Cistanche Tubulosa pwovoke oksijèn reyaktif espès medyatè apoptoz nan selil primè ak metastaz kansè nan kolon imen

ENTWODIKSYON

Kansè kolorektal se youn nan kansè ki pi komen atravè lemond (Brenneret al., 2014), ak ensidans li yo toujou ap ogmante ak yon estime 2.4 milyon ka nan 2035, akòz rejim modèn ak fòm, ansanm ak aktivite fizik redwi. Efò aktyèl yo pa ase pou konbat epidemi aktyèl kansè kolorektal la e se poutèt sa yo bezwen nouvo apwòch pou prevansyon ak tretman efikas ki gen ladan chanjman nan fòm nan konbinezon ak entèvansyon altènatif ki pi an sekirite tankouPhytotherapeutics (Weidneret al., 2015). Fitoterapi, itilizasyon plant medsin pou trete maladi, se yon pati inevitab nan istwa imen ansyen. Plant medsin yo te itilize depi lontan kòm sous tretman altènatif pou kansè, ki reprezante plis pase swasant pousan nan ajan antikansè yo itilize nan medikaman konvansyonèl (Balunas and Kinghorn, 2005; Saibu).et al., 2015). Gen kèk nan egzanp ki pi koni yo enkli ekstrè soti nanCatharanthus roseusG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae), ak Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg and Newman, 2005; da Rochaet al., 2001). Plizyè ekstrè èrbal ak phytochemicals yo te montre fè egzèsis efè antitumoral nan kansè kolorektal atribiye a endiksyon an nan pwodiksyon espès oksijèn reyaktif (ROS) ak asosye apoptoz nan selil kansè tankou nan ka a nan ekstrè soti nan.Melissa officinalis(Weidneret al., 2015)

Pami kandida fitoterapi,Cistanche tubulosa, yon plant dezè parazit Orobanchaceae (Jiang et al., 2009) ki lajman distribiye nan rejyon arid ak semi-arid nan Lafrik di, pwovens Lazi, ak rejyon Mediterane a, yo te montre yo gen pwopriyete valab medsin. Cistanche tubulosa te itilize anpil nan medikaman tradisyonèl epi li sijere ke gen efè gerizon nan deficiency ren, leukorrhea morbid, metrorrhagia, sterilite fi, ak konstipasyon senil (Jiang et al., 2009).Anplis de itilizasyon medsin tradisyonèl li yo, enpòtan medsin. pwopriyete Cistanche Tubulosa yo te etidye entansif pandan dènye dekad la ki gen ladan vasorelaxant (Yoshikawa et al., 2006), epatoprotective (Morikawa et al, 2010), efè anti-ipèglisemi ak ipolipidemi (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa te sigjere tou kòm yon pisan amelyore sistèm iminitè a, yon pwomotè nan fòmasyon zo, ak yon ajan anti-aje ak anti-fatig (Xu et al., 2014). Anplis de sa, yo te montre ekstrè Cistanche tubulosa bloke depo amiloid nan modèl maladi alzayme a (Wu et al., 2015). Malgre plizyè itilizasyon ki ka geri li yo, efè Cistanche Tubulosa kòm yon potansyèl ajan antikansè pa te etidye ankò.

Nan travay aktyèl la, nou te envestige efè antikansè Cistanche Tubulosa sou de liy selil kansè nan kolon prensipal ak de metastatik ak mekanis potansyèl ki kache efè sa a.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMELIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERYÈL AK METÒD

Koleksyon ak preparasyon ekstrè plant

Echantiyon yo nan Cistanche tubulosa yo te kolekte nan zòn dezè yo nan Katar nan 2014 ak otantisite nan plant la te konfime pa èrbatològ la. Yo achive echantiyon bon yo nan Depatman Toksikoloji ak Multipurpose nan ADLQ. Echantiyon plant yo seche solèy yo te piye ak Retsch Knife Mill Grindomix GM300 nan yon poud amann. Ven gram poud yo te ekstrè ak 200 mL dlo ultrapur lannwit lan nan 37 degre sou yon shaker rotary nan 200 rpm. Brit laEkstrè Cistanche tubulosa (CTE)yo te santrifuje pou 30 min nan 8000 rpm nan granules konpoze ki pa idrosolubl, sipènatant yo te kolekte epi friz-seche lè l sèvi avèk yon Labconco Freezone 6 plis Freeze seche. Ekstrè sèk la te rekonstitye nan Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, SIGMA, Almay) nan yon konsantrasyon 20 mg/mL ak esteril-filtre nan yon filtè manbràn 0.2-mikwon.

