Asidoz ekstraselilè limite metabolis yon sèl-kabòn epi konsève tij selil T

Akimilasyon nan pwodwi dechè metabolik asid nan mikro-anviwònman timè an anpeche fonksyon efè nan lenfosit ki gonfle timè (TIL). Sepandan, li rete klè ki jan yon anviwònman asid afekte metabolis selil T ak diferansyasyon. Isit la nou montre ke ekspoze pwolonje nan asid repwogram metabolis selil T entraselilè ak kapasite mitokondriyo ak prezève tij selil T. Mekanistikman, elve asidoz ekstraselilè afekte absòpsyon methionine ak metabolis atravè downregulation nan SLC7A5, kidonk chanje depozisyon H3K27me3 nan pwomotè yo nan jèn selil T kle yo. Chanjman sa yo ankouraje antretyen yon eta 'tankou memwa' ak amelyore alontèm nan pèsistans yap ogmante jiska nan vivo ak efikasite anti-timè nan sourit. Konklizyon nou yo pa sèlman revele yon kapasite inatandi nan asidoz ekstraselilè pou kenbe pwopriyete yo tankou tij nan selil T, men tou avanse konpreyansyon nou sou ki jan metabolis methionine afekte tij selil T.

cistanche plant-ogmante sistèm iminitè

Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity

【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Transfè adoptif nan timè-antijèn-espesifik selil T reprezante yon gwo avans nan jaden an nan terapi kansè, kòm li te mennen nan regresyon konplè a nan sèten maladi malfezan. Efikasite terapetik li depann anpil sou pèsistans yap ogmante jiska ak diferansyasyon selil T transfere yo1,2. Selil T memwa mwens diferansye yo se popilasyon an pi pito pou transfè selil T adoptif (ACT) akòz pwopriyete yo ki sanble ak selil souch nan renouvèlman pwòp tèt ou ak miltipotans3,4. Vreman vre, yo montre itilizasyon selil T memwa ki sanble ak tij pou ACT yo reyalize repons siperyè anti-timè5. Kòm konpare ak selil T efèktè tèminal différenciés, selil T tankou tij montre karakteristik diferan6. Tou de selil T moun ak sourit ki tankou tij yo karakterize pa ekspresyon yo nan molekil antijèn ki gen eksperyans ak ki asosye ak omaj, ki gen ladan nivo segondè nan CD62L ak CCR7 (ref. 7). Konpreyansyon nou sou pwofil transkripsyon yo, modifikasyon epijenetik, ak chemen metabolik ki kontwole selil T ki sanble ak tij yo te dramatikman avanse nan dènye ane yo8-10. Plizyè faktè transcriptional, tankou TCF1, KLF2, ak LEF1, yo te rapòte yo jwe wòl esansyèl nan kondwi oswa kenbe tij selil T9. Miyò, TCF1 se faktè kle transkripsyon ki ankouraje jenerasyon selil T memwa ki dire lontan11. Pandan enfeksyon kwonik, yon ti fraksyon nan selil T TCF1+ tij yo kenbe repons selil T kont enfeksyon segondè1,12. Chanjman epijenetik bay yon mwayen pou selil T yo tou de inisye chanjman transcriptional ki kache akizisyon de karakteristik memwa-selil epi kenbe modèl ekspresyon transcriptional sa yo13. Plizyè etid yo te demontre ke trimethylation nan histon H3 nan K4 (H3K4me3), yon modifikasyon ki asosye ak aktivasyon, te vin jwenn nan loci jèn ki asosye ak memwa, ki gen ladan TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 ak SELL, pandan diferansyasyon an nan CD nayif{{47 }} Selil T nan selil T memwa, tandiske trimetilasyon H3 nan K27 (H3K27me3), yon modifikasyon represif, pèdi nan loci13-15 sa yo. Okontrè, jèn ki asosye ak efèktè (GZMB, PRF1, IFNG, ak TBX21) demontre diminye represyon ak ogmante modifikasyon epigenetik aktive nan loci sa yo nan selil T effector13,16. Finalman, akimile liy prèv sijere ke sikui metabolik dikte desizyon sou sò selil T yo epi fòme eta epigenetik ak fonksyonèl yo17. Selil T efèktè ki dire lontan yo trè glikolitik epi yo depann de metabolis yon sèl-kabòn18,19, tandiske selil T memwa ki sanble ak tij yo montre pwofil metabolik diferan ki karakterize pa ogmante oksidasyon asid gra (FAO) ak kapasite respiratwa rezèv mitokondriyo (SRC), kadinal la. karakteristik ki enplike nan pèsistans alontèm20–22. Se poutèt sa, repwogram metabolik enpòtan pou akizisyon efikas nan stemness ak siviv alontèm nan selil T.

benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè

Mikroenvironment timè imunosuppressive (TME), karakterize pa pH ba, ipoksi, privasyon glikoz, ak anrichisman asid laktik, se baryè kle ki anpeche bon ekspansyon selil T, diferansyasyon, ak fonksyonalite23,24. Vreman vre, estrès metabolik enpoze pa TME a afekte kapasite mitokondriyo ak kapasite, deklanche ensifizans metabolik selil T intratumoral ak malfonksyònman25-28. Entrigan, pifò lenfosit ki enfiltre timè yo (TIL) pa fonksyone, men yon ti fraksyon gen memwa tankou tij oswa pwopriyete précurseur7,29. Sous-ansanm TIL ki sanble ak tij sa a prezève potansyèl proliferasyon ak pèsistans yap ogmante jiska epi li asosye ak yon repons favorab nan blokaj iminitè (ICB) ak TIL-ACT nan moun ki gen kansè11,30. Etid anvan yo te montre ke elve asidoz ekstraselilè (↑[H+]) siprime aktivite cytolytic nan selil T tou de nan vitro ak nan vivo31-33. Anplis de sa, TME asid la gen yon enfliyans konsiderab sou aktivite a ak diferansyasyon nan timè-enfiltre selil myeloid, tankou selil dendritik (DCs) ak makrofaj timè ki asosye (TAMs) 34-36. Sepandan, enpak ↑[H+] sou tij selil T ak kapasite metabolik rete lajman enkoni. Isit la, nou rapòte ke ekspoze alontèm nan vitro ↑[H+ ] fasilite diferansyasyon selil T CD8+ tij imen ak sourit sou depans pou selil T efektè CD8+ tèminal yo. Nou te jwenn ke tretman alontèm ↑[H+] remodele metabolis selil T yo epi kenbe kapasite respiratwa mitokondriyo. Anplis de sa, ekspoze ki pèsistan ↑[H+] afekte absòpsyon methionine ak metabolis, ki answit rezilta nan diminye depozisyon H3K27me3 nan jèn ki gen rapò ak memwa, kidonk fasilite antretyen nan yon estati 'tankou memwa tij'. Finalman, transfè adoptif nan selil T ki kiltive nan ↑[H+]-kondisyon yo montre aktivite anti-timè ki pisan nan vivo, an liy ak fenotip mwens fin itilize yo. Se konsa, etid nou an revele wòl inatandi nan asidoz ekstraselilè nan prezève tij selil T atravè renovasyon nan metabolis selilè ak modèl epigenetik.

Rezilta yo

↑[H+ ] ekspoze ankouraje CD8+ selil tij T

Pou detèmine si ekstraselilè ↑[H+] afekte diferansyasyon selil T ki sanble ak tij, nou te fè analiz sikometrik nan fenotip kle ki sanble ak tij sou selil T imen yo kiltive pou 12 jou nan nenpòt mwayen kontwòl, ↑[H+] medya ki gen 10 mM asid laktik. (imite konsantrasyon laktat nan sitiyasyon fizyolojik23,35) oswa mwayen asid (~pH 6.6, pa asid idroklorik) (Fig. 1a). Yon pwopòsyon ki pi wo nan selil tij CD8+ T, ki gen ladan memwa bonè (CD45RO− CD{27+ ) ak memwa santral (CD45RO+ CD{27+ ), yo te wè nan selil T ki kondisyone nan ↑ [H+] kont mwayen kontwòl (Done pwolonje Fig. 1a). Anplis de sa, nou te jwenn ke selil T yo kiltive nan ↑[H+] mwayen te gen yon pousantaj ki pi wo nan selil tij tankou (CCR7+ CD62L+) (Fig. 1b). Se pou nou remake, nou remake ekspresyon TCF1 anlèman ogmante, faktè kle ki mennen nan diferansyasyon memwa tankou tij ak santral, nan nivo pwoteyin nan selil T CD8+ imen ak sourit ki ekspoze a ↑[H+] (Fig. 1c ak Done pwolonje Fig. 1b). Anplis de sa, te gen yon [H +]-konsantrasyon-depandan efè sou ekspresyon CCR7 ak TCF1 (Done pwolonje Fig. 1c). An akò ak fenotip tij-tankou selil T ↑[H+]-kondisyone yo, pwodiksyon entèferon- (IFN-) ak faktè nekwoz timè (TNF-) te siyifikativman redwi nan selil sa yo (Fig. 1d).

Pou pi byen sonde estati diferansyasyon selil T a, nou te fè analiz RNA sekans (RNA-seq) epi nou te jwenn ke ekspoze alontèm nan vitro ↑[H+] te lakòz yon pwofil transkripsyon diferan (Done pwolonje Fig. 1d). Ekspozisyon nan ↑[H+] te mennen nan konsiderableman diminye ekspresyon jèn ki kode molekil effector, tankou PRF1, GZMB ak IFNG, ak reseptè BTLA ko-inhibitory (figi 1e, f ak done pwolonje Fig. 1e). Kontrèman, ↑[H+]-kilti selil T demontre pi wo ekspresyon nan BACH2, CCR7, LEF1 ak TCF7, ki korelasyon ak tij selil T (figi 1e, f ak done pwolonje Fig. 1e). Gene ansanm anrichisman analiz (GSEA) te montre ke modèl transkripsyon pwovoke pa ekspoze ↑[H+] te menm jan ak selil T memwa yo (figi 1g ak done pwolonje fig. 1f). Anplis de sa, analiz quantitative polymerase chèn reyaksyon (qPCR) konfime ogmante ekspresyon mRNA nan BACH2, KLF2, LEF1 ak TCF7 apre ↑ [H + ] tretman (Fig. 1h). Ansanm, obsèvasyon sa yo sipòte lefèt ke ↑[H+] tretman anpil fòme pwofil transkripsyon selil T yo pou etabli stemness. Nan nòt, nou te jwenn ke ↑[H+] tretman an anpeche pwopagasyon selil T ak dekonpoze distribisyon sik selil la nan faz G1 la epi lwen faz S la (figi siplemantè 1a-c). Apre sa, nou te egzamine deklanchman selil T sou tretman ↑[H+] pandan eksitasyon TCR epi nou te jwenn ke ↑[H+] ekspoze pa gen okenn efè enpòtan sou ekspresyon makè deklanchman selil T oswa gwosè selil (figi siplemantè 2a, b). Anplis de sa, nou konfime plis ke ↑[H+] ekspoze apre aktivasyon selil T ka toujou pwovoke yon eta tankou tij nan selil T (Siplemantè Fig. 2c-f). Konklizyon sa yo elimine posiblite pou selil T ki ekspoze a ↑[H+] yo tou senpleman refractory a eksitasyon, kontrèman ak adopte yon eta ki sanble ak tij.

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Rapò anvan yo te montre ke milye asid la egi inibit aktivite cytolytic nan selil T tou de nan vitro ak nan vivo23,31. Nou te jwenn tou ke kout tèm ↑[H+] ekspoze afekte pwodiksyon cytokines men te gen ti enpak sou fenotip nan tij ki tankou nan selil T (Done pwolonje Fig. 1g-i ak Figi Siplemantè 3a-c). Anplis de sa, efè inhibition pwodiksyon cytokine pa ↑[H+] ekspoze yo pasajè ak revèsib paske retire ↑[H+] rapidman retabli pwodiksyon cytokine pa selil T (Done pwolonje Fig. 1h). Kidonk, anpèchman nan fonksyon efè selil T pa milye asid la trè rapid, tandiske repwogram nan tij selil T mande pou pwolonje ↑[H+] ekspoze. Paske laktat prezan nan solisyon swa nan fòm undissociated li (asid laktik) oswa kòm yon sèl iyon (laktat sodyòm), nou pwochen t'ap chache detèmine si laktat sodyòm parèt efè menm jan an sou tij selil T epi li te jwenn ke laktat sodyòm tou ankouraje siyati stemness, byenke efikasite li yo te pi ba anpil pase tretman asid laktik (10 mM) (Done pwolonje Fig. 1j, k ak Fig. Siplemantè 4a-f). Konklizyon sa yo sijere tou de enpòtans ↑[H+] ak diferans li genyen nan tretman iyon laktat, nan endiksyon fenotip tij CD8+ selil T yo.

