Evalye Antioksidan, Blanchiman ak Pwopriyete Antiaje nan idrolysat pwoteyin diri

Kontakte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hui-Ju Chen1,2, Fan-Jhen Dai 2, Cheng-You Chen 3, Siao-Ling Fan 2, Ji-Hong Zheng 4, Yu-Chun Huang 2, Chi-Fai Chau 1, Yung-Sheng Lin3,4, 5,* ak Chin-Shuh Chen1,*

Depatman Syans Manje ak Biotechnologie, National Chung Hsing University, Taichung 402204, Taiwan; d103043004@mail.nchu.edu.tw (H.-JC); chaucf@nchu.edu.tw (C.-FC)

Healthmate co, Ltd., Changhua City 500016, Taiwan; jane@healthmate.com.tw (F.-JD); eileen@healthmate.com.tw (S.-LF); tina@healthmate.com.tw (Y.-CH)

Ph.D. Pwogram nan Materyèl ak Jeni Chimik, National United University, Miaoli 360001, Taiwan; D0612002@smail.nuu.edu.tw

Depatman Jeni Chimik, National United University, Miaoli 360001, Taiwan; U0714049@smail.nuu.edu.tw

Enstiti pou Sekirite Manje ak Evalyasyon Risk Sante, National Yang-Ming University, Taipei 112304, Taiwan Korespondans: linys@nuu.edu.tw (Y.-SL); cschen@mail.nchu.edu.tw (C.-SC)

Résumé: Idwoliz pwoteyin ki sòti nan plant yo gen aplikasyon potansyèl nan nitrisyon. Rice pwoteyin idrolysat (RPHs), yon sous ekselan nan pwoteyin, te atire atansyon pou devlopman nan kosmeceuticals. Sepandan, kèk etid te rapòte aplikasyon potansyèl RPH nan analiz, ak etid sa a egzamine yoantioksidanaktivite ak aktivite inhibition nan anzim po aje. Rezilta yo te endike konsantrasyon total fenolik ak flavonoid yo te 2.06 士 0.13 mg ekivalan asid galik/g RPHs ak 25.96 士 0.52 µg ekivalan quercetin/g RPHs , respektivman. RPH yo te demontre aktivite ki depann de dòz la pou elimine radikal gratis ki soti nan 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl [mwatye-maksimòm konsantrasyon inhibitor (IC50)=42.58 士 2.1 mg/g RPH] ak 2. ,2′ -and-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (IC50=2.11 士 0.88 mg/g RPHs), kapasite rediksyon ki depann de dòz (6.95 士 1.40 mg vitamin C ekivalan/g RPHs) ak kapasite absorpsyon radikal oksijèn (473 µmol Trolox ekivalan/g RPHs). Konsantrasyon yo nan solisyon an RPH oblije reyalize 50 pousan anpèchman nan hyaluronidase aktirozinazaktivite yo te detèmine yo dwe 8.91 ak 107.6 mg / mL, respektivman. Etid sa a te demontre ke RPH yo genyenantioksidan, antihyaluronidase, ak anti-tirozinazaktivite pou aplikasyon kosmetik nan lavni.

Mo kle: idrolysat pwoteyin diri; antioksidan; yaluronidaz; tirozinaz; kosmetik

Cistanche gen yonantioksidanepiswen blanchimanefè

1. Entwodiksyon

Ekspozisyon radyasyon iltravyolèt responsab pou aje foto (oswa aje ekstèn); Kontrèman, espès oksijèn reyaktif ki pwodui nan metabolis selilè ak deteryorasyon fonksyon byolojik yo responsab pou aje intrinsèques [1,2]. Manje trete souvan gen natirèlantioksidantankou katechin, asid ascorbic, tokoferol, asid rosmarinic, ak ekstrè fenolik soti nan divès plant. Rechèch ki fèt nan natirèlantioksidankounye a konsidere pwovens ki pa tradisyonèl yo. Sous natirèlantioksidanyo pi dezirab pase pwodui chimikantioksidandepi kèk antioksidan sentetik yo te rapòte yo dwe kanserojèn [3]. Diri (Oryza sativa) se yon pi gwo elemantè dyetetik pou moun atravè lemond, patikilyèman moun k ap viv nan pwovens Lazi. Pwodiksyon diri anyèl mond lan se apeprè 741 milyon tòn [4]. Nan peyi Azyatik yo, diri se sous la nan 75 pousan nan konsomasyon enèji nan plis pase 2 milya moun [5]. Pwodiksyon diri vaste rezilta nan yon kantite korespondan nan pwodiksyon by-pwodwi. Pwodui rezidyèl ki soti nan pwosesis pwodiksyon diri a genyen majorite pwoteyin grenn nan (~60–85 pousan), men yo jete oswa itilize pou bay bèt yo manje [6–8]. Peptides yo jwenn nan divès idrolysat pwoteyin yo rapòte aji kòm potansyèlantioksidan[9]. Se poutèt sa, antioksidan natirèl ak ki pa toksik yo ka ekstrè nan idroliz pwoteyin manje. Anpil entelektyèl te anplwaye modèl ki gen anpil lipid e yo rapòte ke idrolysat pwoteyin ak lèt, zein, ak peptides pwoteyin soya yo gen enpòtans.antioksidanKarakteristik yo, ki gen ladan scavenging nan radikal gratis, anpèchman nan manje, ak peroksidasyon lipid in-vitro, ak chelation nan metal tranzisyon [10-12].

