Evalyasyon transpò entesten yon ekstrè feniletanoid ki rich ak glikozid ki soti nan Cistanche Deserticola atravè modèl monokouch selil Caco-2
Apr 03, 2024
Entwodiksyon
Liy selil Caco-2, ki te sòti nan adenokarcinom kolon imen, montre karakteristik ki sanble ak enterosit. Nan kondisyon nòmal, selil Caco-2 espontaneman diferansye ak selil ki gen matirite epi yo fòme monokouch entak [1]. Selil adjasan yo konfòme yo atravè junctions sere ki fòme nan bò apical monokouch la, sa ki ka fè diskriminasyon dwòg yo transpòte pasif ak aktivman atravè kouch epitelyal la [2]. Akòz resanblans mòfolojik ak byochimik ak enterosit nòmal yo, monokouch selil Caco -2 sèvi kòm yon modèl in vitro byen aksepte pou etid potansyèl absòpsyon entesten ak karakteristik transpò dwòg [3, 4].
Kontrèman ak pwodui chimik, ekstrè plant (PE) se melanj ki gen aktivite byolojik ak konstitiyan aktif yo souvan pa byen idantifye [5]. Anplis, pwopriyete transpò entesten PE yo, kontrèman ak pwopriyete elektè li yo, yo gen rapò ak itilizasyon klinik. Mezi flux pou yon echantiyon tès atravè yon monokouch selil Caco-2 souvan enplike metòd chimik, tankou HPLC, LC/MS, elatriye. Malgre ke metòd sa yo se zouti pwisan, yo konplèks, yo pran tan, chè, epi detanzantan. mande pou ekipman sofistike. Sa ki pi enpòtan, ni yon sèl ni yon eleman minorite ka reflete PE kòm yon antye. Kidonk, yon nouvo apwòch endepandan de detèminasyon elektè yo bezwen etabli pou idantifye ak evalye karakteristik transpò PE yo.
Cistanche deserticola YC Ma (CD), yon plant oloparazit, se yon medikaman tradisyonèl Chinwa ki itilize sitou pou trete defisyans ren, feblès kò, ak konstipasyon, epi itilizasyon sa yo te anrejistre ofisyèlman nan Farmakope Chinwa [6]. Phenylethanoid glikozid (PhGs), ki gen ladanechinacoside (EC), acteoside (AC) ak isoacteoside(IS), elatriye, se yon klas konpoze polifenolik [7]. Yo konsidere kòm youn nan pi gwokonstitiyan byoaktif nan espès Cistanche[8]. Etid farmakolojik yo te montre ke byoaktivite PhGs yo divès e li gen ladan anti-oksidatif [9], anti-fatig [10], epatoprotective [11], imunomodulateur [12], anti-enflamatwa [7, 13], ak efè neropwotektif [11]. 14]. Sepandan, karakteristik transpò entesten PhG yo pa te envestige. Nan etid sa a, nou te eksplorepèmeyabilite entesten nan yon ekstrè PhG ki rich (PRE) soti nan CDkòm yon sistèm entegre ak pèmeyabilite twa gwo PhG (AC, IS, ak EC) nan selil Caco-2 diferansye. Rezilta nou yo endike ke PRE se transpòte prensipalman atravè difizyon pasif mal absòbe desann yon gradyan konsantrasyon san eflux, ki bay baz famakokinetik pou aplikasyon klinik PhGs nan CD.
NATURAL CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE HERBS PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Materyèl ak Metòd
Materyèl
The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98%) yo te achte nan men Must Biotechnology Co (Chengdu, Lachin). Dulbecco a modifye Eagle's medium (DMEM), serom fetal bovine (FBS), ak asid amine ki pa esansyèl (NEAA) te pwodwi pa Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). 6-byen plak TranswellTM (insert manbràn kwasans zòn 4.67 cm2) yo te jwenn nan Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Kolagen rat-tail te jwenn nan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Tout reyaktif ak pwodwi chimik pou analiz HPLC yo te nan klas analyse.
