan 25 ◦C pou 30 min. Apre reyaksyon an, yo te mezire absorbans nan 475 nm, ak rezilta yo te konpare ak kontwòl la. TIA a te kalkile dapre ekwasyon ki anba a:

TIA (pousan)={1 −Abs (echantiyon) / Abs (kontwòl)}× 100 (4)

kote Abs(kontwòl) se absòbe kontwòl la ak Abs (echantiyon) se absòbe ekstrèm lan.

cistanche diminye aktivite tirozinaz

3.6. Collagemase Inhibitory Activity (CIA) Assay

Yo te fè tès CIA a dapre metòd Wünsch ak Heindrich [50 rapòte. Collagenase (0.2 mg/mL, Sigma-Aldrich) te fonn nan 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5). Substra a, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg (0.4 mg/mL, Sigma-Aldrich), te fonn nan 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) ki gen 4 mM CaCl2. Melanj reyaksyon pou evalye idroliz kolagen an genyen kolagenaz (75 µL), echantiyon (50 µL), ak solisyon substrate (125 µL). Pou gwoup kontwòl la, yo te ajoute 50 µL dlo distile nan melanj reyaksyon an olye pou yo ekstrè a. Yo te pèmèt melanj lan enkube nan 37 ◦C pou 30 min, epi yo te ajoute 0.25 mL nan 25 mM asid asid pou mete fen nan reyaksyon anzim yo. Apre melanje ak acetate etil, yo te separe supernatant la epi yo te mezire absorbans nan 320 nm. Pousantaj anpèchman an te kalkile dapre fòmil sa a:

CIA (pousan) ={1 −Abs (echantiyon)/Abs (kontwòl)}× 100 (5)

kote Abs(kontwòl) se absòbe kontwòl la ak Abs (echantiyon) se absòbe ekstrèm lan.

3.7. Validasyon modèl la

Kondisyon yo optimize pou UAE (tan ekstraksyon, tanperati ekstraksyon, ak konsantrasyon etanòl) yo te valide ak evalyasyon an vitro nan aktivite antioksidan,po-blanchiman, ak efè anti-rid (RSA, TIA, ak CIA) dapre valè yo jwenn nan CCD. Tout repons yo te detèmine ankò anba kondisyon optimize UAE yo. Valè eksperimantal yo te konpare ak sa yo prevwa pa modèl la nan lòd yo evalye validite li yo. Analiz LC-MS/MS te fèt sou ekstrè yo ki te pwodwi nan kondisyon ki pi bon pou jwenn eleman prensipal yo nanS. thunbergiiekstrè.

3.8. Kilti Selil

B{{0}}F0 selil melanom yo te achte nan men Korean Cell Line Bank Co. (KCLB, Seoul, Kore di) epi yo te kiltive nan mwayen Eagle modifye Dulbecco a (DMEM, Gibco BRL Co., Ltd., Gaithersburg). , MD, USA) kontni ak 10 pousan serom fetis bovin, ak 1 pousan penisilin (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, USA). Selil yo te enkube nan 37 ◦C ak 5 pousan CO2 (MCO-5AC, Sanyo Co., Ltd., Tokyo, Japon) epi yo grandi kòm yon monokouch nan 25 cm2cultureflasks. Lè yon liy selilè rive nan anviwon 80 pousan konfluans, yo te fè subculturing pa trete ak tripsin-EDTA pou jwenn selil sèl pou asire bon kwasans ak sante selil yo.

3.9. Ranvèse transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Pou fè RT-PCR, 1.0 × 10selil yo te plake pou chak pi nan yon plak 24-pi. TotalRNA te ekstrè nan selil ak yon twous ekstraksyon RNA inivèsèl AccuPrep (BioneerCo., Daejeon, Kore di). Transkripsyon ranvèse te fèt ak 0.5 µg sentèz total RNA forcDNA lè l sèvi avèk amfiRivert cDNA sentèz platinum mèt melanj la (GenDEPOTCo., TX, USA). cDNA te anplifye ak chak primè, tankou TRP-1, MMP-1, MMP-9, ak -aktin (Tablo 5). PCR te fèt nan yon volim 20 µL ki gen 1 µL cDNA, 10 µLTaq Premix (Genet bio, Daejeon, Kore di), ak 9 µL diethylpyrocarbonate (DEPC). Kondisyon PCR yo te jan sa a: 94 ◦C pou 5 min, ki te swiv pa 25 sik nan 95 ◦C pou 5 s, 60 ◦C pou 31 s (pou TRP-1) oswa 55 ◦C pou 30s (pou MMP{{ {26}}) oswa 59 ◦C pou 30 s (pou MMP-9), ak 72 ◦C pou 30 s ekstansyon. Chak pwodwi PCR yo te fè elektwoforèz sou 1 pousan jèl agaroz epi yo te vizyalize lè l sèvi avèk sistèm Gel Doc TM XR plus ak kantite yon lojisyèl (Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA). Yo te itilize -aktin nan kòm yon jèn nan kay pou nòmalize nivo ekspresyon TRP-1, MMP-1, ak MMP-9.