Asid yaluronik (HA) ede rajenisman po a paske li ogmante viskozite, li gen imidite, epi li fè likid ekstraselilè mwens pèmeyab. Akòz ekselan kapasite li kenbe dlo, HA ogmante jèn, idratasyon, ak lis po a epi redwi degre ondilasyon [13,14]. Malerezman, nivo HA nan po a natirèlman diminye ak laj. Hyaluronidase se yon anzim ki detwi HA, sa ki lakòz pèt fòs po, fleksibilite, ak imidite, ki an vire, mennen nan aje po. Se poutèt sa, ondilasyon yo ka trete pa anpeche hyaluronidase ak kenbe kontni an HA nan po a [15,16]. Anzim ki pwodui melanintirozinazkontribye esansyèlman nan etap ki limite pousantaj nan pwosesis la nan ki melanin pwodui. Se poutèt sa, maladi pigmantasyon yo souvan trete ak eklere po reyalize pa anpeche oswa downregulatingtirozinazaktivite [17,18].

Nan plizyè etid, yo te dekouvri idrolysat pwoteyin grenn yo ak peptides yo ka jwenn nan yo.antioksidan, antihypertensive, ak aktivite antitumoral [19,20]. Kontribisyon pozitif nan sante moun nan peptides ak pwoteyin ki soti nan manje yo piti piti rekonèt [21]. Konsomatè de pli zan pli mande ke endistri kosmetik ak swen sante yo sèvi ak konpoze natirèl byoaktif. Idroliz pwoteyin diri (RPH) te atire atansyon kòm yon sous ekselan nan pwoteyin. Sepandan, kèk etid te rapòte karakterizasyon ak analiz fonksyonèl RPH yo. Se poutèt sa, etid sa a evalye aantioksidanaktivite ak hyaluronidase aktirozinaz-inhibiteur

aktivite RPH yo.

2. Rezilta ak Diskisyon

2.1. Konsantrasyon total fenolik (TPC) ak kontni total flavonoid (TFC)

Estanda nan tès TPC a se asid galik nan plizyè konsantrasyon. Pi wo absòbe endike yon TPC ki pi wo. TPC echantiyon RPH yo te jwenn lè w mete valè absòbe optik echantiyon RPH yo nan koub kalibrasyon asid galik la. Lè w trase konsantrasyon RPH a kont konsantrasyon fenolik la (Figi 1a), yo te jwenn yon TPC mwayèn 2.06 士 0.13 mg GAE/g RPHs. Yon TFC nan 25.96 士 0.52 µg QE/g RPH yo te jwenn nan swiv yon pwosedi menm jan an (Figi 1b). Figi 1c plis gen rapò TPC ak TFC nan echantiyon RPH yo. Li revele ke relasyon ki genyen ant TPC ak TFC ka eksprime kòm y=0.0121x plis 0.0659, kote x ak y se TPC a ak TFC, respektivman.

TPC RPH yo enkli konsantrasyon fenolik asid amine ak konpoze fenolik peptides yo. Pwoteyin-fenolik entèraksyon konpoze jeneralman enplike lyezon kovalan ak noncovalent. Konpoze fenolik yo lage pandan idroliz anzimatik. Anzim espesifik yo ka pi anmezi pou detwi konplèks pwoteyin-polifenol; sa a lakòz yon pi gwo kantite konpoze fenolik ak peptides ak gwoup fenolik, tankou tirozin, yo te lage [22]. Yo te rapòte yon gwo korelasyon ant kontni an polifenol total nan grenn ak aktivite byolojik yo. Polifenol yo byen konnen yo gen fòantioksidanaktivite [23]. Malgre ke yo jwenn nan mwens kantite, tèrpèn [24] oswa sesquiterpenes [25] nan diri ta ka tou kontribye nanantioksidanaktivite yo.

2.2. Aktivite nan antioksidan

2.2.1. Aktivite Radical Scavenging Radikal Gratis DPPH

Figi 2 dekri aktivite DPPH lib radikal scavenging nan solisyon RPH la. Yo te dekouvri yon konsantrasyon ki pi wo nan solisyon an pou rezilta nan pi wo aktivite. Demi-maksimòm konsantrasyon inhibitory (IC50), ki se konsantrasyon ekstrè pou ki mwatye nan tout radikal gratis DPPH ka scavenged, te 42.58 士 2.1 mg / mL nan peptides diri.

2.2.2. Aktivite pou netwaye radikal ABTS gratis

Aktivite scavenging ABTS lib radikal RPH yo, ilistre nan Figi 3, te pi wo lè yo te itilize yon pi gwo konsantrasyon ekstrè. IC50 te 2.11 士 0.88 mg/mL peptides diri. Rezilta sa a te endike ke RPH yo te gen gwo aktivite ABTS radikal gratis. Asid amine ki gen souf, ki gen ladan Met ak Cys, ak asid amine idrofob, ki gen ladan Ala, Val, Ile, Leu, Met, Cys, Tyr, Phe, Try ak Pro, ta ka faktè enpòtan anrapò ak scavenging radikal gratis ABTS. aktivite [26]. Anplis de sa, asid amine aromat, ki gen ladan Phe ak Tyr, tou ankouraje ABTS radikal gratis aktivite scavenging paske nan bag benzèn yo bay pwoton nan radikal defisi elektwon [27].