Preparasyon PRE soti nan CD
Materyèl CD lè sèk la te an poud ak ekstrè pa pèrkolasyon ak etanòl 70%. Yo te prepare fraksyon nan PhG ki rich la jan sa te dekri anvan an [10] epi yo te ekstrè ak dlo-satire alkòl n-butil. Likè ekstrè a te konsantre epi seche anba presyon redwi. Macroporous résine-UV spectrophotometry [15] mezire yon kontni PhG nan 78.4%. Echantiyon final la reprezante yon sede 1.75% nan matyè premyè pa pwa sèk. Yo te estoke echantiyon an jwenn nan -20 degre jiskaske plis itilize.
Detèminasyon AC, IS, ak EC pa HPLC
Yo te itilize yon sistèm HPLC Shimadzu ekipe ak lojisyèl solisyon LC pou analize sa ki nan AC, IS, ak EC nan PRE. Yon kolòn Intersil C18 faz ranvèse (4.6 mm × 25 0 mm, 5 μm) te itilize epi konsève nan tanperati chanm. Faz mobil yo te asetonitrile ak dlo ki gen 0.1% asid fosfò (v/v) ak elisyon gradyan (Tablo 1) nan yon vitès koule 1.0 ml/min. Detektè UV spectrophotometer te mete sou 334 nm. Pou detèmine avèk presizyon flux AC ak IS, nou devlope yon nouvo metòd HPLC-fluoresans deteksyon (HPLC-FLD). Apre yon analiz estriktirèl ak optik longèdonn fliyoresans (done yo pa montre), nou jwenn kondisyon yo pi bon deteksyon fliyoresan pou AC (Egz: 338 nm, Em: 448 nm) ak IS (Egz: 320 nm, Em: 434 nm).
Metòd analitik HPLC te valide lè l sèvi avèk karakteristik pèfòmans sa yo: estabilite, linearite, sansiblite, presizyon (variabilite ant ak entè-jou), ak presizyon. Analit yo nan tanpon transpò a te estoke nan 25 degre nan fè nwa a pou 24 èdtan, epi yo te mezire estabilite yo. Analit yo te trè estab nan prezans vitamin C (0.4%) paske valè relatif estanda devyasyon (RSD) nan zòn pik yo te <3.5%. Ekwasyon regression lineyè a, koyefisyan korelasyon, ranje linearite, LOD, ak LOQ pou AC, IS, ak EC yo montre nan Tablo 2. LOD yo (18–30 nM) ak LOQ yo (60–100 nM) valè yo montre ke metòd HPLC-FLD ak HPLC-UV yo trè sansib. Valè RSD ki eksprime presizyon metòd la te tout < 2% pou varyasyon andedan ak entè-jou, sa ki endike bon presizyon. Pou evalyasyon rekiperasyon, yo te ajoute AC, IS, ak EC nan tanpon transpò a pou bay twa (segondè, mwayen ak ba) nivo konsantrasyon. Valè rekiperasyon metòd pou analit yo rezime nan Tablo 3. Rekiperasyon mwayèn yo varye ant 90.0% ak 96.4%, ki endike bon presizyon. An konklizyon, metòd HPLC etabli yo satisfezan konsènan linearite, sansiblite, presizyon, ak presizyon pou quantification AC, IS, ak EC nan tanpon transpò.
NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Detèminasyon PRE pa sistèm byoessai
Bioassay la (kapasite total anti-oksidatif) te baze sou FRAP (ferrik rediksyon / pouvwa antioksidan) tès nou te deja dekri [16] ak valide an tèm de linearite ak presizyon (varyabl ant ak entè-jou). Yo te detèmine linearite metòd byoessai ki baze sou koub kalibrasyon yo. Ranje konsantrasyon lineyè a te 0.0625 - 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Yo te detèmine presizyon nan metòd la byoassay etabli an tèm de varyasyon nan andedan ak entè-jou pou yon analiz de PRE (10.0 ug / ml). Yo te detèmine repetibilite nan yon jounen nan metòd la ki baze sou senk detèminasyon youn apre lòt nan menm jou a. Yo te mezire repetibilite ant jou a ki baze sou senk detèminasyon youn apre lòt sou twa jou diferan. Valè RSD yo pou presizyon metòd la te 1.014% ak 4.72% pou varyasyon andedan ak entè-jou, respektivman, ki endike bon presizyon. Kidonk, metòd bioassay etabli a satisfezan konsènan linearite, presizyon, ak presizyon pou quantification PRE nan yon tanpon transpò.