3.10. LC-MS/MS analiz

Separasyon kwomatografik ekstrè S. thunbergii te fèt lè l sèvi avèk yon Finni gan Surveyor Plus HPLC System (Thermo Electron Corporation, San Jose). Separasyon te reyalize lè w itilize yon kolòn ROC C18 ki gen 150 mm longè kolòn, 3 mm dyamèt entèn ak 3 µm gwosè patikil (RESTEK Co., Bellefonte, PA, USA) pandan w ap itilize yon gradyelusyon nan 0.1 pousan asid fòmik nan dlo (mobil faz A) ak 0.1 pousan asid fòmik nan asetonitrile (mobil faz B) nan yon pousantaj koule nan 0.2 mL/min, jan sa a: 5 pousan a 100 pousan faz mobil B pou 11 min, 100 pousan a 5 pousan faz mobil B pou 4 min, 37 pousan faz mobil B pou 2 min, 37 pousan a 10 pousan faz mobil B pou 0.1 min, ak 10 pousan faz mobil B pou 2.4 min. . Volim piki a te 10 µL, epi kolòn nan te kenbe nan 30 ◦C. Eksperyans espektwometrik mas yo te fèt lè l sèvi avèk yon espektwomèt Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra EMR trip quadrupolemass (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, USA). S. thunbergii extractwas analize pa negatif ion electrospray ionizasyon lè l sèvi avèk electrospray ionizasyon (ESI), espesyalman itilize mòd nan turbo ion espre. Paramèt sous ESI pou ionizasyon ekstraksyon S. thunbergii nan mòd negatif yo te jan sa a: tanperati gaz, 270 ◦C; koule gaz, 19 L/min; tanperati gaz djenn, 400 ◦C; koule gaz djenn, 10 L / min; capillaryvoltage, 3000 V; vòltaj bouch, 1000 V. Yo te anrejistre spectre mas nan ionmode negatif ant 100 ak 500 m/z lè l sèvi avèk nitwojèn kòm gaz kolizyon an. Analiz de eleman prensipal yo nanS. thunbergiiekstrè te fèt lè w konpare molekilè yo jwenn ak modèl fwagmantasyon nan rezilta LC-MS/MS ak done ki soti nan literati a ak yon bibliyotèk mas pou konpoze estanda yo.

4. Konklizyon

Etid sa a pwopoze kondisyon pi bon pou pwosesis UAE ki ka maksimize antioksidan,po-blanchiman, epianti-ridefè pou pwodiksyon an nan valè-added konpoze bioaktif soti nan S. thunbergii, ki gaye toupatou nan kòt la subtropikal nan Sidès Lazi, sa ki lakòz polisyon maren ak twoub ekolojik. Varyab ki pi enfliyan nan fè optimize UAE se konsantrasyon etanòl, ki konfime ke itilizasyon ak detèminasyon konsantrasyon nan solvang binè ki gen ladan dlo ak etanòl te yon konsiderasyon enpòtan nan UAE la. Lè yo sipèpoze chak sifas repons pou optimize similtane RSA, TIA, ak CIA, yo prevwa yon tan ekstraksyon 12.0 min, yon tanperati ekstraksyon 65.2 ◦C, ak yon konsantrasyon etanòl 53.5 pousan, nan ki kondisyon RSA. valè 86.5 pousan, valè TIA 88.3 pousan, ak valè CIA 91.4 pousan.

Lè efè TRP-1, MMP-1, ak MMP-9 sou ekspresyon yo te evalye nan nivo mRNA lè l sèvi avèk ekstrè S. thunbergii ki pwodui nan kondisyon optimal UAE, li te konfime ke ekstrè S. thunbergii. ka diminye nivo mRNA TRP-1, MMP-1, ak MMP-9 epi kidonk anpeche pwodiksyon melanin osi byen ke dekonpozisyon kolagen an po.

Kidonk,S. thunbergiiEkstrè espere yo dwe lajman itilize kòm yon nouvo sous soti nan marinebiomass nan pwodiksyon an nan engredyan fonksyonèl pou pwodui kosmetik, manje, ak medikaman. Anplis de sa, yo kwè pwosesis la nan èkstraksyon byoaktif konpoze lè l sèvi avèk UAE bay done fondamantal sou devlopman pwosesis la ak kontribye nan la. determinationof pi bon kondisyon ekstraksyon nan pwodiksyon an nan nouvo engredyan fonksyonèl soti nan S.thunbergii ak lòt makroalg.