Figi 1|↑[H+] ekspoze fasilite diferansyasyon selil T CD8+ tankou tij yo. a Schema aktivasyon selil T imen nan kondisyon ki endike yo: pH 7.4 (–↑[H+], kontwòl), pH 6.6 (+↑[H+], asid idroklorik), oswa 10 mM asid laktik (+↑[H+]). PBMC yo, selil mononikleyè san periferik. b, Reprezantan pwofil ekspresyon CCR7 ak CD62L nan selil T imen CD8+ nan diferan kondisyon nan jou 12. n=3 echantiyon endepandan. c, Istogram reprezantatif ak quantifikasyon ekspresyon TCF1 nan selil T imen CD8+ nan diferan kondisyon nan jou 12. n=3 echantiyon endepandan. MFI, vle di entansite fluoresans. d, Selil T imen yo te elaji tankou nan yon pou 12 jou ak ankouraje ak phorbol 12-myristate 13- acetate (PMA) ki gen brefeldin A (BFA) pou 4.5 èdtan. Pwofil ekspresyon entraselilè IFN- ak TNF- reprezante pou selil T nan kondisyon pH 7.4 (agòch), 10 mM asid laktik (midwayen), oswa pH 6.6 (adwat). n=3 echantiyon endepandan. e, f, RNA-seq analiz de selil T imen ki te elaji nan kontwòl (pH 7.4) oswa asid laktik (10 mM). Kat jeyografik chalè nan jèn chwazi (e) ak trase vòlkan nan tout jèn kote jèn ki asosye ak memwa, efèktè, ak selil T ki fin itilize yo te make (f). Nan trase vòlkan an, aks x la reprezante valè chanjman pliye transfòme yo (FC) pou selil trete ak asid laktik parapò ak kontwòl nan jou 12, ak aks y reprezante valè P ajiste yo. n=4 echantiyon endepandan. g, GSEA trase konpare kontwòl ak asid laktik selil T kondisyone pou efèktè kont anrichisman memwa. NES, nòmalize nòt anrichisman. h, Ekspresyon mRNA quantitative nan faktè transkripsyon ki asosye ak tij selil T (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) nan selil T anba kondisyon ki endike yo. n=3 echantiyon endepandan. Done yo prezante kòm mwayen ± sem Analiz estatistik yo te detèmine pa tès t Elèv ki pa pè de ke (b–d,h). Valè P nominal yo ak pousantaj dekouvèt fo (FDR) yo te kalkile ak metòd defo lojisyèl GSEA (g).

Olè [H+] deklanche repwogram metabolik

Pi lwen pase pwogram transkripsyon diferan yo, selil T ki sanble ak tij yo genyen tou preferans atribi metabolik inik, ki gen ladan FAO ki wo ak metabolis glikolitik restriksyon17,20,37. Pou eksplore karakteristik metabolik nan selil T alontèm nan vitro ↑[H+]-ekspoze, nou te fè analiz anrichisman Gene Ontology (GO) epi nou te jwenn diferans enpòtan nan ekspresyon jèn ki gen rapò ak wout metabolik, tankou metabolis ti molekil ak glikoliz (figi 2a). Vreman vre, alontèm ↑[H+]-kondisyone selil T ekspoze glikoliz redwi ak metabolis asid amine kontrèman ak ogmante metabolis asid gra chèn long (Done pwolonje Fig. 2a, b). Kontrèman ak alontèm ↑[H+] ekspoze, kout tèm ↑[H+] tretman inibit sèlman glikoliz, men pa te gen okenn efè enpòtan sou FAO (Siplemantè Fig. 5a). Analiz PCR quantitative plis konfime ke jèn yo glikoliz SLC2A1, SLC2A3 ak LDHA te siyifikativman diminye nan ↑ [H + ]-ekspoze selil T (Done pwolonje Fig. 2c). Kontrèman, ↑[H+] kondisyone ankouraje ekspresyon de carnitine palmitoyltransferase 1 (kode pa CPT1A), yon anzim limite pousantaj ki enplike nan FAO (Done pwolonje Fig. 2c). Pou plis elicide alterasyon metabolik yo pwovoke pa ↑[H+], nou te fè yon analiz metabolomik san patipri epi nou te jwenn 285 entèmedyè distenk nan selil T kiltive ak ↑[H+] kont kontwòl (Done pwolonje Fig. 2d). An patikilye, ekspoze a ↑[H+] siyifikativman diminye entèmedyè glikolitik yo ak sèten asid amine esansyèl olye pou yo ogmante plizyè espès karnitin, fòm aktive asid gra ki transfere nan mitokondri pou oksidasyon (Done pwolonje Fig. 2e-g). Analiz flux metabolik lè l sèvi avèk [13C6]glikoz oswa [13C16]palmitat te demontre ke ↑[H+] ekspoze drastikman anpeche [13C6]glikoz enkòporasyon nan entèmedyè TCA ak asid laktik pandan y ap ankouraje [13C16]palmitat enkòporasyon nan asetil-CoA ak sitrat, sipòte nosyon an. ke asidoz ekstraselilè siprime glikoliz ak amelyore FAO nan selil T (figi 2b-e). Selil T ↑[H+]-kondisyone sa yo te montre limit ki gen rapò ak absòpsyon eleman nitritif yo, jan sa montre pa konsomasyon [13C6] glikoz ak absòpsyon analogue lipid yo (BODIPY FL C16), yon rezilta ki ka rive akòz yon ogmantasyon gradyan elektwochimik. (Done pwolonje Fig. 2h, i).

Limite absorption eleman nitritif la ak switch metabolis selilè ka mennen nan chanjman rezo siyal yo nan selil T yo. Analiz anrichisman GO nan selil T trete ak asid laktik revele ke pi fò nan jèn ki afekte yo prensipalman enplike nan siyal PI3K-AKT, mTOR ak TCR (Done pwolonje Fig. 3a). Siyal mTOR jwe yon wòl santral nan entegre siyal iminitè ak siyal metabolik pou deklanchman apwopriye selil T yo, epi anpèchman siyal mTOR fè selil yo nan direksyon fòmasyon selil T memwa CD8+ olye pou yo diferansye efèktè38–40. Analiz GSEA nou an te endike ke aktivite tou de AKT-mTOR ak NF-кB siyal nan ↑[H+]-kondisyone selil T yo te redwi konpare ak sa ki nan selil T kontwòl (Figi 2f ak Done Pwolonje Figi 3b). Sa a te konfime plis pa fosforilasyon an diminye nan S6 (nan Ser235 ak Ser236), 4EBP1 (nan Thr37 ak Thr46), AKT (nan Ser473) ak NF-кB (nan Ser536) nan ↑ [H + ]-kondisyone selil T (Fig. 2g,h ak done pwolonje Fig. 3c). Yo konnen mTOR se yon regilatè enpòtan nan divès pwosesis byolojik, ki gen ladan gwosè selil, jenerasyon enèji ak sentèz pwoteyin41. Vreman vre, nou te jwenn ke gwosè selil ↑[H+]-kondisyone selil T yo te redwi an konparezon ak selil T kontwòl yo (Done pwolonje Fig. 3d). Apre sa, nou te evalye sentèz pwoteyin depandan bioenèji nan selil T ↑[H+]-kondisyone lè l sèvi avèk SCENITH, yon metòd ki fèk devlope ki sèvi ak enkòporasyon puromicin kòm yon lekti nivo sentèz pwoteyin42. Kòm espere, ↑[H+] ekspoze siprime sentèz pwoteyin entansif enèji (Fig. 2i), sijere ke metabolis enèji nan CD8+ selil T yo te chanje. Rezilta sa yo konsistan avèk rezilta anvan yo ki anpèchman aktivite mTOR pa rapamicin ogmante ekspresyon faktè transcriptional ki asosye avèk stemness (Done pwolonje Fig. 3e, f). Lè nou pran rezilta nou yo ansanm, nou konkli ke ekspoze alontèm ↑[H+] òkestre yon switch metabolik ak siprime aktivite mTOR, kidonk fasilite akizisyon ak antretyen nan tij selil T.

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

↑[H+]-medyatè restriksyon nan metabolis methionine prezève tij epigenetik

Liy akimile prèv sijere ke metabolis yon sèl-kabòn dikte desizyon sou sò selil T ak fòm eta fonksyonèl yo43,44. Analiz RNA-seq nou an te montre move anrichisman pou pwosesis metabolik yon sèl-kabòn ak siyati sik methionine nan selil T ki ekspoze a tretman alontèm, olye ke kout tèm, ↑[H+] (Fig. 3a, Done Pwolonje Fig. 4a, ak Figi Siplemantè 5b). An konsekans, ekspoze ↑[H+] anpeche ekspresyon jèn ki kode anzim ki gen rapò ak sik methionine (MTR, AHCY ak BHMT) osi byen ke metabolis folat (SHMT1 ak SHMT2) (Done pwolonje Fig. 4b). Pli lwen analiz metabolomik te revele ke selil T kiltive nan asid laktik te montre yon diminisyon ki make nan metabolit entraselilè ki enplike nan sik la methionine, ki gen ladan methionine, S-adenosylmethionine (SAM) ak S-adenosylhomocysteine ​​(SAH), men nivo ogmante nan serin ak omosistein (pwolonje). Done Fig. 4c). [13C5] methionine trase plis konfime ke absorption ak abondans entraselilè methionine, 13C ki make entraselilè SAM (m+5), SAH (m{+4) ak 5′-methyl-thioadenosine (MTA, m). +1) yo te siyifikativman redwi nan ↑[H+]-ekspoze selil T (figi 3b-d ak done pwolonje Fig. 4d). Nòt, sipleman methionine ekzojèn te retabli absorption ak abondans entraselilè [13C5] methionine ansanm ak entèmedyè ki enpòtan nan selil T ↑[H+]-ekspoze (figi 3c,d ak done pwolonje fig. 4d), sijere ke methionine ekzojèn. sipleman te kapab retabli absorption methionine ak metabolis nan ↑[H+]-ekspoze selil T. Nou pwochen te envestige si restriksyon methionine ka kondwi tij selil T. Nou te jwenn ke privasyon methionine tout bon ankouraje endiksyon TCF1+ CD{8+ T selil popilasyon an men pa te gen okenn efè sou ekspresyon CD62L ak CD44 (Done Pwolonje Fig. 4e, f). Pou plis etidye wòl metabolis methionine nan tij selil T ↑[H+]-induit, nou kiltive selil T ak ↑[H+] mwayen ki konplete ak methionine, SAM, oswa SAH. Fenotip nan tij selil T ki te pwovoke pa asidoz ekstraselilè te tout bon pasyèlman entèdi pa sipleman ak methionine oswa SAM, men se pa SAH (Fig. 3e ak Done Pwolonje Fig. 4g-i). Entraselilè methionine konvèti nan SAM, yon donatè methyl-gwoup enpòtan pou reyaksyon ADN ak histon methylation (Done pwolonje Fig. 5a). Kidonk, nou karakterize modèl methylation histon epi nou jwenn ke elve [H +] redwi anpil nivo H3K27me3 total nan selil T, men pa t 'gen yon efè enpòtan sou ekspresyon lòt makè methylation histon (Fig. 3f ak Done Pwolonje Fig. 5b). Kòm espere, sipleman methionine nan selil T anba ↑[H+] ekspoze retabli nivo total ekspresyon H3K27me3 (Fig. 3f). Rediksyon espesifik nan nivo H3K27me3 yo obsève nan selil T ki te sibi tretman alontèm↑[H+] te pouse nou ipotèz ke ↑[H+] ekspoze oaza kontwole methyltransferase espesifik pou depo H3K27me3. Vreman vre, nou obsève ekspresyon siyifikativman redwi nan EZH2, yon methyltransferase kle pou H3K27me3, tou de nan nivo mRNA ak pwoteyin nan ↑ [H + ]-ekspoze selil T (Done pwolonje Fig. 5c, d). Anplis de sa, anpèchman aktivite EZH2 pa yon inibitè trè espesifik, GSK126, ogmante ekspresyon TCF1, osi byen ke pousantaj CCR 7+ CD62L + CD{8+ T selil (Done pwolonje Fig. 5e, f) , ki te nan liy ak yon rapò anvan ke EZH2 te kapab kontwole potansyèl selil memwa-T atravè modifikasyon epigenetik selektif45. Pou idantifye chanjman nan tout genòm nan modèl epigenetik nan tij selil T ↑[H+]-induit, nou te fè tès CUT&Tag-seq la epi nou te jwenn chanjman minimòm nan pwopòsyonèl depozisyon H3K4me3 ak H3K27me3 nan mitan diferan gwoup trete ansanm pwomotè a, kò jèn ak rejyon entèrjenik (Done pwolonje Fig. 5g). Espesyalman, profil epigenomik revele yon nivo diminye nan makè histon represif H3K27me3 nan loci jèn ki asosye ak memwa (pa egzanp, TCF7, CCR7, ID3, LEF1 ak KLF2) nan selil T trete alontèm ↑[H+] (Fig. 3g) . Sa ki enpòtan, adisyon a nan methionine anba ↑[H+] ekspoze pasyèlman retabli nivo H3K27me3 nan loci ki anwo yo, osi byen ke ekspresyon jèn yo, sijere yon wòl enpòtan pou methionine nan modulation epigenetik jèn sa yo ki asosye ak memwa (Fig. 3g ak Done pwolonje Fig. 5h). Konfòm ak yon etid anvan14, jèn efèktè tankou PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 ak NR4A2 akeri favorab yon modèl histon-methylation aktive (H3K4me3hi ak H3K27me3lo) (Fig. 3g). Nan nòt, lokatè yo nan H3K4me3 nan rejyon pwomotè nan jèn efèktè sa yo te andikape nan selil T kiltive anba ↑ [H + ] ekspoze epi yo te retabli pa sipleman methionine (Fig. 3g). An jeneral, rezilta sa yo endike ke ↑[H+]-medyatè dezòd nan sik la methionine ankouraje prezèvasyon epigenetik nan tij selil T.