Figi 3. Enfliyans konsantrasyon RPH sou kapasite 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzo-othiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) pou netwaye.

Nan etid sa a, valè IC50 ABTS lib radikal scavenging aktivite te pi ba pase DPPH lib radikal scavenging aktivite, dakò ak rezilta Jatropha curcas L. grenn kal ak du [28] ak jujube fwi pitit pitit ak kale kaka [29]. Konklizyon sa a koresponn tou ak rapò hydrolysates pwoteyin bran diri ak 43.98–66.25 µmol Trolox ekivalan/g echantiyon ak 403.28–430.12 µmol Trolox ekivalan/g echantiyon pou aktivite DPPH radikal gratis ak aktivite ABTS, respektivman [27].

Youn nan rezon posib se diferans ki genyen nan solubility ant DPPH radikal gratis (lwil oliv idrosolubl) ak ABTS radikal gratis (lwil oliv / dlo idrosolubl) [30,31]. Laantioksidanpotansyèl hydrolysates pwoteyin bran diri yo te enfliyanse pa pwofil pwa molekilè li yo, konpozisyon asid amine ak idrofobisite [32].

2.2.3. Kapasite Rediksyon

Konklizyon tès kapasite rediksyon pou RPH yo prezante nan Figi 4. Kapasite rediksyon an ogmante ak konsantrasyon RPH yo. Kapasite rediksyon an te 6.95 士 1.40 mg VCE/g RPHs, ki endike ke RPH yo se yon efikas.antioksidan.

Figi 4. Enfliyans konsantrasyon RPH sou kapasite rediksyon.

2.2.4. Kapasite Radikal Absòbsyon Oksijèn (ORAC)

Esè ORAC la gen avantaj sou lòt apwòchantioksidandetèminasyon aktivite, ki gen ladan reyaktif yo itilize yo se radikal peroxy ak yon mekanis reyaksyon menm jan ak potansyèl redox ak oksidan fizyolojik; chaj la an jeneral ak eta pwotonasyon ak ki laantioksidanreyaji sanble ak moun ki nan kò imen an [33]. Metòd ORAC la tou gen enpòtans byolojik nan efikasite nanantioksidannan kò imen an. Figi 5 montre rezilta analiz ORAC RPH yo ak estanda Trolox nan divès konsantrasyon. ORAC a te sòti nan ekwasyon regresion koub kalibrasyon ki gen rapò ak AUC nèt ak konsantrasyon Trolox la. Rezilta yo te endike ke RPH yo te gen yon ORAC de 473 µmol TE/g RPHs.

Antioksidanpeptides oswa asid amine yo ka jwenn pa idroliz pwoteyin anzimatik, sa ki lakòz trè aktif kont oksidan [34]. Chelation iyon metal la, anpèchman peroksidasyon lipid, ak elimine radikal gratis nan peptides byolojik aktif yo responsab aktivite antioksidan yo. Radikal lib yo ka etenn epi ekspresyon pwoteyin oksidatif-diminye estrès ak anzim regilasyon.antioksidanpeptides. Efikasite antioksidan idroliz pwoteyin ak peptides yo rapòte depann sou sekans asid amine ak gwosè peptide a, ki afekte pa kondisyon idroliz yo, sous pwoteyin, ak kalite proteaz [35]. Dapre Adebiyi et al. [36], pi gwo pwoteyin bran diri dijèstibl ka kase an pi piti moso pa subtilisin, sa ki lakòz pi gwo sede pwoteyin ak kontni. Yon TPC hydrolysate a akantioksidanaktivite a ka afekte pa spesifik anzim yo. Se poutèt sa, aktivite antioksidan yon peptide ka enfliyanse pa karakteristik sous pwoteyin yo, spesifik anzim nan, ak nivo idwoliz [37].

Gen anpil rapò ki sèvi ak pwoteaz (tankou Alcalase, yon non komèsyal nan yon subtilisin A ki soti nan espès Bacillus) pou idrolize pwoteyin ki sòti nan plant yo jwennantioksidanpeptides. Nan sans sa a, pwoteyin soya se youn nan pwoteyin ki pi rapòte [38]. Anplis de sa, yo jwenn idroliz Alcalase nan pwoteyin bran diri tou. Anba kondisyon pi bon, idroliz Alcalase nan bran diri glutinous pwodui idrolys pwoteyin ak valè IC5 0 0.87 士 0.02 mg/mL nan DPPH gratis radikal scavenging [39]. Nan etid nou an, valè IC50 RPH yo te 42.58 士 2.1 mg/mL. Malgre ke valè IC50 nan DPPH radikal gratis nan etid sa a pa t 'tan efikas tankou sa ki soti nan pwoteyin bran diri, ABTS gratis radikal scavenging (IC50=2.11 mg/mL) te pi efikas pase idrolysat pwoteyin soya te jwenn pa Alcalase. idwoliz (IC50=2.93 mg/mL) [40].