Liy selilè ak antretyen selil yo

Liy selil kansè nan kolon imen CaCo2, SW620, ak LoVo yo te jwenn nan Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Almay) pandan y ap liy selil HCT 116 la te yon kado kalite nan Syans Byolojik ak Anviwònman, Depatman Katar University. CaCo2 ak HCT11 te sòti nan sit prensipal la nan kansòm kolon pandan y ap SW620 ak LoVo te sòti nan sit la metastatik. Selil SW620, HCT116, ak LoVo yo te kiltive epi konsève nan DME Medium pandan y ap selil CaCo2 yo te konsève nan Mwayen Esansyèl Minimòm Eagle (EMEM, SIGMA, Almay). Selil yo te grandi kòm monokouch kiltive nan 37 degre nan mwayen respektif complétée ak 10% serom fetis bovin (FBS, SIGMA, Almay) ak 1% penisilin / Streptomycin (SIGMA, Almay) nan yon atmosfè imidite ki gen 5% gaz kabonik.

Tès viabilite selilè

Yo te itilize tès {{0}}[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolyum (MTT) pou evalye aktivite sitotoksik CTE menm jan sa dekri pi bonè (Jaganjac et al., 2010). Dansite simen CaCo2, HCT116, SW620, ak selil LoVo ki te kiltive nan 96-plak byen yo te 104 selil pou chak pui. Selil yo te plake nan mwayen respektif complétée ak 10% FBS 24 èdtan anvan tretman an. Apre 24 èdtan, yo te retire mwayen an epi yo te trete selil yo ak 0, 0.25, 0.5, 1, ak 2 mg/mL CTE pou 24, 48, ak 72 èdtan nan 37 degre nan yon atmosfè imidite ki gen 5% CO2. Apre tretman CTE, yo te retire mwayen an epi yo te ajoute 40 µL solisyon MTT (0.5 mg/mL) nan chak pi.

Apre 3 èdtan nan enkubasyon, yo te retire solisyon MTT, pwodwi formazan fonn nan dimethylsulfoxide (DMSO, SIGMA, Almay), epi yo te mezire absorpsyon nan 590 nm ak yon lektè microplate (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Swis) .

Esè apoptoz

Apoptoz nan selil CaCo2, HCT116, SW620, ak LoVo yo te detekte lè l sèvi avèk PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I ak 7-Amino-Actinomycin D ({7-AAD) kòm yon koloran vital (Becton). Dickinson International, Bèljik) dapre enstriksyon manifakti a. Yon ti tan, selil yo te simen nan 24-plak byen nan yon dansite 5 × 1{04 selil / pi nan yon medya respektif siplemantè ak 10% FBS pou 24 èdtan anvan adisyon a nan CTE (0, 0.5). oswa 1 mg/mL). Apre enkubasyon 24 CTE, selil yo te rekòlte, lave de fwa ak saline frèt ki gen tanpon fosfat, epi tache ak Phycoerythrin (PE) Annexin V ak 7-AAD pou 15 minit nan tanperati chanm nan fè nwa a. Selil tache yo te analize nan 1 èdtan pa sikometri koule lè l sèvi avèk FACS. Sitomèt koule Aria III ak lojisyèl FACSDiva (Becton Dickinson) nan yon pousantaj koule ki ba ak yon minimòm de 104 selil. Yo te itilize tretman selil yo pou 4 èdtan ak 6 µM camptothecin (SIGMA) kòm yon kontwòl pozitif pou tès la.