Plizyè transpòtè methionine (SLC), ki gen ladan SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2, ak SLC43A2, ka medyatè transpò methionine46. Pou mennen ankèt sou fason ↑[H+] ekspoze diminye absorption methionine ak metabolis nan selil T, nou analize modèl ekspresyon SLCs diferan epi nou te jwenn ke ↑[H+] te diminye dramatikman ekspresyon SLC7A5 ak SLC38A2, men li te gen ti enfliyans sou ekspresyon SLC38A1 (pwolonje). Done Fig. 6a, b). Anplis de sa, ↑[H+] ekspoze redwi ekspresyon ak aktivite MYC (Done pwolonje Fig. 6c, d), ki te rapòte kontwole ekspresyon transpò methionine tankou SLC7A5 (ref. 47). Nou plis demontre yon gwo lokatè nan MYC sou pwomotè a SLC7A5 ak nan yon limit pi piti sou pwomotè a SLC38A2 (Done pwolonje Fig. 6e). Sa ki enpòtan, siyifikativman redwi MYC obligatwa nan loci sa yo te obsève nan alontèm ↑ [H + ]-trete selil T (Done pwolonje Fig. 6e). Konfòm ak obsèvasyon sa yo, twòp ekspresyon nan MYC remakab retabli ekspresyon SLC7A5 ak SLC38A2 nan selil T ↑[H+]-ekspoze (Done pwolonje Fig. 6f). Rezilta sa yo sipòte wòl enpòtan MYC nan ekspresyon redwi transpò methionine lè ekspoze ↑[H+]. Enteresan, nou te jwenn ke sipleman an nan methionine kapab tou retabli ekspresyon nan MYC ak SLC7A5 nan ↑[H+]-ekspoze selil T (Done pwolonje Fig. 6g), sijere ke sipleman methionine ta ka retabli kapasite nan absòpsyon methionine nan selil T pa upregulating methionine transpòtè SLC7A5 ekspresyon nan yon fason ki depann de MYC. Yon etid anvan te montre ke SLC7A5 se transpòtè methionine ki pi abondan nan selil T aktive47. Sa a, ansanm ak rezilta anvan nou yo, sijere ke SLC7A5 ta ka jwe yon wòl enpòtan nan ↑[H+]-induit restriksyon methionine ak antretyen nan yon eta tankou tij. Vreman vre, nou te jwenn ke twòp ekspresyon nan SLC7A5 pasyèlman andikape fenotip ↑[H+]-pwovoke tij-tankou (Done pwolonje Fig. 6h, i), plis sipòte patisipasyon transpòtè methionine SLC7A5 la nan memwa selil T ↑[H+]-induit. -tankou fenotip. Lè nou analize diferan subpopulasyon selil CD8+ T ki enfiltre timè yo, nou te jwenn ekspresyon redwi tou de MYC ak SLC7A5 nan TIL ki sanble ak CD8+ memwa (Done pwolonje Fig. 7a,b), ki nan liy. ak rezilta in vitro nou yo. Kidonk, rezilta sa yo sijere ke aks MYC-SLC7A5-methionine ta ka potansyèlman kontribye nan prezève estati memwa-tankou TIL yo.

Figi 2|↑[H+] ekspoze deklannche repwogram metabolik ak siprime siyal mTOR. a, GO analiz lè l sèvi avèk RNA-seq done, ki montre reprezantan diferan eksprime jèn metabolik nan kontwòl ak asid laktik-kondisyone selil T imen (ajiste valè P <4.23 × 10-2). b, Chema nan modèl etikèt [13C6] glikoz oswa [13C16] palmitate. c, Pousantaj m+3 laktat ki endike nan total laktat oswa m+3 piruvat nan total piruvat nan selil T yo. n=3 echantiyon endepandan. d, Pousantaj izotopomè pou entèmedyè TCA yo, tankou sitrat (m+2), malat (m+2), ak succinate (m+2), ki sòti nan [13C6] glikoz. n=3 echantiyon endepandan. e, Pousantaj m+2 asetil-CoA endike nan total asetil-CoA oswa nan izotòp m+2 sitrat soti nan total sitrat nan selil T ki soti nan [13C16] palmitate. n=4 echantiyon endepandan. f, GSEA ak analiz estatistik sou seri jèn ki asosye ak siyal mTORC1 nan kontwòl kont asid laktik-kondisyone (gòch) oswa pH 6.6-kondisyone (adwat) selil T imen. g,h, Flow cytometric analiz ak quantification pou S6 fosforilasyon nan Ser235 ak Ser236 (g) ak 4EBP1 fosforilasyon nan Thr37 ak Thr46 (h) nan selil T imen CD8+ nan kondisyon ki endike yo. n=3 echantiyon endepandan. I, Flow cytometric analysis and quantification of enèji-entansif sentèz pwoteyin nan kontwòl oswa asid laktik-oswa pH 6.6-kondisyone selil T imen. n=3 echantiyon endepandan. Done yo prezante kòm mwayèn ± sem Analiz estatistik yo te detèmine pa yon sèl-bò tès egzak Fisher ak tès Benjamini-Hochberg pou konparezon miltip (a) oswa tès t-de-tailed Student's t-tès (c-e,g-i). Valè P nominal yo ak FDR yo te kalkile ak metòd default nan lojisyèl GSEA (f).

Figi 3|Ogmantasyon [H+] chanje metabolis methionine selil T pou konsève tij epigenetik. yon trase GSEA nan seri jèn ki asosye ak metabolis yon sèl-kabòn ak metabolis sistein ak methionine nan kontwòl kont asid laktik-kondisyone selil T imen. b, Chema nan modèl etikèt [13C5] methionine. c, Pousantaj SAM intraselilè (m+5), SAH (m+4), ak MTA (m+1) ​​ki sòti nan [13C5] methionine, nan pisin total respektif yo, nan Selil T yo kiltive nan kondisyon kontwòl oswa ak 10 mM asid laktik oswa 10 mM asid laktik konplete ak methionine (10 mM + Met). n=3 echantiyon endepandan. d, Abondans relatif [12C5] methionine ak [13C5] methionine nan selil T yo. e, Istogram reprezantatif ak quantifikasyon TCF1 nan selil T imen CD8+ kiltive nan divès kondisyon. n=3 echantiyon endepandan. f, Efè sipleman methionine sou methylation histon nan selil T imen. H3K4me3, histon H3 trimethylated nan K4; H3K79me2, H3 dimethylated nan K79; H3K27me3, H3 trimethylated nan K27; H3K9me2, H3 dimethylated nan K9. n=3 echantiyon endepandan. g, View tras jenom nan loci jèn reprezantan ki montre H3K27me3 (wouj, anwo liy lan) oswa H3K4me3 (ble, anba liy lan) pik. Done CUT & Tag-seq yo soti nan de echantiyon endepandan. Done yo prezante kòm mwayen ± sem Valè nominal P ak FDR yo te kalkile ak metòd defo lojisyèl GSEA (a). Analiz estatistik yo te fè lè l sèvi avèk analiz de divèjans (ANOVA) ak tès konparezon miltip Tukey a (c–f).

Ekspozisyon nan ↑[H+] kenbe kondisyon fizik mitokondriyo 

Bay sentèz pwoteyin redwi enèji-entansif nan ↑[H+]-kondisyone selil T, nou te ipotèz ke ekspoze alontèm nan ↑[H+] ta ka lakòz chanjman konsiderab nan metabolis enèji selilè. Tou de kontwòl ak ↑[H+]-kondisyone selil T yo te analize lè l sèvi avèk SCENITH42 yo nan lòd yo kalkile depandans glikoz, depandans mitokondriyo, kapasite glikolitik, ak FAO ak kapasite oksidasyon asid amine (Fig. 4a ak Done pwolonje Fig. 8a). Dapre metabolomik nou yo ak rezilta trase izotòp nou yo, nou te obsève ogmante metabolis mitokondriyo nan selil T ↑[H+]-ekspoze, alòske pousantaj glikoliz yo te redwi (figi 4b,c ak done pwolonje fig. 8b), ki endike yon repwogram entraselilè. metabolis enèjik nan ↑[H+]-kondisyone selil T. Analiz Seahorse revele plis ke ↑[H+]-kondisyone selil T yo te montre yon pi gwo pousantaj konsomasyon oksijèn (OCR) osi byen ke SRC, yon karakteristik kadinal nan selil T CD8+ memwa ki dire lontan22 ak yon pi ba pousantaj asidifikasyon ekstraselilè ( ECAR) (Fig. 4d–h ak Done Pwolonje Fig. 8c–f). Kòm ogmante mas / fizyon mitokondriyo ak diminye potansyèl manbràn mitokondriyo (Δψm) enpòtan pou antretyen nan tij selil T48-50, nou plis egzamine kantite ak bon jan kalite mitokondri nan selil T ↑[H+]-kondisyone epi nou jwenn ke ↑[H+. ] tretman amelyore mas mitokondriyo nan tou de selil T imen ak sourit (Fig. 4i, j ak Pwolonje Done Fig. 8g, h), ki tou kenbe yon pi ba Δψm (Fig. 4k ak Done Pwolonje Fig. 8i). Analiz ultrastructure pa mikwoskòp elèktron (EM) te revele ke ↑[H+]-ekspoze selil T yo te gen gwo mitokondri ki chaje anpil dispèse nan sitoplasm la epi yo te gen anpil kristae sere, etwat konpare ak selil T kontwòl yo, ki an liy ak rezilta pibliye ki gen rapò. nan mòfoloji mitokondri nan selil T memwa (figi 4l, m). Konfòm ak konklizyon sa a, nou te tou obsève ogmante ekspresyon jèn plizyè regilatè kritik nan fizyon mitokondriyo nan ↑ [H + ]-kondisyone selil T (Done pwolonje Fig. 8j), ki te sijere yo jwe yon wòl nesesè pou jenerasyon selil T memwa50. Ansanm, rezilta sa yo endike ke ↑[H+] ekspoze amelyore mas/fizyon mitokondriyo ak kapasite pou ankouraje fòmasyon selil T ki sanble ak tij yo.

cistanche plant-ogmante sistèm iminitè

↑[H+] ekspoze amelyore aktivite anti-timè selil T CD8+ 

Selil T ki sanble ak tij yo favorize engraftment, ekspansyon, ak efikasite anti-timè nan imunoterapi adoptif51. Pou envestige si alontèm nan vitro ↑[H+ ]-konsève CD8+ selil T yo montre ekspansyon oswa pèsistans ogmante lè yo transfere, CD45.1+ OT-I selil T ki te elaji nan kontwòl oswa ↑[ Mwayen H+ ]-kondisyone yo te transfere adoptif nan CD45.2+C57BL/6N sourit ki pa gen okenn timè implanté (figi 5a). Malgre ke yon ti kras ogmante kantite selil apoptotik yo te detekte sou kondisyone ↑[H+] (Done pwolonje Fig. 9a), te gen yon pousantaj siyifikativman pi wo nan selil T nan san periferik sourit yo transfere ak selil T elaji nan kondisyon ↑[H+] an konparezon ak sa yo elaji nan mwayen kontwòl (selil T kontwòl) (figi 5b). Menm jan an tou, siyifikativman pi wo frekans nan selil T nan larat ak nœuds lenfatik yo (LNs) yo te detekte (Done pwolonje Fig. 9b, c). Anplis de sa, nou te jwenn siyifikativman ogmante akimilasyon selil T nan timè, larat ak nœuds lenfatik drenaj nan B16-OVA sourit ki gen timè kote ↑[H+]-elaji selil yo te transfere adoptif an konparezon ak sa ki nan sourit ki te resevwa selil kontwòl, sigjere ke CD 8+ selil T kenbe nan ↑ [H + ] te amelyore pèsistans (Fig. 5c-e ak Done Pwolonje Fig. 9d). Nan liy ak rezilta sa yo, pousantaj selil T memwa yo te ogmante siyifikativman nan larat yo ak LN nan sourit ki te resevwa ↑[H+]-kondisyone selil T (figi 5f ak done pwolonje Figi 9e). Miyò, ↑[H+]-elaji OT-I selil T ekspoze siyifikativman reta kwasans timè konpare ak selil T kontwòl (figi 5g). Apre sa, nou te envestige efikasite terapetik selil T ↑[H+]-agrandi CD19 chimeric-antigen-receptor-modified (CAR) ak yon modèl timè in vivo kote selil timè CD19-K562 yo te enjekte anba lar nan flan yo. NCG sourit (figi 5h). Nou te jwenn ke ↑[H+] ekspoze tou ankouraje tij selil CAR-T men pa te gen okenn efè sou apoptoz (Done pwolonje Fig. 9f), jan sa evidans pousantaj yo siyifikativman ogmante nan CCR7+ CD62L+ tankou tij CAR-T. selil kòm byen ke ekspresyon an upregulated nan TCF1 (Done pwolonje Fig. 9g, h). Anplis de sa, te gen yon pi gwo pousantaj nan akimilasyon selil CAR-T nan sit timè ak larat nan sourit NCG apre perfusion ak ↑ [H + ]-kondisyone selil T (Fig. 5i). Jan nou espere, sourit NCG ki te transfere adoptif ak selil CAR-T ki te elaji nan ↑[H+] te montre yon pi gwo clearance nan timè CD19+ enplante an konparezon ak sa yo ki te resevwa selil CAR-T ki te elaji. nan mwayen kontwòl (figi 5j). Ansanm, done sa yo demontre ke ↑[H+] tretman ankouraje pèsistans yap ogmante jiska nan vivo ak aktivite anti-timè nan selil T yo.