2.3. Aktivite Inhibition Hyaluronidase

Yo jwenn yon anzim pwoteolitik, hyaluronidase, nan dèrm la epi li katalize degradasyon HA nan matris ekstraselilè [41]. Etid sa a te anplwaye asid tannik kòm yon kontwòl pozitif pou rezon konparezon. Figi 6 revele ke asid tannik te gen yon anpèchman aktivite hyaluronidase ki pi wo; IC5 a0 te 0.14 mg/mL, menm jan ak valè Nishida et al. (0.121 mg/mL; 71.1 mM) [42]. Kontrèman, yo te kalkile yon IC50 nan 8.91 mg / mL pou solisyon an RPH. Rezilta solisyon RPH sa a te koresponn ak valè IC50 anvan nou an, 7.61 mg/mL [43]. Pwoteyin, polisakarid, ak konpoze ki soti nan plant ak sentetik se yo ki pami seri a nan konpoze nan ki inibitè hyaluronidase yo prezan. Inibitè sa yo ede kenbe balans sentèz-degradasyon HA [44]. Ba konsantrasyon HA nan po a lakòz sechrès ak ondilasyon. Se poutèt sa, anpèchman nan aktivite hyaluronidase se yon wout nan ki mòfoloji po a ka amelyore ak aje li an reta.

2.4. Tirozinaz-Inhibitory Aktivite

Hydrolysates pwoteyin ki soti nan sous natirèl gen potansyèl pou anpechetirozinazaktivite. Anjeneral yo itilize tès anpèchman tirozinaz in vitro pou evalye kijan ajan blanchi po yo afekte dirèkteman aktivite tirozinaz [45]. Lè w patisipe nan etap ki limite vitès sentèz melanin lan,tirozinazkatalize L-tirozin idroksilation nan L-DOPA ak Lè sa a, oksidasyon lèt la nan o-dopaquinone. Lè li se dezirab yo anpeche byosentèz nan melanin, anpèchman nan aktivite L-tirozinaz ka enpòtan. Isit la,tirozinazte itilize pou evalye aktivite antitirozinaz RPH. Jan yo montre nan Figi 7, konsantrasyon 107.6 mg/mL reyalize 50 pousan anpèchman nan aktivite tirozinaz. Ascorbic asid te montre gwo tyrosinase-inhibitory aktivite (IC50=0.098 mg/mL), ki te sanble ak 0.102 mg/mL ki Seo et al. rapòte [46].

Figi 7. Efè konsantrasyon RPH soutirozinaz- aktivite inhibition. Vle di ki pa pataje yon sipèskri komen yo siyifikativman diferan (p <>

Idrolizat pwoteyin bran diri yo te montre anpil wotirozinaz-aktivite inhibition [47,48]. Aktivite inhibition tirozinaz solisyon RPH a ka soti nan pwofil asid amine peptides yo. Schurink et al. dekri sa efikastirozinaz-peptides inhibiteur konpoze de résidus arjinin ak fenilalanin [49]. Aktivite tirozinaz-inhibitory kapab amelyore pa résidus asid amine idrofob (egzanp, alanine), ak pwodiksyon melanin ka deranje pa alanine [50]. Anplis de sa, Zhang et al. tou te rapòte ke diri pwoteyin hydrolysat te kapab redwi melanin kontni aktirozinazaktivite nan modèl selil UVB-induit [51].

2.5. Pwofil asid amine ak MW nan RPH yo

Kontni pwoteyin diri a apre yo fin retire lanmidon nan etid prezan an te 23.56 pousan pa pwa, ak degre nan idroliz echantiyon an idrolize pa pwoteaz te 9.36 pousan. Tablo 1 detaye konpozisyon asid amine nan RPH yo. Nan echantiyon an, chak 100 g te genyen 5.18 g asid amine. Konsènan eleman asid amine yo, RPH yo te rich nan alanin, leucine, arjinin, asid glutamik, ak asid aspartik. Chak 100 g nan echantiyon an genyen 1.73 g nan asid amine idrofob (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, fenilalanin ak sistein) nan total. Rezilta sa a te konplètman diferan de rapò anvan nou an [43] nan solisyon an amilaz ak tanperati tretman li yo retire lanmidon. Kontni asid amine idrofob te 1.90 fwa pi wo pase rapò anvan nou an. Tanperati tretman ki pi ba (60 О C) nan etid sa a ka anpeche denaturasyon pwoteyin nan gwo kantite, pou aktivite asid amine yo ka pi byen konsève. Anplis de sa, konklizyon menm jan an tou jwenn nan lòt amilaz chanpiyon ak glukoamilaz sakarifi lanmidon nan bran diri blan [52].

Tablo 1. Pwofil asid amine nan echantiyon diri idrolizat pwoteyin (RPH).