Kilti selilè
Selil Caco{{0}} yo te kiltive nan 37 degre ak 95% imidite relatif nan yon atmosfè ki gen 5% CO2 ak yon mwayen ki gen ladann DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutamin, penisilin. (100 U / ml), ak streptomycin (100 ug / ml). Mwayen an te chanje chak jou pandan kwasans selil ak diferansyasyon. Selil yo te grandi nan 75-cm2 flakon plastik epi yo te rekòlte chak 3-5 jou ak 0.05% EDTA-trypsin. Pou eksperyans transpò yo, selil yo te simen nan yon dansite 1 × 105 selil / cm2 sou foure Transwell kouvwi ak kolagen an. Apeprè 21 jou apre simen, monokouch yo te itilize pou eksperyans transpò yo. Yo te detèmine entegrite yo lè yo mezire rezistans elektrik trans-epitelyal (TEER) atravè monokouch yo ak yon EVOM ekipe ak ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA). Valè TEER monokouch selil Caco-2 bezwen depase 500 O∙cm2.
Eksperyans transpò
Monokouch la te lave ak tanpon transpò (P-tanpon ki gen 10 mM HEPES, 1 mM piruvat sodyòm, 10 mM glikoz, 3 mM CaCl2, ak 145 mM NaCl, pH 7.4) ak Lè sa a, pre-enkube pou 20 min. nan 37 degre. Apre yo fin retire tanpon transpò a, yo te ajoute tanpon transpò fre ki gen echantiyon tès nan chanm apical (AP) (1.5 ml) nan etid direksyon AP a basolateral (BL) oswa chanm BL (2.5 ml) nan etid direksyon BL pou AP. Pou tès AC, IS, ak EC lè l sèvi avèk HPLC, yo te retire yon aliquot (300 ul) nan chak chanm reseptè nan diferan entèval tan (30, 60, 90, ak 120 min). Chanm reseptè a te ranpli ak menm volim fre prechofe (37 degre) tanpon transpò apre chak echantiyon. Echantiyon yo kolekte yo te estoke nan -20 degre pou plis itilize. Pou detèminasyon PRE lè l sèvi avèk bioassay, se sèlman echantiyon yo te pran nan 120 min. Akòz enstabilite PRE, AC, IS, ak EC, 0.4% (w/v) vitamin C te
ajoute pou estabilize echantiyon yo pou detèmine kontni AC, IS, ak EC pa HPLC, epi yo te teste echantiyon yo pou bioassay PRE imedyatman apre yo fin pran echantiyon. Yo te kalkile valè pèmeyabilite aparan (Papp oswa 'Papp) chak echantiyon.
Analiz done
Valè Papp nan direksyon AP BL oswa BLAP AC, IS, ak EC yo te kalkile dapre ekwasyon sa a: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), kote Papp se koyefisyan pèmeyabilite aparan (cm/s) detèmine pa HPLC. (4Q/4t) se pousantaj aparans konpoze tès la (AC, IS oswa EC) sou bò reseptè a (μmol/s); A se sifas insert an (cm2); C0 se premye konsantrasyon konpoze tès la sou bò donatè (μmol/ml). Espesyalman, inite mas "ug" yo te itilize olye pou yo "μmol" lè yo te kalkile 'valè Papp yo. Done yo eksprime kòm mwayen ± SD.
Rezilta yo
Konpozisyon AC, IS, ak EC nan PRE soti nan CD
Paske AC, IS, ak EC yo konsidere kòm pi gwo byoaktif laPhG nan espès Cistanche[8], nou analize sa yo nan PRE atravè HPLC-UV. Chromatogram reprezantan yo montre nan Fig. 1. Idantifikasyon konstitiyan sa yo te baze sou konpare tan yo retansyon ak spectre UV ak sa yo ki nan estanda natif natal nan yon longèdonn nan 334 nm. Sa ki nan AC, IS, ak EC nan PRE te 26.60%, 1.84%, ak 32.83%, respektivman. Kidonk, twa konpoze sa yo reprezante 61.27% nan PRE; nplis de sa, rezilta ki anwo yo endike ke kontni an PhG nan PRE se 78.4%. Se poutèt sa, AC, IS, ak EC konte pou apeprè 80% nan PhG nan PRE.
NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMEYORE FONCTION REN PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Total kapasite anti-oksidatif nan PRE, AC, IS, ak EC
Etid aktivite anti-oksidatif nan PhG soti nan CD yo te rapòte [9], ak AC, IS, ak EC konte pou apeprè 80% nan PhG nan PRE. Kidonk, total kapasite anti-oksidatif PRE, AC, IS, ak EC yo te teste ak eksprime lè l sèvi avèk valè FRAP yo (× 10-6 mmol). Jan yo montre nan Fig. 2, lè valè FRAP la te 8 × 10-6 mmol, konsantrasyon final PRE, AC, IS, ak EC yo te 6.20 ug/ml, 3.14 ug/ml, 22.92 ug/ml, ak 4.89 ug. /ml, respektivman, ki endike ke total kapasite anti-oksidatif kat echantiyon sa yo klase jan sa a: AC > EC > PRE > IS. Byoaktivite PRE a atribiye nan gwoup engredyan aktif li yo (AIG). Pou apeprè 60% nan PRE, AC ak EC te montre pi fò total aktivite anti-oksidatif pase PRE ak IS. Paske IS (1.84%) konstitye yon ti fraksyon nan PRE, lòt konpozan, tankou IS ki fèb antioksidan, yo klèman aktif nan PRE. Etonan, aktivite total antioksidatif la te diferan nan prèske 7-pliye ant AC ak izomè li yo, sa ki endike non sèlman kantite gwoup idroksil fenolik [9] men tou pozisyon gwoup idroksil fenolik nan molekil la te afekte a. efè anti-oksidatif.
Validasyon monokouch Caco-2 yo
Pou valide sistèm monokouch selil Caco-2, valè Papp propranolol (yon makè ki byen transpòte) ak jòn Lisifè (yon makè ki mal transpòte) soti nan AP rive nan BL atravè monokouch Caco-2 yo. detèmine kòm 1.51 × 10-5 cm / s ak 2.8 × 10-7 cm / s, respektivman, ak valè sa yo te dakò ak sa yo pibliye nan rapò anvan yo [17, 18]. Egzamen aktivite alkalin fosfataz la te konfime tou ke monokouch selil Caco-2 yo te kalitatif konparab ak ti epithelium entesten [19].
Pèmeyabilite AC, IS, ak EC
In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10-5 cm/s), tandiske sa yo ki nan dwòg mal absòbe yo te ba (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2 [20]. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion.
Pèmeyabilite PRE
Rezilta ki anwo yo endike ke kapasite total anti-oksidatif PRE a se omwen akòz 61.27% nan AIG ki soti nan PRE. Kidonk, nou evalye TR nan PRE ki baze sou koub konsantrasyon-efè li nan kapasite total anti-oksidatif ak kalkile 'valè Papp yo reflete karakteristik transpò PRE. Valè Papp PRE pou AP!BL ak BL!AP yo te (2.16 ± 0.26) × 1{0-7 cm/s ak (3.13 ± 0.29) × 10-7 cm/ s, respektivman, ki endike ke konpoze sa a te mal pèmeyab. Anplis de sa, ekoulman oswa transpò aktif pa t evidan paske rapò 'Papp BL a AP / 'Papp AP a BL pou PRE te 1.45 [20]. Anplis, TR a bidireksyon nan PRE ogmante lineyè ant apeprè 300 ak 900 ug / ml (figi 5). Mank preferans direksyon rezilta yo sijere ke difizyon pasif se mekanis transpò prensipal PRE.
Diskisyon
Konpare ak pwodwi dwòg trè pirifye, PE se jeneralman melanj ki konpoze de dè santèn de elektè ak pwopriyete fizyochimik lajman diferan. Se poutèt sa, PE egzèse aksyon sinèrjik sistematik, miltisib ak miltichanèl akòz konplèks AIG yo [21], ki anpeche analiz karakteristik transpò PE yo. Pou evalye pwopriyete transpò PE yo plis syantifikman, kèk chèchè te idantifye plizyè konpozan, olye ke yon sèl eleman, nan PE [22-24]. Men, yon kantite limite nan elektè pa ka reflete PE a an antye. Sepandan, detèmine tout eleman nan PE se enposib. Anplis, si divès eleman nan PE montre karakteristik transpò konplètman diferan, karakteristik transpò holistic PE yo pral difisil pou idantifye.