Pwodiksyon entraselilè ROS

Pwodiksyon entraselilè ROS yo te egzamine lè l sèvi avèk 2,7- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA, SIGMA, Almay). DCFH-DA se yon pwofonde ki pa fliyoresan, ki soksid ak ROS intraselilè nan konpoze fliyoresan 2, 7- dichlorofluorescein (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). Yo te fè tès DCFH DA a menm jan nou te dekri anvan an (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Yon ti tan, dansite simen nan selil CaCo2, HCT116, SW620, ak LoVo ki te kiltive nan 96-plak nwa byen yo te 104 selil pou chak pi. Selil yo te plake nan mwayen respektif complétée ak 10% FBS pou 24 èdtan. Anvan selil tretman yo te enkube ak 10 µM DCFH-DA nan 37 degre pou 30 min nan 5% CO2 / 95% lè. Lè sa a, selil yo te lave ak trete ak 0, 0.5, ak 1 mg / mL nan CTE nan mwayen an san fenol wouj. Fòmasyon ROS intraselilè a te kontwole kontinyèlman pandan 25 èdtan nan 37 degre ak 5% CO2 lè l sèvi avèk yon lektè microplate ak modil fluoresans siperyè ak kontwòl gaz (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Swis). Entansite fluoresans la te mezire ak yon longèdonn eksitasyon 500 nm ak deteksyon emisyon nan 529 nm. Inite abitrè yo, inite fluoresans relatif (RFU), yo te baze dirèkteman sou entansite fluoresans.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMEYORE FONCTION REN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitokondriyo jenerasyon superoksid

Kapasite CTE pou pwovoke jenerasyon superoksid pa mitokondri yo te estime lè l sèvi avèk selil pèmeyab, mitokondri yo vize MitoSOX Red sond (Life Technologies) ak Hoechst 33342 pou tach nikleyè (Life Technologies). Selil CaCo2, HCT116, SW620, ak LoVo yo te simen nan 96-plak byen nan yon dansite 104 selil pou chak pi nan yon mwayen respektif ki te konplete ak 10% FBS pou 24 èdtan. . Lè sa a, selil yo te chaje ak 4 µM MitoSOX ak 2 µM Hoechst 33342 pou 20 min, depase koloran lave, ak pwi trete ak 0, 0.5, ak 1 mg/mL CTE pou 24 èdtan nan 37 degre ak 5% CO2. Entansite fliyoresans lan te mezire ak yon longèdonn eksitasyon 510 nm ak deteksyon emisyon nan 580 nm pou MitoSOX ak yon longèdonn eksitasyon 350 nm ak deteksyon emisyon nan 461 nm pou Hoechst 33342 lè l sèvi avèk yon lektè mikwoplak ki gen gwo fluoresans (PRO, 2000). AG, Swis)

Analiz estatistik

Estatistik deskriptif yo te montre kòm mwayen +/− SD. Yo te evalye siyifikasyon diferans ki genyen ant gwoup yo lè l sèvi avèk Tès Student ak tès Chi-kare. Lè yo te konpare plis pase de gwoup, nou te itilize yon sèl-sided ANOVA ak tès post hoc apwopriye. Yo te itilize SPSS 11.01 pou Microsoft Windows. Diferans ak P mwens pase 0.05 yo te konsidere kòm estatistik enpòtan.