Rechèch yo te jwenn asid amine idrofob yo sanbleantioksidanpa ogmante solubilite ki baze sou lipid nan idroliz pwoteyin ak peptides ki soti nan divès sous pwoteyin, kidonk ankouraje entèraksyon an ak radikal gratis [38,53]. Gen kèk asid amine yo te rapòte pa Chen et al. [54] jeneralman yo dwe antioksidan; asid yo mansyone enkli triptofan, sistein, methionine, tirozin, ak histidine. Nan etid la prezan, asid amine aromat (fenilalanin, tirozin, ak triptofan) te gen ladan 0.53 g/100 g RPH. Se poutèt sa, asid amine peptide-orijin sa yo te pwobableman responsab pou RPH yo.antioksidanaktivite.

Anplis de sa, pwoteyin ki idrolize nan pi kout peptides gen yon distribisyon MW diferan, ak kèk gwoup idrofob ki plwaye nan enteryè a nan molekil konplè pwoteyin natirèl yo anjeneral ekspoze a faz akeuz la. Sa a gen rapò ak molekil pwoteyin yo te ranje estriktirèl ak kidonk ak pwopriyete fonksyonèl pwoteyin yo [55,56]. Done tricine-SDS-PAGE yo endike ke MW nan RPH yo te nan seri 5-35 kDa (Figi 8a).

Figi 8. Detèminasyon pwa molekilè (MW) pou RPH yo atravè elektwoforèz jèl sodyòm dodecyl sulfat-polyacrylamid (SDS-PAGE): (a) modèl tricine-SDS-PAGE makè MW (liy 1) ak RPHs (liy 2) epi (b) kontni relatif (pousan) chak MW RPH yo.

Figi 8b dekri kontni relatif divès MW nan RPH. An jeneral, 45.24 pousan nan tout pwoteyin yo te nan gwoup prensipal la (MW ≈ 2.4 kDa). Yo te jwenn rezilta menm jan an konsènan peptide idrolysat pwoteyin bran diri yo. Pi wo aantioksidanaktivite Thamnarathip et al. [37] se te pou peptides MW=6–50 kDa. Anplis de sa, relasyon egziste ant fonksyon idrolysat pwoteyin ak distribisyon MW ak konpozisyon asid amine [57]. Sa a eksplikeantioksidanaktivite RPH yo obsève nan etid prezan an.

2.6. Tès Toksisite Selil

Ba toksisite selil obligatwa pou aplikasyon nan lavni. Pou evalye sitotoksisite ak byokonpatibilite RPH yo, yo te mezire viabilite selil kri 264.7 selil nan solisyon RPH atravè metòd MTT. Jan yo montre nan Figi 9, viabilite selil la te pi wo pase 100 pousan lè yo te trete ak 25-2000 µg/mL RPH pou 24 èdtan ak 48 èdtan. Rezilta yo endike sitotoksisite konsiderableman ba nan RPH yo. Se poutèt sa, RPH yo ka potansyèlman itilize kòm aplikasyon kosmetik ak sitotoksisite ki ba anpil.

Figi 9. MTT tès pou toksisite selil kri 264.7 selil trete ak diferan konsantrasyon RPH pou 24 ak 48 èdtan.

3. Materyèl ak Metòd

3.1. Reyaktif

Klori fè (III), 2,2′ -azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), Trolox (6-hydroxy-2,5,7 ,8-tetramethylchroman-2-asid karboksilik), l-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil ( DPPH), ak asid trichloroacetic yo te akeri nan Alfa Aesar (Tewksbury, MA, USA). 2,2′ -azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH), reyaktif fenol Folin-Ciocalteu a, asid galik, asid ascorbic, tirozinaz djondjon, ak sodyòm fliwoscein te jwenn nan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Sodyòm carbonate te jwenn nan Riedel-de Haën (Seelze, Almay). Finalman, yo te jwenn ferricyanide potasyòm, fosfat idwojèn sodyòm ak fosfat diidwojèn sodyòm nan Showa Chemical (Tokyo, Japon).

3.2. Preparasyon RPH yo

RPH yo te prepare jan sa dekri deja, eksepte ke yo te adopte amilaz chanpiyon pou sakcharifye lanmidon nan farin diri, pou evite domaj nan asid amine ki te koze pa idroliz amilaz bakteri nan tanperati ki wo [43,58]. Yo te tranpe 100 gram farin diri nan 1000 mL dlo distile ki gen 0.5 pousan amilaz chanpiyon (Genencor, NY, USA); Melanj lan te imedyatman chofe pou 24 èdtan a 60 О C (pH 4.2), apre sa li te pèmèt yo refwadi nan tanperati chanm. Santrifugasyon te fèt pou 10 min nan 1968 × g pou retire surnatant ki rete a. Apre 20-pliye dlo ak 2 mL 0.1 pousan proteaz idrolitik (Healthmate, Changhua, Taiwan) te ajoute nan pòsyon ensolubl la, yo te souke solisyon an epi enkube pou 4 èdtan nan 55 О C. Metòd pH-stat la te anplwaye pou kenbe pH solisyon an nan nivo optimal, epi 85 О C chofaj te Lè sa a, fèt pou 10 min pou inaktivasyon anzim. Yo te retire fraksyon ensolubl ki rete a atravè santrifujasyon pou 15 min nan 3075 × g. Yo te fè lyofilizasyon sou supernatant la, ki te answit estoke nan _20 О C anvan ou itilize.