Ekspozisyon nan ↑[H+] limite fatig selil T

Pou plis eksplore efè ki pèsistan ↑[H+] ekspoze sou fatig selil T an vitro, nou mezire ekspresyon LAG-3 ak TIM-3 nan selil T imen ↑[H+]-prime ki te sibi plizyè tou. plis eksitasyon ak antikò anti-CD3 epi yo te kondisyone nan mwayen kontwòl (figi 6a). Nou te jwenn tou de ekspresyon LAG-3 ak TIM-3 te redwi nan ↑[H+]-ekspoze selil T (figi 6b ak done pwolonje fig. 10a), ki endike ke ↑[H+] rezilta tretman an redwi. fatig selil T. Anplis de sa, nou te jwenn ke yon gwo konsantrasyon nan methionine mennen nan yon ogmantasyon nan ekspresyon de makè inhibiteur, tankou PD-1, LAG-3, ak TIM-3, tandiske tretman ak yon ba. konsantrasyon methionine yon ti kras diminye ekspresyon makè sa yo (figi siplemantè 6a-c). Miyò, lè yo te ekspoze nan vitro ↑[H+] alontèm, frekans TIM-3+ LAG{-3+ enfiltre selil OT-I T ak selil CD19-CAR T nan timè yo te lajman. redwi apre transfè adoptif (Fig. 6c-e ak Pwolonje Done Fig. 10b), ki se ki konsistan avèk pi ba fatig yo nan vitro ak amelyore kapasite kontwòl timè nan vivo. Anplis de sa, nou demontre ke alontèm ↑[H+]-kondisyone selil T yo te montre siyifikativman redwi ekspresyon TOX tou de nan vitro ak nan vivo (figi 6f, g ak done pwolonje Fig. 10c, d). Jan sa te dekri deja, selil T ki fin itilize yo ka jeneralman divize an yon sou-ansanm ki fin itilize oswa ki fini, jan yo detèmine pa ekspresyon TCF1 ak TIM-352,53. Kòm sa yo, nou te mezire modèl ekspresyon TCF1 ak TIM-3 nan CD45.1+ TIL yo epi nou remake ke frekans TCF1− TIM-3+ selil T ki te fin itilize tèminal yo te redwi anpil, ak yon siyifikativman ogmante pousantaj nan TCF1+ TIM-3-ansyen selil T anba kondisyone ↑[H+] (Fig. 6h). Anplis de sa, nou te demontre yon ogmantasyon LY108+ TIM{-3– popilasyon selil T zansèt (Done pwolonje Fig. 10e) ansanm ak yon ogmantasyon frekans IFN- + TNF{- + T. selil (Done Pwolonje Fig. 10f), plis sipòte lefèt ke alontèm in vitro ↑[H+ ]-agrandi adoptif transfere selil T limite fatig ak prezève stemness.

Diskisyon

ACT espesifik timè se yon apwòch pwomèt pou trete moun ki gen timè refractory, men efè terapetik yo lajman limite pa malfonksyònman selil T nan TME la. Dènyèman, yo te peye yon atansyon konsiderab nan pre-kondisyone selil T ak grangou glikoz pasajè, restriksyon glutamin, oswa potasyòm ekstraselilè ki wo (↑[K+]) pandan kilti in vitro pou konsève tij selil T ak amelyore rezilta terapetik54-56. Nan etid sa a, nou te demontre ke kiltivasyon CD8+ selil T anba nivo segondè [H+] pandan priming te ankouraje akizisyon de tij selil T ak ogmante rezistans nan fatig selil T, anpil amelyore efè anti-timè nan adoptivman transfere selil T.

Twòp akimilasyon asid laktik nan TME a te konsidere depi lontan kòm yon faktè kle nan chape iminitè timè. Pou egzanp, asid laktik ak TME asid yo te siprime aktivite CD{{0}} selil T cytolytic ak pwodiksyon cytokine31–33,57. Nan liy ak rezilta sa yo, nou menm tou nou te jwenn ke ekspoze kout tèm nan ↑[H+] nan vitro te ase yo pwofondman anpeche pwodiksyon cytokine effector men pa te gen okenn efè sou ekspresyon TCF1 oswa karakteristik metabolik stemness ki asosye. Men, tretman alontèm ↑[H+] te ankouraje ekspresyon TCF1 san atann epi li te kenbe fenotip selil T tij yo atravè repwogram metabolik ak renovasyon epigenetik. Ekspozisyon selil T yo nan ↑[H+] apre deklanchman konplè yo kapab tou pwovoke yon fenotip tij-tankou, kidonk eskli posibilite pou selil T ki ekspoze a pH ba yo te tou senpleman vin refractory a eksitasyon, olye ke yo te adopte yon eta tankou tij. Konsantrasyon asid laktik fizyolojik nan san moun ki an sante se alantou 1.5-3.0 mm, men li ka monte a 10 mm a 40 mm nan TME35,58 la. Sèvi ak yon modèl eksitasyon ki pèsistan anti-CD3/CD28, Feng et al. dènyèman te rapòte ke yon gwo konsantrasyon nan laktat sodyòm ogmante nivo H3K27ac nan TCF7 super-enhancer locus la nan anpèchman nan aktivite histon deacetylase, ki mennen nan ogmante ekspresyon TCF1 ak pwomosyon nan CD 8+ T selil tij59. Kontrèman, nou te jwenn ke ekspoze alontèm nan yon konsantrasyon relativman ba nan asid laktik (10 mM), men pa laktat sodyòm, ka fasilman deklanche yon siyati tij-tankou nan selil T atravè restriksyon nan metabolis methionine ak règleman an nan H3K27me3. depozisyon nan loci jèn ki asosye ak stemness, ki klèman sipòte règleman epigenetik diferan pa laktat sodyòm ak asid laktik. Sepandan, tretman ki ba-asidite (pH 6.9) pa gen yon enpak siyifikatif sou ekspresyon TCF1 anba eksitasyon ki pèsistan anti-CD3/CD28, ki sijere ke siyati ki sanble ak tij CD8+ selil T pwovoke pa ↑[H+] eksitasyon TCR ka depase ekspoze a. Aktivasyon TCR ka amelyore absòpsyon methionine ak repwogram metabolis methionine pou ede aktivasyon selil T19,60. Nou te espekile ke eksitasyon TCR ka ranfòse absorption nan methionine nan ↑[H+]-trete selil T, ki te gen restriksyon metabolis methionine, kidonk twoublan ↑[H+]-induit tij epigenetik. Anplis de sa, selil T yo ka itilize iyon laktat kòm yon sous kabòn ekstraselilè pou fasilite akizisyon de stemness nan prezans oswa absans eksitasyon TCR ki pèsistan. Aktivite metabolik asosye byen ak diferansyasyon selil T, ak sèten entèvansyon metabolik ka anpil ankouraje fòmasyon selil T memwa ki dire lontan21,37,61,62. An konsekans, metabolomik nou yo ak analiz izotòp-trase sipòte nosyon ke ekspoze alontèm ↑[H+] mennen nan repwogram metabolik frape, tankou redwi absorption nan glikoz ak diminye glikoliz ak metabolis sik TCA. Plizyè etid yo montre ke selil memwa CD8+ T yo itilize FAO pou satisfè bezwen enèji yo, byenke sa a gen anpil chans yon adaptasyon pou diferansyasyon liyaj memwa a, ak twòp ekspresyon nan Cpt1 ankouraje lonjevite selil T21,22,63,64. Sepandan, nan modèl yo nan sipresyon jenetik espesifik selil T nan Cpt1a, Raud et al. dènyèman te demontre ke LC-FAO se lajman dispansab pou aktivasyon selil T ak fòmasyon nan CD8+ selil T memwa65. Li rete yon defi pou eksplike yon diferans konsa. Nan kontèks etid nou an, nou espekile ke repwogram nan metabolis asid gra kondwi pa asidoz ekstraselilè gen anpil chans ki asosye ak jenerasyon selil T memwa, byenke mekanis egzak ki kache ipotèz sa a mande plis envestigasyon. Anplis de sa, nou te jwenn ke ↑[H+] ekspoze inibit aktivite mTOR, ki ka pwovoke pa anpèchman glikolitik. Miyò, repwesyon siyal mTOR ka kontribye tou nan chanjman metabolik soti nan glikoliz nan respirasyon mitokondriyo. Vreman vre, selil T sa yo ↑[H+]-elaji yo te montre amelyore kapasite mitokondriyo, jan sa evidans SRC ogmante ak mas mitokondriyo ak diminye Δψm. Siyati mitokondriyo sa yo, ki anrichi nan selil T ki sanble ak tij epi ki gen rapò ak lonjevite ak aktivite siperyè anti-timè nan vivo, yo byen modile pa fizyon mitokondriyo ak dinamik fisyon22,48,50. Pwoteyin fizyon manbràn enteryè mitokondriyo OPA1 jwe yon wòl endispansab nan jenerasyon selil T memwa50. An akò, nou te jwenn ke asidoz ekstraselilè tou ankouraje ekspresyon OPA1 nan selil T, evantyèlman sa ki lakòz ekilib mòfoloji nan direksyon fizyon nan selil T. Anpil metabolit selilè yo te montre dirèkteman kontribye nan modifikasyon epigenetik. Pou egzanp, metabolis yon sèl-kabòn ka jenere SAM donatè methyl inivèsèl pou methylation histon66.

Figi 4|Fòm mitokondriyo soutni nan selil T ki ekspoze a ↑[H+]. yon analiz SCENITH sou selil T imen yo nan kontwòl oswa selil T ki kondisyone ak asid laktik. Yo montre yon nivo tradiksyon reprezantan (anti-Puro) (n=3 echantiyon endepandan). Liy tirè yo reprezante nivo background yo jwenn apre tretman 2-deoxy-d-glikoz + oligomisin ({2-DG+O). b,c, Kantite analiz kapasite glikolitik (b) ak depandans mitokondriyo (c) nan a. n=3 echantiyon endepandan. d-f, OCR (d) nan kontwòl ak laktik-asid-kondisyone selil T yo te mezire an tan reyèl nan kondisyon fondamantal an repons a inibitè yo endike yo. FCCP, carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone; ROT / AA, rotenone ak antimycin A. Reprezantan analiz estatistik nan OCR fondamantal (e), respirasyon maksimòm (e) ak SRC (f). n=9 tès; Yo te analize 3 echantiyon endepandan epi yo te mezire chak echantiyon 3 fwa. g,h, ECAR (g) nan kontwòl oswa laktik-asid-kondisyone selil T mezire an repons a inibitè yo endike yo. Reprezantan analiz estatistik ECAR fondamantal ak ECAR ensiste (h). n=9 tès; Yo te detekte 3 echantiyon endepandan epi yo te mezire chak echantiyon 3 fwa. i, Immunoblot analiz COXIV ak TIM23 nan selil T imen yo anba kondisyon ki endike yo. Aktin te itilize kòm yon kontwòl loading. j,k, Istogram reprezantan oswa trase kontou ak analiz estatistik mas mitokondriyo (MTG) (j) ak potansyèl manbràn mitokondriyo (TMRM) (k), respektivman, nan kontwòl oswa asid laktik oswa pH 6.{{30} }selil T imen kondisyone. n=3 echantiyon endepandan. l, m, Reprezantan mòfoloji mitokondriyo nan selil T kiltive nan kondisyon kontwòl la, asid laktik oswa kondisyon pH 6.6 la pou 12 jou, analize pa EM (ba echèl, 1 μM) (l). Sipèfisi mitokondri endividyèl yo nan selil T (m), n=45 selil yo. Done yo prezante kòm mwayèn ± sem Analiz estatistik yo te fè lè l sèvi avèk tès t Elèv ki pa pè de ke.

Figi 5|↑[H+]-elaji selil T montre aktivite anti-timè amelyore. a,b, Kontwòl oswa asid laktik-agrandi CD8+ selil T yo te analize pou pèrsistans apre transfè adoptif (n=6 sourit). Te fèk izole CD45 sourit.1+ Selil T OT-I yo te aktive ak IL sourit-2 ak antikò CD3 anti-sourit ak anti-sourit CD28 ki mare nan plak pandan 2 jou epi yo te kenbe yo nan yon mwayen kilti ak sourit IL-2 jiskaske transfè adoptif (CD3&CD28+IL-2). Nan (b) yo montre yon chema eksperyans bèt (a) ansanm ak siplo reprezantatif FACS ak analiz estatistik CD45.1+ ak CD45.2+ selil T nan san an. c–g, CD45.1+ Selil OT-I T yo te elaji nan kontwòl oswa mwayen asid laktik pou 7 jou epi yo te transfere nan sourit B{16-OVA-timè ki pote, epi yo te evalye enfiltrasyon nan rapò. (n=5 sourit). Yon chema eksperyans bèt la lè l sèvi avèk B16-OVA sourit ki gen timè (c), osi byen ke siplo reprezantatif FACS (agòch) ak estatistik pou nimewo (adwat) CD45 transfere.1+ OT- Selil T nan timè a (d). sc, piki anba lar. Estatistik pou pousantaj CD45.1+ Selil T (e) ak done reprezantan (gòch) ak estatistik pou pousantaj (adwat) CD62L+ CD44+ CD45.1+ Selil T (f ) nan larat yo montre. Koub kwasans timè (g) (n=5 sourit, jou 14). h–j, CD19-CAR T selil yo te elaji nan kontwòl oswa mwayen asid laktik pou 12 jou epi yo te transfere nan CD{19-overexpressing K562 timè NCG sourit yo, ak rapò a enfiltrasyon nan timè ak larat te evalye (n=6 sourit). Yon chema eksperyans bèt (h), yon pousantaj reprezantan selil T transfere nan timè a ak larat (i), ak koub kwasans timè (j) yo montre (n=6 sourit, jou 10). Done yo prezante kòm mwayèn ± sem Analiz estatistik yo te fè lè l sèvi avèk tès t Elèv ki pa pè de ke.