REZILTA

Efè CTE sou pwopagasyon liy selil kansè nan kolon imen yo montre nan Figi 1. Tout konsantrasyon CTE yo teste yo te montre yon gwo efè inhibition sou liy selil CaCo2 nan yon konsantrasyon ak fason ki depann de tan (Figi 1A). Swasanndisèdtan tretman CTE anpeche kwasans selil CaCo2 yo pa plis pase 60% konpare ak kontwòl (p <0.05 pou tout konsantrasyon). Enpak siyifikatif nan tretman CTE sou kwasans selil HCT116 yo te detekte tou nan pwen tout tan nan de konsantrasyon ki pi wo yo (1 mg/mL ak 2 mg/mL), rive nan plis pase 70% rediksyon nan dènye konsantrasyon (Figi 1B, p <0.05). Malgre ke de pi ba konsantrasyon CTE yo (0.25 ak 0.5 mg/mL) siyifikativman redwi kwasans HCT116 nan selil apre 24 èdtan (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). Tan ak konsantrasyon-depandan anpèchman nan pwopagasyon ak CTE te konfime plis nan selil LoVo pa plis pase 60% nan pi gwo konsantrasyon (p <0.05) (Figi 1C), ak tout kat konsantrasyon CTE yo teste redwi kwasans selil SW620 apre 48 èdtan (Figi 1D, p <0.05 pou tout). Apre 72 èdtan nan tretman, yo te obsève menm efè sèlman pou de konsantrasyon ki pi wo yo (p <0.05) pandan ke 0.25 ak 0.5 mg/mL konsantrasyon pa te montre okenn efè enpòtan konpare ak kontwòl (p> 0.05). Enpak tretman CTE 0.5 ak 1 mg/mL sou endiksyon apoptoz te teste plis nan tout kat liy selil yo (Figi 2). Yo te detekte yon ogmantasyon kantite selil nan apoptoz bonè nan HCT116 ak LoVo apre tretman 24-èdtan ak 0.5 mg/mL (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Fig. 1:Efè aCistanche tubulosasou viabilite nan liy selil kansè nan kolon. Vitabilite selil yo mezire pa tès MTT nan (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo, ak (D) selil SW620 yo prezante kòm yon pousantaj nan liy selil kansè nan kolon kontwòl ki pa trete. Yo bay valè mwayen (± SD) pou 5 replike eksperyans reprezantan an: (*) siyifikasyon p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fig. 2: Ekstrè dlo Cistanche tubulosa pwovoke apoptoz nan selil kansè nan kolon imen. Annexin-V-FITC analiz sikometri koule nan (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo, ak (D) SW620 selil yo prezante kòm pousantaj nan kontwòl ki pa trete liy selil kansè nan kolon. Yo bay valè mwayen (± SD) pou 3 replike eksperyans reprezantan an: (*) siyifikasyon p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fig. 3: Ekstrè dlo Cistanche tubulosa pwovoke pwodiksyon entraselilè ROS nan yon tan- ak dòz-depandan. Pwodiksyon ROS mezire pa tès DCFH-DA nan (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo, ak (D) selil SW620 yo prezante kòm valè RFU mwayen (± SD) pou repwodiksyon respektif yo nan 5-. yon eksperyans reprezantan. (*) Siyifikasyon p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Fig. 4: Ekstrè dlo Cistanche tubulosa pwovoke pwodiksyon mitokondriyo supèroksid nan selil kansè nan kolon imen. Entansite fliyoresan nan mitokondri yo vize MitoSOX Wouj sond nan A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ak (D) selil SW620 yo prezante kòm yon pousantaj nan kontwòl selil kansè nan kolon ki pa trete. Yo bay valè mwayen (± SD) pou 5 replike eksperyans reprezantan an: (*) siyifikasyon p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DISKISYON

Malgre ke etid pi bonè yo te rapòte anpil pwopriyete medsin nan Cistanche tubulosa, sa a se premye rapò sou efè anti-proliferatif li yo nan selil malfezan. Konpoze bioaktif Cistanche tubulosa extrait ak dlo, yon sòlvan trè polè, te montre gwo byoaktivite antikansè. Nou te deja konpare efikasite nan Cistanche tubulosa solubilize nan dlo kont lòt solvang tankou metanol ak acetate etil, men ekstrè dlo ekspoze aktivite yo antikansè ki pi pwomèt (done yo pa montre).