Nan ane 1990 yo, sistèm byoassay yo te itilize pou evalye TR nan ajan antimikwòb [25]. Rive 2005, Eguchi ak kòlèg li yo [26] te evalye aktivite anti-oksidatif ekstrè kawòt lè yo itilize medya BL ki soti nan selil Caco-2 diferansye; apwòch sa a pi apwopriye pou reflete sitiyasyon an vivo.
Baze sou yon rapò anvan sou aktivite PhGs [9] ak rezilta nou yo (Fig. 2), TR nan AIG nan PRE ka evalye lè w detèmine kapasite total anti-oksidatif mwayen an nan chanm reseptè a. Apre eksperyans transpò yo, nou te jwenn ke TR nan PRE te sanble nan toude direksyon, ak transpò sa a te enstore ak mal absòbe ('Papp < 1.0 × 10-6 cm / s) [3], ak li pa t 'endike ekoulman, sijere ke difizyon pasif desann yon gradyan konsantrasyon se mekanis prensipal transpò nan PRE (figi 5). Anplis de sa, karakteristik transpò PRE yo konsistan avèk sa yo ki nan AC, IS, ak EC, eleman efikas ki montre aktivite anti-oksidatif nan PRE (Fig. 4 ak Tablo 4). Rezilta sa a te espere epi endike ke sistèm bioassay aktyèl la apwopriye ak fyab pou evalyasyon karakteristik transpò AIG nan PRE nan selil Caco-2 diferansye.
Kontrèman ak valè Papp kanonik, ki souvan itilize pou reflete transpò yon sèl konpoze, 'valè Papp yo jwenn nan TR ki baze sou koub konsantrasyon-efè a ka pa sèlman reflete eleman ki penetre monokouch ak yon estrikti entak men. enplike tou lòt faktè ki gen rapò ak aktivite sib la, tankou metabolit konpozan yo, pwodui chimik ki degrade, e menm kèk sitokin ki sekrete nan selil Caco-2 an repons a eksitasyon ki ka afekte biyoaktivite sib la. Kidonk, multifaktè mansyone pi wo a, olye ke sèlman konpozan yo transpòte entak, detèmine 'valè Papp la. Se poutèt sa, 'Papp ka korelasyon pi fòtman ak sitiyasyon in vivo pase valè kanonik Papp [26]. Nan etid sa a, nou klarifye nati pasif difize ak mal absòbe nan PRE ki baze sou 'valè Papp li yo, ak nati sa a ka gen rapò ak dòz la wo ak peryòd tretman klinik long nan CD [27]. Men, rezilta sa yo pral bay klinisyen plis konsèy sistematik nan aplikasyon CD lè sèlman karakteristik transpò yo nan pifò AIG nan CD, pa sèlman PhGs, yo te idantifye.
NATURAL CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE EXTRACT PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Sepandan, atik la bioaktivite chwazi yo dwe ase sansib pou yo detekte nan mwayen chanm reseptè a, ki prezante yon defi nan etablisman an nan yon sistèm byoassay pou evalye karakteristik transpò PE yo. Anplis de sa, byoaktivite a ta dwe tou depann de eleman anpil ke posib. Nan etid nou an, total tès kapasite anti-oksidatif la te pi apwopriye pase plizyè lòt metòd (S1 Fig.). Men, menm si sa, tès nou an ka sèlman detekte TR nan PRE nan 120 min.
Ansanm, etid prezan an te etabli yon nouvo sistèm bioassay pou evalye pèmeyabilite entesten PRE nan selil Caco-2 diferansye yo. Rezilta yo jwenn yo te montre ke yon difizyon pasif mal absòbe desann yon gradyan konsantrasyon san eflux se mekanis transpò prensipal PRE (Fig. 5), ki bay baz famakokinetik pou aplikasyon klinik PhG nan CD. Itilizasyon yon nouvo sistèm bioessai pou evalye TR a epi kidonk kalkile 'valè Papp yo pou evalyepwopriyete transpò entestennan AIG nan PE yo se posib. Apwòch sa a kapab tou apwopriye pou lòt PE bay byoaktivite apwopriye.