Figi 6|↑[H+] ekspoze limite fatig selil T. yon Schema eksitasyon kwonik nan selil T imen an vitro. b, Reprezantatif FACS trase pou LAG-3 ak TIM-3 nan selil T imen kwonik ki ankouraje yo kiltive nan kondisyon kontwòl oswa asid laktik. n=3 echantiyon endepandan. c, Ekspresyon LAG-3 ak TIM-3 nan CD45.1+ TIL ki soti nan sourit B{16-OVA ki gen timè C57BL/6N (n=5 sourit ). d, Kantifikasyon ekspresyon LAG-3, TIM-3 ak PD{-1 nan CD45.1+ TIL ki soti nan B{16-OVA-timè ki bay C57BL/ 6N sourit (n=5 sourit). e, Ekspresyon LAG-3 ak TIM-3 nan selil CD19-CAR T ki enfiltre timè ki soti nan sourit NCG ki gen timè CD19-K562, jan sa detèmine pa sitometri koule. (n=6 sourit). f, Ekspresyon TOX nan CD45.1+ TIL soti nan B{16-OVA sourit C57BL/6N ki gen timè (n=5 sourit). g, Istogram yo ak analiz estatistik TOX nan selil CD19-CAR T ki enfiltre timè ki soti nan CD19-K562 sourit NCG ki gen timè (n=6 sourit). h, Goch, trase sitometri koule reprezantatif pou TIM-3 ak TCF1 nan CD45.1+ TIL ki soti nan B{16-OVA sourit C57BL/6N ki gen timè (n=5 sourit) . Adwat, pousantaj popilasyon TCF1+ TIM-3– oswa TCF1– TIM-3+. Done yo prezante kòm mwayèn ± sem Analiz estatistik yo te fè lè l sèvi avèk tès t Elèv ki pa pè de ke.

Yo rapòte metabolit, tankou S-2-hydroxyglutarate ak -hydroxybutyrate, fonksyone kòm regilatè epigenetik diferansyasyon selil T memwa67,68. Rezilta nou yo te montre ke tretman ↑[H+] ki pèsistan limite absorption methionine ak metabolis methionine ak diminye methionine entraselilè, SAM, ak SAH atravè anpèchman ekspresyon transpò methionine. Rezilta sa yo ka pasyèlman eksplike poukisa selil T yo pa kapab konkirans selil timè pou absòpsyon methionine nan TME69 la. Mekanistikman, nou te demontre ke ↑[H+] ekspoze dramatikman redwi ekspresyon MYC ak obligatwa li nan pwomotè SLC7A5 la, kidonk sa ki lakòz diminye ekspresyon SLC7A5 ak metabolis methionine andikape nan selil T yo. Entrigan, sipleman methionine ka retabli ekspresyon MYC ak SLC7A5, osi byen ke flux sik methionine nan ↑[H+]-ekspoze selil T, ki sijere ke restorasyon kapasite absòpsyon methionine te gen anpil chans akòz regilasyon transpò methionine. SLC7A5 nan yon fason ki depann de MYC. Yo rapòte aktivite mTOR pou kontwole tradiksyon MYC70. An konsekans, nou te espekile ke ↑[H+]-pwovoke downregulation nan MYC gen anpil chans akòz represyon tradiksyon atravè anpèchman pwogresif nan mTOR ak absòpsyon nan pwoblèm nan methionine. Represyon sa a ta ka ranvèse pa sipleman methionine ekzojèn, byenke mekanis egzak la bezwen plis etid. SAM ki sòti nan sik methionine yo te konsidere kòm medyatè methylation histon ak renovasyon epigenetik pandan diferansyasyon selil effector-T8,71. Konfòm ak diminisyon nan SAM intraselilè nan ↑[H+]-elaji selil T, nou te jwenn ke abondans total H3K27me3 ak lokatè li yo nan pwomotè T selil-semness loci yo te tou de redwi anpil. H3K27me3 ak H3K4me3 yo oaza modifye nan yon fason ki korelasyon ak ekspresyon jèn ki santral nan pwogram efèktè oswa stemness selil T yo14. Vreman vre, te gen yon pi ba anrichisman nan H3K4me3 nan pwomotè efèktè-jèn nan ↑[H+]-elaji selil T. Kidonk, nivo redwi SAM methyl-donatè ki soti nan absòpsyon methionine andikape ak metabolis anba kondisyon ↑[H+] mennen nan chanjman epigenetik ki finalman favorize diferansyasyon selil T nan estati memwa. Enteresan, adisyon nan methionine anba ekspoze ↑[H+] pa sèlman sove ekspresyon MYC ak SLC7A5 nan selil T ↑[H+]-ekspoze, men tou, retabli nivo total ekspresyon H3K27me3, sipòte yon wòl enpòtan pou MYC-SLC7A5. –Methionine metabolis aks nan reglemante ↑[H+]-induit tij epigenetik. Vreman vre, nou te jwenn ke twòp ekspresyon nan SLC7A5 pasyèlman andikape fenotip ↑[H+]-induit stemness-like a, plis sipòte wòl nan kritik nan transpòtè methionine SLC7A5 nan akizisyon nan fenotip nan T selil memwa-tankou anba ↑[H+] ekspoze.

Pifò TIL yo te istorikman te panse yo te fin itilize akòz ekspoze kontinyèl TCR nan timè, men paradoksal yon ti sou-ansanm klonotip selil T nan TIL ki eksprime faktè transkripsyon TCF1 kenbe pwopriyete ki sanble ak selil souch yo. Konklizyon nou yo te revele ke ↑[H+] ekspoze konpanse fonksyon efèktè selil T ak prezève tij selil T atravè aks metabolis MYC-SLC7A5-methionine, ki bay yon eksplikasyon posib pou paradoks aktyèl la kòm rezon ki fè yon ti fraksyon nan TIL yo toujou kenbe tij. tankou memwa oswa pwopriyete précurseur. An reyalite, rezilta ki sanble yo te rapòte kote iyon potasyòm nan TME a sèvi yon wòl doub enfliyanse tou de fonksyon efèktè selil T ak stemness56,72, plis sipòte efè konplèks nan faktè imunosuppressive TME (pa egzanp, eksitasyon TCR kwonik, ipoksi, ak ba. glikoz) sou fonksyon selil T ak diferansyasyon. Anplis de sa, rejyon asid ki nan timè yo trè dinamik epi yo kontwole espasyalman ak tanporèl, epi kapasite selil T ki adapte ak asidoz ekstraselilè gen anpil chans kouvri lè yo rankontre lòt faktè TME piman bouk ki ka afekte fonksyon efèktè selil T intratumoral ak diferansyasyon. Anplis de sa, nou te obsève ekspresyon MYC ki pi wo nan selil T tèminal yo (LY108− TIM-3+) pase nan selil T ki te fin itilize yo (LY108+ TIM-3– ), ki se an liy ak rapò anvan yo ke selil MYClo T preferansyèlman jwenn sò a memwa73. Konfòm ak diminye ekspresyon SLC7A5 ak absòpsyon methionine nan ↑[H+]-ekspoze selil T, ekspresyon SLC7A5 te siyifikativman redwi tou nan popilasyon selil T LY108+ TIM{-3-progenitor fin itilize nan timè yo, sijere ke aks regilasyon MYC-SLC7A5-methionine ka opere tou nan vivo. Li se kounye a aparan ke selil T memwa tij ki gen mwens diferansye yo gen efè siperyè anti-timè akòz pèsistans alontèm yo ak rezistans nan devlopman malfonksyònman51,74. Nou bay prèv konvenkan ki montre selil T CD8+ kondisyone ↑[H+ ] alontèm yo te montre pèsistans yap ogmante jiska ak kapasite siperyè anti-timè an vivo, ak yon popilasyon selil T ki diminye tèminalman (TCF1− TIM{). {39}} ) ak ogmante sou-ansanm tij ki sanble ak tij (TCF1+ TIM{-3– ) nan timè yo. An konklizyon, etid prezan nou an bay apèsi sou efè miltidimansyonèl ekspoze ↑[H+] sou repwesyon fonksyon efè selil T ak enfliyans konyensidans li sou tij selil T.

Metòd

Sourit ak liy selil yo

Tout eksperyans bèt yo te fèt ak apwobasyon Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal (IACUC) nan Suzhou Institute of Systems Medicine (ISM-IACUC-0151-R), epi bèt yo te loje nan enstalasyon espesifik sourit san patojèn. Sourit yo te loje nan kondisyon estanda, ak 12-h/{12-h sik limyè/fè nwa ak yon tanperati kontwole nan 22-24 degre ak imidite nan 60%, ak manje san restriksyon ak dlo. disponiblite, epi yo te egzamine chak jou. Tout chay timè yo pa t depase pèmisyon ki te apwouve pa Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal nan Suzhou Institute of Systems Medicine. CD45.1+ Sourit transjenik OT-I TCR fi sou yon background C57BL/6N yo te loje ansanm. CD45.2+ Sourit fi C57BL/6N ki gen laj 6–8 semèn yo te achte nan men Vital River kòm benefisyè. Fi NCG (NOD/ ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) sourit ki gen laj 6-8 semèn yo te achte nan men GemPharmatech. Pou yon eksperyans endepandan an vivo, sourit CD45.1+ ak CD45.2+ (6-12 semèn) te matche ak sèks. Selil HEK-293T ki soti nan American Type Culture Collection (ATCC) yo te konsève nan mwayen DMEM ki te konplete ak 10% serom fetal bovine (FBS) ak 1% penisilin-streptomycin. Liy selil melanom sourit B16, ki soti nan ATCC, yo te transdui pou eksprime OVA epi konsève nan mwayen DMEM siplemantè ak 10% FBS ak 1% penisilin-streptomycin. Selil K562 ki soti nan ATCC yo te transdui pou eksprime CD19 imen ak kiltive nan mwayen RPMI 1640 siplemantè ak 10% FBS, 1% penisilin-streptomycin, 1% GlutaMAX, 0.1 M HEPES, 1% asid amine ki pa esansyèl, 1 mM piruvat sodyòm ak piruvat sodyòm. μM -mercaptoethanol. Tout reyaktif ki anwo yo te achte nan men Gibco.

Izolasyon primè selil T, aktivasyon, ak transdiksyon retroviral

Sourit CD{{0}} T lenfosit yo te izole nan larat yo nan 6-12 semèn sourit OT-I gason oswa fi lè yo itilize yon twous izolasyon selil T nayif CD8 (BioLegend) epi yo te kiltive nan RPMI{{5} } mwayen siplemantè ak 10% FBS, 1% penisilin-streptomycin, 1% asid amine ki pa esansyèl, 1% GlutaMAX, 1 mM piruvat sodyòm, 0.1 M HEPES ak 50 μM -mercaptoethanol nan prezans IL sourit. -2 (20U/ml, Peprotech). Pou yon eksperyans endepandan an vitro, sourit gason ak fi (6-12 semèn) yo te itilize yo te matche ak sèks. Selil pirifye yo te aktive pa anti-sourit CD3 (2 ug/ml, BioLegend) ak anti-sourit CD28 (1 ug/ml, BioLegend) pou 48 èdtan. Selil mononikleyè san periferik imen (PBMC) ki soti nan donatè ki an sante yo te achte nan men Sailybio epi yo te kiltive nan mwayen RMPI-1640 ki te ajoute ak 5% Serum Imèn AB (Gemini), 1% penisilin-streptomycin, 1% asid amine ki pa esansyèl, 1% GlutaMAX, 1 mM piruvat sodyòm, 0.1 M HEPES ak 50 μM -mercaptoethanol nan prezans IL-2 imen (100 U / ml, Peprotech). Anti-moun CD3 (1 ug/ml, BioLegend) ak anti-moun CD28 (1 ug/ml, BioLegend) yo te itilize antikò monoklonal pou aktive PBMC yo pandan 3 jou. Pirifye sourit ak selil T imen yo te aktive ak elaji nan kondisyon kilti ki endike yo: pH 7.4, pH 6.6, asid laktik (Sangon), oswa laktat sodyòm (Sangon). Yo te itilize metabolit sa yo pou konplete pH 6.6 oswa asid laktik (10 mM) mwayen: methionine 800 μM (MCE), SAM 100 μΜ (MCE), oswa SAH 100 μM (Sigma). Pou transdiksyon viral, 1 × 106 PBMC yo te aktive pou chak pi nan 24-plak byen yo. Apre 48 èdtan nan aktivasyon, majorite nan mwayen an te ranplase ak yon supernatant retroviral san konsantre ak 10 ug / ml polybrene (Santa Cruz). Apre santrifujasyon nan 600 g pou 90 min nan 30 degre, selil yo te kiltive nan enkibatè a pou 24 èdtan ak mwayen fre. Transdiksyon an te repete 24 èdtan pita epi retounen nan yon mwayen fre pou kilti. Reseptè faktè kwasans nè ki ba-affinite (LNGFR) te itilize pou quantifier efikasite enfeksyon an.