3.3. Aktivite antioksidan nan RPH yo

3.3.1. Konsantrasyon fenolik total (TPC)

Yo te itilize metòd Folin-Ciocalteu pou dekouvri TPC RPH yo [59]. Premyèman, 200 µL reyaktif fenol Folin-Ciocalteu a (0.3M) te melanje inifòm pandan 5-min souke ak 200 µL solisyon RPH, epi nan melanj sa a, 400 µL deyonize (DI) dlo ak 200 µL nan 10 pousan (w/v) solisyon kabonat sodyòm yo te ajoute. Solisyon an melanje te sibi 60 minit nan enkubasyon nan fènwa nan tanperati chanm. Lè sa a, li te santrifuje pou 15 minit nan 3000 rpm. Mezi a te itilize 100 µL supernatant. Pou detèmine TPC (inite: mg) ekivalan asid galik (GAE) pou chak gram echantiyon RPH sèk (inite: mg GAE/g RPHs), done absòbe optik yo te antre nan yon koub estanda ki reprezante asid galik. Absorbans la te jwenn nan 700 nm lè l sèvi avèk Epoch Microplate Spectrophotometer (BioTek, VT, USA).

3.3.2. Kontni Flavonoid Total (TFC)

TFC te jwenn apre apwòch Wathoni et al. ak ti modifikasyon [60]. Premyèman, yo te melanje 500 µL chak nan echantiyon an ak 2 pousan (w/v) solisyon klori aliminyòm. Yo te melanje solisyon reyaksyon an byen epi kite pou 10 min, epi yo te evalye absorpsyon nan 415 nm. Yo rapòte rezilta a an mikrogram ekivalan quercetin (QE) pou chak gram echantiyon RPH sèk la (µg QE/g RPH).

3.3.3. DPPH Aktivite gratis Radikal Scavenging

Premyèman, yo te melanje 198 µM DPPH etanòl solisyon (50 µL) ak solisyon RPH a oswa dlo DI (0.5 µL; echantiyon an ak kontwòl, respektivman) epi yo te kite yo kanpe pou 30 minit nan fènwa nan tanperati chanm. Absòbsyon solisyon an nan 517 nm te imedyatman jwenn. Aktivite netwayaj relatif yo te kalkile pa detèmine diferans ki genyen absorpsyon ant echantiyon an ak kontwòl. Segondè DPPH radikal gratis aktivite scavenging te reflete pa absòsyon optik ki ba. Nan evalyasyon aktivite DPPH lib radikal solisyon RPH a, estanda a te anplwaye se vitamin C [61-63].

3.3.4. Aktivite pou netwaye radikal ABTS gratis

Apwòch la rapòte pa Wu et al. te anplwaye pou evalye solisyon RPH aantioksidanaktivite [64]. Premyèman, yo te reyaji 7 mM solisyon stock ABTS (250 µL) ak 2.45 mM persulfat potasyòm (250 µL) pou bay kasyon radikal lib ABTS (ABTS● plus ), ak melanj lan yo te kenbe. pou 16 h nan 4 О C nan fènwa anvan li te anplwaye. Apre ekilib nan fènwa nan tanperati chanm nan, 0.1 M fosfat-tampon saline (PBS; pH 7.4) yo te anplwaye pou delye solisyon an nan 0.70 士 0.02 absorbans nan 734 nm. Lè sa a, nan 180 µL solisyon ABTS dilye, yo te ajoute 20 µL Trolox (kontwòl pozitif) oswa solisyon RPH (echantiyon). Lè sa a, melanj lan te sibi 10 min nan enkubasyon nan tanperati chanm. Etid sa a detèmine absorpsyon optik nan 734 nm; pi ba absorption koresponn ak pi wo ABTS radikal gratis aktivite scavenging. Estanda ki te itilize pou evalye RPH solisyon ABTS lib radikal scavenging aktivite se te antioxydant Trolox.

3.3.5. Kapasite Rediksyon

Te fè tès pouvwa antioksidan ki diminye ferrik la te anplwaye pou detèmine total solisyon RPH laantioksidanaktivite. Kòm rapòte pa Lin et al. [29], solisyon RPH a (200 µL) te melanje inifòm ak 1 pousan (w/v) K3Fe(CN)6 ak 0.2 M PBS tanpon (pH 6.6; 100 µL chak) . Pou 20 min, yo te itilize yon beny dlo 50 О C pou chofe melanj lan; apre yo fin retire melanj lan nan beny lan, li te byen vit refwadi pou 3 min. Apre sa, yo te fè yon adisyon 10 pousan (w/v) trichloroacetic asid (100 µL) ak 10-min santrifujasyon nan 3000 rpm. Sa a te swiv pa ekstraksyon nan supernatant la (400 µL) ak inifòm melanje li yo ak 0.1 pousan (w/v) FeCl3 (100 µL) ak dlo DI (400 µL). Fe4 [Fe(CN)6 ]3 te jwenn nan 10-min reyaksyon melanj sa a nan fènwa. Imedyatman, yon pi wo absòbe optik (mezire nan 700 nm) endike pi wo kapasite rediksyon. Yo te itilize vitamin C estanda pou detèmine kontni ekivalan vitamin C (VCE) pou chak gram RPH.