Nou te demontre kapasite CTE nan 1 mg/mL ak 2 mg/mL pou anpeche 60% kwasans nan tou de liy selil kansè nan kolon prensipal ak metastatik, revele yon wòl potansyèlman enpòtan nanCistanche tubulosakòm yon tretman kansè nan kolon. Konpare ak selil nòmal, selil kansè yo jeneralman karakterize pa yon twoub nan omeyostazi redox ak yon estrateji komen nan terapi antikansè aktyèl se ogmante estrès oksidatif selilè (Yang et al, 2013). Malgre ke nivo fizyolojik ki ba nan ROS gen yon wòl enpòtan kòm molekil siyal, twòp pwodiksyon ROS ka kontribye nan enstabilite kansè ak maliyans (Liou and Storz, 2010). Paradoksal, move balans sa a nan omeyostazi redox selilè rann selil kansè yo pi vilnerab a lanmò selil ROS-induit (Jaganjac et al., 2008; Nogueira and Hay, 2013). Efè anti-proliferatif CTE rapòte nan etid sa a ka medyatè pa plizyè mekanis siplemantè ak entraselilè nan konpoze li te ye ak enkoni nan ekstrè a, vize plizyè chemen ki jwe wòl esansyèl nan apoptoz. Pou fè diferans ant diferan mòd lanmò selil, nou te envestige mekanis potansyèl ki responsab pou sitotoksisite CTE-induit obsève a.

CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT Anti Alzhermer's PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Done nou yo endike ke CTE ogmante pwodiksyon entraselilè ROS ak konsekans lanmò selil ROS-induit. Eta Redox nan selil la jwe tou yon wòl enpòtan nan reglemante apoptoz ak chèn transpò elèktron mitokondriyo a se youn nan pi gwo sit jenerasyon selilè ROS (Trachootham et al., 2008). Anplis de sa, ROS intraselilè a ka lakòz apoptoz selilè atravè tou de mitokondri-depandan ak endepandan chemen (Sinha et al., 2013). Vreman vre, done nou yo tou endike ke ekstènasyon fosfatidilserin CTE-induit, se yon efè komen nan apoptoz, nan tou de liy selil kansè prensipal ak metastatik, sijere ke mekanis nan lanmò CTE-induit se medyatè pa apoptoz olye ke nekwoz. Aktivasyon nan apoptoz nan selil kansè yo se yon estrateji korektif ak anpil dwòg antikansè ka egzèse efè apoptotik nan selil kansè yo.

Konpoze oswa ekstrè ak aktivite pro-apoptotik nan selil kansè yo Se poutèt sa potansyèlman itil nan rechèch dwòg antikansè (Wong, 2011). Pou detèmine si efè pro-apoptotik CTE-induit se medyatè pa mekanis ROS mitokondri-induit, nou mezire pwodiksyon supèroksid lè l sèvi avèk yon sond fliyoresan mitokondri vize nan selil CTE-trete. Done nou yo montre klèman ke CTE stimul pwodiksyon mitokondriyo supèroksid ki sijere ke aktivite antikansè Cistanche tubulosa se omwen an pati medyatè atravè mekanis ROS mitokondriyo-induit.

KONKLIZYON

An konklizyon, done nou yo sijere ke ekstrè dlo nan plant dezè Cistanche tubulosa ka reprezante yon kandida pwomèt pou yon apwòch antikansè an konbinezon ak lòt terapi konvansyonèl pou prevansyon ak tretman kansè nan kolon. Nou demontre tou ke toksisite nan ekstrè plant la kont selil kansè yo medyatè pa ogmante pwodiksyon entraselilè ROS epi, omwen an pati, pa apoptoz mitokondriyo-depandan. Plis etid yo ap kontinye izole ak karakterize elektè endividyèl yo biyolojik aktif ki responsab pou aktivite antikansè.

Gen plis rechèch ki nesesè pou evalye itilizasyon potansyèl ekstrè sa a kòm yon ajan chemopreventive efikas ak konprann mekanis aksyon sou selil kansè nan kolon nan nivo molekilè. Plis etid preklinik ak klinik yo bezwen tou pou konfime efè sante benefisye obsèveCistanche tubulosa pou prevansyon kansè.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE COFFE AMELIORE MEMORY ANTI-FATIG PHGS75% ECH 30% ACT 12%