Sitometri koule

Selil yo te tache ak antikò fliyoresan ak Lè sa a, analize pa sikometri koule. Pou tach makè sifas, selil yo te tache ak antikò konjige fliyoresan ak Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit (Invitrogen) nan tanpon FACS (saline tampon fosfat (PBS) ak 2% FBS), Lè sa a, fiks ak 2% paraformaldehyde (Casmart) pou 20 minit nan tanperati chanm. Pou tach entraselilè nan fosfo-pwoteyin, selil pre-tache yo te fiks ak yon Tanpon Fixation (BioLegend) ak Lè sa a, tache ak antikò fosfo-espesifik nan yon Tanpon Permeabilization (Invitrogen). Pou deteksyon cytokins entraselilè, selil yo te ankouraje ak phorbol myristate acetate (PMA) nan prezans Brefeldin A (BFA) (BioLegend) pou 4.5 èdtan. Lè sa a, selil yo pre-tache yo te fiks ak tache ak antikò cytokines nan yon tanpon pèmeabilizasyon. Pou tach transkripsyon-faktè intraselilè, selil yo te pre-tache ak Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit ak antikò konjige fluorescent nan tanpon FACS pou detekte makè sifas yo. Lè sa a, selil yo te fikse pou 30 min sou glas lè l sèvi avèk FOXP3 / Transcription Factor Fixation Tanpon (Invitrogen) ak tache ak antikò faktè transcription nan tanpon Permeabilization. Apre tach, selil yo te resuspend nan tanpon FACS pou sikometri koule. Done sitometri koule yo te kolekte pa BD LSR Fortessa ak BD FACSDiva (v8.0.2), epi analize ak lojisyèl FlowJo (v10.4). Yo bay estrateji reprezantatif yo nan Done Pwolonje Figi 10b.

Sekans RNA

Yo te fè analiz RNA-seq lè l sèvi avèk 12-selil T ki grandi nan jou ki te kiltive nan kondisyon ki endike yo jan yo montre nan Fig. 1a. Yon ti tan, 12 jou apre ekspansyon selil T, RNA total yo te ekstrè pa omojènizasyon nan TRIzol (Takara) ak konjelasyon nan tib RNase-gratis ak nitwojèn likid. Yo te evalye entegrite RNA lè l sèvi avèk Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Bibliyotèk yo te konstwi avèk twous preparasyon echantiyon TruSeq RNA (FC-122-1001, Illumina). Lè sa a, bibliyotèk yo te sekans lè l sèvi avèk yon platfòm Illumina NovaSeq 6000 (PE150), epi yo te pwodwi apeprè 40 milyon lekti pè (Novogene). Konte lekti kri yo te ekstrè ak Lè sa a, nòmalize pa faktè gwosè bibliyotèk yo lè l sèvi avèk DESeq2 (v1.28.1). Yo te itilize transfòmasyon logaritm regilarize (r-log) pou estabilize divèjans atravè echantiyon yo. Analiz anrichisman chemen GO ak KEGG nan jèn ki eksprime diferan yo te fèt ak pwofil gwoup (v3.16.0). Kat chalè ekspresyon yo te pwodwi ak pake R 'pheatmap' (v1.0.12). GSEA v.4.0 te itilize pou analiz GSEA.

CUT&Tag-seq

CUT&Tag-seq te fèt jan sa te dekri deja75, lè l sèvi avèk Hyperactive Universal CUT & Tag Assay Twous pou Illumina (TD903, Vazyme). Yon ti tan, selil T imen yo te elaji pou 12 jou anba kondisyon kontwòl, asid laktik, oswa asid laktik ak 800 μM methionine. Lè sa a, 1 × 105 selil T yo te lysed pou fè ekstraksyon nan materyèl nikleyè epi yo te enkube ak pèl ConA nan tanperati chanm pou 10 min. Selil yo te resuspend nan 50 µL tanpon antikò pre-melanje ak antikò prensipal (anti-H3K27me3 oswa anti-H3K4me3) ak enkubasyon lannwit lan nan 4 degre. Echantiyon yo te enkube ak antikò segondè a nan tanperati chanm pou 30 minit epi apre sa yo te ko-enkube ak transposaz pwoteyin A/G-Tn5 nan tanperati chanm pou 1 èdtan pou deranje fwagmantasyon ADN. Pirifye ADN te itilize pou preparasyon bibliyotèk ak sekans lè l sèvi avèk PE150 pa Illumina Nova6000 sekans.

CUT&Tag-seq analiz

FastQC (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) te itilize pou tcheke bon jan kalite lekti sekans lan. Lekti yo te koupe bon jan kalite a yon nòt Phred minimòm de 20 lè l sèvi avèk trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) . Tout lekti ki te pwodwi pa CUT&Tag-seq nan H3K27me3 ak H3K4me3 yo te aliyen ak genomic imen an hg38 lè l sèvi avèk Bowtie2 (v2.2.8) (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) ak opsyon: –local– trè-sansib-lokal-no-unal-no-mixed-no-discordant-phred33 -I 10 -X 700. Yo te nòmalize echantiyon yo san ADN ki pa gen pik nan lè l sèvi avèk metòd ChIPseqSpikeInFree, ki se yon nouvo metòd nòmalizasyon pou detèmine efektivman faktè dekale pou echantiyon yo atravè divès kondisyon ak tretman76. Pou H3K27me3, yo te rele pik lè l sèvi avèk MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_ peak_apèl_macs .html) ak opsyon '-g hs -f BAMPE–keep-dup all– broad–broad-cutoff 0.1'. Pou H3K4me3, apèl pik yo itilize MACS2 ak paramèt '-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all'. Pik yo te anote ak ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/), ak vizyalizasyon yo te kreye lè l sèvi avèk deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en /develop/) ak pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

qRT-PCR

Total RNA te izole ak TRIzol (Takara) epi ranvèse transkripsyon nan cDNA ak HiScript Reverse Transcriptase (Vazyme), dapre enstriksyon manifakti a. Pou PCR quantitative an tan reyèl, ABI prism 7500 an tan reyèl PCR System (Thermo Fisher) ak 2 × SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) yo te itilize dapre enstriksyon manifakti a. ACTB te itilize kòm yon estanda entèn. Ekspresyon relatif mRNA te kalkile lè l sèvi avèk metòd 2-ΔΔCT. Ou ka jwenn sekans Primer yo itilize pou qPCR nan Tablo Siplemantè 1.

Lwès blotting

Pou analiz ekspresyon pwoteyin, selil yo te kolekte epi lave ak PBS frèt, epi yo te ekstrè pwoteyin total la lè l sèvi avèk 1% SDS (Sangon) sou glas. Konsantrasyon pwoteyin yo te mezire pa yon twous tès pwoteyin BCA (Merck). Echantiyon pwoteyin yo te separe pa jèl SDS-PAGE epi yo te transfere nan manbràn PVDF (Millipore). Manbràn yo te bloke ak 5% lèt san grès nan PBS ki gen Tween20. Apre bloke, manbràn yo te enkube ak antikò prensipal lannwit lan nan 4 degre ak HRP-makonnen antikò segondè pou 2 èdtan nan tanperati chanm. Siyal HRP a te devlope pa electrochemiluminescence (ChemeMINI610) ak kolekte pa Sage Capture (v2.19.12). Analiz done yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ (v1.8.0).

Analiz mòfoloji mitokondriyo

Nan chak pi nan plak {{0}}byen, PBMC yo te aktive pa antikò imen anti-CD3 ak anti-CD28 pandan 3 jou epi yo te kiltive nan mwayen RPMI-1640 nan diferan kondisyon pou 12 jou. Lè sa a, 1 × 106 PBMC yo te kolekte epi fikse nan yon tanpon fiksasyon pre-refwadi (2.5% glutaraldehyde, 0.1 M tanpon fosfat (PB), pH 7.4) lannwit lan nan 4 degre. Apre yo te fin lave ak PBS twa fwa, selil yo te post-fixe nan 1% osmyòm tetoksid nan PBS pou 2 èdtan, dezidrate ak entegre nan résine Spurr a, dapre pwosedi estanda a. Seksyon ultramin yo te tache ak acetate uranyl ak sitrat plon. Yo te fè imaj mòfoloji mitokondriyo lè l sèvi avèk Hitachi HT-7800 mikwoskopi elektwonik transmisyon (TEM) (v01.20) ak kamera AMT-XR81DIR.

Antikò ak reyaktif

Antikò yo te itilize pou analiz sitometrik koule yo te jan sa a. APC anti-moun NGFR (cat. No. 345108, 1:1,000 pou FACS), FITC anti-moun CD4 (cat. No. 357406, 1:200 pou FACS), Pacific Blue anti-moun CD8 (chat. No. 300928, 1:200 pou FACS), APC-Cy7 anti-moun/sourit CD44 (cat. No. 103028, 1:200 pou FACS), PE anti-moun CCR7 (kat. No. 353204, 1 :200 pou FACS), PE anti-moun TNF- (cat. No. 502909, 1:200 pou FACS), PE-Cy7 anti-moun CD45RO (cat. No. 304230, 1:200 pou FACS), APC anti- imen IFN- (cat. No. 502512, 1:200 pou FACS), PE-Cy7 anti-moun LAG-3 (cat. No. 369310, 1:200 pou FACS), PE anti-moun TIM{{ 52}} (cat. No. 345006, 1:200 pou FACS), BV711 anti-moun PD-1 (kat. No. 329928, 1:200 pou FACS), Percp-Cy5.5 anti-moun CD62L (cat. No. 304824, 1:200 pou FACS), APC anti-moun CD27 (cat. No. 302810, 1:200 pou FACS), BV711 anti-sourit CD8 (cat. No. 100748, 1:200 pou FACS ), PE-Cy7 anti-sourit CD62L (cat. No. 104418, 1:200 pou FACS), APC-Cy7 anti-sourit CD45.2 (cat. No. 830789, 1:200 pou FACS), Pacific Blue anti- sourit CD45.1 (cat. No. 110722, 1:200 pou FACS), APC anti-sourit Ly108 (cat. non. 134610, 1:200 pou FACS), PE anti-sourit LAG-3 (cat. No. 125207, 1:200 pou FACS), Alexa Fluor 488 anti-c-MYC Antibody (cat. No. 626811, 1 :200 pou FACS), PE anti-sourit TNF- (cat. No. 506306, 1:200 pou FACS), ak APC anti-sourit IFN- (cat. No. 505810, 1:200 pou FACS) te achte nan men BioLegend . Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit, PerCP-eFluor710 anti-sourit PD-1 (chat. No. 46-9981-82, 1:200 pou FACS), PE fosfò-S6 (Ser235/236) (chat. . No. 12-9007-42, 1:200 pou FACS), PE anti-moun/sourit TOX (cat. No. 12-6502-82, 1:200 pou FACS), ak PE-Cy7 anti-sourit TIM{ {149}} (No. Cat. 25-5870-82, 1:200 pou FACS) yo te achte nan men Thermo Fisher. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (cat. No. 6709, 1:200 pou FACS) ak fosfò-4E-BP1 (Thr37/46) (cat. No. 2846, 1:200 pou FACS) te achte nan men Teknoloji siyal selilè. Alexa Fluor 647 anti-puromicin (cat. No. MABE343-AF647, 1:800 pou FACS) te achte nan men Merck. Antikò yo itilize pou tach lwès yo te jan sa a. Lapen anti-phospho-Akt (Ser473) (cat. No. 4060, 1:1,000 pou IB), anti-phospho-NF-κB p65 (Ser536) (kat. No. 3033, 1:1) ,000 pou IB), anti-c-MYC (cat. No. 18583, 1:1,000 pou IB), anti-EZH2 (kat. No. 5246, 1:1,{ {200}} pou IB), anti-tri-methyl-histone H3 (Lys27) (cat. No. 9733, 1:1,000 pou IB), anti-tri-methyl-histone H3 (Lys4) (cat. No. 9751, 1:1,000 pou IB), anti-di-methyl-histone H3 (Lys9) (kat. No. 4658, 1:1,000 pou IB) , anti-di-methyl-histone H3 (Lys79) (cat. No. 5427, 1:1,000 pou IB), anti-histone H3 (kat. No. 9715, 1:1,{{242 }} pou IB), anti-COXIV (cat. No. 850, 1:1,000 pou IB), anti-lapen IgG (HRP-lye) (cat. No. 7074, 1:2,{ {253}} pou IB), ak anti-sourit IgG (HRP ki lye) (cat. No. 7076, 1:2,000 pou IB) yo te achte nan men Cell Signaling Technology. Sourit anti-Tim23 (cat. No. 611223, 1:1,000 pou IB) te soti nan BD Biosciences. Sourit anti- -aktin (chat No. 66009-1-Ig, 1:5,000 pou IB), anti-SLC7A5 (cat. No. 67951-1-Ig, 1: 1,000 pou IB), ak lapen anti-SLC38A1 (cat. No. 12039-1-AP, 1:1,000 pou IB) te soti nan Proteintech. Lapen anti-SLC38A2 (cat. No. BMP081, 1:1,000 pou IB) te achte nan men laboratwa medikal ak byolojik.

T-selil metabolik tès

Pou tcheke absòpsyon BODIPY FL C16 nan kontwòl oswa ↑[H+]-trete selil T, selil T yo te kiltive ak frèch fonn 1 μM BODIPY FL C16 (Invitrogen) pou 1 èdtan, Lè sa a, lave de fwa ak PBS anvan tach sifas yo. Pou plis eksplore depandans metabolik la nan diferan gwoup tretman, eksperyans yo te fèt lè l sèvi avèk metòd SCENITH (sèl selil enèjik metabolis pa pwofil anpèchman tradiksyon)42. Yon ti tan, selil T yo te simen nan 96-plak byen nan 1 × 106 selil/ml. Lè sa a, selil yo te trete ak kontwòl (Ctrl), 2-deoxy-d-glikoz (konsantrasyon final 100 mM), oligomycin (konsantrasyon final 5 μM), oswa yon melanj de inibitè yo nan konsantrasyon final yo pou 40 min nan 37. degre. Puromicin (konsantrasyon final 10 ug/ml) te ajoute pandan dènye 30 minit yo. Apre tretman puromicin, selil yo te lave ak PBS frèt ak pre-tache ak Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit ak antikò kont makè sifas yo. Tach nan puromicin intraselilè te swiv pa pwosesis la tach pou faktè transcription intraselilè.