3.3.6. Kapasite Radikal Absòbsyon Oksijèn (ORAC)

Etid sa a te jwenn ORAC lè li modifye yon metòd ki te deja rapòte [65]. Apre yo fin fonn echantiyon RPH la nan dlo distile, yo te melanje solisyon RPH a (50 µL) ak fluorescein (10 µM) nan yon 96-plak microtiter byen. Solisyon an te sibi 15-min enkubasyon nan 37 О C ki te swiv pa adisyon 50 µL AAPH (500 mM). Chak 5 min ak plis pase yon total de 120 min, yo te anrejistre fliyoresans (λex ak λem=485 ak 528 nm, respektivman). LaantioksidanKapasite RPH yo te dekouvri nan sinetik pouri fliyoresans lè yo kalkile zòn anba koub la (AUC). Nan enfòmatik RPH ORAC la, estanda a te 15-250 µM Trolox. Yo rapòte ORAC la kòm mikromol ekivalan Trolox (TE) pou chak gram echantiyon RPH sèk (µmol TE/g RPH).

3.4. Aktivite Inhibition Hyaluronidase

Yo te fè tès anpèchman hyaluronidaz la lè l sèvi avèk yon {{0}}mikwoplak byen ak yon metòd ki te rapòte deja ak ti modifikasyon [4{0]. N-acetylglucosamine te libere pa reyaji hyaluronidase ak substra HA a. Nan prezans nenpòt inibitè, lage N-acetylglucosamine la te redwi, ak liberasyon sa a detekte pa jwenn absorpsyon nan 600-nm. HA te presipite ak solisyon albumin asid ki konpoze de 0.1 M tanpon acetate (pH 3.9) ak albumin serom bovin (1 mg / mL). Solisyon echantiyon an ak 5 mg/mL hyaluronidaz te sibi 20-min enkubasyon nan 37 О C. Nan melanj enkubasyon an, HA (1{{20}}0 µL; 5.0 mg/mL nan 0.1 M tanpon acetate) te ajoute imedyatman. Yo te fè plis enkubasyon nan 37 О C pou 40 min. Yo te ajoute 0.1 mL 0.4 M solisyon alkalin borat pou sispann reyaksyon anzimatik la.

3.5. Tirozinaz-Inhibitory Aktivite

Etid la prezan evalye aantitirozinazaktivite RPH yo lè l sèvi avèk yon pwotokòl ki te rapòte deja ak modifikasyon [66]. Yon solisyon anzim (135 U/mL) te prepare pa fonntirozinaznan 20 mM tanpon fosfat (pH 6.8). Anplis de sa, yo te itilize dlo DI pou preparasyon solisyon 1.25 mM L-DOPA. Lè sa a, 40 µL nan divès konsantrasyon nan solisyon echantiyon RPH yo te melanje ak 40 µL nan solisyon tirozinaz ak 120 µL nan solisyon L-DOPA. Pou 30 min, yo te kenbe melanj sa a nan 37 О C nan tès la nan anpèchman RPH yo nan.tirozinazaktivite. Yo te itilize yon espektrofotomèt (FLUOstar Omega Microplate Reader, BMG Labtech GmbH, Almay) pou jwenn 475-nm absorbans. Tout mezi yo te fè twa fwa. Absòbsyon gwoup korespondan a lètirozinazpa te prezan te soustraksyon. Yo te detèmine pousantaj anpèchman anzim kòm

3.6. Karakterizasyon RPH yo

3.6.1. Pwofil asid amine

Etid sa a te dekouvri konpozisyon asid amine RPH yo. Premyèman, pou 24 èdtan ak nan 115 О C, yo te itilize 4 M asid metansulfonik pou idrolize echantiyon yo nan tib sele evakye. De Waters 510 sistèm livrezon sòlvan ak yon analizè asid amine (L- 8900; Hitachi, Tokyo, Japon) yo te anplwaye pou separasyon asid amine derivatize sou yon kolòn Spherisorb ODS2 ki mezire 25 m × 64.6 mm. Etid sa a te anplwaye solvants sa yo: (a) sodyòm acetate (0.14 M) ak triethylamine (850 µL/L; pH 5.6) ak (b) 60 pousan acetonitrile, pou ki gradyan an. te 0 pousan pou 2 min; 0-42 pousan pou 15.5 min (kob konvèks); ak 100 pousan pou 4 min. Yo te pran echantiyon kopi pou mezire pwofil asid amine nan 254 nm [67,68].