Analiz metabolomik ak LC-MS/MS

Analiz metabolomik ak koleksyon echantiyon yo te fèt tankou nan rapò anvan yo77. An brèf, PBMC yo te aktive endividyèlman nan 24-plak byen pa moun anti-CD3/CD28 pou 3 jou epi yo te kiltive nan mwayen RPMI 1640 ak kontwòl oswa asid laktik nan jou 12. Lè sa a, 8 × Yo te kolekte 106 selil pou chak echantiyon (n=4 echantiyon endepandan pou chak gwoup) epi yo te transfere nan yon tib 1.5-ml pou santrifujasyon nan 300 g pou 5 min nan 4 degre epi apre sa. lave ak PBS frèt. Apre santrifujasyon nan 300 g pou 5 min ankò, yo te ajoute 80% metanol frèt ak kouray toubiyon pou deranje grenn selil la nèt, ak Lè sa a, selil yo te transfere nan yon frizè nan -80 degre. Yo te santrifuje echantiyon yo nan 12,000 g pou 10 min nan 4 degre. Surnatant la te kolekte. Finalman, ekstrè yo te lyofilize ak analize pa UHPLC-MS / MS nan Novogene. Fichye done anvan tout koreksyon ki te pwodwi pa UHPLC-MS/MS yo te trete lè l sèvi avèk Compound Discoverer (v3.1, Thermo Fisher) pou fè aliyman pik, pik pik, ak kantite pou chak metabolit. Lojisyèl Metaboanalyst (v5.0) te itilize pou plis analiz done, ak Lè sa a, siyifikativman anrichi chemen yo te chwazi lè l sèvi avèk P <0.05.

Eksperyans ki estab-izotòp-etikèt

Flux metabolik 13C la te fèt sou selil T lè l sèvi avèk metòd yo te dekri deja60,78,79. Yon ti tan, PBMC yo te aktive pou chak pi nan 24-plak byen ak anti-CD3/CD28 imen pou 3 jou, jan sa dekri pi wo a. Pou trase glikoz [13C6], yo te chanje mwayen an apre 11 jou nan RPMI san glikoz (Gibco) siplemantè ak 10% FBS dyalize (Thermo Fisher Scientific), 1% penisilin-streptomycin, 1% asid amine ki pa esansyèl, 50 μM. -mercaptoethanol ak 0.1 M HEPES, ki gen 11 mM [13C6] glikoz (Cambridge Isotope Laboratories) ak kontwòl oswa 10 mM asid laktik, pou 24 èdtan. Pou trase [13C16] palmitate, 2 × 107 selil T yo te aktive epi yo mete yo nan yon mwayen ranpli ak kontwòl oswa 10 mM kondisyon asid laktik jan sa dekri pi wo a nan jou 12, ki gen 200 μM [13C16] palmitate (Cambridge Isotope Laboratories), pou 8. h. Pou [13C5] methionine trase, selil T yo te elaji anba kontwòl, asid laktik oswa asid laktik ak 800 μM kondisyon methionine pou 12 jou. Lè sa a, 4 × 107 T selil yo te chanje nan methionine-gratis mwayen RPMI konplè (Gibco) ak kiltive nan kondisyon kontwòl, asid laktik, oswa asid laktik complétée ak methionine (ki gen 100 μM, 100 μM, oswa 800 μM [13C5] methionine) (Cambridge Isotope Laboratories), pou 8 h. Supernatant respektif yo te kolekte epi answit estoke nan -80 degre. Selil yo te granules pa santrifujasyon (300 g, 4 degre, 5 min), lave de fwa ak saline, epi imedyatman jele nan nitwojèn likid epi estoke nan -80 degre. Metabolit yo te ekstrè lè l sèvi avèk glas-frèt HPLC-klas 80% metanol ak vortexed yon ti tan, ki te swiv pa adisyon a nan 200 ml HPLC-klas dlo, Lè sa a, 500 ml HPLC-klas klowofòm (metanòl: dlo: rapò klowofò, 5:2:5). ). Te melanj lan vortexed ak santrifuje pou reyalize faz separasyon. Supernatant yo te cheche pa vire vakyòm pou derivatization ki vin apre, ak Lè sa a, enkube ak 2% (wt / vol) methoxyamine hydrochloride (226904, Sigma-Aldrich) nan piridin pou 60 minit nan 37 degre, ak silylated pa N-methyl-N-( tert-butyldimethylsilyl) trifluoroacetamide ak 1% tert-butildimethylchlorosilane (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) pou 30 min nan 45 degre. [13C6] dérivés glikoz yo te analize pa GC-HRMS, chromatograph gaz Trace 1310 (Thermo Fisher) ak kolòn DB-35MS (Agilent Technologies), ak sistèm Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS (Thermo Fisher). Metabo-Profile te fè tès GC-MS/MS metabolomik. Xcalibur (v4.1) ak TraceFinder (v5.1) (Thermo Fisher) idantifye ak quantifye metabolit yo, ki gen ladan tan retansyon, rapò chaj-a-mas fragman ion, ak entansite pik. [13C16] palmitate ak [13C5] methionine dérivés yo te analize pa ultrahigh-pressure likid chromatography-trip quadrupole mas spectrometer (UPLC-TQMS). Done anvan tout koreksyon ki soti nan UPLC-TQMS yo te analize lè l sèvi avèk lojisyèl MassLynx Waters '(v4.1, Waters) pou fè ekstraksyon pik, entegrasyon, idantifikasyon, ak quantification nan metabolit yo. Yo te itilize lang R (v4.1.1) pou analiz estatistik ki vin apre.

Modèl timè B16 ak imunoterapi transfè selil adoptif

Pou envestige aktivite anti-timè selil T yo nan vivo, yo te enjekte selil melanom 0.2 × 106 B16-OVA yo anba lar nan sourit fi C57BL/6N. Nèf jou apre enplantasyon timè, sourit yo te enjekte nan venn ak 5 × 106 selil T ki soti nan sourit fi OT-I elaji pou 7 jou nan diferan kondisyon. Sourit ki gen timè te resevwa 5 Gy iradyasyon subletal anvan ACT. Yo te mezire zòn timè a chak 2 jou epi yo kalkile kòm longè (mm) × lajè (mm). Sourit ki gen yon zòn timè ki apwoche 300 mm2 yo te elimine. Pou eksplore pèsistans selil T elaji nan diferan kondisyon, 4 × 106 CD45.1+ Selil T ki soti nan sourit OT-I fi yo te transfere adoptif nan sourit C57BL/6N fi. Yon semèn apre, yo te elimine sourit yo epi yo te konte selil ki soti nan san izole, larat, ak nœuds lenfatik yo. Pwopòsyon selil T transfere yo te detèmine pa gating sou selil T ki eksprime CD45.1+ ak CD45.2+ atravè sitometri koule.

Modèl sourit NCG ak terapi CD19-CAR-T

Sourit fi NCG yo te enplante anba lar ak 1 × 106 CD19-K562 selil yo. Lè volim timè yo te rive nan 75 mm3, sourit yo te resevwa 5 × 106 selil T ki pa transdui ak selil CD19-CAR T ki te kiltive nan kontwòl oswa 10 mM mwayen ki gen asid laktik. Kwasans timè yo te mezire chak jou 2 ak konpa elektwonik ak kalkile pa longè (mm) × lajè (mm). Sourit ki gen yon zòn timè ki pi gwo pase 300 mm2 yo te elimine. Timè yo te kolekte, dijere, ak trete ak Percoll (Sigma), ak Lè sa a, fonksyon selil T ak fenotip yo te detèmine pa sikometri koule.

Pousantaj konsomasyon oksijèn debaz ak analiz pousantaj asidifikasyon ekstraselilè

Pou analiz de karakteristik metabolik yo, OCR ak ECAR te evalye pa Seahorse XF24 analyzer (Agilent). Yon ti tan, selil T imen yo kiltive ak kondisyon diferan pou 12 jou yo te pretrete ak mwayen XF ki pa tampon (RPMI 1640 ki pa tampon ki gen 10 mM glikoz 1mM piruvat sodyòm, ak 2mM glutamin) . Apre sa, selil T imen yo te simen nan 0.5 × 106 selil pou chak pi nan yon mikroplak kilti selil XF24 ak enkubasyon nan yon enkibatè ki pa CO2 pou 1 èdtan nan 37 degre. Pou amelyore aderans selilè yo, plak yo te file nan tanperati chanm pou 5 min nan 100 g ak fren zewo. Konsomasyon oksijèn ak asidifikasyon ekstraselilè yo te analize nan kondisyon fondamantal ak an repons a 1.25 μM oligomycin, 50 mM 2-deoxy-d-glikoz, 1.5 μM FCCP, 0.5 μM rotenone, ak 0.5 μM antimycin A. SRC te kalkile pa soustraksyon. OCR fondamantal ki soti nan OCR maksimòm.

ChIP–qPCR

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) te fèt swiv enstriksyon manifakti a bay ak ChIP-IT eksprime twous taye anzimatik (Active Motif). An brèf, 15 milyon selil T imen kiltive nan kontwòl oswa 10 mM kondisyon asid laktik yo te fiks ak fòmaldeyid pou 10 min nan tanperati chanm, epi yo te sispann reyaksyon an fikse pa adisyon a nan 1 × glisin. Selil fiks yo te boule ak PMSF ak bwason anpèchman pwoteyin epi estoke nan -80 degre anvan liz selil. Lè sa a, granules dekonjle a te resuspende nan 1 ml glas-frèt lysis tanpon ak PMSF ak bwason anpèchman pwoteyin sou glas pou 30 minit pou jwenn materyèl nikleyè. Lè sa a, granules nikleyè a te resuspende ak dijere ak yon bwason anzimatik taye kwomatin pou 15 minit nan 37 degre. Chromatin taye te enkube ak pwoteyin G pèl mayetik ak anti-c-MYC (CST, cat. No. 18583, 1:100 pou ChIP) ak anti-IgG (CST, Cat. No. 2729, 1:100 pou ChIP) nan 4 degre lannwit lan. Lè sa a, pèl mayetik yo te lave ak tanpon ChIP kat fwa epi elite ak 50 ul tanpon elisyon. ADN eliye a te ranvèse reticulation pou 2.5 èdtan nan 65 degre ak Lè sa a, pirifye pa ekstraksyon fenol-klowofòm. Yo te itilize ADN pirifye a pou fè ChIP-qPCR pou detekte anrichisman MYC nan pwomotè jèn sib yo. Ou ka jwenn primè yo itilize pou ChIP-qPCR nan Tablo Siplemantè 2.

Mas mitokondriyo ak analiz potansyèl manbràn

Mas mitokondriyo ak potansyèl manbràn yo te analize lè l sèvi avèk MitoTracker Green ak tetramethyrhodamine methyl ester (TMRM). Selil yo te tache ak 250 nM MitoTracker Green (Thermo Fisher) oswa 50 nM TMRM (Thermo Fisher) nan yon enkibatè nan 37 degre (5% CO2) pou 1 èdtan anvan tach sifas selil yo. Selil yo te lave ak tanpon FACS twa fwa, ki te swiv pa makè sifas tach pou plis analiz FACS.

Analiz estatistik

Yo te fè analiz estatistik lè l sèvi avèk GraphPad Prism vèsyon 8.0. Rezilta yo parèt kòm mwayen ± sem Yo te itilize tès t Elèv de-ke pou konpare tretman ak gwoup kontwòl yo. De-fason ANOVA ak tès Sidak Tukey a oswa tès miltip konparezon Dunnett a te aplike pou konparezon miltip. P < 0.05 te konsidere kòm estatistik enpòtan.

Referans

1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. & Bonini, C. T selil souch memwa nan sante ak maladi. Nat. Med. 23, 18–27 (2017).

2. Gao, S. et al. Selil souch ki sanble ak selil T memwa: yon pèspektiv ki soti nan bò nwa a. Imunol selilè. 361, 104273 (2021).

3. Rosenberg, SA & Restifo, NP Transfè selil adoptif kòm imunoterapi pèsonalize pou kansè imen. Syans 348, 62–68 (2015).

4. Ribas, A. & Wolchok, JD Imunoterapi kansè lè l sèvi avèk blokaj pòs. Syans 359, 1350–1355 (2018).

5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK & Youngblood, BA Stem, effector, and hybrid states of memory CD8+ T cells. Tandans Immunol. 41, 17–28 (2020).

6. Galletti, G. et al. De sou-ansanm tij-tankou CD8+ memwa T selil ansèyman ak angajman diferan sò nan imen. Nat. Imunol. 21, 1552–1562 (2020).

7. Gattinoni, L. et al. Yon sou-ansanm selil T memwa imen ak pwopriyete ki sanble ak selil souch. Nat. Med. 17, 1290–1297 (2011).

8. Franco, F., Jaccard, A., Romero, P., Yu, YR & Ho, PC Metabolik ak epigenetik règleman nan fatig T-selil. Nat. Metab. 2, 1001–1012 (2020).

9. Kaech, SM & Cui, W. Kontwòl transkripsyon efektè ak memwa CD8+ diferansyasyon selil T. Nat. Rev Immunol. 12, 749–761 (2012).

10. Huang, Q. et al. Diferansasyon primè nan selil T CD8+ memwa espesifik timè yo kòm sekouris bon konfyans nan blokaj PD-1/PD-L1 nan drenaj gangliyon lenfatik yo. Selil 185, 4049–4066 (2022).