3.6.2. Pwa molekilè (MW) nan pwoteyin

Dapre metòd Schägger a [69] ak nan kondisyon rediksyon, etid sa a te jwenn distribisyon MW nan trikin-sodyòm dodecyl sulfat (SDS)-polyacrylamid gel electrophoresis (PAGE) ak ti modifikasyon. Yon echantiyon tanpon (30 g/L SDS, 0.375 M Tris-HCl, 0.125 g/L Coomassie Brilliant Blue G-250, ak 75 g /L glycerol; pH 7) yo te anplwaye pou dispèse echantiyon an friz-seche, ak santrifujasyon Lè sa a, fè anvan loading. Yo te ajoute yon total de 20 µL 2-mercaptoethanol nan 1 mL echantiyon tricine-SDS-PAGE la. Yo te chofe echantiyon an nan 100 О C pou 90 s. Yo te chaje yon echantiyon byen ak chak echantiyon ak Unstained Pwoteyin Standard Broad Range (Bio-Rad Laboratories, Almay) lè l sèvi avèk yon microsyringe. Lè sa a, elektwoforèz te fèt-premye nan yon konstan 30 mV jiskaske tout echantiyon an te genyen nan jèl la anpile epi apre sa jiskaske fini nan yon konstan 100 mV. Apre sa, yo te aplike 0.02 pousan solisyon Coomassie Brilliant Blue R-250 pou tach jèl. Absoli background detaining nan jèl yo te fèt pa souke jèl yo nan 10 pousan asid acetic lannwit lan. Finalman, yo te analize imaj jèl la pou idantifye bann pwoteyin ki nan liy yo; analiz sa a te fèt nan ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Yo te itilize makè estanda pou jwenn yon koub kalibrasyon ki te estime MW la. Yon ti tan, premye etap la se detèmine longè migrasyon chak gwoup (Rf) soti nan tèt jèl separasyon an. Dezyèm etap la se te kalkil koub kalibrasyon an pa anplwaye Rf ak log (MW) pou yon makè estanda ak yon MW bay yo. Detèminasyon MW te fèt lè l sèvi avèk Rf nan bann pwoteyin nan RPHs.

3.7. Esè sitotoksisite

Selil kri 264.7 yo te kiltive nan gwo glikoz Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ki gen 10 pousan serom fetal bovine (FBS), 4.5 g/L Glikoz, 1 pousan solisyon antibyotik (100 inite/). mL penisilin ak 100 µg/mL Streptomycin), 4 mM L-Glutamin ak 1.5 g/L bikabonat sodyòm nan 37 О C ak 5 pousan CO2. Toksisite selil anvan tout koreksyon selil 264.7 pou RPH yo te mezire pa yon tès pwopagasyon 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl-tetrazolium bromur (MTT) metòd. Apeprè 1 × 104 selil pou chak pi yo te plake nan plak 96-pi. Apre 24 èdtan, yo te ajoute plizyè konsantrasyon RPHs (0-2000 µg/mL) nan selil yo. Apre 24 ak 48 èdtan nan enkubasyon, yo te ajoute 100 µL nan solisyon MTT (0.5 mg / mL). Kristal formazan ble yo te obsève lè yo tcheke anba yon mikwoskòp. Yo te retire DMEM epi yo te ajoute 100 µL dimethyl sulfoxide (DMSO) pou chak pwi. Absorbans la te mezire lè l sèvi avèk yon lektè plak mikrotiter. Lè sa a, yo te kalkile viabilite selil la (pousan) kòm [A570 (selil trete) _ A570 (selil ki pa trete)] / [A570 (selil ki pa trete) _ A570 (selil trete)] × 100 pousan [70].

3.8. Analiz estatistik

Rapò pou chak echantiyon idrolysat te valè mwayèn nan twa eksperyans endepandan repete ak detèminasyon. Rezilta ki eksprime an mwayèn 士 devyasyon estanda (SD) yo te analize pa yon sèl-fason ANOVA ak tès post hoc Duncan a lè l sèvi avèk Sistèm Analiz Estatistik (vèsyon 20.0; SPSS, Armonk, NY, USA) . Valè p <0.05 yo="" te="" konsidere="" kòm="" siyifikasyon="">

4. Konklizyon

Etid sa a te egzamine fonksyon RPH yo. Rezilta eksperimantal yo te revele ke RPH yo te genyen konpoze fenolik ak flavonoid epi yo te montre yon seriantioksidanaktivite, tankou aktivite DPPH ak ABTS, kapasite rediksyon, ak ORAC. Anplis de sa, RPHs efektivman inibittirozinazak aktivite hyaluronidase. Pwoteaz la se te yon faktè kritik ki afekte modèl MW nan RPH yo. Analiz RPH yo endike potansyèl yo pou itilize kòm yon engredyan nan pwodui kosmetik.

Kontribisyon otè: Y.-SL te konsèptualize etid la; analiz fòmèl te fèt pa Y.-SL ak C.-SC; se H.-JC, F.-JD, C.-YC, J.-HZ ak Y.-CH ki te fè gerizon done; maniskri orijinal la te ekri pa H.-JC, F.-JD, ak S.-LF; finalman, C.-FC, Y.-SL, ak C.-SC te revize e edite bouyon an. Tout otè yo te li epi dakò ak vèsyon maniskri a ki te pibliye a.

Finansman: Ministè Syans ak Teknoloji te bay finansman pou etid sa a. Deklarasyon Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl: Pa aplikab.

Deklarasyon Konsantman Enfòme: Pa aplikab.

Deklarasyon Disponibilite Done: Done yo prezante nan etid sa a disponib sou demann nan men otè ki koresponn lan.

Konfli enterè: Otè yo deklare pa gen okenn konfli enterè. Egzanp Disponibilite: Pa disponib.