11. Siddiqui, I. et al. Entratumoral Tcf1+ PD-1+ CD8+ selil T ki gen pwopriyete ki sanble ak tij yo ankouraje kontwòl timè an repons a vaksen ak imunoterapi bloke. Iminite 50, 195–211 (2019).

12. Jeannet, G. et al. Wòl esansyèl nan Wnt pathway effector Tcf-1 pou etablisman fonksyonèl CD8 T selil memwa. Pwosedi. Natl Acad. Sci. USA 107, 9777–9782 (2010).

13. Henning, AN, Roychoudhuri, R. & Restifo, NP Epigenetic kontwòl nan CD 8+ diferansyasyon selil T. Nat. Rev Immunol. 18, 340–356 (2018).

14. Crompton, JG et al. Relasyon linyonaj CD8+ T selil yo revele pa chanjman pwogresif nan peyizaj epigenetik la. Selil Mol. Imunol. 13, 502–513 (2016).

15. Yu, B. et al. Peyizaj epijenetik revele faktè transkripsyon ki kontwole diferansyasyon selil T CD8+. Nat. Imunol. 18, 573–582 (2017).

16. Araki, Y. et al. Analiz nan tout genòm nan metilation histon revele regilasyon kwomatin ki baze sou eta a nan transkripsyon jèn yo ak fonksyon selil T CD8+ memwa yo. Iminite 30, 912–925 (2009).

17. Moller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC Pwogram metabolik adapte iminite selil T nan enfeksyon viral, kansè, ak aje. Selil Metab. 34, 378–395 (2022).

18. Phan, AT et al. Metabolis glikolitik konstititif sipòte diferansyasyon memwa CD8+ T cell efector pandan enfeksyon viral. Iminite 45, 1024–1037 (2016).

19. Sinclair, LV et al. Kontwòl reseptè antijèn nan metabolis methionine nan selil T. eLife 8, e44210 (2019).

20. O'Sullivan, D. et al. Selil T memwa CD8+ yo sèvi ak lipoliz selil-intrinsèk pou sipòte pwogram metabolik ki nesesè pou devlopman. Iminite 41, 75–88 (2014).

21. Pearce, EL et al. Amelyore memwa CD8 T-selil pa modulation metabolis asid gra. Nature 460, 103-107 (2009).

22. Van der Windt, GJ et al. Kapasite respiratwa mitokondriyo se yon regilatè enpòtan nan devlopman memwa selil T CD8+. Iminite 36, 68–78 (2012). 23. Boedtkjer, E. & Pedersen, SF Mikwo anviwònman timè asid kòm yon chofè kansè. Ann. Rev Physiol. 82, 103–126 (2020). 24. Thommen, DS & Schumacher, TN disfonksyon selil T nan kansè. Cancer Cell 33, 547–562 (2018).

25. Scharping, NE et al. Mikro-anviwònman timè a reprime byojenèz mitokondriyo selil t pou kondwi ensifizans metabolik intratumoral ak malfonksyònman. Iminite 45, 374–388 (2016).

26. Yu, YR et al. Dinamik mitokondriyo deranje nan CD8+ TIL ranfòse fatig selil T yo. Nat. Imunol. 21, 1540–1551 (2020).

27. Chang, CH et al. Konpetisyon metabolik nan mikroanvironman timè a se yon chofè pwogresyon kansè. Selil 162, 1229–1241 (2015).

28. Scharping, NE et al. Estrès mitokondriyo pwovoke pa eksitasyon kontinyèl anba ipoksi rapidman kondwi fatig T-selil. Nat. Imunol. 22, 205–215 (2021).

29. Jansen, CS et al. Yon nich andedan-timoral kenbe ak diferansye selil T CD8 tankou tij yo. Nature 576, 465–470 (2019).

30. Im, SJ et al. Defini CD8+ selil T ki bay pete proliferasyon apre terapi PD-1. Nature 537, 417-421 (2016).

31. Haas, R. et al. Laktat kontwole sikui metabolik ak pro-enflamatwa nan kontwòl sou migrasyon selil T ak fonksyon efèktè yo. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).

32. Wu, H. et al. Selil T yo pwodui nich asid nan nœuds lenfatik pou siprime pwòp fonksyon efèktè yo. Nat. Komin. 11, 4113 (2020).

33. Calcinotto, A. et al. Modulasyon nan asidite mikwo-anviwònman ranvèse anergy nan lenfosit T imen ak murin ki enfiltre timè. Kansè Res. 72, 2746–2756 (2012). 34. Gottfried, E. et al. Asid laktik ki sòti nan timè modil aktivasyon selil dendritik ak ekspresyon antijèn. San 107, 2013–2021 (2006).

35. Colegio, OR et al. Polarizasyon fonksyonèl nan makrofaj ki asosye ak timè pa asid laktik ki sòti nan timè. Nati 513, 559-563 (2014).

36. Erra Diaz, F. et al. Asidoz ekstraselilè ak anpèchman mTOR kondwi diferansyasyon selil dendritik moun ki sòti nan monosit yo. Rep. Selilè 31, 107613 (2020).

37. Sukumar, M. et al. Anpeche metabolis glikolitik amelyore memwa selil T CD8+ ak fonksyon antitumoral. J. Clin. Envesti. 123, 4479–4488 (2013).

38. Scholz, G. et al. Modulasyon siyal mTOR deklanche fòmasyon selil T memwa ki sanble ak selil souch yo. EBioMedicine 4, 50-61 (2016).

39. Pollizzi, KN et al. mTORC1 ak mTORC2 kontwole selektivman CD8+ selil T yo. J. Clin. Envesti. 125, 2090–2108 (2015).

40. Zhang, L. et al. Sib mamifè rapamicin konplèks 2 kontwole diferansyasyon memwa selil T CD8 nan yon fason ki depann de Foxo1-. Rep. Selilè 14, 1206–1217 (2016).

41. Zhou, H. & Huang, S. Wòl mTOR siyal nan mobilite selil timè, envazyon ak metastaz. Curr. Pwoteyin Pept. Sci. 12, 30–42 (2011).

42. Arguello, RJ et al. SCENITH: yon metòd sikometri ki baze sou fonksyonèl pwofil metabolis enèji ak rezolisyon yon sèl selil. Selil Metab. 32, 1063–1075 (2020).

43. Ron-Harel, N. et al. Byogenesis mitokondriyo ak renovasyon pwoteòm ankouraje metabolis yon sèl-kabòn pou aktivasyon selil T. Selil Metab. 24, 104–117 (2016).

44. Han, C., Ge, M., Ho, PC & Zhang, L. Fueling T-selil iminite antitumoral: metabolis asid amine revize. Immunol kansè. Res. 9, 1373–1382 (2021).

45. Kakaradov, B. et al. Byen bonè transkripsyon ak règ epigenetik nan CD8+ diferansyasyon selil T revele pa sekans RNA yon sèl selil. Nat. Imunol. 18, 422–432 (2017).

46. ​​Wang, W. & Zou, W. Asid amine ak transpòtè yo nan iminite selil T ak terapi kansè. Mol. Selil 80, 384–395 (2020).

47. Marchingo, JM, Sinclair, LV, Howden, AJ & Cantrell, DA Analiz kantitatif sou fason Myc kontwole pwoteòm selil T ak chemen metabolik pandan aktivasyon selil T. eLife 9, e53725 (2020).

48. Sukumar, M. et al. Potansyèl manbràn mitokondriyo idantifye selil ki gen tij amelyore pou terapi selilè. Selil Metab. 23, 63–76 (2016).

49. Alizadeh, D. et al. IL15 amelyore aktivite antitumoral selil CAR-T pa diminye aktivite mTORC1 ak prezève fenotip memwa selil souch yo. Immunol kansè. Res. 7, 759–772 (2019).

50. Buck, MD et al. Dinamik mitokondriyo kontwole sò selil T atravè pwogram metabolik. Selil 166, 63–76 (2016).

51. Krishna, S. et al. Selil T CD8 tankou tij yo medyatè repons imunoterapi selil adoptif kont kansè imen. Syans 370, 1328–1334 (2020).

52. Burger, ML et al. Yerachi dominasyon antijèn yo fòme fenotip TCF1+ pitit pitit CD8 T nan timè yo. Selil 184, 4996–5014 (2021).

53. Guo, Y. et al. Repwograme metabolik selil T CD8+ T ki fin itilize pa IL-10 amelyore iminite anti-timè. Nat. Imunol. 22, 746–756 (2021).

54. Klein Geltink, RI et al. Kondisyone metabolik selil T CD8+ efector pou terapi selil adoptif. Nat. Metab. 2, 703–716 (2020).

55. Suzuki, J., Nabe, S., Yasukawa, M. & Yamashita, M. Glutamine kontwole aktivite antitumoral selil T CD8 yo. Gan To Kagaku Ryoho 47, 11–15 (2020).

56. Vodnala, SK et al. Tij selil T ak malfonksyònman nan timè yo deklanche pa yon mekanis komen. Syans 363, eaau0135 (2019).

57. Bosticardo, M. et al. Aktivasyon partial nan lenfosit T imen akòz pH ekstraselilè ki ba se antagonize pa costimulation B7 / CD28. Lajan ewo. J. Immunol. 31, 2829–2838 (2001).

58. Pucino, V. et al. Laktat akimilasyon nan sit la nan enflamasyon kwonik fè pwomosyon maladi lè li pwovoke CD4+ T cell rewiring metabolik. Selil Metab. 30, 1055–1074 (2019).

59. Feng, Q. et al. Laktat ogmante tij selil CD8+ T pou ogmante iminite anti-timè. Nat. Komin. 13, 4981 (2022).

60. Roy, DG et al. Metabolis methionine fòme repons selil T helper yo atravè règleman repwogram epijenetik. Selil Metab. 31, 250–266 (2020).

61. Zhang, L. & Romero, P. Kontwòl metabolik nan CD 8+ Desizyon selil T ak iminite antitumoral. Tandans Mol. Med. 24, 30–48 (2018).

62. Cham, CM, Driessens, G., O'Keefe, JP & Gajewski, TF Privasyon glikoz anpeche plizyè evènman kle ekspresyon jèn ak fonksyon efèktè nan selil T CD8+. Lajan ewo. J. Immunol.38, 2438-2450 (2008).

63. O'Sullivan, D. et al. Selil T memwa CD8+ yo sèvi ak lipoliz selil-intrinsèk pou sipòte pwogram metabolik ki nesesè pou devlopman. Iminite 49, 375–376 (2018).

64. Lin, R. et al. Oksidasyon asid gra kontwole CD8+ tisi-rezidan memwa siviv selil t nan adenokarcinom gastric. Immunol kansè. Res 8, 479–492 (2020).

65. Raud, B. et al. Aksyon Etomoxir sou selil T regilasyon ak memwa yo endepandan de oksidasyon asid gra Cpt1a-medyatè. Selil Metab. 28, 504–515 (2018).

66. Sharma, U. & Rando, OJ Antre metabolik nan epigenom la. Selil Metab. 25, 544–558 (2017).

67. Tyrakis, PA et al. S-2-idroksiglutarat kontwole sò CD8+ lenfosit T yo. Nature 540, 236-241 (2016).

68. Zhang, H. et al. Beta-hydroxybutyrate ki pwodui ketogenesis se yon regilatè epigenetik devlopman memwa selil T CD8+. Nat. Selil Biol. 22, 18–25 (2020).

69. Bian, Y. et al. Kansè SLC43A2 chanje metabolis T-selil methionine ak metilation histon. Nature 585, 277-282 (2020).

70. Wall, M. et al. Kontwòl tradiksyon c-MYC pa rapamicin fè pwomosyon diferansyasyon tèminal myeloid. San 112, 2305–2317 (2008).

71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. & Weidinger, C. Kontwòl metabolik epigenetik ak wòl li nan diferansyasyon ak fonksyon selil T CD8+. Devan. Imunol. 10, 2718 (2019).

72. Eil, R. et al. Suppression iminitè ionik nan mikwo-anviwònman timè limite fonksyon efèktè selil T. Nature 537, 539-543 (2016).

73. Guo, A. et al. Konpozan konplèks cBAF ak MYC kolabore byen bonè nan sò selil T CD8+. Nature 607, 135–141 (2022).

74. Raynor, JL, Chapman, NM & Chi, H. Kontwòl metabolik jenerasyon T-selil memwa ak stemness. Sou entènèt jwèt Cold Spring Harb. Pèspektif. Biol. 13, a037770 (2021).

75. Kaya-Okur, HS et al. CUT & Tag pou pwofil epigenomik efikas nan ti echantiyon ak selil sèl. Nat. Komin. 10, 1930 (2019).

76. Jin, H. et al. ChIPseqSpikeInFree: yon apwòch nòmalizasyon ChIP-seq pou revele chanjman mondyal nan modifikasyon histon san pike-in. Bioinformatics 36, 1270-1272 (2020).

77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ Ekstraksyon metabolit soti nan selil mamifè kiltive sispansyon pou pwofil metabolit mondyal. Nat. Pwotok. 6, 1241–1249 (2011).

78. Li, C. et al. Katabolism asid amine kontwole proteostaz selil souch ematopoyetik atravè yon aks GCN2-eIF2. Cell Stem Cell 29, 1119–1134 (2022).

79. Wenes, M. et al. Pòtè mitokondrial piruvat la kontwole diferansyasyon selil T memwa ak fonksyon antitumoral. Selil Metab. 34, 731–746 (2022).